CN106566793B - 一种赖氨酸芽孢杆菌及其在降解农药中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种赖氨酸芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX‑5。本发明保藏号为CGMCC No.13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX‑5，可以有效降解拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药，可用于这些物质污染的土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，应用前景优良。

Description

一种赖氨酸芽孢杆菌及其在降解农药中的应用
技术领域
本发明涉及一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解农药中的应用。
背景技术
氯氰菊酯(Cypermethrin，CY)是拟除虫菊酯类农药中最常用品种之一，其广泛应用于茶树、果蔬、人畜等虫害的防治。由于其具有疏水性强、对光热稳定等特性，因此自然降解速率慢，在环境中半衰期长达94.2d-1103d，易导致其在环境中残留蓄积，因此其在土壤、水体、农畜产品中常出现较高的检出率和超标率。氯氰菊酯对鱼类及其他水生动物有高毒性，其还能在动植物体内蓄积，对神经系统有急性毒性，并能损伤男性生殖系统发育，长期接触还可能引发多种慢性疾病，美国环境保护局已将其认定为一种致癌剂。在我国广泛应用于茶树、果蔬、人畜等虫害的防治，氯氰菊酯类农药的过量使用不仅造成了环境污染，同时由于食物链的传递，在动物性来源食品中也存在严重的残留现象，从而严重危害人体健康，随着人们生活质量的不断提高和环保意识的逐渐增强，该类农药的残留问题已越来越引起人们的关注。如何消除氯氰菊酯类农药对环境的危害，已经成为关系人类健康和国民经济发展的重大科学问题。以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物去除方法。
氨基甲酸酯(Carbamate；通式RO(CO)NRR)类农药是在有机磷酸酯之后发展起来的合成农药，广泛应用于除虫，杀螨，除草等农业生产中。氨基甲酸酯类农药一般无特殊气味，在酸性环境下稳定，遇碱分解，在水中溶解度较高。大多数品种毒性较有机磷酸酯类低，并不是剧毒化合物，但具有致癌性，可经呼吸道、消化道侵入机体，也可经皮肤黏膜缓慢吸收。氨基甲酸酯类农药具有致突变、致畸和致癌作用。例如将西维因以各种方式处理小鼠和大鼠，均可引起癌变，并对豚鼠、狗、小鼠、猪、鸡和鸭有致畸作用。急性氨基甲酸酯类农药中毒是短时间内密切接触氨基甲酸酯类杀虫剂后，因体内胆碱酯酶活性下降而引起的毒蕈碱样，烟碱样和以中枢神经系统症状为主的全身性疾病。因此，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸酯类列为2A类致癌物。如何消除这些危害，已经受到广泛关注，目前以微生物降解是较为行之有效的办法。
拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药是常用的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。
微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。
然而，现有细菌对拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药的降解速度慢，如，公开号为CN101139559A的专利申请公开了一种不动杆菌，以10％的接种质量接种如20mg/L的氯氰菊酯溶液中，处理24h后，降解率仅77.8％；胡桂萍，氟氯氰菊酯降解菌FLQ-11-1分离鉴定、降解特性及降解机理，中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑2016年第08期中公开了一种细菌，其在作用5天后对100mg/L的甲氰菊酯的降解率也仅90.23％；公开号为CN1723276A公开的细菌作用于氨基甲酸酯化合物后10天时，降解率仅60％。
急需提供一种可以快速、高效降解拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药的新的菌株。
发明内容
本发明提供了一种新的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)及其在降解拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药中的应用。
本发明提供了一种赖氨酸芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5。
本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，于2016年10月24日保藏在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.13142。
本发明还提供了赖氨酸芽孢杆菌在降解拟除虫菊酯类农药和/或氨基甲酸酯类农药中的用途。
其中，所述赖氨酸芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No.13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5。
其中，所述拟除虫菊酯类农药是氰戊菊酯、溴氰菊酯或氟氯氰菊酯。
其中，所述氨基甲酸酯类农药是(1-萘基)-N-甲基氨基甲酸酯。
本发明还提供了一种降解农药的方法，包括如下步骤：
(1)取赖氨酸芽孢杆菌，复苏制备种子液；
(2)将种子液加入待处理的样品中，混匀，即可。
