CN107106562B - 使用糖皮质激素和盐皮质激素受体拮抗剂的脂肪肝疾病治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用一类嘧啶二酮环己基化合物的脂肪肝疾病的治疗。在一个实施方式中，本发明提供了治疗脂肪肝疾病的方法。该方法包括向有此需要的对象给予治疗上有效量的式I的化合物，从而治疗脂肪肝疾病，其中式I的化合物具有结构(I)。

Description

使用糖皮质激素和盐皮质激素受体拮抗剂的脂肪肝疾病治疗

相关申请的交叉参考

本申请要求于2014年12月15日提交的美国临时专利申请第62/092,041号和2014年10月15日提交的美国临时专利申请第62/064,358号的优先权。上述临时申请的全部内容通过引用纳入本文。

发明背景

肝脏疾病可以分为不同类别的疾病，如酒精诱导的脂肪肝疾病(AFLD)，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，药物或酒精相关肝脏疾病，病毒性疾病，免疫介导的肝脏疾病，代谢性肝脏疾病，和与肝功能不全和/或肝移植相关的并发症。非酒精性脂肪肝疾病是在很少饮酒或不饮酒的个体中的一种常见的肝脏疾病，其组织学特征与酒精诱导的脂肪肝疾病相似。脂肪肝疾病是由于肝细胞内脂质(脂肪)的异常保留。

AFLD和NAFLD的有效治疗仍然不足。迄今为止，没有为这种患者建立治疗的药物治疗。需要管理脂肪肝疾病的新型治疗选择。

在包括人类的大部分物种中，生理性糖皮质激素是皮质醇(氢化可的松)。糖皮质激素是响应ACTH(促肾上腺皮质激素)而分泌的，其显示生理节律变化和响应应激和食物的升高。皮质醇水平在几分钟内对许多身体和心理压力都有反应，包括创伤，手术，运动，焦虑和抑郁。皮质醇是一种类固醇且通过结合胞内糖皮质激素受体(GR)发挥作用。在人中，糖皮质激素受体以两种形式存在：777个氨基酸的配体结合GR-α；和缺失50个羧基端残基的GR-β同种型。由于这些包括配体结合域，GR-β不能结合天然配体，并组成型位于细胞核中。该GR也称作GR II。

皮质醇和其它糖皮质激素也可作用于盐皮质激素受体(MR)，在这种情况下它们被称作盐皮质激素或盐皮质激素受体拮抗剂(MRA)。所述盐皮质激素受体主要调控体内的盐浓度。所述MR对盐皮质激素和糖皮质激素可具有基本相等的亲和性。

可使用受体调节剂(如激动剂、部分激动剂和拮抗剂)在GR水平调节皮质醇的生物效果，包括由皮质醇增多症导致的那些。几种不同类型的试剂能够阻断GR激动剂结合的生理作用。这些拮抗剂包括通过结合GR从而阻断激动剂有效结合和/或激活GR的能力的组合物。一种这类已知的GR拮抗剂，米非司酮，已被发现是人类中有效的抗糖皮质激素试剂(Bertagna(1984)J.Clin.Endocrinol.Metab.59：25)。米非司酮以高亲和性结合GR，解离常数(K_d)为10^-9M(Cadepond(1997)Annu.Rev.Med.48：129)。

除了皮质醇外，其它类固醇的生物学效应可使用受体调节剂(如激动剂、部分激动剂和拮抗剂)在GR水平调节。当给予有需要的对象时，类固醇可提供预期的治疗效果，例如通过刺激糖皮质激素受体反式抑制，以及负面的副作用，例如通过慢性糖皮质激素受体反式激活。

本领域中需要用于调节GR受体以治疗脂肪肝疾病的新的组合物和方法。出乎意料的是，本发明满足了这些及其他需求。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供了一种治疗脂肪肝疾病的方法。该方法包括给予有需要的对象治疗上有效量的分子式I的化合物，从而治疗脂肪肝疾病，其中所述式I的化合物具有结构：

在式I的化合物中，虚线是不存在或是键。X是O或S。R¹是环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基，任选被1到3个R^1a基团取代。每个R^1a独立地为H，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，C_1-6烷基-OR^1b，卤素，C_1-6卤代烷基，C_1-6卤代氧基，-OR^1b，-NR^1bR^1c，-C(O)R^1b，-C(O)OR^1b，-OC(O)R^1b，-C(O)NR^1bR^1c，-NR^1bC(O)R^1c，-SO₂R^1b，-SO₂NR^1bR^1c，环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基。R^1b和R^1c各自为H或C_1-6烷基。R²是H，C_1-6烷基，C_1-6烷基-OR^1b，C_1-6烷基-NR^1bR^1c或C_1-6亚烷基-杂环烷基。R³是H或C_1-6烷基。Ar是被1-4个R⁴基团任选取代的芳基。每个R⁴是H，C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素，C_1-6卤代烷基或C_1-6卤代烷氧基。L¹是键或C_1-6亚烷基。下标n是0至3的整数。还包括本文所述化合物的盐和异构体。

附图说明

图1显示了相对于接受高脂肪饮食和载剂的对照小鼠，接受高脂肪饮食和化合物1(60mg/kg/天)的小鼠的油红O染色肝脏中的脂肪(脂滴)的百分比。

图2A和2B显示了来自接受高脂肪(“HF”)饮食和化合物1的小鼠(图2A)和接受高脂肪饮食和载剂的对照小鼠(图2B)的肝脏的脂滴的油红O染色。

图3显示了相对于接受高脂肪饮食和载剂的对照小鼠，接受高脂肪饮食和米非司酮或化合物1(60mg/kg/天)的小鼠的油红O染色肝脏中的脂肪(脂滴)的百分比。*p＜0.05“化合物1”与“CTRL”相比

图4显示了在给予正常饮食(“CHOW”组)的小鼠，给予3周高脂肪饮食的小鼠(“HF-3wks”组)，给予6周高脂肪饮食的小鼠(“HF-6wks”组)，给予6周高脂肪饮食和化合物1的小鼠(“HF+118335-6wks”组)，给予6周高脂肪饮食，仅在最近3周给予化合物1的小鼠(“HF-118335rev”组)的肝脏中的甘油三酯水平。**p＜0.01与“CHOW”相比；#p＜0.05与“HF-6wks”相比；##p＜0.01与“HF-6wks”相比。

发明详述

I.概述

本发明提供了通过向患有脂肪肝疾病的患者给予本发明的化合物治疗脂肪肝疾病的化合物和方法。不受任何理论限制，与本领域公认的理解相反，本发明所述的化合物特异性结合糖皮质激素受体，本发明中脂肪肝疾病的治疗是通过同时结合糖皮质激素和盐皮质激素受体完成的，而不是特异性结合糖皮质激素受体超过其它核受体，如盐皮质激素受体和孕酮受体。

II.定义

本文所用的缩写具有其在化学和生物领域内的传统涵义。

当取代基基团由其常规化学通式从左至右书书写时，它们同样包括了从右至左书写该结构所得的化学上相同的取代基，例如-CH₂O-与-OCH₂-等同。

“烷基”指具有指定数量的碳原子的直链或支链的，饱和的脂肪烃基。例如，C₁-C₆烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。

“亚烷基”指1到7个碳原子的直链或支链亚烷基，即1到7个碳原子的二价烃基，例如直链亚烷基是式-(CH₂)_n-的二价基团，其中n是1，2，3，4，5，6或7。优选地，亚烷基表示1到4个碳原子的直链亚烷基，例如亚甲基，亚乙基，亚丙基或亚丁基链，或被C₁-C₃-烷基(优选甲基)单取代或被C₁-C₃-烷基(优选甲基)在相同或不同碳原子上双取代的亚甲基，亚乙基，亚丙基或亚丁基链，碳原子总数达到并包括7。本领域的技术人员应理解亚烷基的单个碳原子可以是二价的，如在-CH((CH₂)_nCH₃)-中，其中n＝0-5。

“烯基”指具有至少一个双键的2-6个碳原子的直链或支链烃。烯基的示例包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，5-己二烯基、2，4-己二烯基或1，3，5-己三烯基。烯基也可具有2到3，2到4，2到5，3到4，3到5，3到6，4到5，4到6和5到6个碳原子。该烯基基团通常是单价的，但可以是二价的，例如当烯基基团将两个部分连接到一起时。

“炔基”指具有至少一个三键的2-6个碳原子的直链或支链烃。炔基的示例包括但不限于：乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1，3-戊二炔基、1，4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1，3-己二炔基、1，4-己二炔基、1，5-己二炔基、2，4-己二炔基或1，3，5-己三炔基。炔基基团也可具有2到3，2到4，2到5，3到4，3到5，3到6，4到5，4到6和5到6个碳原子。该炔基基团通常是单价的，但可以是二价的，例如当炔基基团将两个部分连接到一起时。

“烷氧基”指如上所述的还具有能共价连接到另一个烃(例如甲氧基，乙氧基或叔丁氧基基团)的氧取代基的烷基基团。

除非另有说明，单独或作为另一取代基一部分的“卤素”指氟、氯、溴或碘原子。

“卤代烷基”指如上文所定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基，氟甲基，1，2，3，4，5-五氟苯基等。术语“全氟”定义了具有至少两个被氟取代的可用氢的化合物或基团。例如，全氟甲烷指1，1，1-三氟甲基。

“卤代烷氧基”指如上文所定义的烷氧基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。“卤代烷氧基”意在包括单卤代烷基(氧基)和多卤代烷基(氧基)。

