CN107384757A

CN107384757A - 黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置及方法

Info

Publication number: CN107384757A
Application number: CN201710652637.2A
Authority: CN
Inventors: 丁勃; 国明; 胡德福; 徐晓洁; 张冕; 胡文宏
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明涉及微生物检测领域中的质控菌悬液制备，公开一种在封闭系统内进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置，包括，培养器，其下部装有琼脂培养基；富集器，设有罐体a，所述罐体a顶部连通有抽液软管，所述罐体a内设有截留菌丝使黑曲霉孢子通过的过滤膜a；所述罐体a下方设有罐体b，所述罐体b内设有截留、富集黑曲霉孢子的过滤膜b，所述罐体b底部设有排液口；蠕动泵，卡接抽液软管。同时公开了一种利用该装置的黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的方法。本发明充分分离菌丝和孢子，能制备出均匀、高浓度的黑曲霉孢子悬液，同时，在封闭的装置中，防止外界菌类污染孢子，也有效避免黑曲霉孢子对实验环境的污染和对实验人员的危害。

Description

黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域中的质控菌悬液制备，具体涉及一种在封闭系统内进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置及方法。

背景技术

黑曲霉孢子是黑曲霉的繁殖体，其在普通环境中生存能力较强，对干燥、紫外线照射、循环风净化及部分消毒剂均有一定的抵抗能力。虽然黑曲霉孢子已作为一种法定菌株用于实验室质量控制，但其仍具有一定的危害性。黑曲霉能分泌有机酸和毒素，对实验人员造成危害。

目前，实验室获取黑曲霉孢子新鲜培养物的主要采用以下方法：取冻干菌或斜面培养物接种至适宜的琼脂培养基表面，经菌株复苏、复壮等步骤后，待孢子成熟以无菌生理盐水洗脱，纱布或脱脂棉过滤，得到孢子悬液，或再经适宜量的生理盐水稀释得到目标浓度的孢子悬液。

但是，基于现有的试验条件和操作方法，黑曲霉孢子在实验过程中对局部试验环境的污染几乎无法避免，黑曲霉培养物接种、孢子洗脱、悬液制备和浓度稀释等均为开放性操作，干燥孢子或气溶胶极易扩散至空气中；实验室内换风系统、人员移动、甚至呼吸等均会导致空气的流动，加速孢子的扩散；黑曲霉孢子对不良外界环境有一定的抗性，针对性的消毒剂也只限于表面杀灭，对于存留在空气、管道、缝隙等中的孢子则不易清除，孢子在数周甚至数月的时间内仍能保持活性，适宜的条件下生长繁殖成为潜在的实验室污染源。此外，现有孢子悬液制备方法还存在菌丝与孢子的分离不彻底导致孢子悬液中出现团块孢子浓度不均、难以制备高浓度孢子悬液的缺陷。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种制备出均匀、高浓度的黑曲霉孢子悬液，同时有效避免黑曲霉孢子对实验环境的污染和对实验人员的危害的黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置及方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置,包括，

培养器，其顶部设有换气口和进出液口，其下部装有琼脂培养基；

富集器，设有罐体a，所述罐体a顶部连通有抽液软管，所述抽液软管的管口与进出液口连通，所述罐体a内设有截留菌丝使黑曲霉孢子通过的过滤膜a；所述罐体a下方设有罐体b，所述罐体b顶部通过软管与罐体a底部连通，所述罐体b内设有截留、富集黑曲霉孢子的过滤膜b，所述罐体b底部设有排液口；

蠕动泵，卡接抽液软管。如此设计，制备出均匀、高浓度的黑曲霉孢子悬液，同时有效避免黑曲霉孢子对实验环境的污染和对实验人员的危害。

进一步的，所述过滤膜a材质为聚丙烯，所述过滤膜a厚度为45~55mm ，所述过滤膜a为非对称膜，所述过滤膜a滤孔孔径从上到下减小，所述过滤膜a滤孔孔径为5～10um。如此设计，能充分过滤去除菌丝，利于黑曲霉孢子通过进入罐体b。

进一步的，所述过滤膜b为混合纤维素滤膜，所述过滤膜b滤孔直径为0.22~0.45um。如此设计，均匀的截留黑曲霉孢子。

进一步的，所述培养基上端面是4~7度的倾斜面；所述培养基上面覆盖有混合纤维素膜；所述混合纤维素膜滤孔直径为0.22~0.45um。如此设计，倾角防止培养面积水，洗脱孢子时，防止将琼脂混入溶液中。

进一步的，所述换气口内设有滤芯。如此设计，防止外部微生物进入造成交叉污染。

进一步的，所述进出液口下端连接有导液管，所述导液管贴在培养器内壁，所述导液管管口位于滤膜a上方2~5mm处，所述进出液口上端连接有卡套式通管接头，所述通管接头的管口设有开关。如此设计，加液体时，防止溅射，往富集器排液体时，能充分的排除，同时，方便与富集器密封连通，方便与取液器密封连通。

