CN106749271B

CN106749271B - 一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物、其制备方法及其用途

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Publication number: CN106749271B
Application number: CN201611115587.6A
Authority: CN
Inventors: 黄龙江; 田媛; 滕大为; 李秀芬
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: CN106749271A

Abstract

本发明涉及本发明涉及杂环化合物领域，公开了一类[1,2,4]‑三氮唑并[1,5‑a]嘧啶酮类杂环化合物、其制备方法及用途。该类[1,2,4]‑三氮唑并[1,5‑a]嘧啶酮类杂环化合物具有如下通式(Ⅰ)，而且试验结果显示，本发明公开的[1,2,4]‑三氮唑并[1,5‑a]嘧啶酮类杂环化合物对脑皮层神经元细胞的钙振荡有抑制活性，为预防和治疗抗癫痫疾病提供了一种新的产品。

Description

一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及杂环化合物，特别涉及一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物、其制备方法及用途。

背景技术

癫痫是一种临床综合征，它的特征是大脑神经细胞反复发作的异常放电，导致大脑功能失调。癫痫不是一个单独的疾病，引起癫痫的原因多种多样，其临床症状也千差万别。但是，癫痫发作时脑部大量神经细胞的异常、过度、同步性放电，在各种癫痫都是相同的。根据WHO的数据报道，世界上超出五千万人口患有癫痫。而我国国内的癫痫流行病学调查表明：我国癫痫的发病率约23人/10万人，可以估算我国目前癫痫患者超过500万。癫痫给患者个人、家庭和社会都造成了极大危害和影响，因此癫痫的治疗引起了社会广泛关注。目前，有关癫痫的治疗包括药物治疗、手术治疗、物理治疗和心理治疗等多种方法，其中药物治疗是目前最常用、最重要的手段。

目前普遍认为,神经元或神经网络兴奋性和抑制性电信号传输的失衡,是癫痫发病的最根本原因，因此，抑制神经元或神经网络兴奋性是抑制癫痫的重要研究方向。目前常用的抗癫痫药物以钠离子通道、钙离子通道、钾离子通道、谷氨酸受体和γ-氨基丁酸离子通道为靶点。已有研究证明钙通道功能缺失，是特发性全身性癫痫、尤其是伴有共济失调的特发性全身性癫痫发病机制之一。但目前还缺乏高选择性的钙离子通道阻断剂。因此，研究和开发高选择性的钙离子通道阻断剂对开发新型抗癫痫药物具有重要的意义。

三氮唑嘧啶类化合物及其相关的衍生物和类似物近些年也有诸多文献报道，且大多用于抗肿瘤活性研究，比较有突出结果的是：例如[1.2.4]三氮唑并[1,5a]嘧啶类化合物被广泛应用于抗肿瘤的研究中,许多[1.2.4]三氮唑并[1,5a]嘧啶衍生物具有抗肿瘤活性,尤其是5位、6位或7位上具有功能性取代基的[1.2.4]三氮唑并[1,2a]嘧啶衍生物,最近发现2位和7位具有功能性取代基的[1.2.4]三氮唑并[1,5a]嘧啶衍生物具有很好的抗癌活性；而有关它的其它方面的活性如抗炎和抗真菌以及抗疟原虫的活性亦有报道，目前制药工业大量生产的催吐剂就是三氮唑嘧啶酮类化合物。

到目前为止，未见相关三氮唑嘧啶酮类化合物在治疗癫痫疾病的相关报道，本发明是关于一类新颖的抑制大脑皮层神经元细胞钙振荡的生物活性的三氮唑嘧啶酮类化合物，该类化合物为一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物，更是意外的发现，本发明提供的三氮唑嘧啶酮类化合物比其传统药物具有更好的抗癫痫活性，因此，本发明提供的新型[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物及新的药用范围具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种新颖的抑制大脑皮层神经元细胞钙振荡的生物活性的一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物和抗癫痫活性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物，所述杂环化合物的通式Ⅰ如下所示：

其中，R₁是氢，烷氧基，烷基，烯基，炔基，环烷基，卤代烷基芳基或杂芳基；每个所述烷基，环烷基，卤代烷基，芳基和杂芳基是未取代或任选一个可取代位置独立取代，各自独立的取代为卤素，氰基，烷氧基，烷基，卤代烷基，卤代烷氧基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基或酰胺基；