“烷基胺”指在具有一个或多个氨基基团的本文中定义的烷基。所述氨基可以是伯氨基、仲氨基或叔氨基。所述烷基胺还可被羟基取代。可用于本发明的烷基胺包括但不限于乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。所述氨基可将烷基胺连接至化合物剩余部分的接合点，其位于烷基的ω位，或在烷基的至少两个碳原子上连接在一起。本领域技术人员应理解，其它烷基胺也可用于本发明中。

“环烷基”指饱和的或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环组成物，其包含3至12个环原子，或指定数量的原子。例如，C₃-C₈环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。环烷基还包括冰片基和金刚烷基。

“杂环烷基”指具有3个环原子到约20个环原子和1到约5个杂原子(如N、O和S)的环系统。另外的杂原子也可以是有用的，包括但不限于B，Al，Si和P。杂原子也可被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)₂-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基，四氢噻吩基，吗啉基，吡咯烷基，吡咯啉基，咪唑烷基，咪唑啉基，吡唑烷基，吡唑啉基，哌嗪基，二氢吲哚基，奎林环基和1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基。

“亚烷基-杂环烷基”指如上所定义的通过亚烷基连接到另一个基团的杂环烷基基团。所述杂环烷基和杂环烷基通过亚烷基连接的基团可连接到亚烷基的相同原子或不同原子上。

除非另有说明，“芳基”指多不饱和、芳族的烃取代基，其可以是单环或者稠合到一起或共价连接的多环(优选1到3个环)。示例包括但不限于苯基、联苯基、萘基和苄基。

“杂芳基”指含有1-4个选自N、O或S的杂原子的芳基基团(或环)，其中所述氮和硫原子任选被氧化，所述氮原子任选被季铵化。杂芳基基团可通过碳或杂原子连接到分子的其余部分上。芳基和杂芳基基团的非限制示例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述每个芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述可接受的取代基。

为了简洁起见，当与其它术语联用时(如芳氧基、芳硫氧基，芳基烷基)，术语“芳基”包括如上所定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基基团连接到烷基基团(如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)上的那些基团，所述烷基包括其中碳原子(例如亚甲基基团)已被例如氧原子(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)取代的那些烷基基团。同样，术语“杂芳基烷基”意在包括其中杂芳基基团连接到烷基基团上的那些基团。

上述术语(如“烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自意在包括指定基团的取代和未取代形式。以下提供了每种类型基团的取代基的示例。

所述烷基和杂烷基基团(包括常常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自但不限于下组的各种基团中的一种或多种：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-S(O)R′，-S(O)₂R′，-S(O)₂NR′R″，-NR(SO₂)R′，-CN和-NO₂，数字范围从0到(2m′+1)，其中m′是这类基团中的碳原子总数。R′、R″、R″′和R″″各自独立地优选指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如，被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基、或硫代烷氧基基团、或芳基烷基基团。当本发明所述的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中的多于一个存在时，每个R基团独立地选自各R′、R″、R″′和R″″基团。当R′和R″连接到相同氮原子上时，它们可与该氮原子结合形成4、5、6或7元环。例如，-NR′R″意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基”意在包括含有与除氢基团以外的基团结合的碳原子的基团，如卤代烷基(例如，-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如，-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

类似于关于烷基基团所述的取代基，芳基和杂芳基基团的取代基是不同的并选自，例如：卤素、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂、-R′、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基、和氟(C₁-C₄)烷基、取代基数量范围为0至芳环系统上开放价态的总数，并且其中R′、R″、R″′和R″″独立地优选选自：氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明所述的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中的多于一个存在时，每个R基团独立地选自各R′、R″、R″′和R″″基团。

当两个取代基是“任选连接到一起以形成环”时，所述两个取代基与这两个取代基所连接的原子或原子共价键合到一起以形成取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的环烷基，或取代或未取代的杂环烷基环。

“盐”指本发明所述的方法中使用的化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的说明性示例有：无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐、季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的其他信息可在Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，宾西马尼亚州伊斯顿，1985中找到，其通过引用纳入本文。

“水合物”指与至少一个水分子复合的化合物。本发明所述的化合物可与1至10个水分子复合。

“异构体”指具有相同化学式但在结构上可以区分的化合物。

“互变异构体”指平衡存在的两种或更多种结构异构体之一，且其易于从一种形式转换成另一种形式。

“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”指有助于对对象施用活性剂和吸收的物质，且可被包括在本发明的组合物中而不会对患者造成显著的不良毒理作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括水、NaCl、生理盐水、乳酸林格溶液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。本领域技术人员应理解，其它药物赋形剂可用于本发明中。

“治疗”，“处理”和“疗法”指损伤、病变或病症的治疗或改善中任何成功的迹象，包括任何客观或主观参数，如消除、缓解；症状的消除或造成损伤、病变或病症对患者更为可耐受、减慢退化或衰退的速率、使退化的终点不那么衰弱、改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数，包括身体检查、神经精神检查和/或精神评价的结果。

“核受体”指负责感应并响应类固醇和甲状腺激素以及合成激素和化合物的一类蛋白质。许多亚家族，包括甲状腺激素受体样，类视黄醇X受体样，雌激素受体样，和神经生长因子IB样等。所述亚家族雌激素受体样包括雌激素受体，雌激素相关受体和3-酮类固醇受体家族。所述3-酮类固醇受体家族包括许多受体，例如但不限于糖皮质激素受体(GR)，盐皮质激素受体(MR)，雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，和雄激素受体(AR)。

“糖皮质激素受体”(“GR”)指特异性结合皮质醇和/或皮质醇类似物的胞内受体家族。所述糖皮质激素受体也称为皮质醇受体。该术语包括GR的异构体，重组GR和突变的GR。“糖皮质激素受体”(“GR”)指特异性结合皮质醇和/或皮质醇类似物如地塞米松的II型GR(例如，参见Turner和Muller，J Mol Endocrinol 2005年10月1日，35283-292)。本发明的所述的化合物对人核受体的抑制常数(K_i)在0.0001nM到1000nM之间；优选在0.0005nM到10nM之间，最优选在0.001nM到1nM之间。

“调节核受体”指用于调节糖皮质激素受体对糖皮质激素、糖皮质激素拮抗剂、激动剂和部分激动剂以及盐皮质激素受体对盐皮质激素，MR拮抗剂，激动剂和部分激动剂的响应的方法。该方法包括使GR和MR接触有效量的拮抗剂、激动剂或部分激动剂并检测GR活性或GR和MR活性的变化。

“核受体调节剂”指调控糖皮质激素受体(GR)激动剂如合成或天然的皮质醇或皮质醇类似物与GR结合以及调控MR激动剂如醛固酮或其类似物与MR结合的任何组合物或化合物。所述调控可包括部分或完全抑制(拮抗)GR激动剂与GR和/或MR激动剂与MR的结合。

“拮抗”指阻断受体分子上的激动剂结合或抑制受体-激动剂产生的信号。受体拮抗剂阻断或抑制激动剂-介导的响应。

“糖皮质激素受体拮抗剂”指部分或完全抑制(拮抗)糖皮质激素受体(GR)激动剂(如合成或天然的皮质醇或皮质醇类似物)与GR结合的任何组合物或化合物。

“特异性糖皮质激素受体拮抗剂”或“特异性盐皮质激素受体拮抗剂”指抑制与GR和/或MR和激动剂的结合相关的任何生物响应的任何组合物或化合物。通过“特异性”，我们预期该药物优先结合GR和/或MR而非其他核受体(如雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)或雄激素受体(AR))。

“盐皮质激素受体”指以基本相等的亲和性结合盐皮质激素如醛固酮和糖皮质激素如皮质醇的胞内受体家族。所述盐皮质激素受体(MR)也被称为醛固酮受体或核受体亚家族3，C组，成员2(NR3C2)。所述MR属于皮质醇受体家族。所述MR由盐皮质激素如醛固酮和其前体脱氧皮质酮以及糖皮质激素如皮质醇激活。

“盐皮质激素受体拮抗剂”指部分或完全抑制(拮抗)盐皮质激素受体(MR)激动剂(如合成或天然的醛固酮或皮醛固酮类似物)与MR结合的任何组合物或化合物。

“患者”或“对象”指患有或易于发生可通过给予本发明提供的药物组合物来治疗的病症的活生物体。非限制性示例包括人、其它哺乳动物和其它非哺乳动物。

“治疗上有效量”指可用于治疗或改善所鉴定的疾病或病症或者用于显示可检测的治疗或抑制效果的共轭功能剂(conjugated functional agent)或药物组合物的量。效果可通过本领域已知的任何测定方法检测。

当用于提及本文中一组取代基或“取代基基团”时，术语“一个”，“一种”或“一个(种)”指至少一个(种)。例如，当化合物被“一个”烷基或芳基取代时，该化合物任选地被至少一个烷基和/或至少一个芳基取代，其中各烷基和/或芳基任选地不同。在另一示例中，当化合物被“一个”取代基基团取代时，该化合物被至少一个取代基基团取代，其中各取代基基团任选地不同。

“脂肪肝疾病”指至少部分由异常肝脏脂质沉积造成的疾病或病理病症。脂肪肝疾病包括，例如酒精性脂肪肝疾病，非酒精性脂肪肝疾病和妊娠急性脂肪肝。脂肪肝疾病可以是，例如大泡性脂肪变性或小泡性脂肪变性。

