CN107308515A - 一种血液中循环肿瘤细胞的灭活系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统以及核黄素在制备用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药剂中的应用，所述的系统以及应用完全诱导外周血液中肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞凋亡失去增殖能力，最大限度保持患者血液细胞、凝血功能、免疫功能。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域，特别涉及一种用于核黄素光化学法灭活循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统及应用。
背景技术
循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作使其从实体肿瘤病灶脱落，大部分循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者复发风险。特别是，恶性实体肿瘤细胞手术前脱落入血以及外科手术切除肿瘤过程中均无法避免存在肿瘤细胞血行播散问题。
目前已有报道对循环肿瘤细胞的处理方法，例如：CN204824871U、CN203846026U公开循环肿瘤细胞分离方法和富集装置，通过滤膜过滤实现了对循环肿瘤细胞最大可能的分离富集，并能实现循环反复采集；CN103732271A公开了将病人血液流过容器时其中的肿瘤细胞就被特异性吸附而不会再流回病人血液，从而被从血液中清除掉，以减少肿瘤病人的复发而延长其生存期。周裕凯(亚甲蓝光化学疗法处理血液中肿瘤细胞的展望，中国煤炭工业医学杂志，2010)讨论了亚甲蓝光化学疗法处理血液中肿瘤细胞技术，但亚甲蓝存在残余毒性、处理后血浆蛋白的损失较大、操作繁琐。
核黄素(RPT)光化学法被认为是处理血液及血液制品具有发展前景的方法，其原理是：核黄素因结构特性可以嵌入病毒的核酸内，在照射下，激发其电子的转移，氧化核酸上的鸟嘌呤残基，病毒的核酸被修饰而受损，不能再进行复制和修复，从而达到灭活病毒的效果，且核黄素为安全药品，没有毒性和副作用，添加处理后不用滤除。
然而，目前核黄素光化学法被常被用于处理血液及血液制品中病毒的灭活。例如：专利CN201418870Y、CN204092616U、CN104248643A等公开了核黄素灭活全血或血浆病毒的装置和方法，通过在设置核黄素添加元件将核黄素加入至血浆中并进行光照灭活，能够灭活血浆中各类病原体，改善血浆安全性。但上述方法处理血液及血液制品时通常会破坏淋巴细胞。
董矜等(光照核黄素对肿瘤细胞生长和端粒长度的作用，第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编，2004)研究了光照核黄素对肿瘤细胞生长和端粒长度的作用。但上述研究没有给出核黄素用于处理血液及血液制品灭活肿瘤细胞的具体方案。
为克服现有技术的缺陷，本发明基于核黄素光化学技术在血液制品病毒、细菌、原虫灭活以及淋巴细胞灭活预防输血相关移植物抗宿主病的理论研究与临床应用基础上，建立一套患者能够耐受、连续处理外周血液的技术方法，完全诱导外周血液中肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞凋亡失去增殖能力，最大限度保持患者血液细胞、凝血功能、免疫功能。
发明内容
本发明的一个目的是解决当前恶性实体肿瘤细胞手术前脱落入血以及外科手术切除肿瘤过程中无法避免的肿瘤细胞血行播散问题。
本发明的另一个目的是实现了采用光化学技术进行血液或血液制品中灭活肿瘤细胞的同时，淋巴细胞可保持一定的活性。
本发明的第一方面提供了一种核黄素在制备用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药剂中的应用。
本发明所述的核黄素在血液或血液制品中的浓度为1-70μmol/L，更优选的，所述的核黄素在血液或血液制品中的浓度为40-60μmol/L，最优选的，所述的核黄素在血液或血液制品中的浓度为50μmol/L。
本发明所述的药剂为核黄素的溶液，例如核黄素的生理盐水溶液，本领域技术人员可以理解，核黄素的浓度可以是任意的，在使用前配置成所需的浓度，更优选的，所述的核黄素溶液浓度为100-20000μmol/L，最优选的，所述的核黄素溶液浓度为1000-10000μmol/L，例如是2000μmol/L、3000μmol/L、4000μmol/L、5000μmol/L、6000μmol/L、7000μmol/L、8000μmol/L。
本发明所述的光化学法使用的光源可以为任意的光源，只要所述的光源可以激发核黄素的电子转移从而产生自由基。例如，所述的光源选自紫外光光源、可见光光源或红外光光源，优选的，所述的光源为紫外光光源或可见光光源，更优选的，所述的光源为300-600nm波长的光源。
本发明所述的光化学法的辐照剂量可以根据血液或血液制品类型进行选择，例如血液或血液制品中含有较高含量的红细胞时，则需要提高辐射剂量。另外，辐射剂量的选择也需要考虑到安全因素，过高剂量的辐射可能会对血液成分产生影响。因而，本发明所述的光化学法的辐照剂量为0.003-15J/cm2，优选的，所述的辐照剂量为9-14J/cm2，更优选的，所述的辐照剂量为10-13J/cm2。
