CN106841439B - 产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，涉及鞋材用胶黏剂、纸制品和油墨等3类产品，枞酸、新枞酸、左旋海松酸、海松酸和脱氢松香酸等5种松香酸的检测分析方法。在样品经过预处理后，加入提取溶剂进行超声提取后，过滤得到提取液，将提取液进行高效液相色谱检测进行分析。本发明提供的方法简便，步骤少，测试结果准确，对5种松香酸进行检测，效果好。

Description

产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法。

背景技术

松香具有粘合、防腐、绝缘等优良的特性,被广泛地应用在胶粘剂、塑料、涂料、油墨、造纸和医药等领域。在日常的消费品中，松香可能存在肥皂、纸张、涂料以及使用胶黏剂和塑料的各种鞋、玩具等产品。松香被大量使用的同时，其危害性也逐渐被人们发现和关注。松香浓蒸汽可引起头疼、昏眩、咳嗽、气喘等急性中毒症状。曾有报导指出，树脂酸对鱼的毒性为0.44μg/mL。毒理学研究表明松香酸可导致人体肺泡上皮细胞溶解，脱氢松香酸对人体红细胞、多核白细胞有毒性作用，Asako Ozaki等发现脱氢松香酸和松香酸具有损伤DNA的活性，Yasushi Kamaya等研究了松香酸、脱氢松香酸对大型水蚤生长的影响，发现二者对水蚤的生长有一定的限制作用。研究表明，松香是全球十大皮肤过敏源物质，长时间暴露在焊接释放出的松香烟雾可引起职业性哮喘，根据欧盟的分类法规，松香大于1％的产品将标识为R43(即能引起皮肤过敏)。

松香是一种无定形透明玻璃状固体树脂，主要成分是树脂酸，占总质量85％～90％,另外还有少量的脂肪酸和中性物质。目前国内外研究报道的对人体过敏的松香主要为枞酸(abietic acid)、新枞酸(Neoabietic acid)、左旋海松酸、海松酸(Pimaric acid)和脱氢枞酸(Dehydroabietic acid)5种。5种松香酸的CAS号、结构式如下所示：

有关松香酸含量的检测技术研究包括松香产品质量分析以及某些产品中松香酸的含量分析。对于松香品质的鉴定，已有国家标准，但该标准不涉及松香中各树脂酸的测定。魏福祥等采用红外光谱法定量测定了弹性体以及松香、液体石蜡混合物中松香酸的含量，但该方法检出限低，受基体干扰大，不能满足各类消费品中松香酸含量测定的要求。由于松香酸的毒性作用，某些产品中掺入或残留的松香酸含量的检测方法研究也引起了人们关注。对于松香酸中各种树脂酸含量的测定，通常可采用薄层色谱法、气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法、液质联用法等方法。这些方法存在两个方面的不足：一、检测方法只涉及松香酸中的枞酸和脱氢松香酸两种物质，而松香酸包含多种物质，检测覆盖面不足；二，松香酸广泛存在于各种日常消费品中，如鞋材中的胶黏剂、纸张、松香皂、油墨等。而报道的文献中主要集中在沉香、松香及纸制品中。为了保护消费者的身体健康和生命安全，应对国外贸易技术壁垒，提前做好技术储备工作，保证产品正常出口，维护社会稳定促进经济社会建设具有积极作用，有必要制定产品中松香酸的检测方法。

CN201310144917公开一种畜禽表皮中松香酸含量的分析方法，涉及畜禽表皮中松香酸的分析方法，属于分析测试领域。在屠宰加工后的生畜禽的表皮样品中加入稀碱溶液，经提取、固相萃取净化后，取得滤过液，再将滤过液采用高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)进行分析。该方法无法检测分离5种松香酸，具有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，该方法采用高效液相色谱法测定3类产品中5种松香酸的检测；该方法优化了液相色谱的流动相，选择合适的DAD检测波长，检测步骤少，测试结果准确，能快速的检测出松香酸的含量，抗干扰性强，能有效检测5种松香酸。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，具体检测步骤为：i)样品的处理：称取待测样品，置于管状硬质玻璃提取器中，加入第一提取溶剂，超声提取，过滤；样品中再加入第二提取溶剂，超声提取，过滤；滤液合并于离心管中，振荡，离心后过滤得上层清液；将上层清液浓缩后，加入第三提取溶剂溶解后定容，取样液经有机滤膜过滤后，提取液待用；

ii)将步骤i)所得提取液用HPLC-DAD进行测定，按色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量；

