CN106645544A - 一种双通道显色直读式薄层层析板及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全的快速检测分析领域，具体涉及一种双通道显色直读式薄层层析板及其制备方法及应用。该双通道显色直读式薄层层析板包括基材和固定相，所述固定相表面的待测特定比移值位置设有显色区，显色区由两块显色分区构成，显色分区之间设有疏水分割线，显色分区分别由显色剂@纳米金属氧化物复合物构成，两块显色分区的显色剂为两种不同的显色剂。在薄层层析板基材上确定显色区后，分别在两个显色分区打印两种显色剂，以疏水溶剂分割，经干燥、活化，制成成品。本发明产品灵敏度高，制作方法简单，使用便捷，可以实现待测底物的定性和半定量，可广泛应用于药物残留的检测中。

Description

一种双通道显色直读式薄层层析板及其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及食品安全的快速检测分析领域，具体涉及一种双通道显色直读式薄层层析板及其制备方法及应用。

背景技术

作为一项经典的分离分析手段，薄层色谱分析被广泛应用于天然产物、药物、食品分析等领域。近年，有研究人员基于高效薄层色谱分离手段发展了一些食品安全快速检测技术，成功的检测了食品中的一系列有害残留诸如真菌毒素、磺胺类药物以及保健食品中非法添加的药物。但由于食品中的有害残留物质通常表现为较低的浓度，缺乏高灵敏度、重现性好的直读显色手段成为阻碍高效薄层色谱技术在食品安全快速分析领域应用的主要桎梏。与纸色谱相比，高效薄层色谱虽然具备更强的分离能力但在食品安全快速分析领域则发展略显迟滞。

基于以上的回顾，发展与探寻基于高效薄层分离-高灵敏度直读显色的直读检测策略与手段，摆脱现有的薄层显色与定量分析方法限制有望成为解决当前基于薄层色谱方法快速食品安全分析的难点问题。将薄层固定相固定在侧向流动纸基条带表面以获得较之硝酸纤维素膜、定量滤纸等纸基更好的分离能力，同时也具备类似于侧向流动直读显色条带的高灵敏度显色能力，即有望发展出一种新型侧向流动直读显色条带。

纳米材料具有较高的比表面积，表面的官能团可以按照所需方案进行修饰成为分析领域的热点应用材料。将特定的专属显色剂固定在纳米材料表面可以有效的提高对生物分子显色分析的灵敏度并给予了显色剂良好的显色微环境。通过溶胶-凝胶自组装(Sol-Gel self-assembly)过程可以在天然纤维素的表面构筑多种金属氧化物纳米材料，可以基于该平台发展多种直读传感显色方案，对生物素分子、亚硝酸根、氨基酸分子如半胱氨酸等实现了高灵敏度的显色传感。基于溶胶-凝胶方法将金属氧化物与显色剂构筑成为纳米显色剂复合物将成为一种新型的显色剂，其显色反应具有高灵敏性、迅速、裸眼可判读的优点，能够为食品安全快速直读显色分析的发展提供借鉴与参考，同时这项策略将拓展当前侧向流动分析直读显色技术，采用更为简单直接的底物-纳米显色剂显色反应可对多种不同类型的有害残留化合物实现直读分析，从而无需依赖现有的抗原-抗体结合及酶-底物信号增强显色分析机制。将以上建立的新型侧向直读显色条带不仅能够快速简便的检测水产品中的有害残留物，更有望通过底物的拓展从而在食品安全的快速分析领域发挥重要作用。

水产品是重要的一类食品，可以为居民提供优质蛋白质与其他有益营养素。近年，食品安全问题越来越引起广泛的社会关注，我国市售与出口的水产品也曝出一系列质量安全问题。当前针对这些有害污染物残留开发的一系列仪器分析方法对实验室条件、仪器设备与人员的技术能力提出了较高要求。这些特点限制了其在现场环境以及低成本快速检测筛查中的应用。发展便捷、快速、灵敏的现场测试与检测手段可为保障食品安全提供技术保障并将具有较好的应用与市场前景。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种双通道显色直读式薄层层析板及其制备方法及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种双通道显色直读式薄层层析板，包括基材和固定相，所述固定相表面的待测特定比移值位置设有显色区，所述显色区由两块显色分区构成，所述显色分区之间设有疏水分割线，显色分区分别由显色剂@纳米金属氧化物复合物构成，两块显色分区的显色剂为两种不同的显色剂。