本发明所述的光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞能够保持血液或血液制品中淋巴细胞的活性。
本发明的还一方面提供了一种核黄素在制备光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统中的应用，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源。
本发明的还一方面提供了一种光化学法灭活血液或血液制品循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源。
所述的透光容器可以为任何适宜的能够透射可见光的装置。优选的，所述的透光容器为透光管、透光血袋、透光瓶等。更优选的，所述的透光容器为透光管，最优选的，所述的透光管呈蛇形排列。所述的透光容器可以为玻璃、塑料或聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)材质。
所述的光源可以为任意的光源，只要所述的光源可以激发核黄素的电子转移从而产生自由基。例如，所述的光源选自紫外光光源、可见光光源或红外光光源，优选的，所述的光源为紫外光光源或可见光源，更优选的，所述的光源为300-600nm波长的光源。
本发明所述的透光容器与血液输入口和血液输出口相连，所述的光源设置在透光容器的一侧或周围，优选的，所述的光源可以为一个或多个。所述的核黄素添加装置与透光容器连通，并且核黄素添加装置与透光容器连通之间设置控制装置，优选的，所述的控制装置为开关、易折件等。
优选的，所述的光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统还包括抗凝剂添加装置。更优选的，所述的抗凝剂添加装置与透光容器连通之间设置控制装置，优选的，所述的控制装置为开关、易折件等。
优选的，所述的光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统还包括蠕动泵。所述的蠕动泵能够保持连续处理外周血液。
本发明所述的血液制品包括全血、血浆、血小板或其它血液制品。
本发明的还一方面提供了一种核黄素在制备治疗肿瘤的药剂上的应用，所述的药剂用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞。
本发明的还一方面提供了一种核黄素在制备治疗肿瘤的系统上的应用，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源，所述的系统通过光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞。
光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞包括：
(1)将血液或血液制品从血液输入口输入至透光容器；(2)通过核黄素添加装置在血液或血液制品中添加核黄素；(3)通过光源光照透光容器灭活循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞；(4)血液或血液制品从血液输出口输出。
本发明所述的肿瘤可以为肺癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、非小细胞肺癌、骨癌、结肠癌、直肠癌、口腔鳞状细胞癌、食道癌、胃癌和前列腺癌等，优选为直肠癌或结肠癌。
本发明建立一种简单、安全、高效的外周血液循环肿瘤细胞/肿瘤干细胞灭活系统及应用，解决当前恶性实体肿瘤细胞手术前脱落入血以及外科手术切除肿瘤过程中无法避免的肿瘤细胞血行播散问题，同时能够保持血液中淋巴细胞的活性。
附图说明
图1为本发明光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统的结构示意图。
其中，1-血液输入口、2-血液输出口、3-核黄素添加装置、4-抗凝剂添加装置、5-透光管、6-光源、7-蠕动泵。
具体实施方式
实施例1光化学法灭活血液或血液制品循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统
如图1所示的光化学法灭活血液或血液制品循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统，包括血液输入口(1)、血液输出口(2)、透光管(5)、核黄素添加装置(3)和300-600nm波长的可见光源(6)，其中透光管(5)为乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)材料制备，透光管(5)与血液输入口(1)和血液输出口(2)相连，光源(6)设置在透光管(5)的一侧，所述的核黄素添加装置(3)和抗凝剂添加装置(4)与透光管(5)连通，透光管上还设置有蠕动泵(7)。其工作原理为：将血液或血液制品从血液输入口(1)输入至透光管(5)，通过核黄素添加装置(3)在血液或血液制品中添加核黄素，通过抗凝剂添加装置(4)在血液或血液制品中添加抗凝剂，保持核黄素在血液或血液制品中的有效浓度，蠕动泵(7)工作使血液流动，通过光源(6)光照透光管(5)中流动的血液或血液制品，最终血液或血液制品从血液输出口(2)输出。
