CN106755185A - 一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，包括以下步骤：A1、将枸杞干果在60℃条件下烘干，再将其粉碎过50目筛，同时准备黄酒酵母菌种；A2、将一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时；A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液，滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同。本发明通过黄酒酵母菌种和去离子水的配合，有利用了微生物法提取枸杞多糖，降低了提取所消耗的时间，提取速度快，适用性强，可靠性高。

Description

一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺

技术领域

本发明涉及枸杞多糖提取技术领域，具体为一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺。

背景技术

枸杞多糖是一种生物活性物质，具有促进T、B、CTL、NK和巨噬细胞等免疫功能，促进IL-2、IL-3和TNFβ等细胞因子产生。增强荷瘤、化疗与辐射损伤小鼠免疫功能及调节神经内分泌免疫调节(NIM)网络的作用，淡黄色纤维状固体，有调节免疫、延缓衰老多种功效，可制药；

枸杞多糖的提取纯化分为二步。一是枸杞粗多糖的提取，二是枸杞多糖的分级纯化。粗多糖的提取工艺如下：称取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮(1：1)回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干后以80%乙醇脱单糖和低聚糖。将脱低聚糖等后的残渣用水在90~100℃水溶提多糖，提取液减压浓缩后用酒精沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。例如公告号为CN1263108的一种枸杞多糖提取纯化工艺，该专利采用新鲜枸杞浆果分离除去枸杞籽后，制得枸杞原汁，先用50万分子量膜分离枸杞色素及不溶固形微粒，再用1—10万分子量膜截留溶解枸杞多糖原汁部分，真空冷冻成枸杞多糖粗品，订制Φ45mm和Φ100mm大柱径分离柱对枸杞多糖粗品柱层析，可以g量级以上制备纯枸杞多糖。上述专利采用了先进的膜分离技术和大柱层析技术，提高了枸杞多糖的制备效率和得率，适宜于工业化生产，使枸杞多糖尽快转化为药品，用于医学临床。但是该专利只是通过过滤和层析这种物理方式进行提取枸杞多糖，提取速度慢，提取时间长；

近年来，越来越多的文献是关于枸杞多糖提取及其分离工艺，枸杞多糖作为一种无毒副作用的活性成分，越来越受到人们的关注。枸杞干果中含有60～70%单糖和双糖、9～11%的多糖、0.2～0.3%的黄酮，以及7～8%的蛋白。目前对枸杞多糖的提取研究是采用水提法进行，该法提取温度较高，易破坏多糖活性，同时传统的提取方法对枸杞原料的要求高，资源利用率低。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，解决了提取速度慢，提取时间长的问题，提高枸杞多糖得率和资源利用率。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，包括以下步骤：

A1、将枸杞干果在60℃条件下烘干，再将其粉碎过50目筛，同时准备黄酒酵母菌种。

A2、将一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时；

A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液，滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同；

A4、滤液用真空泵抽到单效浓缩器中（滤液以装满容器体积的2/3为宜），在温度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽压力0.2MPa条件下进行减压浓缩，浓缩到至固形物为50-55%左右；

A5、加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉两次，再经过离心、乙醚洗涤、粉碎和喷雾干燥，最后通过80目筛，得枸杞多糖。

优选的，A1中黄酒酵母菌种的制作方法包括以下步骤：

A11、YPD培养基的配制。

A12、挑取黄酒酵母单菌落接菌于YPD培养基中，并将混入有黄酒酵母单菌的YPD培养基放入28℃的空气摇床中，180r/min，培养48小时之后即得。

优选的，A11中YPD培养基的配制方法为称取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析纯葡萄糖，加水定容至1000mL，分装置500mL的锥形瓶中各100mL，121℃高温高压灭菌15min制得。

优选的，A3中的过滤采用板框进行，板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布。

优选的，A1和A5中粉碎均采用型号为ZN-04B的小型粉碎机。

优选的，A5中的离心采用低速大容量台式离心机。

（三）有益效果

本发明提供了一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺。具备以下有益效果：

1、本发明通过黄酒酵母菌种和去离子水的配合，有利用了微生物法提取枸杞多糖，降低了提取所消耗的时间，提取速度快，适用性强，可靠性高。

2、本发明有效的利用了板框对保温搅拌后的液体进行过滤，并且板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布，过滤面积大，占地面积小，过滤效果高，结构简单，便于携带。

3、本发明通过无水乙醇对固定物含量50-55%的滤液进行醇沉，再经过低速大容量台式离心机进行离心、乙醚洗涤保证了提取后的枸杞多糖干净度，提取质量高。

4、本发明不使用有机溶剂，对环境友好，枸杞资源利用率高，提取温度低，发酵过程中产生多肽和多酚等功效成分，可以提高枸杞的生物活性，保留了枸杞的多糖、黄酮等有效成分，资源利用率达到55%以上。

附图说明

图1为本发明微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺流程图;

图2为多糖提取率温度单因素实验图;

图3为多糖提取率料液比单因素实验图;

图4为多糖提取率提取时间单因素实验图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，如图1所示，包括以下步骤：

