CN107184452A - 一种茶叶总黄酮的制备方法、测试方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉公开了一种茶叶总黄酮制备方法，特别是一种从茶叶中分离茶叶总黄酮的生产工艺和方法。包括以下步骤：1)使用70％乙醇对茶叶进行提取；2)在乙醇溶液提取液加入明胶溶液进行沉淀、过滤；加入硅藻土处理，浓缩干燥；3)用大孔树脂拌样加在大孔树脂柱上，先用水洗脱，然后分别用不同梯度的乙醇对大孔树脂柱进行洗脱；4)收集洗脱液，并将洗脱液合并，在40‑50℃的条件下，进行减压浓缩，蒸干；并将蒸干得到的产物，加乙醇溶解；6)静置；抽滤，取滤液并洗涤沉淀；8)将滤液浓缩干燥、研细粉。得到的产物用于化妆品中。以此方法获得的茶叶总黄酮，纯度高不仅可以满足爱美人士的需要而且可以创造出巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种茶叶总黄酮制备方法、测试方法及应用，特别是一种从茶叶中分离茶叶总黄酮的生产工艺和方法。
背景技术
茶叶总黄酮是以茶的叶采用合适的提取，分离和纯化手段提取制得的一类产品，包括黄酮和黄酮醇类的提取物，该类成分也有重要的生理作用。已有事实证明茶中的类黄酮混合物具有非常强的抗氧化和清除自由基杀害的活性大大高于维生素C和E。同时茶中的类黄酮物质有维生素P的功能，能促进人体从食物中摄取并蓄积维生素C。茶叶总黄酮具有浅黄色，可流动的外观，固有的香气，味苦，可广泛用于化妆品领域。其在化妆品领域主要作为辅料和功能性成分，主要有美白、收敛、保湿、防晒、抗皱等作用。
我国是世界上最大的茶叶产地之一，茶叶资源十分丰富。深入开展茶叶中总黄酮的提取及其生物学活性的研究，开发出一系列具有医疗和保健作用的化妆品在人类护肤美容方面将会发挥更大的作用，不仅可以满足爱美人士的需要而且可以创造出巨大的经济效益。
申请号为200610097615.6的发明专利公开了一种总黄酮提取物的制备方法，但该种方法针对的是黄蜀葵花，而非茶叶；并且在提取步骤、提取的纯度、用途等多个方面存在较大区别。在现有技术中未发现从茶叶中提取总黄酮的制备方法，并进而将产物用于化妆品领域。
发明内容
本发明提供如下的技术方案：
(1)使用乙醇对茶叶进行提取；
(2)对提取液进行预处理:将步骤(1)的乙醇溶液提取液过滤，加入明胶溶液进行沉淀，过滤(若难以澄清，加入硅藻土处理)，浓缩干燥；
(3)大孔树脂柱洗脱:将步骤(2)处理好的过滤液用少量水溶解，用大孔树脂拌样加在大孔树脂柱上，先用水洗脱，然后分别不同梯度的乙醇对大孔树脂柱进行洗脱；乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、纯乙醇；
(4)收集洗脱液:收集步骤(3)中自大孔树脂柱中流出的20-60％乙醇之间的洗脱液；
(5)减压浓缩:将步骤(4)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；
(6)溶解:步骤(5)蒸干得到的产物，加乙醇溶解；
(7)静置；
(8)抽滤，取滤液，洗涤沉淀；
(9)浓缩干燥、研细粉，即得。
(10)含量测定：
对照品溶液制备：精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液Iml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外一可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，获得曲线斜率。
测定方法：取本品细粉约0.2g，精密称定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约4小时)，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。取供试品贮备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。
本品按干燥品计算，含总黄酮以无水芦丁(C27H3006)计，可以达到41％。
有益效果，本发明的从茶叶中分离纯化高含量总黄酮的方法，主要目的是通过除去黄烷醇(儿茶素)类杂质增加黄酮(黄酮，黄酮醇)含量。其制备工艺简单、可靠、成本低，过程中不使用有毒试剂，安全、可控。其所得总黄酮，含量高、浪费少。成品为棕褐色粉末，具较好的流动性，粘附较小。可作为原料开发，用于化妆品、食品等领域。
附图说明
图1标准曲线图
图2样品含量测定图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
本实施例包括以下步骤：