优选地，所述显色剂为茜素红或磷钼酸。

优选地，所述金属氧化物为二氧化钛或二氧化锆。

优选地，所述基材为铝基薄层层析板、塑料基材薄层层析板或纸基薄层层析板。

制备权利要求所述双通道显色直读式薄层层析板的方法，包括以下步骤：

(1)取基材薄层层析板一块，确定待测底物的比移值位置，即待设显色区；

(2)确定显色区后，在其中一个显色分区打印其中一种显色剂@纳米金属氧化物复合物，同时另一个显色分区被包被保护避免受到干扰；

(3)一个显色分区打印好后，在另一个显色分区打印另一种显色剂@纳米金属氧化物复合物；

(4)两个显色分区打印好后，以疏水溶剂在两个显色分区之间进行疏水分割；

(5)疏水分割后的薄层层析板进行干燥、活化，制成成品。

优选地，步骤(4)所述疏水溶剂为2-10％的二氯甲氧基硅氧烷。

优选地，步骤(5)所述活化条件为100～110℃活化0.5～1h。

所述双通道显色直读式薄层层析板在检测药物残留中的应用。

所述显色剂@纳米金属氧化物复合物，显色剂为茜素红或磷钼酸，所述金属氧化物为二氧化钛或二氧化锆。

制备所述的显色剂@纳米金属氧化物复合物的方法，包括以下步骤：

(1)处理模板材料：将模板材料置于抽滤装置中，用乙醇润洗，空气流抽干；

(2)配制前驱物溶液；

(3)利用抽滤将前驱物溶液通过模板材料，使模板材料饱和吸附前驱物溶液；

(4)利用抽滤将显色剂溶液通过模板材料，反应生成显色剂@纳米金属氧化物复合物。

优选地，步骤(1)所述模板材料的材质为天然纤维素。

更进一步地，步骤(1)所述模板材料为定量滤纸、柔软的面巾纸或是布料。

优选地，步骤(2)所述前驱物溶液的溶质是钛酸四丁酯或锆酸四丁酯，溶剂是甲苯和乙醇的混合物，浓度为50～300mM。

更进一步地，所述前驱物溶液的浓度是100mM，甲苯和乙醇的体积比为1:1。

优选地，步骤(4)所述显色剂溶液的溶剂是乙醇和水的混合物，浓度为0.2～2.0％。

更进一步地，所述显色剂溶液的浓度为0.5％，乙醇和水的体积比为1:1。

优选地，所述制备方法还包括对反应生成的显色剂@纳米金属氧化物复合物进行洗涤干燥，然后重复步骤(2)-(4)若干次。

将制备出的显色剂@纳米金属氧化物复合物从模板材料中研磨过滤至溶剂中，得到制备双通道显色直读式薄层层析板所需的显色剂@纳米金属氧化物复合物分散液。

本发明的有益效果在于：

(1)以茜素红@纳米二氧化锆或者磷钼酸@二氧化钛复合物分别打印于薄层层析表面特定位置成为显色区，实现层析分离与待测底物显色过程一步完成，使用便捷；(2)纳米二氧化钛(锆)的多层包裹和键合交联作用，显色剂被大量有效固定在纳米材料中，可以实现高灵敏度显色且不会发生色带和斑点的扩散，二氧化钛(锆)化学性质稳定，不影响待测底物和纳米显色剂之间的显色反应；(3)由于纳米材料的极高比表面积，其显色的灵敏度也获得极大提高。(4)通过本层析条带可以实现待测底物的定性和半定量。定性能力是基于层析条带的的比移值、双通道显色锁定底物的不同官能团来实现，半定量则基于显色的颜色深浅以标准比色参考来判定的。

