CN106967758A - 一种丁二酸和丙酸的提取方法 - Google Patents
一种丁二酸和丙酸的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种丁二酸和丙酸的提取方法,所述方法包括如下步骤:(1)发酵液的预处理:将发酵液收集进行酸化处理;(2)丁二酸的吸附:将步骤(1)酸化后的发酵液过量上样到装填了阴离子交换树脂的第一层析单元中,收集穿柱液;(3)丙酸的吸附:将步骤(2)收集的穿柱液上样到装填了阴离子交换树脂的第二层析单元中;(4)洗脱:采用碱和酸对第一层析单元和第二层析单元进行洗脱,得到所述丁二酸钠和丙酸;其中,步骤(2)所述过量上样为相对于阴离子交换树脂的丁二酸的饱和吸附量多。本发明方法通过采用“两段式”层析技术将发酵液中的丁二酸分离出来,实现了丁二酸(盐)和丙酸(盐)的联产,进一步提高产品中丙酸(盐)的纯度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,涉及一种丁二酸和丙酸的提取方法,具体涉及一种从发酵液中提取丁二酸和丙酸的方法。
背景技术
丙酸及其盐如丙酸钙、丙酸锌、丙酸钾能有效地抑制霉菌、嗜氧芽孢杆菌,而且对人体基本无害,广泛应用在谷物、饲料和食品中,是良好的防腐保鲜剂。目前,丙酸的工业生产方式主要为化学合成法,但在当前全世界面临环境污染、能源短缺的情况下,微生物发酵法生产丙酸已引起人们的广泛关注。特别地,生物法生产的丙酸钙,简称生物法丙酸钙,是世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)批准使用的一种新型、安全、高效的食品防霉剂。
丙酸杆菌属菌株(如费氏丙酸杆菌,丙酸丙酸杆菌等)可代谢合成丙酸,但是研究发现,发酵液中丙酸的不断积累会对菌体细胞生长及丙酸自身代谢产生反馈抑制作用,进而降低了丙酸产量。为了解除丙酸对发酵的反馈抑制作用,研究人员对生产菌株进行了基因改造(Biotechnology and Bioengineering,2009,104:766-773;MetabolicEngineering,2015,27:46-56),研究了丙酸的反馈抑制机理(Journal of Biotechnology,2013,167:56-63),并采取适当的调控策略(Bioresource Technology,2012,105:128-133;Bioresource Technology,2013,135:504-512)来提高批次发酵过程中丙酸的产量。此外,研究还发现,在发酵过程中采用过程工程手段及时移除丙酸,可有效减缓或消除其对发酵的反馈抑制作用,提高发酵效率。Goswami构建了一种原位细胞截留反应器,通过不锈钢旋转过滤器将菌体细胞截留,使含高浓度丙酸的发酵清液滤过,从而实现了菌体细胞与丙酸的分离(Applied Microbiology and Biotechnology,2001,56:676-680)。南京工业大学欧阳平凯院士构建了一种多孔纤维床反应器将发酵过程中产生的丙酸及时分离出来,提高了发酵产率(Journal of Biotechnology,2012,164:202-210)。浙江大学徐志南教授通过将菌体细胞固定化在纤维床反应器上,采用流加葡萄糖的方式,提高了发酵效率(Bioresource Technology,2012,112:248-253)。中科院过程所王云山研究员将扩张床层析技术与发酵过程耦合起来,建立了一种以扩张床原位吸附为特征的新型发酵过程,提高了丙酸产量(Bioresource Technology,2012,104:652-659)。
尽管如此,目前市场上生物法丙酸钙的含量仅有40~50%,究其原因主要是因为缺乏有效的下游提取工艺,导致产品中含有大量的丁二酸、乳酸、乙酸等杂质。“过程工程学报,2016,16(3):86-91”中科院过程所王云山研究员提出,采用离子交换层析技术提取发酵液中的丙酸,并初步建立了其提取工艺,有效提高了产品中丙酸的含量,但其无法同时分离和提取丁二酸,导致丙酸中含有丁二酸,且丙酸的含量不高。
对于丙酸杆菌生产发酵丁二酸和丙酸,如何将丁二酸和丙酸提取分离出来成为丙酸杆菌生产发酵的一个关键问题。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明旨在提供一种丁二酸和丙酸的提取方法,所述方法通过采用“两段式”层析技术将发酵液中的丁二酸分离出来,不仅提高了生物法丙酸(盐)的品质,还实现了丁二酸(盐)的联产,进一步提高产品中丙酸(盐)的纯度。