(1)茶叶5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加热提取1小时，过滤得提取液，按10：1得比例加入10％明胶溶液适量，静置，过滤取滤液，浓缩干燥。
(2)取大孔树脂D101适量，大孔树脂D101是一种非极性有机高聚物吸附剂预处理后湿法装柱，95％乙醇冲洗后，水洗至无醇味，即可上样；
(3)分别以不同浓度梯度乙醇对大孔树脂柱进行洗脱，收集20-60％乙醇部位的洗脱液，50-60℃减压回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分别是:乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；
(4)减压浓缩:将步骤(3)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；蒸干得到的产物，加乙醇溶解、静置、抽滤，取滤液，洗涤沉淀、浓缩干燥、研细粉，即得。
(5)经含量测定，总黄酮提取物中总黄酮含量为41.1％，提取物得率为8.1％。
实施例2：
本实施例包括以下步骤：
(1)茶叶5kg置提取罐中，加入80％乙醇，加热提取1小时，过滤得提取液，按10：1得比例加入10％明胶溶液适量，静置，过滤取滤液，浓缩干燥。
(2)取大孔树脂D101适量，预处理后湿法装柱，95％乙醇冲洗后，水洗至无醇味，即可上样；
(3)分别以不同浓度梯度乙醇对大孔树脂柱进行洗脱，收集20-60％乙醇部位的洗脱液，50-60℃减压回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分别是:乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；
(4)减压浓缩:将步骤(3)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；蒸干得到的产物，加乙醇溶解、静置、抽滤，取滤液，洗涤沉淀、浓缩干燥、研细粉，即得。
(5)经含量测定，总黄酮提取物中总黄酮含量为39.3％，提取物得率为7.5％。
实施例3：
本实施例包括以下步骤：
(1)茶叶10kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加热提取1小时，过滤得提取液，按10：1得比例加入10％明胶溶液适量，静置，过滤取滤液，浓缩干燥。
(2)取大孔树脂D101适量，预处理后湿法装柱，95％乙醇冲洗后，水洗至无醇味，即可上样；
(3)分别以不同浓度梯度乙醇对大孔树脂柱进行洗脱，收集20-60％乙醇部位的洗脱液，50-60℃减压回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分别是:乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；
(4)减压浓缩:将步骤(3)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；蒸干得到的产物，加乙醇溶解、静置、抽滤，取滤液，洗涤沉淀、浓缩干燥、研细粉，即得。
(5)经含量测定，总黄酮提取物中总黄酮含量为38.6％，提取物得率为8.5％。
实施例4：
本实施例包括以下步骤：
(1)茶叶5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加热提取1小时，过滤得提取液，按10：1得比例加入10％明胶溶液适量，静置，过滤取滤液，浓缩干燥。
(2)取大孔树脂D101适量，预处理后湿法装柱，95％乙醇冲洗后，水洗至无醇味，即可上样；
(3)分别以不同浓度梯度乙醇对大孔树脂柱进行洗脱，收集10-60％乙醇部位的洗脱液，50-60℃减压回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分别是:乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；
(4)减压浓缩:将步骤(3)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；蒸干得到的产物，加乙醇溶解、静置、抽滤，取滤液，洗涤沉淀、浓缩干燥、研细粉，即得。
(5)经含量测定，总黄酮提取物中总黄酮含量为28.7％，提取物得率为12.2％。
实施例5：
本实施例包括以下步骤：
(1)茶叶5kg置于提取罐中，加入70％乙醇，加热提取1小时，过滤得提取液，按10：1得比例加入10％明胶溶液适量，静置，过滤取滤液，浓缩干燥。
(2)取大孔树脂D101适量，预处理后湿法装柱，95％乙醇冲洗后，水洗至无醇味，即可上样；