附图说明

图1为茜素红@纳米二氧化锆、磷钼酸@纳米二氧化钛通过溶胶-凝胶过程形成纳米显色剂复合物的示意图；

图2为吸附在纤维素表面的茜素红@纳米二氧化锆复合物微观结构的透射电镜图；

图3为在薄层条带(纸基、铝基或者塑料基材)表面特定位置打印双显色区形成直读条带示意图；

图4为纸基条带打印显色区后效果图；

图5为氟取代化合物上氟离子与茜素红-锆离子配合物形成显色反应的原理示意图；

图6为本发明双通道点样双显色区显色示意图；其中，1为1号点样处；2为2号点样处；3为1号显色分区；4为2号显色分区；5为疏水分割线；

图7为半定量显色判定连续色带的示意图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

实施例1制备茜素红@纳米二氧化锆复合物

如图1所示，制备茜素红@纳米二氧化锆复合物：

(1)配制100mM的锆酸四丁酯溶液，溶剂为甲苯/乙醇溶液(v:v＝1：1)，室温搅拌一小时。

(2)将柔性的纤维纸，也可以是面巾纸、定量滤纸中的一种，置于抽滤装置中，用乙醇润洗2-3次，除去其中的水分，并以空气流抽干。移取约10mL锆酸四丁酯溶液加入至抽滤装置中，静止3分钟，使得锆酸四丁酯溶液充分浸润于纤维素纸中。

(3)开启抽滤装置，使得锆酸四丁酯溶液缓慢滤过纤维素纸，随后加入乙醇2-3次润洗，并静止2分钟。

(4)再次以抽滤装置除去剩余的乙醇，然后加入以乙醇/水(v:v＝1：1)配制的0.5％的茜素红溶液润洗并静置2分钟，最后以空气流彻底将纸基抽干。

(5)完成一个周期后，再次重复以上过程4次，得到多层复合茜素红@纳米二氧化锆复合物的纤维素材料，其透射电镜下微观结构如图2所示。

(6)将修饰后的纤维素材料取出，在研钵中加入乙醇溶液充分研磨，经过滤得到复溶分散的茜素红@纳米二氧化锆复合物分散液。

实施例2制备磷钼酸@纳米二氧化钛复合物

如图1所示，制备磷钼酸@纳米二氧化钛复合物：

(1)配制100mM的钛酸四丁酯溶液，溶剂为甲苯/乙醇溶液(v:v＝1：1)，室温搅拌一小时。

(2)将柔性的纤维纸，也可以是面巾纸、定量滤纸中的一种，置于抽滤装置中，用乙醇润洗2-3次，除去其中的水分，并以空气流抽干。移取约10mL钛酸四丁酯溶液加入至抽滤装置中，静止3分钟，使得钛酸四丁酯溶液充分浸润于纤维素纸中。

(3)开启抽滤装置，使得钛酸四丁酯溶液缓慢滤过纤维素纸，随后加入乙醇2-3次润洗，并静止2分钟。

(4)再次以抽滤装置除去剩余的乙醇，然后加入以乙醇/水(v:v＝1：1)配制的0.5％的磷钼酸溶液润洗并静置2分钟，最后以空气流彻底将纸基抽干。

(5)完成一个周期后，再次重复以上过程4次，得到多层复合磷钼酸@纳米二氧化钛复合物的纤维素材料。

(6)将修饰后的纤维素材料取出，在研钵中加入乙醇溶液充分研磨，经过滤得到复溶分散的磷钼酸@纳米二氧化钛复合物分散液。

实施例3制备含茜素红(磷钼酸)/纳米二氧化锆(钛)复合物作显色剂的薄层板

取铝基、纸基或者塑料基材薄层层析条带一片，规格约10cm*5cm。首先确定待测底物的比移值位置，通过薄层层析-碘显色法完成。确定位置后，在底物比移值Rf处左右1mm，即2mm宽度以薄层条带打印机打印前述的纳米显色剂分散液各5微升，如图3所示。在打印过程中，另一侧显色区以铝泊纸包被保护避免受到干扰。双显色区打印好后，以5％的二氯甲氧基硅氧烷进行中间的疏水分割。将薄层层析板在110℃环境中活化30分钟，干燥后即成如图4所示的薄层板，打印后的纳米显色区未有明显颜色区别，但能显示出有光滑和凹陷之感，将其置于有干燥剂的干燥箱中备用。