为达此目的,本发明采用了以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种丁二酸和丙酸的提取方法,包括如下步骤:
(1)发酵液的预处理:将发酵液收集进行酸化处理;
(2)丁二酸的吸附:将步骤(1)酸化后的发酵液过量上样到装填了阴离子交换树脂的第一层析单元中,收集穿柱液;
(3)丙酸的吸附:将步骤(2)收集的穿柱液上样到装填了阴离子交换树脂的第二层析单元中;
(4)洗脱:采用碱和酸对第一层析单元和第二层析单元进行洗脱,得到所述丁二酸钠和丙酸。
本发明中,通过两段式层析,通过控制上样量将丁二酸从发酵液中分离出来,实现了丁二酸和丙酸的联产分离。
根据本发明,步骤(1)所述的酸化处理具体包括:采用H型的阳离子交换树脂对所述发酵液进行上样,所述阳离子交换树脂上的H被交换下来,使得发酵液穿柱后的pH值降到3以下,收集穿柱液。
根据本发明,所述H型的阳离子交换树脂为能够将发酵液酸化的阳离子树脂都是可行的,本领域技术人员可以根据需要进行选择,在此不做特殊限定,本发明选用001×7H型阳离子交换树脂。
发明人发现,采用001×7H型阳离子交换树脂将发酵液进行酸化处理,但酸化处理的发酵液pH小于3以下时,步骤(2)和步骤(3)对发酵液的处理量大大提高,所述阳离子交换树脂对发酵液的处理量可达到3BV,发酵清液经酸化后,ZGD630阴离子交换树脂对丁二酸和丙酸的吸附量较初始发酵清液(pH6.8)的吸附载量提高了71.74%和101.35%。
本发明中,所述BV为柱床体积(bed volume),即树脂柱内装载树脂的体积,示例性地,3BV指的是树脂可处理自身体积3倍的发酵液。
本发明中,发明人发现阴离子树脂在吸附发酵液的时候,优先选择吸附丁二酸,当丁二酸吸附完全以后才转而吸附丙酸、乙酸,步骤(2)所述过量上样为相对于阴离子交换树脂的丁二酸的饱和吸附量多,所述过量上样是为了保证第一层析单元吸附的全是丁二酸盐而没有丙酸。
本发明中,第一层析单元的穿柱液可分为全吸附、部分吸附和全穿柱三个阶段,对于丙酸和丁二酸浓度分别为38-42g/L和18-20g/L的发酵液,所述上样体积为0-2BV为全吸附,全吸附的穿柱液不含丁二酸、丙酸和乙酸,所述上样体积为2-6.5BV为部分吸附,部分吸附的穿柱液不含丁二酸,只含有丙酸和乙酸,所述上样体积为6.5BV以上为全穿柱,全穿柱的穿柱液含丁二酸、丙酸和乙酸;所述过量上样为上样体积不小于6.5BV,例如可以是6.5BV、6.8BV、7BV、7.2BV、7.5BV、7.8BV、8BV、8.2BV、8.5BV、8.8BV、9BV、9.5BV、9.8BV、10BV、10.2BV、10.5BV、10.8BV、11BV、11.2BV、11.5BV、11.8BV、12BV、12.5BV、13BV、13.5BV、14BV、14.5BV或15BV,优选为10-12BV。
根据本发明,所述第一层析单元的上样量为不小于6.5BV,例如可以是6.5BV、6.8BV、7BV、7.2BV、7.5BV、7.8BV、8BV、8.2BV、8.5BV、8.8BV、9BV、9.5BV、9.8BV、10BV、10.2BV、10.5BV、10.8BV、11BV、11.2BV、11.5BV、11.8BV、12BV、12.5BV、13BV、13.5BV、14BV、14.5BV或15BV,优选为10-12BV。
根据本发明,所述上样速度直接影响着料液在层析柱内的停留时间,当停留时间低于一定值时,基团来不及充分交换,会导致吸附载量下降,即处理量下降,步骤(2)所述上样的速度为1-5BV/h,例如可以是1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h或5BV/h,优选为2-4BV/h,进一步优选为3BV/h。
根据本发明,所述第一层析单元包括1-5个层析柱,优选为1-3个层析柱。
根据本发明,所述第二层析单元的上样量为不大于3BV,例如可以是0.5BV、0.6BV、0.7BV、0.8BV、0.9BV、1BV、1.2BV、1.5BV、1.6BV、1.8BV、2BV、2.3BV、2.5BV、2.8BV或3BV,优选为2-3BV。
根据本发明,所述上样速度直接影响着料液在层析柱内的停留时间,当停留时间低于一定值时,基团来不及充分交换,会导致吸附载量下降,即处理量下降,步骤(3)所述上样的速度为1-5BV/h,例如可以是1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h或5BV/h,优选为2-4BV/h,进一步优选为3BV/h。