A1、将枸杞干果在60℃条件下烘干，再将其粉碎过50目筛，同时准备黄酒酵母菌种。

本发明A1中黄酒酵母菌种的制作方法包括以下步骤：

A11、YPD培养基的配制。

A12、挑取黄酒酵母单菌落接菌于YPD培养基中，并将混入有黄酒酵母单菌的YPD培养基放入28℃的空气摇床中，180r/min，培养48小时之后即得。

本发明A11中YPD培养基的配制方法为称取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析纯葡萄糖，加水定容至1000mL，分装置500mL的锥形瓶中各100mL，121℃高温高压灭菌15min制得。

A2、将一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时。

A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液，滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同。

本发明A3中的过滤采用板框进行，板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布。

A4、滤液用真空泵抽到单效浓缩器中（滤液以装满容器体积的2/3为宜），在温度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽压力0.2MPa条件下进行减压浓缩，浓缩到至固形物为50-55%左右。

A5、加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉两次，再经过离心、乙醚洗涤、粉碎和喷雾干燥，最后通过80目筛，得枸杞多糖。

本发明A1和A5中粉碎均采用型号为ZN-04B的小型粉碎机，A5中的离心采用低速大容量台式离心机。

该微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺是通过以下步骤优化而来：

S1、利用单因素实验先后采集温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数、料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数和提取时间对枸杞多糖提取率的影响工艺参数，每个因素做三个平行。

S1中温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:50，分别于26℃、28℃、30℃、32℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清液，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图2：

由图可见，枸杞多糖提取率在28℃之前随着温度的升高而显著升高，28℃之后随着温度的升高而显著下降，过高的温度会对酵母的活性有抑制作用，故温度选在26℃-30℃为宜。

S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分别加入180mL去离子水（即料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图3：

由图可见，枸杞多糖的提取率随着料液比的先显著增高后显著下降，在1:40达到最大提取率，料液比为1:40之后开始显著下降的原因可能是随着料液比的增大，发酵底物中菌和酶的浓度较小，使多糖的提取率降低。故料液比应选取1:30-1:50为宜。

S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:40，于28℃空气摇床内，180r/min，分别发酵36h、48h、60h、72h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图4：

有图可知，在微生物提取时间为48h时，枸杞多糖的提取率最大， 48h之后随着时间的增加，提取率开始显著下降，时间取36h-60h为宜。

S2、在单因素实验的基础上进行L9正交实验，按照正交实现确定的最佳工艺进行验证实验，做出三个平行，具体请见下表：

由图可知，三个因素对于枸杞多糖提取率影响大小为C>A>B，即料液比>发酵温度>时间，根据显著性分析可得，料液比和温度对微生物法提取枸杞多糖影响显著（P<0.05），时间对微生物法提取枸杞多糖影响不显著。由图微生物法提取正交实验结果可得最佳提取工艺为A2B1C2，提取率为2.74%，所以微生物法产表面活性剂提取枸杞多糖的最佳工艺为发酵温度28℃、发酵时间为36h、料液比为1:40。

S3、通过观察实验记录表，取得最佳工艺，并制定微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺。

该优化步骤以枸杞作为实验材料，枸杞多糖的提取率作为考察目标，通过酵母产槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和热水法提取枸杞多糖，选取影响枸杞多糖提取率的主要因素，通过单因素实验和正交设计实验确定表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的最优工艺条件，对比表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的提取率，评价利用酵母产表面剂提取枸杞多糖的可行性和优越性

综上所述，本发明通过黄酒酵母菌种和去离子水的配合，有利用了微生物法提取枸杞多糖，降低了提取所消耗的时间，提取速度快，适用性强，可靠性高。

同时，本发明有效的利用了板框对保温搅拌后的液体进行过滤，并且板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布，过滤面积大，占地面积小，过滤效果高，结构简单，便于携带。

其次，本发明通过无水乙醇对固定物含量50-55%的滤液进行醇沉，再经过低速大容量台式离心机进行离心、乙醚洗涤保证了提取后的枸杞多糖干净度，提取质量高。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

A1、将枸杞干果在60℃条件下烘干，再将其粉碎过50目筛，同时准备黄酒酵母菌种；

A2、将一定量的枸杞干果粉原料投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时；

A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液，滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同；

A4、滤液用真空泵抽到单效浓缩器中（滤液以装满容器体积的2/3为宜），在温度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽压力0.2MPa条件下进行减压浓缩，浓缩到至固形物为50-55%左右；

A5、加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉两次，再经过离心、乙醚洗涤、粉碎和喷雾干燥，最后通过80目筛，得枸杞多糖。

2.根据权利要求1所述的一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于：A1中黄酒酵母菌种的制作方法包括以下步骤：

A11、YPD培养基的配制；

A12、挑取黄酒酵母单菌落接菌于YPD培养基中，并将混入有黄酒酵母单菌的YPD培养基放入28℃的空气摇床中，180r/min，培养48小时之后即得。

3.根据权利要求2所述的一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于：A11中YPD培养基的配制方法为称取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析纯葡萄糖，加水定容至1000mL，分装置500mL的锥形瓶中各100mL，121℃高温高压灭菌15min制得。

4.根据权利要求1所述的一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于：A3中的过滤采用板框进行，板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布。

5.根据权利要求1所述的一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于：A1和A5中粉碎均采用型号为ZN-04B的小型粉碎机。

6.根据权利要求1所述的一种微生物法提取枸杞多糖产业化生产工艺，其特征在于：A5中的离心采用低速大容量台式离心机。