“酒精相关肝脏疾病”或“ARLD”指完全或部分由或归因于过量饮酒引起的肝脏疾病。有四种主要类型的ARLD，酒精性脂肪肝(AFL，脂肪肝疾病的亚型)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，酒精性诱导的肝硬化，和酒精性肝细胞癌。本文所用的“过量饮酒”通常指消耗超过约15-30g/天的乙醇。

饮酒对肝功能或疾病的生理作用取决于调节ARLD的个体敏感性和临床病程的各种遗传和非遗传因子。因此，在某些患者中，ARLD可以在低得多的酒精消耗率下发展，包括至少消耗约12g/天，15g/天，20g/天，25g/天或更多。此外，应理解，在一些患者中，每日酒精消耗量的估计是包括重度饮酒时期和很少或不饮酒时期的平均值。这种平均值可包括超过至少约一周，两周，一个月，三个月，六个月，九个月，一年，2，3或4年或更长的饮酒平均值。在某些情况下，确定肝功能障碍是否是ARLD基于各种因素的参考，包括但不限于：酒精饮料消耗的量和类型(例如啤酒或烈酒)；酒精滥用的持续时间；饮酒行为模式(例如酗酒，空腹饮酒等)；性别；种族；共存疾病病症如代谢综合征或糖尿病，铁超载，或感染肝炎病毒，遗传标志物；家族史；肝酶水平；促炎性细胞因子水平；基因或蛋白质表达分析；或肝组织或细胞的组织病理学检查。

“与过量酒精摄入无关的肝脏疾病”是区别于ARLD的肝脏疾病。因此，这种疾病是指不是由饮酒引起的广泛的肝脏疾病。例如，病毒感染可导致肝炎。由过量饮酒和其它因素引起的肝脏疾病被认为是ARLD而不是与过量酒精摄入无关的肝脏疾病。相比之下，仅仅因过量饮酒加剧的肝脏疾病被认为是与过量酒精摄入无关的肝脏疾病。

“非酒精性脂肪肝疾病”或“NAFLD”指以肝脏中存在脂肪(脂质)并且没有实质性炎症或肝损伤为特征的脂肪肝疾病。NAFLD可发展成为非酒精性脂肪性肝炎，然后成为不可逆转的晚期的肝瘢痕或肝硬化。

“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”指类似于酒精性肝脏疾病但发生在很少饮酒或不饮酒的人群中的脂肪肝疾病。NASH的主要特征是肝脏中的脂肪以及炎症和损伤。NASH可导致肝硬化，其中所述肝脏永久性损伤和瘢痕并且不再能够正常运转。NASH与NAFLD的鉴别诊断可通过肝活检来确定。

本发明所述的化合物的描述受到本领域技术人员已知的化学成键原理的限制。因此，当某一基团可被一种或多种取代基取代时，这类取代基的选择应符合化学成键原理并生成非内在不稳定和/或本领域普通技术人员已知其在环境条件(如水性、中性或生理条件)下可能是不稳定的化合物。

III.脂肪肝疾病

脂肪肝疾病(FLD，也称为脂肪肝)是在肝细胞中积累脂质时发生的普遍的肝脏病症。所述脂质积累引起细胞损伤并使肝易受进一步损伤。脂肪肝疾病的特征在于肝细胞中过量脂肪(脂质)的积聚，通常由肝细胞中脂质的异常保留(即脂肪变性)引起。除脂肪外，蛋白质和水保留在肝细胞中，其可导致肝细胞膨胀。肝脏中脂肪的积累可能归因于肝细胞和脂肪细胞的脂质代谢中以下步骤之一的扰动：(1)增加游离脂肪酸输送到肝脏；(2)肝脏内的游离脂肪酸合成增加；(3)减少脂肪酸的β-氧化；和(4)降低非常低密度脂蛋白的合成或分泌。(Bacon等，Gastroenterology，1994，107，1103-1109)。

FLD可产生于许多来源，包括过量饮酒和代谢紊乱，如与胰岛素抵抗，肥胖和高血压相关的那些疾病。所述疾病在肥胖或患有糖尿病的个体中最普遍。在酒精诱导的脂肪肝疾病(AFL)中脂肪最初在肝细胞中积累，但如果个体继续饮酒，那么该疾病可发展成为导致肝脏膨胀并受损的酒精性肝炎。所述个体还可发展肝硬化或会进而导致肝衰竭的肝瘢痕。重度饮酒者可随时间从AFL发展成为酒精性肝炎至酒精性肝硬化。

非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)是具有AFL的组织学特征但在少量饮酒或不饮酒的个体中的肝脏疾病。像AFL一样，NAFLD是由于肝细胞中脂肪(脂质)的异常保留。其它脂肪肝疾病可在患有其它类型的肝脏疾病的患者中发展，例如但不限于慢性病毒性丙型肝炎(HCV)，慢性病毒性乙型肝炎(HBV)，慢性自身免疫性肝炎(AIH)，糖尿病和威尔逊病(Wilson’s disease)。脂肪肝疾病也可与脂质代谢紊乱引起的适应症相关，如由药物引起的疾病，例如胃肠道疾病(例如肠道细菌生长，胃瘫和肠易激综合征)，化疗，肥胖胃肠道手术，营养不良和加工脂质的蛋白质中的遗传缺陷。

在一些实施方式中，所述脂肪肝疾病是酒精相关肝脏疾病(ARLD)或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。在一些实施方式中，所述酒精相关肝脏疾病是酒精性脂肪肝疾病(AFL)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)或酒精性肝硬化。在一些实施方式中，所述非酒精性脂肪肝疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性肝硬化。

A.酒精相关肝脏疾病(ARLD)

酒精相关肝脏疾病(ARLD)描述了一系列酒精相关的或酒精诱导的肝脏病变，包括酒精诱导的脂肪肝(AFL)，酒精性肝炎，和酒精性肝硬化。事实上所有长期或重度饮酒者都将发展AFL。另外，由于普通人群中复杂因子如肥胖，糖尿病和代谢综合征的高流行率，许多不符合慢性重度饮酒者标准的个体都易发展AFL。

AFL可通过超声诊断。通常，AFL患者的肝呈现“回声”，意思是比通常的成像声波更致密。此外，肝脏通常由于膨胀和大量脂肪的存在而扩大。

AFL也可由一种或多种症状或危险因素(例如肥胖，糖尿病，饮酒行为等)的呈现指示并由此诊断。脂肪肝疾病可呈现如疲劳，肌肉无力，腹部不适，体重减轻和混乱等症状。然而，脂肪肝疾病通常不会呈现明显的身体症状。脂肪肝疾病还可伴有或之后发生肝脏炎症或肝纤维化。脂肪肝患者通常出现升高的血清肝酶水平。此外，几种肝酶的相对水平改变。AFL通常呈现出高于丙氨酸转氨酶(ALT)水平的血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平。这区别于非酒精性脂肪肝疾病，其中ALT高于AST。

AFL有四个主要的致病因素：(1)增加由酒精氧化引起的NADH的产生，促进脂肪酸和甘油三酯合成，并抑制脂肪酸的线粒体β氧化。(2)增加来自脂肪组织的游离脂肪酸和来自肠黏膜的乳糜微粒的肝脏流入。(3)乙醇介导的腺苷单磷酸激活激酶(AMPK)活性的抑制导致脂肪生成增加并通过抑制过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)和刺激固醇调节元件结合蛋白1c(SREBPlc)降低脂解作用。和(4)乙醛破坏线粒体和微管，分别导致NADH氧化降低和VLDL积累。

通过一种或多种临床，实验室或组织病理学症状的改善指示AFL的成功治疗。例如，可通过脂肪肝体积减小指示成功的治疗。例如通过超声检查显示。作为另一个示例，可通过一种或多种临床症状如疲劳，虚弱，或体重减轻停止来指示成功的治疗。作为另一个示例，可通过肝酶水平或相对水平的标准化指示成功的治疗(例如，天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶比率的标准化)。

酒精性肝炎或酒精性脂肪性肝炎(ASH)，是AFL后ARLD的下一个阶段。因此，AFL是ASH发展的先决条件。17％的进入酒精性解毒的患者的肝活检揭示了ASH和40％的酒精性肝硬化患者在肝硬化的肝脏中也有ASH。25％的患者发展具有肝衰竭和肝性脑病的临床症状的过量肝坏疽。在严重的情况下，ASH可引起严重的肝脏损害，增加血流阻力并与不良预后相关。严重ASH的急性致死率在约15％和25％之间。ASH通过肝脏的炎症表征。多种因素可导致ASH的发展，包括：(1)乙醛诱导的毒性作用；(2)活性氧(ROS)产生和由此产生的脂质过氧化；(3)促炎细胞因子上调；和(4)泛素-蛋白酶体通路功能受损。

乙醛结合蛋白质和DNA导致功能改变和蛋白质加成物。这种加成物可通过形成自身抗原激活免疫系统。乙醛也诱导线粒体损伤并损害谷胱甘肽功能，导致氧化应激和细胞凋亡。

ROS的主要来源是CYP2E1依赖性线粒体电子转运，NADH依赖性细胞色素还原酶和黄嘌呤氧化酶。慢性酒精摄入显著上调CYP2E1，加重了ROS产生。此外，CYP2E1将乙醇代谢为乙醛导致蛋白质和DNA的进一步变化。