步骤(1)中，所述赖氨酸芽孢杆菌是保藏号CGMCC No.13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5。
步骤(1)中，所述种子液的浓度不低于106cfu/mL。
优选地，所述种子液的浓度为106～109cfu/mL。
所述种子液的按照如下方法制备：取赖氨酸芽孢杆菌，用LB培养基培养，调整浓度，即可。
本发明赖氨酸芽孢杆菌JX-5(Lysinibacillus sp.JX-5)，其可以高效、快速降解拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药，用于这些物质污染的土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，具有极好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明菌株JX-5培养48h的菌落培养特征。
图2为本发明菌株JX-5的细胞形态图。
图3为本发明降解菌株JX-5对西维因的降解能力。
图4为本发明降解菌株JX-5对氯氰菊酯的降解能力。
图5为本发明降解菌株JX-5降解西维因及其产物的色谱图。
具体实施方式
本发明培养基：
Luria-Bertani培养基(LB)：酵母浸膏(Yeast extract)5.0g；胰蛋白胨(Caseintryptone)10g；氯化钠(Sodium chloride)10g；蒸馏水(H2O)1000mL；调pH至7.0，此固体培养基是在液体培养基中再加20g/L琼脂(Agar)制成的。培养基于121℃，灭菌20min备用。
实施例1 本发明赖氨酸芽孢杆菌的分离鉴定
1、分离
取醋赔样品，以温度、pH值、农药浓度和培养基为富集条件，经过多种农药梯度驯化，筛选得到的一株农药降解菌，编号为JX-5。
2、鉴定
(1)形态、生理生化特征
形态：挑取菌株JX-5至LB固体培养基平板培养，记录其菌落形态特征，挑取单菌落进行涂片、革兰氏染色，于10×100倍油镜下观察记录颜色、大小、形状、排列等。
生理生化鉴定参见《伯杰细菌鉴定手册》第八版。
菌株JX-5的形态鉴定(如图1、图2所示)：革兰氏染色阳性，芽孢杆菌，菌落近圆形，扁平，不透明，微黄色，表面皱褶，边缘不整齐。
表1 菌株JX-5生理生化鉴定结果
(2)16S rDNA鉴定
对菌株16S rDNA基因的PCR扩增，PCR条件：94℃预变性5min；然后94℃、45s，56℃、45s，72℃、90s，循环30次；最后72℃延伸10min；PCR产物经电泳检测，扩增产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，菌株JX-5的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示:
TTGACTGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAACAGAGAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCTTATAGTTTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTATTTCATTTCATGATGAAATACTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTTCCCTTCGGGGACAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGTAAGAGATGG。
测定，测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Lysinibacillus sp.菌株基因序列高度同源。
综上，结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA鉴定结果，将本发明分离株JX-5鉴定为赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.，并将其命名为赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillussp.JX-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13142。
实施例2 采用本发明赖氨酸芽孢杆菌降解土壤中的农药
取本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，保藏号为CGMCC No.13142，简称菌株JX-5。菌种活化：挑取菌株JX-5至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理土壤中，混匀，即可。
实施例3 采用本发明赖氨酸芽孢杆菌降解水中的农药
取本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，保藏号为CGMCC No.13142，简称菌株JX-5。菌种活化：挑取菌株JX-5至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为108cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理水中，混匀，即可。
实施例4 采用本发明赖氨酸芽孢杆菌降解土壤中的农药
取本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，保藏号为CGMCC No.13142，简称菌株JX-5。菌种活化：挑取菌株JX-5至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为109cfu/mL，制成种子液。