根据本发明,所述第二层析单元包括1-5个层析柱,优选为1-3个层析柱。
根据本发明,所述第一层析单元和第二层析单元的阴离子交换树脂独立的选自大孔型或凝胶型的树脂,优选为ZGD630阴离子交换树脂。
优选地,步骤(4)所述的碱为强碱,优选为NaOH和/或KOH,优选为NaOH。
优选地,所述NaOH的浓度为1-5mol/L,例如可以是1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L或5mol/L,优选为2-4mol/L,进一步优选为3mol/L。
优选地,所述NaOH洗脱的速度为0.1-1BV/h,例如可以是0.1BV/h、0.2BV/h、0.3BV/h、0.35BV/h、0.4BV/h、0.45BV/h、0.5BV/h、0.55BV/h、0.6BV/h、0.7BV/h、0.8BV/h、0.9BV/h或1BV/h,优选为0.3-0.6BV/h,进一步优选为0.45BV/h。
优选地,步骤(4)所述的酸为强酸,优选为H2SO4和/或HCl,优选为H2SO4。
优选地,所述H2SO4的浓度为1-5mol/L,例如可以是1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L或5mol/L,优选为2-4mol/L,进一步优选为3mol/L。
优选地,所述H2SO4洗脱的速度为0.1-1BV/h,例如可以是0.1BV/h、0.2BV/h、0.3BV/h、0.4BV/h、0.5BV/h、0.6BV/h、0.7BV/h、0.8BV/h、0.9BV/h或1BV/h,优选为0.5-0.8BV/h,进一步优选为0.6BV/h。
根据本发明,所述发酵液为采用丙酸杆菌发酵培养后的发酵液。
本发明中,所述丙酸杆菌包括费氏丙酸杆菌、产丙酸丙酸杆菌、谢氏丙酸杆菌等,本发明优选的是产丙酸丙酸杆菌,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CMCC 1.2230。
根据本发明,所述发酵培养具体包括:将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养,再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养,再转接至发酵罐中发酵。
本发明中,所述丙酸杆菌保存在甘油管或斜面培养基中,所述甘油管或斜面培养基只要能够用于保存丙酸杆菌的都是可行的,在此不做特殊限定,本领域技术人员可以根据需要自行选择,示例性地,所述斜面培养基包括如下组分:20g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、2g/L硫酸铵、2g/L碳酸钙和15g/L琼脂。
优选地,所述转接的接种量为5-20%,例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%,优选为10%。
根据本发明,所述一级种子培养基和二级摇瓶种子培养基的培养基成分是相同的,所述种子培养基包括如下组分:30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾,优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾。
优选地,所述种子培养基的pH为6-7.5,例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5,优选为6.8-7.0。
根据本发明,所述丙酸杆菌在一级种子培养基和在二级摇瓶种子培养基中的培养条件是相同的。
优选地,所述静置培养的温度为25-35℃,例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃,优选为30℃。
优选地,所述静置培养的时间为40-55h,例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h或55h,优选为48h。
优选地,所述发酵罐中的发酵培养基包括如下组分:55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和磷酸二氢钾4-5g/L,优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾。