酒精代谢物和ROS刺激信号通路如由肝固有细胞中的NF-κB，STAT-JAK和JNK介导的信号通路，导致炎症介质如TNFα和CXC趋化因子(例如白细胞介素-8)以及骨桥蛋白的局部合成。酒精滥用还导致结肠微生物群变化并增加肠通透性，导致在Kupffer细胞中通过CD14/TLR4诱导炎症反应的脂多糖的血清水平增加。在酒精性肝脏中产生的炎症环境导致多形核白细胞(PMN)浸润，ROS形成和肝细胞损伤。

ASH组织病理学可通过与坏疽相关的肝细胞的膨胀，增强的细胞凋亡，和经常出现马洛里小体(MDB)产生来表征。ASH组织病理学也可表现为免疫细胞，包括多形核细胞、T-淋巴细胞、或天然杀伤细胞的浸润。MDB与不良预后相关。除了MDB，可在ASH患者的肝细胞中观察到巨型线粒体。ASH的其它组织病理学特征包括大泡性脂肪变性，小泡性脂肪变性，小叶肝炎，核空泡，管状增生，血管周围纤维化，和肝纤维化或肝硬化。

ASH患者可发展进行性纤维化。在ARLD中，所述纤维化组织通常位于中枢周和窦周区域。在晚期阶段，胶原蛋白带明显并且桥接纤维化发展。这种病症在再生结节和肝硬化发展之前发生。尚未完全了解ARLD中纤维化的细胞和分子机制。酒精代谢物如乙醛可直接激活肝星状细胞(HSC)，这是受损肝脏中主要的胶原蛋白生产细胞。HSC也可通过受损的肝细胞，激活的Kupffer细胞和浸润的PMN细胞以旁分泌形式激活。这些细胞释放纤维化介质，如生长因子(TGF-β1，PDGF)，细胞因子(瘦蛋白，血管紧缩素II，白细胞介素-8和TNFα)，可溶介质(一氧化氮)和ROS。重要的是，ROS刺激HSC中的促纤维化胞内信号通路，包括由ERK，PI3K/AKT，和JNK介导的那些。它们还上调TIMP-1并降低金属蛋白酶的作用，因此促进胶原蛋白积累。除HSC以外的细胞也可在ARLD中合成胶原蛋白。它们包括门静脉成纤维细胞和骨髓来源细胞。

ASH可根据广泛的主观和客观的临床发现的强度和频率分成轻度，中度和重度形式。ASH的临床症状包括：非特异性的右上腹痛，恶心和呕吐，常伴有发烧和黄疸。其它症状包括：疲劳，口干，口渴，或食管下部壁扩张静脉出血。其它指示ASH的皮肤症状包括：皮肤上的小红蜘蛛状静脉，非常黑或苍白的皮肤，脚或手发红或瘙痒。ASH患者也可呈现戒酒症状和营养不良迹象。其它临床标志物包括肿大，腹水，厌食，脑病，脾肿大，体重减轻，胰腺炎或胃肠道出血。在严重的情况下，患者可表现出思考，记忆，和情绪问题，昏厥或头晕，或腿脚麻木。

ASH的血清和血液标志物包括天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的活性增加，伴有超过丙氨酸转氨酶的较高水平的天冬氨酸转氨酶。通常，在ASH患者中γ-谷氨酰肽酶也升高。γ-谷氨酰肽酶的升高通常被认为是由于乙醇的酶诱导；然而，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平被认为是肝细胞损伤的标志物。40-80％的患者也呈现出升高的碱性磷酸酶活性水平。在严重的ASH中，β-和γ-球蛋白水平升高。此外，ASH可呈现出伴随着中毒性肉芽和发热的白细胞计数升高。ASH的血液学异常包括巨红细胞增色性贫血和血小板增多。严重的ASH也可呈现出指示原发性肝功能的参数如凝血酶原时间，血清胆红素，或血清白蛋白的降低。在一些情况中，可由尿胆红素的存在检测ASH。

ASH通常通过超声波与AFL无法区分。然而超声波可用于排除肝外胆汁淤积，其可呈现出相似临床症状(例如黄疸)。如果不能通过临床标志物，血清或血液标志物和超声波的检查建立诊断，可进行肝活检。肝活检还可有助于确定疾病的严重程度或指导药理学干预。

通过改善一种或多种临床，实验室或组织病理学症状指示ASH的成功治疗。例如，可通过脂肪肝体积减小指示成功的治疗，例如通过超声检查显示。作为另一个示例，可通过一种或多种临床症状如疲劳，虚弱，或体重减轻停止的减少来指示成功的治疗。作为另一个示例，可通过肝酶水平或相对水平的标准化指示成功的治疗(例如，天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶比率的标准化)。还有另一个示例，可通过β-和γ-球蛋白水平或碱性磷酸酶水平的降低指示成功的治疗。作为另一个示例，原发性肝功能参数如凝血酶原时间，血清或尿胆红素和血清白蛋白的恢复或改善可指示成功的治疗。还有一个示例，可通过改善或停止一种或多种肝肿大，腹水，厌食，脑病，脾肿大，体重减轻，胰腺炎或胃肠道出血指示成功的治疗。

酒精性肝硬化是由炎症，肿胀，纤维化，细胞膜损伤，瘢痕和坏疽标记的严重肝脏疾病的晚期。约10％到约20％之间的重度饮酒者将发展肝硬化。肝硬化的症状包括但不限于黄疸，肝肿大和疼痛和触痛。肝功能恶化的进展速度的任何降低都可指示成功的治疗。

B.非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)

NAFLD包括一系列组织学形式，包括肝脂肪变性，和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其特征在于由于肝细胞破坏引起的肝脏炎症，脂肪变性，坏疽和纤维化。与NAFLD相关的病症多种多样，并且包括2型糖尿病，肥胖，血脂异常，代谢综合征，肝毒性药物，毒素，感染因子或其它外源性原因的治疗。例如，NAFLD可由代谢紊乱如，例如半乳糖血症，糖原储存疾病，高光氨酸尿症和酪氨酸血症以及饮食条件如营养不良，全胃肠外营养，饥饿，和营养过剩引起。在某些情况中，NAFLD与空肠旁路手术相关。其他原因包括暴露于某些化学物质，例如烃溶剂和某些药物，例如胺碘酮，雌激素(例如合成的雌激素)，他莫昔芬，马来酸盐，甲氨蝶呤，核苷类似物和冠心宁。妊娠期间也可发生急性脂肪肝病症。

NAFLD通常遵循良性的，非进行性的临床过程，然而，NASH是潜在的严重病症。多达25％的NASH患者可发展到晚期肝纤维化，肝硬化并经历门静脉高压，肝衰竭和肝癌细胞的并发症(Yeh和Brunt，Am J Clin Pathol，2007，128(5)：837-47)。

NAFLD患者可能无症状，但临床实验室测试可显示升高的肝酶水平。个体可能会出现NAFLD的症状，如腹部不适(例如右上腹部不适)，黑棘皮病，肠蠕动不足，昏迷，便秘，弥散性血管内凝血病，上腹部疼痛，疲劳，不适，肝肿大(触诊时通常具有光滑坚硬的表面)，低血糖，黄疸，脂肪过多症，脂肪萎缩，脂肪营养不良，恶心，神经功能缺损，帕尔默红斑，脂膜炎，脐周疼痛，小肠细菌过度生长，蜘蛛血管瘤，脾肿大，亚急性肝衰竭和呕吐。排除酒精相关脂肪肝疾病的临床评估包括确定是否个体在过去5年内饮酒过量(例如男性＞60g/天和女性＞20g/天)。抗丙型肝炎抗体和血清铜蓝蛋白水平的存在或水平可用于指示个体具有NAFLD。

生物化学和代谢的非入侵性评估可用于诊断NAFLD和NASH。通过使用生物样品如血液，血浆或血清，除血清葡萄糖和胰岛素抵抗性参数外，通常测定高水平的酶如丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(AP)，和/或γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，以及其它肝源蛋白(包括触珠蛋白，总胆红素，α-2-微球蛋白，抵抗素，切割或完整的细胞角蛋白-18)的存在。由于NASH患者ALT活性水平通常升高(Angulo和Lindor，Best Pract Res ClinGastroenterol，2002，16(5)：797-810)，因此该标准通常被认为是评估肝损伤的替代标志物。

在怀疑患有NAFLD或NASH的患者中，血清的基线测试可包括检测或确定ASY，ALT，总胆红素和直接胆红素，和空腹血糖以及脂质组的水平。例如，当已排除其他原因(例如急性肝炎，自身免疫疾病，慢性肝炎，肝硬化，爆发性肝炎，肝细胞癌，转移性癌，右心衰竭，和病毒性肝炎)时，可通过肝酶(例如AST，ALT，GGT和碱性磷酸酶)升高的血清水平(通常中度升高，例如比正常水平升高约2、3、4、5、6、7、9、10、11或12倍)指示脂肪变性。例如，ALT值大于每升血清32，24或56单位或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多倍的正常值可指示与肝脏脂质沉积相关的疾病，或通过ALT值大于每升血清40单位或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多倍的正常值指示。血清转氨酶水平的轻度至中度升高最常见(平均范围100-200IU/L)。AST/ALT的比率通常低于NAFLD患者，但可能高于酒精性肝脏疾病或晚期肝脏疾病或者如果患者发展到肝纤维化的患者。GGT水平还可显著升高，例如由正常健康个体所定义的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多倍的正常值。肝酶水平在大量NAFLD患者中可能正常，因此正常的AST或ALT水平不排除晚期疾病的存在。血清碱性磷酸酶和GGT水平可轻度异常。鉴于超过80％的NAFLD患者具有代谢综合征的一些组分，可以确定空腹胆固醇和甘油三酯，以及空腹葡萄糖和胰岛素的血清水平。白蛋白，胆红素和血小板水平可能是正常的，除非疾病已进展到肝硬化。一些NAFLD患者具有低滴度的自身免疫性抗体(例如抗核和抗平滑肌抗体)和铁蛋白升高(Carey等，“非酒精性脂肪肝疾病”于《新编临床医学》(Current Clinical Medicine)，第2版，Elsevier，纽约)。在一些实施方式中，AST/ALT比率大于1可预测更晚期脂肪肝疾病。