色谱条件为C18反相液相色谱柱；流动相为乙腈-水(75：25)溶液；波长为200nm、240nm、280nm；检测器为DAD检测器。

进一步地，所述C18反相液相色谱柱为4.6mm×250mm，粒径5μm，美国安捷伦。

进一步地，所述样品称取1g，定容至25mL。

进一步地，所述色谱条件中，柱温为40℃；进样量为10uL，流量为1.0mL/min。

进一步地，所述待测样品为经过预处理的胶黏剂、纸制品或油墨。

更进一步地，所述胶黏剂为鞋类部件的胶黏剂、热熔胶样品、液态胶黏剂。更进一步地，所述胶黏剂为309胶黏剂，热熔胶，乳胶，以及使用胶水的鞋类部件如鞋底衬中的胶合部位、鞋面的胶合部位、鞋后跟的胶合部位，鞋底的胶合部位。更进一步地，所述纸制品为瓦楞原纸、白卡纸等。更进一步地，所述油墨为快干凉胶印刷油墨。

进一步地，所述预处理的胶粘剂的处理过程如下：对于鞋类部件的胶黏剂，其通过将使用胶水粘合的鞋类部件，用刀刮起材料中的胶黏剂；若无法刮起，或者量不足，则直接取鞋类部件检测；

对于热熔胶样品，将样品剪成约1mm×1mm的小碎片后检测；

对于液态胶黏剂，将胶黏剂倒在玻璃平板上，自然晾干，剪成约1mm×1mm的小碎片后检测。

进一步地，所述预处理纸制品的处理过程为：将纸制品进行剪碎成约1mm×1mm的小碎片即可用于检测。

进一步地，所述预处理油墨的处理过程为：油墨材料在玻璃板上自然晾干后，剪碎；印刷制品用刮刀刮下，若无法刮下，则直接连基体材料一同处理。

进一步地，所述步骤i)中第一提取溶剂为叔丁基甲醚、水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醇-水的混合溶剂(V/V＝75/25)。

进一步地，所述步骤i)中第二提取溶剂为叔丁基甲醚、水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醇-水的混合溶剂(V/V＝75/25)。

进一步地，所述步骤i)中第三提取溶剂为叔丁基甲醚、水、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醇-水的混合溶剂(V/V＝75/25)或乙腈-水的混合溶剂(V/V＝75/25)。

进一步地，所述步骤i)中超声提取在40～80℃下提取20～60分钟。更进一步地，进一步地，所述步骤i)中超声提取在60℃下提取30分钟。

进一步地，所述过滤采用脱脂棉过滤。

进一步地，所述有机滤膜是孔径为0.45μm或0.22μm的聚四氟乙烯的有机滤膜。

进一步地，所述5种松香酸为枞酸、新枞酸、左旋海松酸、海松酸和脱氢松香酸。

进一步地，所述浓缩为真空减压浓缩或氮气吹干浓缩。

本发明的有益效果

本发明分别研究了鞋材用胶黏剂、纸张和油墨等3类产品中5种松香酸的检测方法，该方法采用超声波辅助溶剂对样品进行萃取，经萃取液浓缩后进行HPLC-DAD检测，所建方法具有良好的重复性和回收率，检测限低，能有效满足各类产品中5种松香酸的测试要求。

在使用C18色谱柱分离5种松香酸时，液相色谱的最优化条件为：流动相为乙腈：水＝75:25，流速为1mL/min，选择枞酸和新枞酸吸收波长240nm，左旋海松酸选择280nm，海松酸和脱氢松香酸选择200nm。在此条件下，5种物质分离情况较好，峰型对称，在20min左右出峰。