(3)分别以不同浓度梯度乙醇对大孔树脂柱进行洗脱，收集20-60％乙醇部位的洗脱液，50-60℃减压回收蒸干。乙醇水溶液的梯度分别是:乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、乙醇；
(4)减压浓缩:将步骤(3)中的洗脱液合并进行减压浓缩，蒸干，控制温度在40-50℃；蒸干得到的产物，加乙醇溶解、静置、抽滤，取滤液，洗涤沉淀、浓缩干燥、研细粉，即得。
(5)对照品溶液制备：精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备：对照样品浓度为199.12mg/ml，纯度为100％。精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液Iml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外一可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度(WL500.0)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1)，其中，斜率为0.122371，截距为-0.00047，相关系数为0.99997。
标准表
| 样品ID | 类型 | Ex | 浓度 | W_500.0 | 权重因子 | 注释 | |
| 1＊ | 1 | Standard | 1.000 | 0.121 | 1.000 | ||
| 2 | 2 | Standard | 2.000 | 0.243 | 1.000 | ||
| 3 | 3 | Standard | 3.000 | 0.369 | 1.000 | ||
| 4 | 4 | Standard | 4.000 | 0.491 | 1.000 | ||
| 5 | 5 | Standard | 5.000 | 0.610 | 1.000 | ||
| 6 | 6 | Standard | 6.000 | 0.733 | 1.000 | ||
| 7 |
测定法：取本品细粉约0.2g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色(约4小时)，提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。取供试品贮备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。滤液的稀释浓度为250倍，精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。
标准曲线吸光度分别为0.121、0.243、0.369、0.491、0.610、0.733。
精密称取芦丁对照品24.89mg，茶叶提取物0.2023g和0.2011g，按照前述方法操作，绘制样品含量测定图(图2)
(5)经含量测定，总黄酮提取物中总黄酮含量为41.1％，提取物得率为8.1％。
Claims (5)
1.一种茶叶总黄酮的制备方法,其特征在于包括以下步骤：
a、使用70％乙醇对茶叶进行提取；
b、在乙醇溶液提取液加入明胶溶液进行沉淀、过滤；加入硅藻土处理，浓缩干燥；
c、将步骤b处理好的过滤液用水溶解，用大孔树脂拌样加在大孔树脂柱上，先用水洗脱，然后分别用不同梯度的乙醇对大孔树脂柱进行洗脱；
d、收集步骤c中自大孔树脂柱中流出乙醇浓度为20-60％的洗脱液；
e、将洗脱液合并，在40-50℃的条件下，进行减压浓缩，蒸干；
f、将蒸干得到的产物，加乙醇溶解；
g、静置；
h、抽滤，取滤液并洗涤沉淀；
i、将滤液浓缩干燥、研细粉。
2.如权利要求1所述的茶叶总黄酮的制备方法,其特征在于：步骤c中所用拌样所选溶剂为水，大孔树脂为以苯乙烯为主要骨架的大孔树脂D101。
3.如权利要求1所述的茶叶总黄酮的制备方法,其特征在于：步骤c中使用的乙醇水溶液的梯度分别是:水、5％乙醇、10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、纯乙醇。
4.如权利要求1所述的茶叶总黄酮的检测方法,其特征在于：
对照品溶液制备:对照品采用芦丁溶液，浓度为199.12mg/ml，纯度为100％；
标准曲线制备：以在500nm的波长处测定的吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，获得曲线斜率；
产物测定：取产品约0.2g，依次加三氯甲烷、甲醇提取至无色，蒸干后依次加如乙醇、水，稀释250倍后待测，根据标准曲线获得的斜率，计算产物含量。
5.将通过权利要求1所述的制备方法获得的茶叶总黄酮用于化妆品中。
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