放射学方法例如但不限于X-射线成像，超声检查，计算机断层扫描(CT)，磁共振成像(MRI)，和磁共振光谱可用于检测NAFLD。使用超声检查后，与肾脏相比，肝脏的回声增强可指示肝脏脂肪变性。

可对肝脏样品使用组织病理学方法诊断NASH(例如活组织检查)以评估大泡性脂肪变性，气球状变性，肝细胞坏死，小叶炎症，巨大线粒体，炎症细胞浸润，凋亡和纤维化(参见例如，Brunt和Tiniakos，World J Gastroenterol，2010，16(42)：5286-8296)。肝细胞膨胀的特征在于细胞膨胀和扩大，并且有时出现含马洛里体(Mallory-Denk body)的细胞质变化。肝纤维化还可随时间发展，最初是细胞外周/小静脉周围的纤维化并最终发展为门静脉中枢桥联肝纤维化和肝硬化。

可进行本领域普通技术人员已知的苏木精和伊红(H和E)，马森三色，油红O和免疫组织化学染色和其它标准组织学方法以分析组织和细胞特征。可使用包括一种或多种组织学特征的评分系统(例如NAFLD活性评分)来评估和诊断NAFLD，包括NASH。在一些实施方式中，由NASH临床研究网络病理委员会开发的NASH临床研究网络评分系统(参加例如，Kleiner等，Hepatology，2005，41(6)：1313-1321)可用于预测个体是否患有NAFLD或NASH。临床医生可根据美国胃肠病协会，美国肝病研究协会和美国胃肠病学会(Chalasani等，Gastroenterology，2012，142：1592-1609)发表的《实践指南》诊断或监测NAFLD，包括非酒精性脂肪肝，NASH和NASH相关的肝硬化。

当活检显示至少5％-10％w/w的脂肪沉积物时，个体的肝脏可被认为是脂肪变性(参见例如，Clark等，J.Am.Med.Assoc.，2003，289：3000-3004(2003)和Adams等，Can.Med.Assoc.J.，2005，172：899-905)。包含高达25％(w/w)的脂肪沉积物的肝脏可被认为是轻度脂肪变性且包含大于25％(w/w)的脂肪沉积物的肝脏可被认为是重度脂肪变性。

包含NASH的NAFLD的治疗包括运动，减肥和避免肝毒素或任何可能损害肝脏的物质。在一些实施方式中，治疗包括给予抗氧化剂，细胞保护剂，抗糖尿病药，胰岛素敏花剂(例如二甲双胍)，抗高脂血症药，其它化学物质，如贝特类，噻唑烷二酮类(即罗格列酮或吡格列酮)，双胍类，他汀类药物，大麻素类，和靶向核受体，血管紧张素受体，大麻素受体或HMG-CoA还原酶的其它治疗化合物或分子。

可通过检测疾病的一种或多种症状或临床表现的降低以及用于诊断的任何上述检测来确定治疗的功效。

IV.化合物

在一些实施方式中，本发明提供了式I的化合物：

其中虚线不存在或是键。X是O或S。R¹是环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基，任选被1到3个R^1a基团取代。每个R^1a独立地为H，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_1-6烷氧基，C_1-6烷基-OR^1b，卤素，C_1-6卤代烷基，C_1-6卤代烷氧基，-OR^1b，-NR^1bR^1c，-C(O)R^1b，-C(O)OR^1b，-OC(O)R^1b，-C(O)NR^1bR^1c，-NR^1bC(O)R^1c，-SO₂R^1b，-SO₂NR^1bR^1c，环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基。R^1b和R^1c各自为H或C_1-6烷基。R²是H，C_1-6烷基，C_1-6烷基-OR^1b，C_1-6烷基-NR^1bR^1c或C_1-6亚烷基-杂环烷基。R³是H或C_1-6烷基。Ar是被1-4个R⁴基团任选取代的芳基。每个R⁴是H，C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素，C_1-6卤代烷基或C_1-6卤代烷氧基。L¹是键或C_1-6亚烷基。下标n是0至3的整数。还包括本文所述化合物的盐和异构体。

在一些其它实施方式中，本发明提供了具有式Ia的化合物：

在一些实施方式中，L¹是亚甲基。在一些实施方式中，Ar是苯基。

在一些实施方式中，本发明提供了具有式Ib的化合物：

在一些其它实施方式中，本发明提供了具有式Ic的化合物：

在一些其它实施方式中，本发明提供了具有式Id的化合物：

在一些实施方式中，每个R^1a，R²和R⁴如上对式I所定义。在一些实施方式中，式Id的化合物是其中每个R^1a独立地是H，C_1-6烷基，卤素，或C_1-6卤代烷基；R²是H，或C_1-6烷基；并且每个R⁴是H，C_1-6烷基，卤素，或C_1-6卤代烷基的化合物。

在一些实施方式中，本发明提供其中R¹是芳基或杂芳基的化合物。在其他实施方式中，R¹选自下组：苯基，吡啶基，嘧啶和噻唑。在一些其他实施方式中，各R^1a独立地是氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基，卤素，C_1-6卤代烷基，-NR^1bR^1c或-SO₂R^1b。在其他实施方式中，每个R^1a是C_1-6卤代烷基。在一些其它实施方式中，每个R^1a独立地是H，Me，Et，-OMe，F，Cl，-CF₃，-NMe₂，或-SO₂Me。在一些其它实施方式中，每个R^1a独立地是H，Me，Et，F，Cl，或-CF₃。在其它实施方式中，每个R^1a是-CF₃。在一些其它实施方式中，R²是H或C_1-6烷基。在其它实施方式中，R²是H。

在一些实施方式中，本发明提供了选自下组的化合物：

在一些实施方式中，所述化合物是

在一些其它实施方式中，本发明提供了具有下述式的化合物：

本发明所述的化合物可以盐存在。本发明包括这类盐。适用的盐形式的示例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐、或其包括外消旋混合物的混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，以及诸如谷氨酸的氨基酸盐。这些盐可由本领域技术人员已知的方法制备。还包括碱加成盐如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐，或类似盐。当本发明所述的化合物含有相对碱性的官能团时，可通过将这种化合物的中性形式接触足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)获得酸加成盐。可接受的酸加成盐的示例包括：衍生自无机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括如精氨酸等的氨基酸的盐，和如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的有机酸的盐。本发明的某些特定化合物含有允许该化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。

其它盐包括用于本发明所述的方法中的化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的说明性示例有：无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐，有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐，和季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的其他信息可在Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，宾西马尼亚州伊斯顿，1985中找到，其通过引用纳入本文。

药学上可接受的盐包括根据本文所述化合物上发现的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明化合物含有相对酸性的官能团时，可通过将这种化合物的中性形式接触足量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)获得碱加成盐。药学上可接受碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐，或类似盐。当本发明所述的化合物含有相对碱性的官能团时，可通过将这种化合物的中性形式接触足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)获得酸加成盐。药学上可接受酸加成盐的示例包括：衍生自无机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢、磷酸、磷酸氢、磷酸二氢、硫酸、硫酸氢、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括如精氨酸等的氨基酸的盐，和如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的有机酸的盐(参见例如，Berge等，“Pharmaceutical Salts(药用盐)”，Journal of Pharmaceutical Science，1977年，66，1-19)。本发明的某些特定化合物含有允许该化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。

优选通过使该盐与碱或酸接触，并以常规方式分离母体化合物，从而再生该化合物的中性形式。该化合物的母体形式在某些物理性质如极性溶剂中的溶解度上不同于各种盐形式。

本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化物形式等同于非溶剂化物形式，并涵盖在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多晶或无定形形式存在。通常，在本发明所考虑的应用中所有物理形式是等同的，并且旨在在本发明的范围内。

本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；可按绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸定义为(D)-或(L)-的对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构体形式和单个异构体均包括在本发明的范围内。本发明所述的化合物不包括本领域已知的过于不稳定而无法合成和/或分离的那些。本发明意在包括外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性的(R)-和(S)-或者(D)-和(L)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术解析。

异构体包括具有相同数目和种类的原子并因此具有相同分子量、但在结构排列或原子组态方面有差异的化合物。

本领域技术人员可以明显看出，本发明的某些化合物可以互变异构形式存在，化合物的所有这类互变异构形式都包括在本发明的范围内。互变异构体指平衡存在的两种或更多种结构异构体之一，且其易于从一种异构形式转换成另一种异构形式。

除非另有说明，本文所描述的结构也意在包括该结构的所有立体化学形式，即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明所述的化合物的单个立体化学异构体以及对映体和非对映异构体的混合物在本发明的范围内。

除非另有说明，本发明所述的化合物在组成该化合物的一个或多个原子上也可含有非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素，如例如氘(²H)、氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)，碳-13(¹³C)或碳-14(¹⁴C)放射性标记本发明所述的化合物。无论是否有放射性，本发明所述的化合物的所有同位素变化都包括在本发明的范围内。