在0.5ug/mL至10.0ug/mL范围内，5种松香酸的线性相关系数均大于0.995；胶黏剂、纸张、油墨等3类物质中脱氢松香酸、枞酸和新松酸测定低限为1mg/kg，左旋海松酸和海松酸测定低限为2mg/kg；3类产品方法回收率在3％～108％，相对标准偏差(RSD)在7.0％以内，表明方法具有良好的重复性和可靠性。

本发明提供的操作方法简单，可操作性强，精密度高，重现性好，有效保证数据的准确性，检测限低，成本低，适合工业应用。

附图说明

图1是5种松香酸的HPLC光谱图；

图2是5种松香酸的HPLC分离图；

图3是不同比例的流动相下枞酸和新枞酸的分离情况图。

图中，(A)枞酸，(B)新枞酸，(C)左旋海松酸，(D)海松酸，(E)脱氢松香酸

具体实施方式

简要说明：

枞酸，纯度98.0％，美国Chroma Dex公司；新枞酸，纯度99.0％，加拿大Sigma公司；海松酸，纯度≧98.0％，加拿大Sigma公司；左旋海松酸，纯度≧98.0％，加拿大Sigma公司；脱氢松香酸，纯度≧98.0％，加拿大Toronto Research Chemicals公司。

乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮均为色谱纯，美国M-TEDIA公司；水为超纯水。

Agilent 1100高效液相色谱仪，配有DAD检测器；KQ-500E型数控超声波清洗器，昆山超声仪器公司；聚四氟乙烯有机系滤膜(孔径0.45μm)，上海兴业净化材料厂。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。

检测条件的优化

1、样品提取条件的优化

(1)提取溶剂的选择：为减少操作步骤，获得尽可能高的提取效率，采用超声波辅助溶剂提取样品。针对胶黏剂、纸张和油墨等3种产品的提取溶剂进行了考察，分别考察了乙酸乙酯、叔丁基甲醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙腈、甲醇-水的混合溶剂(V/V＝75/25)、乙腈-0.3％乙酸水溶液的混合溶剂的提取效果，比较五种溶剂对样品的提取效率。在综合考虑提取效率、提取溶剂毒性和提取溶剂的沸点的前提下，胶黏剂中以叔丁基甲醚为最佳提取溶剂；纸张以甲醇-水的混合溶剂(V/V＝75/25)为最佳提取溶剂；油墨以乙酸乙酯为最佳提取溶剂。

(2)提取方式的选择：萃取方式一般采用索氏提取、振荡提取和超声提取三种方式。实验考察可知，索氏提取方法提取效率高，但是消耗时间长；振荡萃取效率较低，时间较长；超声萃取法提取效率能满足检测需求，时间较短，操作方便。采用超声萃取。

2、色谱条件的优化

(1)流动相及洗脱条件的选择：

不同的流动相对目标物质的分离效果及色谱峰形通常有显著影响。采用乙腈-水体系进行比例的选择，实验结果表明，当采用乙腈-水比例为65:35时，4种松香酸出峰时间长、峰型较宽；当采用乙腈-水比例为75:25时，5种松香酸在20min内全部被洗脱出，分离度较好，峰型对称。具体见图2和图3。

(2)吸收峰的选择：具体如图1所示，图1为5种松香酸的光谱图。光谱图显示，枞酸最大吸收波长在241nm处，在265nm以上和200nm以下几乎无吸收峰；新枞酸最大吸收波长在254nm处，在280nm以上和200nm以下几乎无吸收峰；左旋海松酸最大吸收波长在274nm，在240nm以下吸收峰较小。海松酸和脱氢松香酸最大吸收波长为200左右nm，在240nm以上几乎无吸收峰。