所述葡萄糖例如可以是55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L或65g/L;所述玉米浆例如可以是35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L或45g/L;所述磷酸二氢钾例如可以是4g/L、4.1g/L、4.2g/L、4.3g/L、4.4g/L、4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L或5g/L。
优选地,所述发酵罐中的发酵培养基的pH为6-7.5,例如可以是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5,优选为6.8-7.0。
本发明中,所述发酵培养基的pH通过流加弱碱来维持pH的恒定,只要能够调节pH的弱碱都是可行的,在此不做特殊限定,本领域技术人员可以根据需要自行选择,本发明中采用氨水进行调节pH。
根据本发明,所述发酵培养中的葡萄糖浓度不低于10g/L。
本发明中随着发酵的进行,葡萄糖不断消耗,通过实时监测葡萄糖浓度,补加葡萄糖来使得葡萄糖的浓度不低于10g/L,所述补加葡萄糖的方式为本领域的常规技术。
优选地,所述发酵培养的培养温度为25-35℃,例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃,优选为30℃。
优选地,所述发酵培养的搅拌速率为40-60r/min,例如可以是40r/min、41r/min、42r/min、43r/min、44r/min、45r/min、46r/min、47r/min、48r/min、49r/min、50r/min、51r/min、52r/min、53r/min、54r/min、55r/min、56r/min、57r/min、58r/min、59r/min或60r/min,优选为50r/min。
作为优选技术方案,所述提取丁二酸和丙酸的提取方法包括如下步骤:
(1’)菌种活化:将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养,再按接种量为5-20%转接至二级摇瓶种子培养基中25-35℃静置培养40-55h,所述种子培养基包括如下组分:30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾,所述种子培养基的pH为6-7.5;
(2’)发酵:将活化后的丙酸杆菌按接种量为5-20%转接到发酵培养基中25-35℃、40-60r/min进行发酵培养,发酵过程中,当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖,同时用氨水调节pH为6-7.5,所述发酵培养基包括如下组分:55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾,所述发酵培养基的pH为6-7.5;
(3’)发酵液的预处理:将发酵液收集采用001×7H型阳离子交换树脂进行酸化处理;
(4’)丁二酸的吸附:将步骤(3’)酸化后的发酵液过量上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第一层析单元中,所述第一层析单元的上样量为不小于6.5BV,所述上样的速度为1-5BV/h,收集穿柱液;
(5’)丙酸的吸附:将步骤(4’)收集的穿柱液上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第二层析单元中,所述第二层析单元的上样量为不大于3BV,所述上样的速度为1-5BV/h;
(6’)洗脱:采用1-5mol/L NaOH和1-5mol/L H2SO4对第一层析单元和第二层析单元进行洗脱,所述NaOH和H2SO4洗脱的速度独立地选自0.1-1BV/h得到所述丁二酸钠和丙酸。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明方法提出了“两段式”层析方式来吸附分离发酵液中的丁二酸和丙酸,不仅使丙酸的纯度提高至70%以上(相比于现有的丙酸产品纯度,即40-50%,提高了40%以上),还实现了丁二酸和丙酸的联产,为微生物发酵生产丙酸和丁二酸提供了新的思路;