除盐形式以外，本发明还提供了前药形式的化合物。本文所述的化合物的前药是在生理条件下易于经历化学变化以提供本发明所述的化合物的那些化合物。此外，前药可通过化学或生物化学方法在体外环境中转化成本发明所述的化合物。例如，当放置在含有合适酶或化学试剂的透皮贴片贮器中时，前药可缓慢转化为本发明所述的化合物。

可通过本领域已知的各种方法制备本发明所述的化合物。参见例如，美国专利号8,685,973，其通过引用全文纳入本文。

V.药物组合物

在一些实施方式中，本发明提供了包含药学上可接受的赋形剂和本发明所述的化合物的药物组合物。

本发明所述的化合物可以各种口服、肠胃外和局部剂型制备和给予。口服制剂包括适于患者摄取的片剂、丸剂、粉末、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆、浆料、悬浮液等。本发明所述的化合物也可通过注射，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给药。另外，本文所述的化合物可通过吸入(例如鼻内)给药。此外，本发明所述的化合物可透皮给药。本发明所述的GR调节剂还可通过眼内、阴道内和直肠内途径(包括栓剂、吹入、粉末剂和气溶胶制剂)给药(例如类固醇吸入剂，参见Rohatagi，J.Clin.Pharmacol.35：1187-1193，1995；Tjwa，Ann.Allergy Asthma Immunol.75：107-111，1995)。因此，本发明还提供包含药学上可接受的运载体或赋形剂，以及式(I)的化合物或式(I)的化合物的药学上可接受的盐的药物组合物。

对于从本发明所述的化合物制备药物组合物，药学上可接受的运载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体载体可以是还能用作稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂、或包封材料的一种或多种物质。关于制剂和给药技术的细节在科学和专利文献中有良好地描述，参见例如最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Maack Publishing Co)(“雷明顿”)。

在粉末剂中，所述载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分混合。在片剂中，活性组分与具有所需粘合性质的载体以合适比例混合并压制为所需的形状和大小。

所述粉末和片剂优选地包含5％或10％至70％的活性化合物。合适的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载体的包封材料的制剂，从而提供其中含有或不含有其它载体的活性成分被载体包围的胶囊，所述载体因此与活性成分相结合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合于口服给药的固体剂型。

合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或脱水山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯或其他作物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。必要时，可添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸，或其盐，例如海藻酸钠。

为糖衣剂芯体提供合适的包衣剂，如浓缩糖溶液，其中还可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入片剂或糖衣剂包衣中，用于产品标示或表征活性化合物的量(即剂量)。本发明的药物制剂还可口服使用，使用例如明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊以及明胶和包衣剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软、密封的胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的GR调节剂。软胶囊中，所述GR调节剂化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，例如含有或不含稳定剂的脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。

对于制备栓剂，首先将低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯或可可油的混合物熔化，并(例如通过搅拌)将所述活性组分均匀分散在其中。然后将熔化均匀的混合物倒入常规尺寸的模具中，使其冷却，从而固化。

液体形式制剂包括溶液、混悬和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可在聚乙二醇水溶液的溶液中配制。

适于口服使用的水溶液可通过将活性组分溶解于水中并如需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适用于口服使用的水性悬液可通过将细碎活性组分分散在具有粘性材料的水中来制备，所述粘性材料例如，天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，例如天然产生的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)。水性混悬液也可含有一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或者对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂，如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。制剂可以调节渗透压。

还包括旨在临使用前转变为用于口服给药的液体形式制剂的固体形式制剂。这种液体形式包括溶液、悬液和乳液。除活性组分外，这些制剂可包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

可通过将本发明的化合物悬浮在植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)或其混合物中来配制油性悬浮剂。油性混悬剂可含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂以提供可口的口服制剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可通过加入抗氧化剂如抗坏血酸保存这些制剂。作为可注射油性载体的实施例，参见Minto，J.Pharmacol.Exp.Ther.281：93-102，1997。本发明的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。所述油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或者它们的混合物。合适的乳化剂包括：天然产生的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶、天然产生的磷脂，例如大豆卵磷脂、源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。所述乳剂也可包含甜味剂和调味剂，如在糖浆剂和酏剂的制剂中。这类制剂也可含有缓和剂、防腐剂、或着色剂。

本发明的化合物可以通过局部途径透皮递送，配制成涂抹棒、溶液剂、悬浮液、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、胶冻剂、涂布剂、粉末剂和气溶胶。

本发明的化合物和组合物还可以微球的形式递送，用于在体内缓释。例如，微球可以通过皮内注射含有药物的微球进行给药，其在皮下缓慢释放(参见Rao，J.Biomater.Sci.Polym.Ed.7：623-645，(1995)；作为可生物降解和可注射的凝胶制剂(参见例如Gao，Pharm.Res.12：857-863，(1995))；或者作为用于口服给药的微球(例如参见Eyles，J.Pharm.Pharmacol.49：669-674，(1997))。透皮和皮内途径均提供几周或几个月的持续递送。

本发明的药物制剂可以盐形式提供并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸，琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是在pH4.5到5.5范围内的1mM-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇中的冻干粉末，在使用前与缓冲液结合。

在另一个实施方式中，本发明的制剂可通过使用与细胞膜融合或内吞的脂质体递送，即通过使用连接至脂质体(或直接连接至寡核苷酸)的配体，其结合细胞的表面膜蛋白受体导致胞吞作用。通过使用脂质体，尤其是在脂质体表面携带有对靶细胞特异性的配体，或者否则优先定向到特定器官的情况下，可以在体内将GR调节剂的递送集中到靶细胞中。(参见例如，Al-Muhammed，J.Microencapsul.13：293-306，1996；Chonn，Curr.Opin.Biotechnol.6：698-708，1995；Ostro，Am.J.Hosp.Pharm.46：1576-1587，1989)。

所述药物制剂优选是单位剂型形式。以这种形式将所述制剂细分成含有适量活性组分的单位剂量。所述单位剂型可以是包装的制剂，所述包装包含不连续量的制剂，如小瓶或安瓿瓶中的包装片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身或其可以是适量的任何这些包装形式。

单位剂量制剂中的活性组分的量可根据活性组分的具体应用和效力而改变或调整为0.1mg-10000mg，更通常1.0mg-1000mg，最通常地10mg-500mg。必要时，所述组合物还可包含其它相容的治疗剂。

所述剂量方案还考虑了本领域众所周知的药代动力学参数，即吸收率，生物利用度，代谢，清除率等(参加，例如，Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58：611-617；Groning(1996)Pharmazie 51：337-341；Fotherby(1996)Contraception 54：59-69；Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84：1144-1146；Rohatagi(1995)Pharmazie 50：610-613；Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24：103-108；最新的雷明顿，同上)。现有技术允许临床医生确定每个患者，GR调节剂和治疗的疾病或病症的剂量方案。

可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次制剂给药。所述制剂应提供足量的活性剂以有效治疗疾病状态。因此，在一个实施方式中，用于口服给予本发明所述的化合物的药物制剂的日剂量是每天每千克体重约0.5mg至约20mg之间。在替代性实施方式中，使用每天每人每千克体重约1mg至约4mg的剂量。可以使用更低的剂量，特别是当药物给予与口服给药相比在解剖学上偏僻的部位，如脑脊髓液(CSF)空间，进入血液，进入体腔或器官内腔。明显较高剂量可用于局部给药。用于制备可肠胃外给予的制剂的实际方法对本领域技术人员是已知的或显而易见的，并在出版物中有更详细的描述，如雷明顿，同上。还参见Nieman，“受体介导的抗痉挛作用(Receptor Mediated Antisteroid Action)”Agarwal等编，De Gruyter，纽约(1987)。

本文所述的化合物可彼此结合使用，与已知的可用于调节糖皮质激素受体的其它活性剂结合使用，或与单独可能无效但可有助于活性剂功效的辅助剂结合使用。

在一些实施方式中，共同给药包括在一种活性剂的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内给予第二活性剂。共同给药包括同时、大约同时(例如在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任意顺序依次施用两种活性剂。在一些实施方式中，共同给药可通过共同配制完成，即制备包含两种活性剂的单一药物组合物。在其它实施方式中，所述活性剂可分开配制。在另一个实施方式中，所述活性剂和/或附加剂可彼此连接或偶联。

在可接受的运载体中制备含有本发明的GR调节剂的药物组合物后，可将其放置于合适的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于本发明的化合物的给药，此标签可包含例如给药的量、频率和方法的说明。

本发明所述的药物组合物可以盐形式提供并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是在pH 4.5到5.5范围内的1mM-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇的冻干粉末，在使用前与缓冲液结合。

在另一个实施方式中，本发明所述的组合物可用于肠胃外给药，如静脉内(IV)给药或给予体腔或器官腔中。用于给药的制剂通常将包含溶解在药学上可接受的运载体中的本发明所述的组合物的溶液。可应用的可接受的载体和溶剂是水和等渗氯化钠的林格氏溶液。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何刺激性小的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂中也同样可使用脂肪酸如油酸。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些制剂可以通过常规公知的灭菌技术灭菌。该制剂可含有模拟生理条件如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂所需的药学上可接受的辅助物质，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中本发明所述的组合物的浓度可广泛变化，并且主要根据所选择的特定给药模式和患者的需要基于流体体积、粘度、体重来选择。对于静脉注射给药，该制剂可以是无菌可注射制剂，如无菌可注射水性或油脂性悬浮液。可利用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，按照已知方法配制该混悬液。所述无菌可注射制剂也可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂如1，3-丁二醇的溶液中的无菌可注射溶液或悬浮液。