由于这些物质为同分异构体，相互之间无法完全分离，因此本发明在后续的实施例中在吸收波长选择中没有选择各种物质的最佳吸收波长：枞酸和新枞酸选择240nm，在此波长处可以避免左旋海松酸和异海松酸的干扰，而左旋海松酸选择280nm，在此波长处可以避免新枞酸和枞酸的干扰，而海松酸和脱氢松香酸选择200nm，在此波长处可以避免枞酸、新枞酸和海松酸的干扰。

实施例1

5种松香酸标准储备液的配制：称取适量的5种松香酸，用乙腈配成浓度500mg/L的标准储备液，

使用乙腈：水＝75:25的混合液稀释成浓度为0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L的标准工作液，供高效液相色谱分析测定，计算线性方程，具体如表1所示，显示在0.5～10.0mg/L的浓度范围内，相关系数均大于0.995。

色谱条件为C18反相液相色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm，美国安捷伦；流动相为乙腈-水(75：25)溶液，流量为1.0mL/min；进样量为10uL；波长为200～280nm；柱温40℃。

表1

实施例2

5种松香酸混合标准工作溶液的配制：取5种松香酸实施例1配置的浓度500mg/L的标准储备液，使用乙腈：水＝75:25的混合液稀释成0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L混合标准工作液，供高效液相色谱分析测定，绘制分离光谱图，具体如图2所示，显示5种松香酸在20min分钟内全部被洗脱出，分离度较好、峰型对称。

色谱条件为C18反相液相色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm，美国安捷伦；流动相为乙腈-水(75：25)溶液，流量为1.0mL/min；进样量为10uL；波长为200nm、240nm、280nm；柱温40℃。

实施例3～5胶黏剂中松香酸的检测

准确称取样品1g，置于管状硬质玻璃提取器中，加入10mL叔丁基甲醚，在60℃下超声提取30min，过滤至离心管中；向样品中再次加入10mL叔丁基甲醚，在60℃下超声提取30min，过滤至离心管中，合并的滤液振荡，离心，用脱脂棉过滤上层清液，氮吹至近干，加入5mL甲醇和水的混合液(甲醇：水＝流动相的比例75:25)溶解后定容至25mL，取上层样液经0.45μm有机滤膜过滤后，进行HPLC-DAD测试，按色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量。色谱条件为C18反相液相色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm，美国安捷伦；流动相为乙腈-水(75：25)溶液，流量为1.0mL/min；进样量为10uL；波长为200nm、240nm、280nm；柱温40℃；检测器为DAD检测器。

所述样品为309胶黏剂，热熔胶，乳胶，以及使用胶水的鞋类部件如鞋底衬中的胶合部位、鞋面的胶合部位、鞋后跟的胶合部位，鞋底的胶合部位；

对于使用胶水粘合的鞋类部件，尽量刮起材料中的胶黏剂；若无法刮起，或者量不足，则直接取鞋类部件检测。

对于热熔胶样品，将样品剪成约1mm×1mm的小碎片后检测。

对于液态胶黏剂，将胶黏剂倒在玻璃平板上，自然晾干，剪成约1mm×1mm的小碎片后检测。

具体结果如表2所示：

表2不同样品中松香酸的含量(mg/kg)

由表2可知，鞋类部件、热熔胶样品和液态胶黏剂样品中5种松香酸的可通过本发明的方法检测含量。

实施例6～7纸制品中松香酸的检测

考察了瓦楞原纸、白卡纸等纸制品。

实验条件为：取剪碎样品约1克，加入10ml甲醇：水(75:25)混合溶液，在60℃下超声提取30分钟，过滤至离心管中；向样品中再次加入10ml甲醇：水(75:25)混合溶液，重复超声过滤；合并提取液，振荡，离心，用脱脂棉过滤上层清液，氮吹至近干，用75:25的甲醇-水溶液溶解，并定容至25ml，经0.45μm有机滤膜过滤，液相色谱分析。

色谱条件为C18反相液相色谱柱，4.6mm×250mm，粒径5μm，美国安捷伦；流动相为乙腈-水(75：25)溶液，流量为1.0mL/min；进样量10uL；波长为200nm、240nm、280nm；柱温40℃。