(2)本发明方法的“两段式”层析,可以与发酵过程耦合起来,实现了半连续发酵,提高了发酵的效率,提高了发酵过程的经济性,且方法操作简单,便于工业化放大生产。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
本发明所列举的实施例,以费氏丙酸杆菌为实验菌株,但同样适用于产酸丙酸杆菌,谢氏丙酸杆菌等菌株;此外,在发酵后提取工艺中,树脂筛选的一个基本原则就是高的吸附载量,本发明所列举的实施例,以001×7H型阳离子交换树脂和ZGD630阴离子交换树脂为实验材料。
实施例1
所述提取丁二酸和丙酸的提取方法包括如下步骤:
(1)菌种活化:将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养,再按接种量为10%转接至二级摇瓶种子培养基中30℃静置培养48h,所述种子培养基包括如下组分:35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾,所述种子培养基的pH为6.8-7;
(2)发酵:将活化后的丙酸杆菌按接种量为10%转接到发酵培养基中30℃、50r/min进行发酵培养,发酵过程中,当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖,同时用氨水调节pH为6.8-7.2,所述发酵培养基包括如下组分:60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾,所述发酵培养基的pH为6.8-7;
当发酵至168h时,发酵结束,OD600为52.3,丙酸浓度为34.33g/L,丁二酸浓度为20.22g/L,乙酸浓度是15.90g/L,发酵液离心分离后,收集上清液备用。
(3)发酵液的预处理:将发酵液收集采用001×7H型阳离子交换树脂进行酸化处理,以3BV/h的速度上样至层析柱内进行酸化处理直到发酵液pH低于3;
ZGD630阴离子交换树脂对丁二酸和丙酸的静态吸附载量分别为108.2mg/g和89.4mg/g;
(4)丁二酸的吸附:将步骤(3)酸化后的发酵液过量上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第一层析单元中,所述第一层析单元包含有一个层析柱,所述层析柱中填充了0.8L的ZGD630阴离子交换树脂,所述过量上样的上样体积为10BV,所述上样的速度为3BV/h,收集穿柱液;
(5)丙酸的吸附:将步骤(4)收集的穿柱液上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第二层析单元中,所述第二层析单元包含有一个层析柱,所述层析柱中填充了1.2L的ZGD630阴离子交换树脂,所述上样的上样体积为3BV,所述上样的速度为3BV/h;
(6)洗脱:采用3mol/L NaOH和对第一层析单元进行洗脱,所述NaOH的洗脱速度为0.45BV/h,此时,丁二酸的洗脱效果最佳,为91.28g/L;
采用4mol/L H2SO4对第二层析单元进行洗脱,H2SO4洗脱的速度为0.6BV/h,此时,丙酸的洗脱效果最佳,为97.02g/L。
实施例2
相比于实施例1,除了步骤(4)和步骤(5)的上样速度为1BV/h之外,其他条件与实施例1相同。
尽管阴离子树脂的处理量不变,洗脱后的丁二酸浓度为90.24g/L,洗脱后的丙酸浓度为93.14g/L;但上样速度减慢,增加了操作时间。
实施例3
相比于实施例1,除了步骤(4)和步骤(5)的上样速度为5BV/h之外,其他条件与实施例1相同。
阴离子树脂的处理量下降,洗脱后的丁二酸浓度为78.52g/L,洗脱后的丙酸浓度为80.17g/L。
实施例4
相比于实施例1,除了步骤(4)中第一层析单元的上样体积为6.5BV之外,其他条件与实施例1相同。
阴离子树脂的处理量下降,洗脱后的丁二酸浓度为61.32g/L,洗脱后的丙酸浓度为92.56g/L。
实施例5
相比于实施例1,除了步骤(5)中第二层析单元的上样体积为2BV之外,其他条件与实施例1相同。
阴离子树脂的处理量下降,洗脱后的丁二酸浓度为92.26g/L,洗脱后的丙酸浓度为54.82g/L。
实施例6
相比于实施例1,除了步骤(6)的NaOH的浓度为1mol/L,NaOH洗脱的速度为1BV/h,H2SO4的浓度为1mol/L,H2SO4洗脱的速度为1BV/h,其他条件与实施例1相同。
洗脱后的丁二酸浓度为86.23g/L,洗脱后的丙酸浓度为88.16g/L。
实施例7