VI.治疗脂肪肝疾病的方法

在一些实施方式中，本发明提供了一种通过调节糖皮质激素受体来治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给予治疗有效量的式I的化合物。

在一些其它实施方式中，本发明提供了一种通过拮抗糖皮质激素受体来治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给予有效量的式I的化合物。

在另一个实施方式中，本发明提供了使用本文所述的技术调节核受体活性的方法。在一个示例性实施方式中，所述方法包括使GR和MR接触有效量的本发明的化合物(如式I的化合物)并检测GR和MR活性的变化。

在一个示例性的实施方式中，所述核调节剂是GR和MR活性的拮抗剂。如本文所用的核受体拮抗剂指部分或完全抑制(拮抗)糖皮质激素受体(GR)激动剂(例如皮质醇和合成或天然的皮质醇类似物)与GR的结合，并部分或完全抑制(拮抗)盐皮质激素受体(MR)激动剂(例如醛固酮或天然的醛固酮类似物)与MR的结合，从而抑制与GR和MR与激动剂结合相关的任何生物响应的任何组合物或化合物。在一些实施方式中，所述核受体拮抗剂优先于雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)和/或雄激素受体(AR)与GR和/或MR结合。所述核受体拮抗剂对于GR和/或MR超过ER，PR，和/或AR的偏好可大于至少10∶1。例如，所述偏好可以是至少10∶1，50∶1，100∶1，500∶1或至少1000∶1。在一些实施方式中，所述核受体拮抗剂以至少100∶1优先于ER，PR和/或AR而与GR和/或MR结合。

在一些实施方式中，本发明所述的核受体拮抗剂可与一种或多种治疗结合使用以改善或减少脂肪肝疾病的一种或多种症状。所述核受体可给予正在经历或已经经历生活方式改进如采取减肥方案或热量限制，增加运动，和/或避免酒精或热毒素的脂肪肝疾病患者。所述患者可能经历或已经经历体重减轻手术(减肥手术)。在一些实施方式中，所述特异性糖皮质激素受体拮抗剂与治疗剂例如但不限于丙硫氧嘧啶、英夫利昔单抗、胰岛素、胰高血糖素、钙通道阻滞剂、抗氧化剂(例如维生素E)、S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAMe)、水飞蓟素和己酮可可碱结合给予个体以治疗酒精性相关脂肪肝疾病，包括AFL和ASH。在其它实施方式中，所述特异性糖皮质激素受体拮抗剂与治疗剂例如但不限于5-羟色胺再吸收抑制剂，西布曲明，奥利司他，胰岛素敏化剂(例如噻唑烷二酮，罗格列酮和吡格列酮)，降脂药(例如普罗布考)，抗氧化剂(例如维生素E，己酮可可碱，甜菜碱和N-乙酰半胱氨酸)，保肝疗法(例如熊去氧胆酸)，血管紧张素转化酶抑制剂，血管紧张素受体阻断剂，二甲双胍，单不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸，和其组合一起给予个体以治疗非酒精性脂肪肝疾病，包括NASH。

VII.测试化合物治疗脂肪肝疾病的测定和方法

可以测试本发明所述的化合物的抗糖皮质激素特性。本文显示了测定能够调节糖皮质激素受体活性的化合物的方法。通常，本发明的化合物能够通过结合核受体如GR和MR，或通过阻止GR和MR配体结合相应的GR和MR来调节核受体活性。在一些实施方式中，所述化合物显示很少或没有细胞毒性。

A.结合测定

在一些实施方式中，通过筛选与核受体的配体如地塞米松竞争的分子确定核受体调节剂。本领域的技术人员将认识到有许多方法来进行竞争性结合测定。在一些实施方式中，将所述核受体与标记的核受体配体预孵育并随后与测试化合物接触。竞争性结合测定的这些类型在这里也可被称作结合位移测定。与核受体结合的配体的量的变化(例如减少)指示该分子是潜在的核受体调节剂。或者，可使用标记的测试化合物直接测量测试化合物与核受体的结合。后一类型的测定叫做直接结合测定。

直接结合测定和竞争性结合测定都可以多种不同的形式使用。所述形式可与免疫测定和受体结合测定中使用的那些类似。对于结合测定包括竞争性结合测定和直接结合测定的不同形式的描述，参见《基本和临床免疫》(Basic and Clinical Immunology)第七版(D.Stites and A.Terr编)1991；酶免疫测定(Enzyme Immunoassay)，E.T.Maggio，编，CRC出版社，Boca Raton，Florida(1980)；和“实践和理论的酶免疫测定(Practice and Theoryof Enzyme Immunoassays)”，P.Tiissen，生物化学和分子生物学实验室技术(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)，Elsevier Science PublishersB.V.Amsterdam(1985)，其各自通过引用纳入本文。

例如，在固相竞争性结合测定中，所述样品化合物可与标记的分析物竞争与固体表面结合的结合剂上的特异性结合位点。在该类型的形式中，所述标记的分析物可以是核受体配体且结合剂可以是与固相结合的核受体。或者，所述标记的分析物可以是标记的核受体且结合剂可以是固相核受体配体。与捕获剂结合的标记的分析物的浓度与结合测定中测试化合物的竞争能力呈反比。

或者，可在液相中进行竞争性结合测定，且多种本领域已知技术中的任意一种都可用于将结合的标记的蛋白与未结合的标记的蛋白分离。例如，已经开发了几种用于区分结合配体和过量结合配体或结合测试化合物和过量未结合测试化合物之间的方法。这些包括通过以下方式鉴定结合的复合物：蔗糖梯度、凝胶电泳或凝胶等电聚焦中的沉降，受体-配体复合物与硫酸鱼精蛋白的沉淀或在羟基磷灰石上的吸附，以及通过在葡聚糖包被的活性炭(DCC)上吸附或与固定的抗体结合以除去未结合的化合物或配体。分离后，确定结合的配体或测试化合物的量。

或者，可进行同质结合测定，其中不需要分离步骤。例如，通过使核受体与其配体或测试化合物结合来改变核受体上的标记。标记的核受体中的这一改变导致标记所发射信号的减弱或增强，从而使得结合测定结束时标记的测量允许在结合状态下检测或定量核受体。可使用多种标记。可以几种方法中的任一种标记所述组分。有用的放射性标记包括纳入³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P的那些。有用的非放射性标记包括纳入荧光，化学发光剂，磷光计，电化学发光剂等的那些。荧光剂在用于检测蛋白结构的位移(如荧光各向异性和/或荧光偏振)的分析技术中特别有用。标记的选择取决于所需敏感度、易于与化合物偶联、稳定性需要和可用的仪器。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利号4,391,904，其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。按照本领域已知的方法，标记物可以与测定所需的组分直接或间接偶联。

高通量筛选方法可用于测定大量潜在的调节剂化合物。然后，在如本文所述的一种或多种测定中筛选这类“化合物文库”，以鉴定显示所需特征性活性的文库成员(特别是化学物质或亚类)。化学文库的制备和筛选是本领域技术人员所熟知的。可商购用于制备化学文库的装置(参见例如，357MPS，390MPS，肯塔基州路易斯维尔市的先进化学技术公司(Advanced Chem Tech)，Symphony，马萨诸塞州沃本的瑞宁公司(Rainin)，433A加州福斯特城应用生物系统公司(Applied Biosystems)，9050Plus，马萨诸塞州贝德福德密理博公司(Millipore))。

B.基于细胞的测定

基于细胞的测定涉及含有核受体的全细胞或细胞组分，以测定本发明的化合物与核受体的结合或对核受体活性的调节。根据本发明的方法，可以使用的示例性细胞类型包括例如任何哺乳动物细胞，包括白细胞(如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞(如T细胞和B细胞))、白血病、伯基特淋巴瘤、肿瘤细胞(包括小鼠乳房肿瘤病毒细胞)、内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞、肌肉细胞、乳腺肿瘤细胞、卵巢癌瘤、宫颈鳞状细胞癌、恶性胶质瘤、肝细胞、肾细胞和神经元细胞，以及真菌细胞(包括酵母)。细胞可以是原代细胞或肿瘤细胞或其他类型的永生细胞系。当然，核受体可以在不表达内源性核受体的细胞中表达。

在一些情况下，核受体的片段以及蛋白融合体可用于筛选。当需要与核受体配体竞争结合的分子时，使用的核受体片段是能够结合配体(如地塞米松)的片段。或者，任何核受体的片段可用作鉴定结合核受体的分子的靶标。核受体片段可包括核受体的任何片段，例如至少20，30，40，50个氨基酸至最多含有除核受体的一个氨基酸以外的所有氨基酸的蛋白质。通常，配体结合片段将包含跨膜域和/或大部分或全部的核受体的胞外结构域。