R₂是C1-C10的链烃基或环烃基、苯基或取代苯基、杂芳环基或取代杂芳环基；

R₃是C1-C10的链烃基或环烃基、苯基或取代苯基、杂芳环基或取代杂芳环基；

卤素取代基为氟、氯、溴或碘。

优选地，其中，R₁为Ar(CH2)n，n＝0-3；Ar为单取代或多取代的苯环、吡啶环、噻吩环或呋喃环；R₂为Ar(CH2)n，n＝0-3；Ar为卤素(Cl，Br和F)取代的芳环、单取代或多取代的苯环；R₃为H、甲基或Ar(CH2)n，n＝0-3；Ar为单取代或多取代的芳环。

本发明的另外一个目的是公开一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的新用途，[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物在制备治疗与大脑皮层神经元细胞的钙振荡相关疾病的产品中的应用，其中，所述的与大脑皮层神经元细胞的钙振荡相关疾病为癫痫。

本发明还提供了一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)在碱的作用下，氨基胍或其盐与酰氯或羧酸或酯反应后得到3-氨基-1,2,4-三氮唑衍生物；酰氯或羧酸或酯与氨基胍及碱的摩尔比为1.0：1.0-5.0：1.0-3.0；

(2)3-氨基-1,2,4-三氮唑衍生物溶于溶剂中，加入酸性催化剂，然后加入乙酰乙酸乙酯或芳基乙酰乙酸乙酯或其衍生物，得到取代的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物。

优选地，步骤(1)酰氯或羧酸或酯与氨基胍及碱的摩尔配比为1.0：1.0-2.0：1.0-2.0。

当反应物为酰氯时，步骤(1)的反应条件为：反应温度为0-70℃，优选地，反应温度为0-25℃，反应时间为1-24小时，优选地，反应时间为1-3小时。

当反应物为羧酸或酯时，步骤(1)的反应条件为：反应温度为50-180℃，优选地，反应温度为80-130℃，反应时间为1-24小时，优选地，反应时间为12-16小时。

步骤(1)中的反应溶剂没有具体的限制，优选地，步骤(1)中所用溶剂为吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF或DMSO非质子溶剂中的一种。

步骤(1)中所用的碱为无机碱或有机碱类；优选地，无机碱类为碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或C1-8的醇的碱金属盐的一种；有机碱为三乙胺、二异丙基乙基胺、三丁胺、吡啶、N-甲基吗啉或N-甲基哌啶中的一种。

步骤(2)中所用溶剂为反应所用的溶剂没有具体的限制，优选地，溶剂选自甲醇、乙醇、丁醇、DMF、NMP或DMSO中的一种。

步骤(2)中可以使用酸性催化剂，所用的酸性催化剂为盐酸、硫酸、磷酸或对甲苯磺酸种的一种。

[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的具体的合成工艺如下：

(1)对于以酰氯为起始原料的合成工艺如下：

(2)以酸或酯为起始原料的合成工艺如下：

本发明还提供了一类根据上述制备方法制备的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物。

本发明提供了一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物，并且进一步拓展了该类化合物的新的应用范围，为预防和治疗抗癫痫疾病提供了一种新的产品。本发明的提供的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的活性试验表明，[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物对脑皮层神经元细胞的钙振荡有抑制活性，因此，本发明提供的新型[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物在制备治疗和预防癫痫疾病产品中的用途中具有良好的临床应用前景。

具体实施方式

本发明公开了通式(Ⅰ)的一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物、其制备方法及用途，该化合物对脑皮层神经元细胞的钙振荡有抑制作用。通式(Ⅰ)表示的化合物是在本发明中新合成的化合物，进而通式(Ⅰ)表示的化合物具有对脑皮层神经元细胞的钙振荡有抑制作用的事实是由本发明首次公开的。本发明的通式(Ⅰ)表示的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物能够用后述实施例中示出的化学合成方法来制造。

只要没有特别说明，本发明的的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物及作为医药有效成分而含有的通式(Ⅰ)表示的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物中还包括其互变异构个体、结合异构体(例如，E构型、Z构型等)，另外，关于对映异构体，在存在的情况下，也被包含在本发明的范围中。下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明所述原料化合物均可通过商业渠道购买，其化学通式I可通过下述通用合成路线按照常规化合物合成方法合成，具体合成方法如下：