进一步的，所述罐体b顶部设有排气口，所述排气口内设有滤芯。如此设计，防止罐体b内压力过大，造成损伤，滤芯防止外部微生物进入污染。

进一步的，所述培养器材质为聚乙烯；所述富集器材质为聚乙烯和聚丙烯；所述罐体a下方通过3~5根可剪断的支柱固定罐体b。如此设计，装置透明，能方便观察内部情况，同时设备稳定性好。

一种使用所述的装置进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的方法，

a将已接种黑曲霉孢子的培养器置20~25℃培养箱中培养5~7天，待培养基表面产生大量孢子后取出；

b将取液器抽取含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌生理盐水40~50ml，自进出液口加入培养器中，振摇，洗脱孢子；

c将富集器抽液软管固定于蠕动泵，将抽液软管口密封连通培养器进出液口，开启蠕动泵定向加压，使培养器内的孢子、菌丝悬液被抽取至富集器内，罐体a内的过滤膜a将菌丝截留，孢子悬液通过软管进入罐体b，过滤膜b可截留孢子，生理盐水自排液口排出；

d另取含孢子的培养器，重复b、c步骤，在过滤最后一个培养器内的孢子悬液之前，堵塞第二罐体的排液口，则液体存留于第二罐体内，用导管夹夹紧软管中段，从上端剪断，振摇罐体，充分混匀，制成黑曲霉孢子悬液。

进一步的，步骤d中，过滤最后一个培养皿内液体时，不堵塞罐体b的排液口，将生理盐水全部排除，分离罐体b后，从软管加入无菌生理盐水。

本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：

本发明所述装置，充分分离菌丝和孢子，能制备出均匀、高浓度的黑曲霉孢子悬液，同时，在封闭的装置中，防止外界菌类污染孢子，也有效避免黑曲霉孢子对实验环境的污染和对实验人员的危害。所述装置简单、制造成本低、维护使用方便。

本发明所述方法，一个孢子富集器可以采集多个培养器内的孢子，可制备出传统方法无法制备的高浓度孢子悬液，满足不同试验要求，该方法促进了黑曲霉孢子悬液制备方法的标准化，较传统方法有更好的溯源性。

附图说明

图1是本发明所述黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液装置的结构示意图；

图中：1、换气口，2、进出液口，3、混合纤维素膜，4、培养基，5、倾斜面，6、 7、抽液软管，8、排气口，9、罐体a，10、过滤膜a，11、支柱 12、软管，13、罐体b，14、过滤膜b，15、蠕动泵，16、排液口。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

实施例1

以培养、分离和制备黑曲霉孢子悬液用于非无菌药品微生物限度检查试验为例，如图1所述，

一种黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置,包括，

培养器，其顶部设有换气口1和进出液口1，其下部装有琼脂培养基4；所述培养基4上端面是5度的倾斜面5；培养基4上面覆盖有混合纤维素膜3；所述混合纤维素膜3滤孔直径为0.45um；

富集器，设有罐体a 9，所述罐体a 9顶部连通有抽液软管7，所述抽液软管7的管口与进出液口2连通，所述罐体a 9内设有截留菌丝使黑曲霉孢子通过的过滤膜a 10，所述过滤膜a10材质为聚丙烯，所述过滤膜a 10厚度为50mm ，所述过滤膜a 10为非对称膜，所述过滤膜a10滤孔孔径从上到下减小，过滤膜a 10上部分滤孔孔径为10um，过滤膜a 10下部分滤孔孔径为5um；所述罐体a 9下方设有罐体b 13，所述罐体b 13顶部通过软管12与罐体a 9底部连通，所述罐体b 13内设有截留、富集黑曲霉孢子的过滤膜b 14，所述过滤膜b 14为混合纤维素滤膜，所述过滤膜b 14滤孔直径为0.45um；所述罐体b 13底部设有排液口 16；

蠕动泵15，卡接抽液软管7。

所述换气口1内设有滤芯。进出液口2下端连接有导液管，导液管贴在培养器内壁，导液管管口位于滤膜a 10上方3mm处，进出液口2上端连接有卡套式通管接头，所述通管接头的管口设有开关。所述罐体b 13顶部设有排气口8，所述排气口8内设有滤芯。所述培养基材质为聚乙烯；所述富集器材质为聚乙烯和聚丙烯；所述罐体a 9下方通过4根可剪断的支柱11固定罐体b13。