实施例2核黄素光化学法处理人结直肠癌HCT116细胞
(1)人结直肠癌HCT116细胞培养、扩增
采用无血清培养：无血清培养液为加入细胞生长因子(包括50ng/mLEGF、10ng/mLNoggin和50ng/mLR-Spondin1)的DMEM/F12培养液。同时制作1％琼脂糖凝胶附着面的6孔板以备用。取结直肠癌HCT116细胞，制成单细胞悬液，用无血清的DMEM/F12培养液重悬，锥虫蓝染色计数，以1×103个/mL密度接种至盛有SFM的上述6孔板中，进行常规培养。将SFM中培养形成的HCT116细胞球用PBS洗涤、离心，制成细胞球悬液。
(2)人结直肠癌HCT116中肿瘤干细胞比例检测
HCT116单层细胞及肿瘤细胞球分别用0.25％胰酶和Accutase制备成细胞悬液，计数后调整细胞数量为1×106个/组，每管中加入鼠抗人单克隆抗体CD133-PE(工作液按1:10稀释)，对照管加入同体积的同型对照抗体，混匀，室温下避光孵育20min。PBS清洗2次后，用含1％多聚甲醛溶液的PBS固定重悬细胞，上流式细胞仪检测CD133+细胞的含量。
(3)核黄素RPT处理HCT116细胞
①配制200μmol/L核黄素溶液，用0.2μm的滤器除菌；
②在局部百万级净化无菌条件下，各取HCT116细胞悬浮液，分别加入核黄素溶液，制成3个浓度梯度：1μmol/L、5μmol/L、15μmol/L，共设计6个实验组：核黄素浓度1μmol/L，辐照剂量0.015J/cm2(实验组1)；核黄素浓度5μmol/L，辐照剂量0.015J/cm2(实验组2)；核黄素浓度15μmol/L，辐照剂量0.015J/cm2(实验组3)；核黄素浓度1μmol/L，辐照剂量0.030J/cm2(实验组4)；核黄素浓度5μmol/L，辐照剂量0.030J/cm2(实验组5)；核黄素浓度15μmol/L，辐照剂量0.030J/cm2(实验组6)；对照组为不经过核黄素及光照处理的正常细胞。
(4)HCT116细胞凋亡测定
各组细胞，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞。然后，加入5μL Annexin V-FITC，混匀后再加5μL Propidium Iodide，混匀。室温避光反应5-15min。用流式细胞仪检测各组肿瘤细胞凋亡情况。
(5)细胞因子检测
将淋巴细胞培养上清冻存，进行细胞因子检测，以验证核黄素光化学法处理后的淋巴细胞是否仍有正常的分泌功能。
操作步骤：加入混合微球45ul/孔(微球用前涡旋15s)，用抽滤器抽掉孔内液体。加入样品或标准品45ul/孔，封板，避光室温震荡60min。配制1xBiotin-dAb,2xBiotin-dAb+2xNR(Mouse/Rat)dAb Diluent至25ul/孔。用抽滤器抽掉孔内液体，加入washing buffer100ul/孔，用抽滤器抽掉孔内液体，洗3次，用吸水纸吸去下面液体。加入1xBiotin-dAb25ul/孔，封板，避光室温震荡30min。用抽滤器抽掉孔内液体，加入washing buffer100ul/孔，用抽滤器抽掉孔内液体，洗3次，用吸水纸吸去下面液体。加入1xSA-PE25ul/孔，封板，避光室温震荡20min。用抽滤器抽掉孔内液体，加入washing buffer100ul/孔，用抽滤器抽掉孔内液体，洗3次，用吸水纸吸去下面液体。加入1xReading buffer150ul/孔，备用。取剩余微球加入400ul1xReadingbuffer混匀倒入流式管，上机调门框。吹吸各孔内液体使孔内微球悬浮，转入流式管上机进行检测。
(6)核黄素光化学法处理的人结直肠癌HCT116细胞成瘤能力检测
选择4周龄的雌性NOD/SCID免疫缺陷鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别设为空白对照组，阳性对照组，实验组7(核黄素浓度15μmol/L，辐照剂量0.015J/cm2)，实验组8(核黄素浓度15μmol/L，辐照剂量0.030J/cm2)。空白对照组每只小鼠左肢腋下注射100μlPBS；阳性对照组每只小鼠左肢腋下注射100μl正常培养的HCT116细胞(含1х106个细胞)；实验组7每只小鼠左肢腋下注射100μl经核黄素15μmol/L，辐照剂量0.015J/cm2照射处理后的HCT116细胞(含1х106个细胞)；实验组8每只小鼠左肢腋下注射100μl经核黄素15μmol/L，辐照剂量0.030J/cm2照射处理后的HCT116细胞(含1х106个细胞)。小鼠于注射后第3周处死，钝性分离取出移植瘤进行后续实验，用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按照TV(肿瘤体积)＝[length×(width)2]/2计算肿瘤大小。
(7)核黄素光化学法处理的全血中人结直肠癌HCT116细胞成瘤能力检测
由于全血中存在多种对光产生吸收或遮蔽作用的成分，因而在测试核黄素光化学法处理全血中人结直肠癌HCT116细胞时，需要增强核黄素的浓度以及辐照剂量，具体如下：