实施例1

在反应瓶中加入2.0mmol氨基胍的碳酸盐，30mL二氯甲烷，4.0mmol的吡啶，所得混合物冷却至0℃，滴加溶解有1.0-2.0mmol酰氯(1)的二氯甲烷溶液10mL，滴加完毕后，所得反应混合物缓慢升至室温并在室温下反应1-12小时(TLC跟踪反应)；反应结束后，将反应液浓缩至干后直接进行下步反应，或加入水稀释残留物，用稀的氢氧化钠溶液缓慢调节溶液的pH值至约12，加入碱的过程中析出大量固体，过滤，滤饼经少量冰水洗涤后干燥得化合物(3)的纯品，收率在20％-90％之间。将上述所得化合物(3)悬浮或溶于水中，加入催化量的对甲苯磺酸，所得混合物加热至回流温度并在该温度下反应12小时(TLC跟踪反应)。反应完毕后，将反应液冷却至0℃，析出大量固体，过滤，滤饼用少量冰水洗涤得化合物(4)的纯品，收率为80-90％。将化合物(4)和乙酰乙酸乙酯或芳基乙酰乙酸乙酯的衍生物(5)溶解于醋酸中，将所得混合物加热至回流并在该温度下反应12-48小时(TLC跟踪反应)，反应完毕后，减压浓缩去除溶剂，所得残留物经柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝100：1-20：1)得化合物(6)纯品，收率为50-75％，其核磁结构均经¹HNMR和ESI-MS确证，表1列出部分化合物结构及谱学数据。

实施例2

在反应瓶中加入2.0mmol氨基胍的碳酸盐和1.0mmol或2.0mmol羧酸(羧酸酯)，加入30mLN，N-二甲基甲酰胺和1.0当量的吡啶，所得反应混合物加热至100-120℃反应12小时(TLC跟踪反应进程)，反应结束后，减压浓缩蒸除溶剂至干，向所得残留物中加入水，部分化合物析出固体，过滤，所得滤饼用少量冰水洗涤，干燥后得化合物(4)，在水中未能析出固体的残留物直接进行柱层析分离得化合物(4)，收率为15-50％之间。将化合物(4)和乙酰乙酸乙酯的衍生物(5)溶解于丁醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，将所得混合物加热至回流并在该温度下反应12-48小时(TLC跟踪反应)，反应完毕后，减压浓缩去除溶剂，所得残留物经柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝100：1-20：1)得化合物(6)纯品，收率为50-75％，其核磁结构均经¹HNMR和ESI-MS确证，表1列出部分化合物结构及谱学数据。

表1化合物结构及光谱学数据

实施例3

在反应瓶中加入2.0mmol氨基胍，30mL二氯甲烷，4.0mmol的三乙胺，所得混合物冷却至0℃，滴加溶解有5.0mmol酰氯(1)的二氯甲烷溶液10mL，滴加完毕后，所得反应混合物缓慢升至室温并在室温下反应1-12小时(TLC跟踪反应)。反应结束后，将反应液浓缩至干后直接进行下步反应，或加入水稀释残留物，用稀的氢氧化钠溶液缓慢调节溶液的pH值至约12，加入碱的过程中析出大量固体，过滤，滤饼经少量冰水洗涤后干燥得化合物(3)的纯品，收率在20％-90％之间。将上述所得化合物(3)悬浮或溶于甲醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，所得混合物加热至回流温度并在该温度下反应12小时(TLC跟踪反应)。反应完毕后，将反应液冷却至0℃，析出大量固体，过滤，滤饼用少量冰水洗涤得化合物(4)的纯品。收率：80-90％。将化合物(4)和乙酰乙酸乙酯的衍生物(5)溶解于醋酸中，将所得混合物加热至回流并在该温度下反应12-48小时(TLC跟踪反应)，反应完毕后，减压浓缩去除溶剂，所得残留物经柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝100：1-20：1)得化合物(6)纯品，收率为50-75％，其核磁结构均经¹HNMR和ESI-MS确证。

实施例4

在反应瓶中加入2.0mmol氨基胍的碳酸盐和1.0mmol或2.0mmol羧酸(羧酸酯)(化合物7)，加入30mLN，N-二甲基甲酰胺和1.0当量的N-甲基哌啶。所得反应混合物加热至100-120℃反应12小时(TLC跟踪反应进程)。反应结束后，减压浓缩蒸除溶剂至干。向所得残留物中加入水，部分化合物析出固体，过滤，所得滤饼用少量冰水洗涤。干燥后得化合物(4)。在水中未能析出固体的残留物直接进行柱层析分离得化合物(4)，收率为15-50％之间。将化合物(4)和乙酰乙酸乙酯的衍生物(5)溶解于NMP中，加入催化量的对甲苯磺酸。将所得混合物加热至回流并在该温度下反应12-48小时(TLC跟踪反应)，反应完毕后，减压浓缩去除溶剂，所得残留物经柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷：甲醇＝100：1-20：1)得化合物(6)纯品，收率为50-75％，其核磁结构均经¹HNMR和ESI-MS确证。