在一些实施方式中，核受体激活引发的信号传递被用于鉴定核受体调节剂。可以许多方式确定核受体的信号传递活性。例如，可以监测下游分子事件以确定信号传递活性。下游事件包括作为刺激核受体受体的结果而发生的那些活性或表现。未改变的细胞中转录激活和拮抗的功能评价中有用的示例性下游事件包括许多应答元件(RE)依赖的基因(PEPCK、酪氨酸转氨酶、芳香酶)的上调。此外，可以使用易于使核受体激活的特定细胞类型，如受糖皮质激素下调的成骨细胞中的骨钙素表达、表现核受体介导的PEPCK和葡萄糖-6-磷酸(G-6-Pase)上调的原代肝细胞。RE介导的基因表达也已经在转染的细胞系中使用公知的RE调节序列(例如在报告基因构建体的上游转染的小鼠乳房肿瘤病毒启动子(MMTV))进行了证实。有用的报告基因构建体的实施例包括萤光素酶(luc)，碱性磷酸酶(ALP)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。可以在细胞系如单核细胞或人皮肤成纤维细胞中进行转录抑制的功能评估。有用的功能试验包括测量转染的细胞系中IL-1β刺激的IL-6表达，胶原酶、环加氧酶-2和多种趋化因子(MCP-1、RANTES)的下调；或NF-kB或AP-1转录因子调控的基因表达的那些试验。

通常，在全细胞试验中测试的化合物也在细胞毒性试验中测试。细胞毒性试验用于确定感知的调节效应在何种程度上取决于非核受体结合的细胞效应。在示例性的实施方式中，所述毒性试验包括将组成性的活性细胞与测试化合物接触。细胞活性的任何降低指示毒性效应。

C.特异性

可对本发明的化合物进行特异性试验(在本文中也称作选择性试验)。通常，特异性试验包括在体外或基于细胞的试验中测试结合核受体的化合物结合非核受体蛋白的程度。可在体外或基于细胞的系统中进行选择性试验，如上文所述。可针对任何合适的非核受体蛋白测试核受体结合，包括抗体、受体、酶等。在示例性的实施方式中，非核受体结合蛋白质是细胞表面受体或核受体。在另一个示例性的实施方式中，所述非核受体蛋白质是类固醇受体，如雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体。

本文中已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，这些术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，应认识到各种修饰都有可能落入本发明要求的范围之内。此外，本发明的任何实施方式的任何一种或多种特征可与本发明的任何其他实施方式的任何一种或多种其他特征结合使用，而不背离本发明的范围。例如，所述核受体调节剂化合物的特征同样适用于本文所述治疗疾病状态的方法和/或药物组合物。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

实施例

实施例1.使用SW1353/MMTV-5细胞的GR报告基因试验

SW1353/MMTV-5是包含内源性糖皮质激素受体的粘附人软骨肉瘤细胞系。用编码位于源自病毒启动子(小鼠乳腺肿瘤病毒的长末端重复体)的糖皮质激素反应元件(GRE)后的萤火虫萤光素酶的质粒(pMAMneo-Luc)转染。用遗传霉素选择稳定的细胞系SW1353/MMTV-5，这是维持该质粒所必需的。因此，该细胞系对糖皮质激素(地塞米松)敏感，导致萤光素酶的表达(EC₅₀ ^dex10nM)。这种地塞米松诱导的反应随时间逐渐消失，并且每三个月开始一个来自早一代的新培养(来自冷冻储存的新培养)。

为了测试如化合物1的GR拮抗剂，在5xEC₅₀ ^dex(50nM)的存在下，将SW1353/MMTV-5与化合物的几种稀释液孵育，并且用在Topcount(Britelite Plus试剂盒，珀金埃尔默公司(Perking Elmer))上检测到的发光测量诱导的萤光素酶表达的抑制。对于每个试验，制备地塞米松的剂量-响应曲线以确定计算来自测试化合物，例如化合物1的IC₅₀的K_i所需的EC₅₀ ^dex。

SW1353/MMTV-5分布在96孔板中并在培养基中(不含遗传霉素)中孵育24小时。在培养基+50nM的地塞米松中加入测试化合物的稀释液并将板再孵育24小时，之后测量萤光素酶的表达。

化合物1命名为(E)-6-(4-苯基环己基)-5-(3-三氟甲基苄基)-1H-嘧啶-2，4-二酮或6-((1r，4r)-4-苯基环己基)-5-(3-(三氟甲基)苄基)嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮，并具有如下所示的化学结构。

化合物1是糖皮质激素受体(GRII)的拮抗剂。在报告基因试验中，化合物1对于GR具有24nM的K_i。

实施例2.使用T47D/MMTV-5细胞的MR和PR报告基因试验

T47D/MMTV-5是包含内源性盐皮质激素受体和孕酮受体(PR)的粘附人乳腺癌细胞系。如对于上述SW1353细胞系所述，用相同的pMAMneo-Luc质粒转染T47D细胞，并用遗传霉素选择稳定系。分离细胞系T47D/MMTV-5，其响应醛固酮(EC₅₀ 100nM)和孕酮(EC₅₀ 10nM)，导致萤光素酶的表达。为了检测MR或PR拮抗剂，在激动剂醛固酮或孕酮的5倍的EC₅₀的存在下将T47D/MMTV-5细胞与化合物的几种稀释液一起孵育。对于每个试验，制备醛固酮和孕酮的剂量响应曲线。

T47D/MMTV-5细胞分布在RPMI640培养基+10％木炭剥离的FCS的96孔板(100μl)中。将所述细胞在CO₂烘箱中孵育24小时。在培养基+激动剂(500nM醛固酮，50nM孕酮)中加入100μl体积的化合物稀释液，并将板再孵育24小时，之后测量萤光素酶的表达。

化合物1是盐皮质激素受体(MR，GRI)的拮抗剂。在报告基因试验中，化合物1对于MR具有148nM的K_i。化合物1在孕酮受体报告基因试验中是失活的。

实施例3.喂养高脂肪饮食的小鼠中肝脏脂质的测定

给予C57B16/J小鼠(每组n＝8)高脂肪饮食(60％脂肪)三周，然后处死。收集肝脏并称重。制备肝脏切片并通过油红O染色分析脂质水平(图1和图3)。一组小鼠接受混合在食物中的化合物1(60mg/kg/天)，而另一组小鼠接受混合在食物中的载剂。所述化合物1喂养小鼠的肝脏没有或有低水平的脂滴(图2A)，而对照小鼠具有更多的脂滴(图2B)。另外一组接受食物中的米非司酮(RU-486；60mg/kg/天)。化合物1具有GR拮抗剂活性和一些MR拮抗剂活性。所述数据显示了与对照相比，米非司酮引起的脂肪肝增加。化合物1具有相反的作用并且不诱导脂肪肝。

在单独的实验中(图4)，通过均质化肝脏并提取甘油三酯来确定喂养高脂肪饮食(60％脂肪)然后处死的小鼠的肝脏中脂肪的积累。该实验包括5组小鼠：

第1组(“CHOW”)：正常饮食6周；

第2组(“HF-3wks”)：高脂肪饮食3周；

第3组(“HF-6wks”)：高脂肪饮食6周；

第4组(“HF+118335-6wks”)：高脂肪饮食和化合物1持续6周；

第5组(“HF-118335 rev”)：高脂肪饮食3周后进行高脂肪饮食和化合物1持续3周。

实施例4.GR蛋白质：蛋白质相互作用试验

蛋白质：蛋白质相互作用试验用来测定测试化合物作为糖皮质激素受体和/或盐皮质激素受体的拮抗剂的能力。这些试验利用了DiscoveRx Corp(Fremont，CA)提供的商业试验平台。DiscoveRx技术基于使用发光底物的β-半乳糖苷酶片段互补。简而言之，中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)已经工程改造以一起表达人重组GR或MR与称为PGC1α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α)的类固醇反应性共激活蛋白(SRCP)。该试验测定GR或MR激活的净结果，即细胞质中的核易位和细胞核中GR或MR与共激活剂PGC1α的相互作用。该试验可以以激动剂和拮抗剂模式配置。

将细胞(100μl)接种到96孔板中并置于37℃，5％CO₂的培养箱中24小时。在从培养箱中取出细胞后，在每个孔中加入5μl测试化合物或载剂，并将板在37℃，5％CO₂下孵育1小时。在所述板的每个孔中加入地塞米松(5μl的792nM溶液)或载剂并将板在37℃，5％CO₂下孵育6小时。每个孔添加55μl检测剂，并且将板在黑暗中室温下孵育而不混合。使用

读板器读取板的发光(3小时读数)。发光值表示为36nM地塞米松的抑制百分比(％抑制)，并且使用Cheng-Prusoff方程从实验测定的IC₅₀值计算K_i值。在该试验中测定了化合物1的K_i为118nM。

实施例5.MR蛋白质：蛋白质相互作用试验

将细胞(100μl)接种到96孔板中并置于37℃，5％CO₂的培养箱中24小时。在从培养箱中取出细胞后，在每个孔中加入5ul测试化合物或载剂，并将板在37℃，5％CO₂下孵育1小时。在所述板的每个孔中加入醛固酮(5μl的88nM溶液)或载剂，并将板在37℃，5％CO₂下孵育6小时。每个孔添加55μl检测剂，并且将板在黑暗中室温下孵育而不混合。使用

(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司)读板器读取板的发光(3小时读数)。发光值表示为4nM醛固酮的抑制百分比(％抑制)，并且使用Cheng-Prusoff方程从实验测定的IC₅₀值计算K_i值。在该试验中测定了化合物1的K_i为125nM。

虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的各参考文献通过引用全文纳入本文，就如同各参考文献单独通过引用纳入本文。当本申请和本文提供的参考之间存在冲突时，以本申请为准。

Claims (2)

1.

在制备用于治疗非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的药物组合物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述非酒精性脂肪肝疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性肝硬化。

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