实施例4水产品中抗生素残留的快速分离定性与半定量

分别取2g虾肉样品，以5mL乙腈均质提取后冷冻离心，取上清液2mL脱蛋白后，氮吹浓缩至0.2mL。分别取10微升在薄层层析条带点样区处点样平行点两点。以展开剂展开，当展开剂到达条带前缘时，结束展开，将条带放入60度烘箱加热5分钟，待显色反应完成。观察结果，样品中残留的氟甲砜霉素经薄层展开到达显色区，分别显色。茜素红可以和水产品中氟甲砜霉素中氟离子显色反应，茜素红与四价锆离子形成红色的配合物，而氟离子则可以将其中的锆离子置换出来使得红色配合物转变成为黄色，其反应原理如图5所示；而磷钼酸是一种杂多酸，共轭的不饱和化合物会将磷钼酸还原成钼蓝，适用于含共轭基团的化合物、芳香化合物，是一种广谱显色剂。如图6所示，双显色区会分别变为淡黄色和褐色，该显色反应表明待测底物上不同的官能团与不同的显色剂发生显色反应，在白色的背景下，清晰可见。

此外，在条带特定比移值处连续打印纳米显色剂形成显色区，此显色区可以对不同浓度的待测底物形成颜色深浅不同的显色，以此连续色带可以对相应的样品板实现比对，从而可以实现初步的半定量读数，如图7所示为磷钼酸@纳米二氧化钛的纸层析条带半定量显色示意图，从上到下分别为己烯雌酚0.05、0.1、0.2、0.5、1.0ug/mL，可以明显区分出其颜色深浅，实现半定量的目的。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种双通道显色直读式薄层层析板，包括基材和固定相，其特征在于：所述固定相表面的待测特定比移值位置设有显色区，所述显色区由两块显色分区构成，所述显色分区之间设有疏水分割线，显色分区分别由显色剂@纳米金属氧化物复合物构成，两块显色分区的显色剂为两种不同的显色剂。

2.根据权利要求1所述的一种双通道显色直读式薄层层析板，其特征在于：所述显色剂为茜素红或磷钼酸。

3.根据权利要求1所述的一种双通道显色直读式薄层层析板，其特征在于：所述金属氧化物为二氧化钛或二氧化锆。

4.根据权利要求1所述的一种双通道显色直读式薄层层析板，其特征在于：所述基材为铝基薄层层析板、塑料基材薄层层析板或纸基薄层层析板。

5.制备权利要求1~4任一项所述双通道显色直读式薄层层析板的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取基材薄层层析板一块，确定待测底物的比移值位置，即待设显色区；

（2）确定显色区后，在其中一个显色分区打印其中一种显色剂@纳米金属氧化物复合物，同时另一个显色分区被包被保护避免受到干扰；

（3）一个显色分区打印好后，在另一个显色分区打印另一种显色剂@纳米金属氧化物复合物；

（4）两个显色分区打印好后，以疏水溶剂在两个显色分区之间进行疏水分割；

（5）疏水分割后的薄层层析板进行干燥、活化，制成成品。

6.根据权利要求5所述双通道显色直读式薄层层析板的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述疏水溶剂为2~10%的二氯甲氧基硅氧烷。

7.根据权利要求5所述双通道显色直读式薄层层析板的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述活化条件为100~110℃活化0.5~1h。

8.权利要求1~4任一项所述双通道显色直读式薄层层析板在检测药物残留中的应用。