相比于实施例1,除了步骤(6)的NaOH的浓度为5mol/L,NaOH洗脱的速度为0.1BV/h,H2SO4的浓度为5mol/L,H2SO4洗脱的速度为0.1BV/h,其他条件与实施例1相同。
洗脱后的丁二酸浓度为88.74g/L,洗脱后的丙酸浓度为90.55g/L。
对比例1
相比于实施例1,除了没有步骤(3)中的发酵液预处理之外,其他条件与实施例1相同。
ZGD630阴离子交换树脂对丁二酸和丙酸的静态吸附载量分别为63mg/g和44.4mg/g,洗脱后的丁二酸浓度为55.12g/L,洗脱后的丙酸浓度为58.34g/L。
对比例2
相比于实施例1,除了没有步骤(4)中丁二酸的吸附分离,将酸化后的发酵液直接上样至第二层析单元之外,其他条件与实施例1相同。
ZGD630阴离子交换树脂对丁二酸和丙酸的静态吸附载量分别为82.4mg/g和61.2mg/g,洗脱液为丁二酸和丙酸的混合液,其中丁二酸浓度为42.12g/L,洗脱后的丙酸浓度为41.92g/L。
对比例3
相比于实施例1,除了步骤(4)中第一层析单元的上样体积为4BV之外,其他条件与实施例1相同。
阴离子树脂的处理量下降,洗脱后的丁二酸浓度为56.26g/L,洗脱后的丙酸浓度为91.39g/L。
对比例4
相比于实施例1,除了步骤(5)中第二层析单元的上样体积为4BV之外,其他条件与实施例1相同。
该实施例中,尽管阴离子树脂的处理量不变,洗脱后的丁二酸浓度仍为91.39g/L,洗脱后的丙酸浓度为89.64g/L;但由于过量上样,导致丙酸部分穿柱,收率下降了25-30%。
综上所述,从实施例1与实施例2-3的实验结果可以看出,随着上样速度的改变后,所述洗脱后的丁二酸和丙酸的浓度随之下降;从实施例1与实施例4-5的实验结果可以看出,随着第一层析单元和第二层析单元的上样体积改变后,所述洗脱后的丁二酸和丙酸的浓度随之下降;从实施例1与实施例6-7的实验结果可以看出,随着洗脱液NaOH和H2SO4的浓度和洗脱速度的变化,所述洗脱后的丁二酸和丙酸的浓度随之下降。
从实施例1与对比例1-4的实验结果可以看出,没有对发酵液进行预处理,洗脱后的丁二酸和丙酸的浓度会降低了近40%;没有进行丁二酸的吸附,所述洗脱后的丙酸和丁二酸的浓度下降了近50%;从对比例3-4可以看出,上样体积不在本申请限定的范围内,或导致洗脱后的丙酸和丁二酸浓度下降了近40%,或导致丙酸的收率降低了25-30%。可见,本发明方法采用两段式层析,提高了发酵效率,实现了丁二酸和丙酸联产,提高了分离后丁二酸和丙酸的浓度。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种丁二酸和丙酸的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)发酵液的预处理:将发酵液收集进行酸化处理;
(2)丁二酸的吸附:将步骤(1)酸化后的发酵液过量上样到装填了阴离子交换树脂的第一层析单元中,收集穿柱液;
(3)丙酸的吸附:将步骤(2)收集的穿柱液上样到装填了阴离子交换树脂的第二层析单元中;
(4)洗脱:采用碱和酸对第一层析单元和第二层析单元进行洗脱,得到所述丁二酸钠和丙酸;
其中,步骤(2)所述过量上样为相对于阴离子交换树脂的丁二酸的饱和吸附量多。
2.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(1)所述的酸化处理具体包括:采用H型的阳离子交换树脂对所述发酵液进行上样;
优选地,所述发酵液酸化后的pH不大于3。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法,其特征在于,所述第一层析单元的上样量为不小于6.5BV,优选为10-12BV;
优选地,步骤(2)所述上样的速度为1-5BV/h,优选为2-4BV/h,进一步优选为3BV/h;
优选地,所述第一层析单元包括1-5个层析柱,优选为1-3个层析柱;
优选地,所述第二层析单元的上样量为不大于3BV,优选为2-3BV。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的提取方法,其特征在于,步骤(3)所述上样的速度为1-5BV/h,优选为2-4BV/h,进一步优选为3BV/h;
优选地,所述第二层析单元包括1-5个层析柱,优选为1-3个层析柱;
优选地,所述第一层析单元和第二层析单元的阴离子交换树脂独立的选自大孔型或凝胶型的树脂,优选为ZGD630阴离子交换树脂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法,其特征在于,步骤(4)所述的碱为强碱,优选为NaOH和/或KOH,优选为NaOH;