测试结果如表3所示：

表3不同纸制品中松香酸的含量(mg/kg)

由表3可知，瓦楞原纸和白卡纸样品中5种松香酸的可通过本发明的方法检测含量。

实施例8油墨中松香酸的检测

考察了快干凉胶印刷油墨。

油墨材料在玻璃板上自然晾干后，剪碎；印刷制品用刮刀刮下，若无法刮下，则直接连基体材料一同处理。取剪碎样品约1克，加入10ml乙酸乙酯，在60℃下采用超声萃取30min，离心，过滤至离心管中；向样品中再次加入10mL乙酸乙酯，在60℃下超声提取30min，过滤至离心管中，合并的滤液振荡，离心，用脱脂棉过滤上层清液，将滤液真空浓缩近干，加入甲醇水混合液(75:25)溶解，转移并定容至25ml，滤膜过滤，液相色谱分析。具体结果如下表4：

表4快干凉胶印刷油墨中松香酸的含量(mg/kg)

由表4可知，快干凉胶印刷油墨样品中5种松香酸的可通过本发明的方法检测含量。

实施例9线性关系、方法的检出限和定量限

于胶黏剂、纸制品、油墨等3种空白基质中加入低浓度的标准溶液，按照实施例3～9分析步骤前处理，测试，采用Agilent 1100软件的信噪比工具计算信噪比S/N，检出限按照3倍信噪比计算，定量检出限按照10倍信噪比计算，结果见表5。从表5中结果可知，在考虑基体干扰情况下，可见3种物质中脱氢松香酸、枞酸和新松酸定量检出限设为1mg/kg，左旋海松酸和海松酸定量检出限设为2mg/kg。

表5

实施例10添加回收实验

选用胶黏剂、纸张、油墨等3类产品空白样品为基质，加入浓度为0.5mg/L、2.0mg/L、10.0mg/L三个不同浓度的5种松香酸混合标准工作溶液，按标准所述的方法进行前处理，平行测定5次，测回收率和精密度，结果见表6，从表6中结果可知，3类产品方法回收率在83％～108％，相对标准偏差(RSD)在7.0％以内，表明方法具有良好的重复性和可靠性。

表6方法的回收率和精密度(n＝5)

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为被包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，具体检测步骤为：i)样品的处理：称取待测样品，置于管状硬质玻璃提取器中，加入第一提取溶剂，超声提取，过滤；样品中再加入第二提取溶剂，超声提取，过滤；滤液合并于离心管中，振荡，离心后过滤得上层清液；将上层清液浓缩后，加入第三提取溶剂溶解后定容，取样液经有机滤膜过滤后，提取液待用；ii)将步骤i)所得提取液用HPLC-DAD进行测定，按色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量；色谱条件为C18反相液相色谱柱，流动相为体积比为75/25的乙腈-水溶液，波长为200nm、240nm、280nm；检测器为DAD检测器；所述待测样品为经过预处理的胶黏剂、纸制品或油墨；所述5种松香酸为枞酸、新枞酸、左旋海松酸、海松酸和脱氢松香酸；所述步骤i)中第一提取溶剂为体积比为75/25的甲醇-水混合溶剂；所述步骤i)中第二提取溶剂为体积比为75/25的甲醇-水混合溶剂；所述步骤i)中第三提取溶剂为体积比为75/25的甲醇-水混合溶剂或体积比为75/25的乙腈-水混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，所述色谱条件中，柱温为40℃；流量为1.0mL/min；进样量为10uL。

3.根据权利要求1所述的产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，所述步骤i)中超声提取在40～80℃下提取20～60分钟。

4.根据权利要求1所述的产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，所述步骤i)中超声提取在60℃下提取30分钟。

5.根据权利要求1所述的产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，所述过滤采用脱脂棉过滤。

6.根据权利要求1所述的产品中5种松香酸的高效液相色谱的分析方法，其特征在于，所述有机滤膜是孔径为0.45μm或0.22μm的聚四氟乙烯的有机滤膜。