非无菌药品微生物限度检查试验所需要的黑曲霉孢子悬液浓度为约50cfu/ml检测一个样品所需的孢子悬液体积在10ml以内，用所述的装置进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的方法如下：

a将已接种黑曲霉孢子的培养器置25℃培养箱中培养7天，待培养基表面产生大量孢子后取出；

b将取液器抽取含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌生理盐水50ml，自进出液口加入培养器中，振摇，洗脱孢子；

d堵塞第二罐体的排液口，则液体存留于第二罐体内，用导管夹夹紧软管中段，从上端剪断，用刻度吸管量取50ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌生理盐水，自导管上端加入罐体b内，振摇罐体，充分混匀，取1ml黑曲霉孢子悬液，用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，得到浓度为50cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。

实施例2

以培养、分离和制备黑曲霉孢子悬液用于抑菌效力测定为例，如图1所述，

一种黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置,包括，

蠕动泵15，卡接抽液软管7。

所述换气口1内设有滤芯。进出液口2下端连接有导液管，导液管贴在培养器内壁，导液管管口位于滤膜a 10上方2mm处，进出液口2上端连接有卡套式通管接头，所述通管接头的管口设有开关。所述罐体b 13顶部设有排气口8，所述排气口8内设有滤芯。所述培养基材质为聚乙烯；所述富集器材质为聚乙烯和聚丙烯；所述罐体a 9下方通过4根可剪断的支柱11固定罐体b 13。

抑菌效力测定所需黑曲霉孢子悬液浓度为10⁸cfu/ml，孢子悬液以挑战菌株的形式加入到供试品中，接种菌液的体积不超过供试品体积的1%，一般样品体积在10ml~100ml，检测一个样品所需的孢子悬液体积在2ml以内用所述的装置进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的方法如下：

a根据要求，准备45个培养器，将已接种黑曲霉孢子的培养器置入25℃内部环温培养箱中培养6天，待培养基表面产生大量孢子后取出；

c将富集器抽液软管固定于蠕动泵，将抽液软管口密封连通培养器进出液口，开启蠕动泵定向加压，使培养器内的孢子、菌丝悬液被抽取至富集器内，罐体a内的过滤膜a将菌丝截留，孢子悬液通过软管进入罐体b，过滤膜b可截留孢子，生理盐水自排液口排出，直到第45个培养器完成孢子悬液富集；

d继续将b罐体内的所有液体排出，用导管夹夹紧软管中段，从上端剪断，用刻度吸管量取5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌生理盐水，自导管上端加入b罐内，充分振摇混匀，得到浓度约为10⁸cfu/ml的黑曲霉孢子悬液，用无菌生理盐水进行10倍系列稀释，对每个稀释级进行精确计数，测定孢子悬液浓度。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的装置,其特征在于，包括，

培养器，其顶部设有换气口（1）和进出液口（2），其下部装有琼脂培养基（4）；

富集器，设有罐体a（9），所述罐体a（9）顶部连通有抽液软管（7），所述抽液软管（7）的管口与进出液口（2）连通，所述罐体a（9）内设有截留菌丝使黑曲霉孢子通过的过滤膜a（10）；所述罐体a（9）下方设有罐体b（13），所述罐体b（13）顶部通过软管（12）与罐体a（9）底部连通，所述罐体b（13）内设有截留、富集黑曲霉孢子的过滤膜b（14），所述罐体b（13）底部设有排液口（16）；

蠕动泵（17），卡接抽液软管（7）。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤膜a（10）材质为聚丙烯，所述过滤膜a（10）厚度为45~55mm ，所述过滤膜a（10）为非对称膜，所述过滤膜a（10）滤孔孔径从上到下减小，所述过滤膜a（10）滤孔孔径为5～10um。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述过滤膜b（14）为混合纤维素滤膜，所述过滤膜b（14）滤孔直径为0.22~0.45um。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述培养基（4）上端面是4~7度的倾斜面（5）；所述培养基（4）上面覆盖有混合纤维素膜（3）；所述混合纤维素膜（3）滤孔直径为0.22~0.45um。

5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述换气口（1）内设有滤芯。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述进出液口（2）下端连接有导液管，所述导液管贴在培养器内壁，所述导液管管口位于滤膜a（10）上方2~5mm处，所述进出液口（2）上端连接有卡套式通管接头，所述通管接头的管口设有开关。

7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述罐体b（13）顶部设有排气口（8），所述排气口（8）内设有滤芯。

8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述培养器材质为聚乙烯；所述富集器材质为聚乙烯和聚丙烯；所述罐体a（9）下方通过3~5根可剪断的支柱（11）固定罐体b（13）。

9.一种使用如权利要求1所述的装置进行黑曲霉孢子培养、分离和制备悬液的方法，其特征在于，

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤d中，过滤最后一个培养皿内液体时，不堵塞罐体b的排液口，将生理盐水全部排除，分离罐体b后，从软管加入无菌生理盐水。