将健康供者全血与HCT116细胞混合，并平均分为四组，每组中加入50μmol/L的核黄素，并根据辐照剂量不同分为6.24J/cm2(实验组9)、9.36J/cm2(实验组10)、12.48J/cm2(实验组11)及不光照的对照四组。处理后利用免疫磁珠分选法对混合物中的HCT116细胞进行分选，将分选出来的HCT116细胞用1640培养基重悬。选择4周龄的雌性NOD/SCID免疫缺陷鼠12只，随机分为4组，每组3只，分别设为阳性对照组，实验组9(核黄素浓度50μmol/L，辐照剂量6.24J/cm2)，实验组10(核黄素浓度50μmol/L，辐照剂量9.36J/cm2)，实验组11(核黄素浓度50μmol/L，辐照剂量12.48J/cm2)，每组加入上述相应处理的分选后HCT116细胞(1х106)。小鼠于注射后2周后处死，钝性分离取出移植瘤进行后续实验，用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按照TV(肿瘤体积)＝[length×(width)2]/2计算肿瘤大小。
(8)实验结果：
表1 HCT116肿瘤细胞总体凋亡率
表2 HCT116肿瘤细胞中肿瘤干细胞凋亡率
表3淋巴细胞凋亡率
表4淋巴细胞细胞因子分泌浓度
表5核黄素光化学法处理的人结直肠癌HCT116细胞成瘤能力检测
表6核黄素光化学法处理的全血中人结直肠癌HCT116细胞成瘤能力检物
实施例3光化学法灭活患者血液中循环肿瘤细胞
将患者的血液从血液输入口(1)输入至透光管(5)，通过核黄素添加装置(3)在血液中添加核黄素，使核黄素在系统的血液中的浓度为40μmol/L，蠕动泵(7)工作使血液流动，通过波长为300-600nm的光源(6)光照透光管(5)中流动的血液45min，辐照剂量约为14J/cm2，最终血液从血液输出口(2)输出，重新输入患者体内。
实施例4光化学法灭活血液制品中循环肿瘤细胞
将血袋中的血液从血液输入口(1)输入至透光管(5)，通过核黄素添加装置(3)在血液中添加核黄素，使核黄素在系统的血液中的浓度为60μmol/L，通过抗凝剂添加装置(4)在血液中添加抗凝剂，蠕动泵(7)工作使血液流动，通过波长为300-600nm的光源(6)光照透光管(5)中流动的血液30min，辐照剂量约为9J/cm2，最终血液从血液输出口(2)输出，重新置入血袋中。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种核黄素在制备用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药剂中的应用，所述的核黄素在血液或血液制品中的浓度为1-70μmol/L。
2.权利要求1所述的应用，所述的核黄素在血液或血液制品中的浓度为40-60μmol/L。
3.权利要求1所述的应用，所述的药剂为核黄素的溶液，所述的核黄素溶液浓度为100-20000μmol/L。
4.权利要求1所述的应用，所述的光化学法的辐照剂量为0.003-15J/cm2。
5.权利要求4所述的应用，所述的光化学法的辐照剂量为9-14J/cm2。
6.一种核黄素在制备光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统中的应用，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源。
7.一种光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的系统，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源。
8.权利要求7所述的系统，所述的透光容器与血液输入口和血液输出口相连，所述的光源设置在透光容器的一侧或周围，所述的光源为一个或多个，所述的核黄素添加装置与透光容器连通，并且核黄素添加装置与透光容器连通之间设置控制装置。
9.一种核黄素在制备治疗肿瘤的药剂上的应用，所述的药剂用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞，所述的光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞包括：
(1)将血液或血液制品从血液输入口输入至透光容器；
(2)通过核黄素添加装置在血液或血液制品中添加核黄素；
(3)通过光源光照透光容器灭活循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞；
(4)血液或血液制品从血液输出口输出。
10.一种核黄素在制备治疗肿瘤的系统上的应用，所述的系统包括血液输入口、血液输出口、透光容器、核黄素添加装置和光源，所述的系统用于光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞，所述的光化学法灭活血液或血液制品中循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞包括：
(1)将血液或血液制品从血液输入口输入至透光容器；
(2)通过核黄素添加装置在血液或血液制品中添加核黄素；
(3)通过光源光照透光容器灭活循环肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞；
(4)血液或血液制品从血液输出口输出。
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