实施例5

对实施例1和2制备得到的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类化合物(6)进行了抑制大脑皮层神经元细胞的钙振荡的生物活性测试。

具体测试方法为：供试原代大脑皮层神经元细胞，C57小鼠大脑皮层极化分离培养，C57小鼠购买于扬州大学医学比较中心(检验合格)，经中国药科大学动物使用与管理规范的认可。

大脑皮层原代神经元培养方法：取怀孕15-16天的孕鼠，脱颈椎处死后，75％乙醇消毒5-10min，于无菌条件下剪开孕鼠下腹腔取出子宫，剥离出胎鼠，取大脑。在解剖镜下分离大脑皮层，仔细剥除脑膜，巴斯德吸管吹散后，胰蛋白酶37℃消化25min。在含有SoybeanTrypsin Inhibitor和DNase I的解剖缓冲液中将皮层吹散为单细胞悬液，取细胞悬液离心(1000rmp/5min)。用Neuron Plating Media重悬，以1.2×106个/mL的密度接种于经0.5mg/ml的poly-L-lysine coated 96孔FLIPR板上，每孔150μL。细胞板培养于37℃、5％CO2和95％湿度的细胞培养箱中。第5天换液，第9天测板。

对脑皮层神经元细胞的钙振荡抑制活性试验：吸弃96孔板中的培养基，每孔加入100μL dye loading buffer(含有4μM Fluo-8和5％BSA的Locke’s缓冲液)，在37℃、5％CO2和95％湿度的环境下孵育45-60min，然后用Locke’s缓冲液洗5次，最终每孔剩余150μL的液体。将细胞置入FLIPR中，激发波长为470-495nm，发射波长515-575nm，每1s读一个点。每个化合物每个浓度三个复孔。化合物在读板300s后加入25μL终浓度为10μM(8×)的化合物工作液，继续读板360s后，加入25μL终浓度为10μM(8×)的4-AP溶液，继续读板840s。观察胞内Ca2+水平变化。并对钙振荡频率统计拟合浓-效关系曲线，得IC50值。

表2化合物对原代大脑皮层神经元细胞胞内钙水平变化及4-AP癫痫模型的抑制总结表

表2中代表性实例中的化合物对原代大脑皮层神经元细胞胞内钙水平变化均有抑制作用，对4-AP癫痫模型也均有抑制作用，其中化合物6-6、6-10、6-16、6-17抑制效果最好。

在此基础上，对选取的代表性实例中的化合物进行了IC50(半数抑制浓度)值测定，化合物6-6的IC50值为50nM，化合物6-10的IC50值为20nM,化合物6-16的IC50值为2.2uM，化合物6-17的IC50值为1.6uM。其它化合物的IC50值在20nM-50μM之间。

活性试验表明，本发明提供的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类化合物不仅对原代大脑皮层神经元细胞胞内钙水平变化均有很好的抑制作用，而且对4-AP癫痫模型也均有很好的抑制作用，此对该类化合物的进一步研究开发有可能发现一类新型的治疗癫痫的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一类[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物在制备治疗与大脑皮层神经元细胞的钙振荡相关疾病的产品中的应用，所述[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的化学式为以下化学式中的一种：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的与大脑皮层神经元细胞的钙振荡相关疾病为癫痫。

3.如权利要求1所述的应用中的[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)在碱的作用下，氨基胍或其盐与酰氯或羧酸或酯溶于溶剂中，发生反应得到反应中间体；酰氯或羧酸或酯与氨基胍及碱的摩尔比为1.0：1.0-5.0：1.0-3.0；

(2)将反应中间体溶于溶剂中，加入酸性催化剂，然后加入乙酰乙酸乙酯或芳基乙酰乙酸乙酯，得到[1,2,4]-三氮唑并[1,5-a]嘧啶酮类杂环化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所用溶剂为吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃、DMF或DMSO中的一种。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所用的碱为无机碱或有机碱类；无机碱类为碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物或C1-8的醇的碱金属盐的一种；有机碱为三乙胺、二异丙基乙基胺、三丁胺、吡啶、N-甲基吗啉或N-甲基哌啶中的一种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用溶剂甲醇、乙醇、丁醇、DMF、NMP或DMSO中的一种。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用的酸性催化剂为盐酸、硫酸、磷酸或对甲苯磺酸中的一种。