优选地,所述NaOH的浓度为1-5mol/L,优选为2-4mol/L,进一步优选为3mol/L;
优选地,所述NaOH洗脱的速度为0.1-1BV/h,优选为0.3-0.6BV/h,进一步优选为0.45BV/h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的提取方法,其特征在于,步骤(4)所述的酸为强酸,优选为H2SO4和/或HCl,优选为H2SO4;
优选地,所述H2SO4的浓度为1-5mol/L,优选为2-4mol/L,进一步优选为3mol/L;
优选地,所述H2SO4洗脱的速度为0.1-1BV/h,优选为0.5-0.8BV/h,进一步优选为0.6BV/h。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,所述发酵液为采用丙酸杆菌发酵培养后的发酵液;
优选地,所述发酵培养具体包括:将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养,再转接至二级摇瓶种子培养基中静置培养,再转接至发酵罐中发酵;
优选地,所述转接的接种量为5-20%,优选为10%;
优选地,所述一级种子培养基和二级摇瓶种子培养基的培养基成分是相同的,所述种子培养基包括如下组分:30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾,优选为35g/L葡萄糖、21g/L玉米浆、5g/L硫酸铵和4g/L磷酸二氢钾;
优选地,所述种子培养基的pH为6-7.5,优选为6.8-7.0;
优选地,所述静置培养的温度为25-35℃,优选为30℃;
优选地,所述静置培养的时间为40-55h,优选为48h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的提取方法,其特征在于,所述发酵罐中的发酵培养基包括如下组分:55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾,优选为60g/L葡萄糖、41g/L玉米浆和4.6g/L磷酸二氢钾;
优选地,所述发酵罐中的发酵培养基的pH为6-7.5,优选为6.8-7.0;
优选地,所述发酵罐中的发酵培养中的葡萄糖浓度不低于10g/L;
优选地,所述发酵培养的培养温度为25-35℃,优选为30℃;
优选地,所述发酵培养的搅拌速率为40-60r/min,优选为50r/min。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1’)菌种活化:将保存的丙酸杆菌接种于一级种子培养基中静置培养,再按接种量为5-20%转接至二级摇瓶种子培养基中25-35℃静置培养40-55h,所述种子培养基包括如下组分:30-40g/L葡萄糖、15-25g/L玉米浆、1-10g/L硫酸铵和1-10g/L磷酸二氢钾,所述种子培养基的pH为6-7.5;
(2’)发酵:将活化后的丙酸杆菌按接种量为5-20%转接到发酵培养基中25-35℃、40-60r/min进行发酵培养,发酵过程中,当葡萄糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖,同时用氨水调节pH为6-7.5,所述发酵培养基包括如下组分:55-65g/L葡萄糖、35-45g/L玉米浆和4-5g/L磷酸二氢钾,所述发酵培养基的pH为6-7.5;
(3’)发酵液的预处理:将发酵液收集采用001×7H型阳离子交换树脂进行酸化处理;
(4’)丁二酸的吸附:将步骤(3’)酸化后的发酵液过量上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第一层析单元中,所述第一层析单元的上样量为不小于6.5BV,所述上样的速度为1-5BV/h,收集穿柱液;
(5’)丙酸的吸附:将步骤(4’)收集的穿柱液上样到装填了ZGD630阴离子交换树脂的第二层析单元中,所述第二层析单元的上样量为不大于3BV,所述上样的速度为1-5BV/h;
(6’)洗脱:采用1-5mol/L NaOH和1-5mol/L H2SO4对第一层析单元和第二层析单元进行洗脱,所述NaOH和H2SO4洗脱的速度独立地选自0.1-1BV/h得到所述丁二酸钠和丙酸。
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