将种子液加入待处理水中，混匀，即可。
以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：
实验例1 采用本发明赖氨酸芽孢杆菌降解氯氰菊酯和西维因的方法
1材料与仪器
1.1材料
菌种：本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，保藏号为CGMCCNo.13142，简称菌株JX-5。
氯氰菊酯：购自中国标准物质中心。
西维因：购自中国标准物质中心。
1.2主要仪器
WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
2试验方法
菌种活化：挑取菌株JX-5至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
将降解菌株JX-5的种子液按5％接种量接种于含有50mg/L、150mg/L、200mg/L西维因和氯氰菊酯的LB液体培养基中,分装30mL/250mL锥形瓶,设接种5％无菌水为空白对照，30℃、180r/min振荡培养，取样时间为0h-96h期间每12h取样1瓶，从锥形瓶中取均匀培养液1mL至刻度试管。
西维因样品前处理及检测条件：从锥形瓶中取均匀培养液1mL至刻度试管，用甲醇定容至10mL，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱(HPLC)分析用。测定条件：色谱柱为WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流动相为乙腈:水(56:44，V/V)，流速0.5mL/min；紫外检测器，其波长为220nm；进样量10μL。
氯氰菊酯样品前处理及检测条件：从锥形瓶中取均匀培养液1mL至刻度试管，用乙腈定容至10mL，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱(HPLC)分析用。测定条件：色谱柱为WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流动相为乙腈:水(85:15，V/V)，流速1.0mL/min；紫外检测器，其波长为210nm；进样量10μL。
3结果与分析
结果如图3、图4所示，经过48h培养，对照组的西维因几乎无降解，实验组中在48h时，对50mg/L西维因降解率达到83％，对50mg/L氯氰菊酯降解率达到54％；如图5，降解菌株JX-5可以降解西维因的降解中间产物，色谱图中8.57min峰为目标峰(西维因)，随着时间的推移，西维因目标峰在变小的同时(0-48h)，在9.12min出现一个新的峰且逐渐升高(0-48h)，并且在48-120h内降低，判断9.12min峰为西维因的降解中间产物。
实验结果说明，本发明赖氨酸芽孢杆菌JX-5可以有效降解西维因和氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。
实验例2 采用本发明赖氨酸芽孢杆菌降解污水中的氯氰菊酯和西维因
1材料与仪器
1.1材料
菌种：本发明赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.JX-5，保藏号为CGMCCNo.13142，简称菌株JX-5。
氯氰菊酯：购自中国标准物质中心。
西维因：购自中国标准物质中心。
1.2主要仪器
WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。
2试验方法
菌种活化：挑取菌株JX-5至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。
用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为106cfu/mL，制成种子液。
从四川省某排污水中取一定量的液体样品，分别添加西维因和氯氰菊酯使其质量浓度约为50mg/L，将降解菌株的种子液按5％接种量接种(实验组)，设接种5％无菌水为空白对照,30℃振荡培养，每24h取样，用实验例2所述方法测定样品中西维因和氯氰菊酯的残留量。
通过HPLC检测样品中西维因、氯氰菊酯的残留量，空白污水样品中西维因、氯氰菊酯含量变化较小，实验组的样品在4d检测到西维因的降解率97.6％，氯氰菊酯的降解率是87.4％(表2)。
表2 菌株JX-5在污水中的应用
实验结果说明，本发明赖氨酸芽孢杆菌JX-5可以有效降解西维因和氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。
综上，本发明分离得到了一株新的赖氨酸芽孢杆菌JX-5(Lysinibacillus sp.JX-5)，其可以高效、快速降解西维因等氨基甲酸酯类农药、氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药，对环境修复的作用佳，具有极好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 一种赖氨酸芽孢杆菌及其在降解农药中的应用
<130> GY044-16P1499
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 16SrDNA
<400> 1
ttgactggcg gcgtgctata catgcagtcg agcgaacaga gaaggagctt gctcctttga 60
cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggcaacctac cttatagttt gggataactc 120
cgggaaaccg gggctaatac cgaataatct atttcatttc atgatgaaat actgaaagac 180
ggtttcggct gtcgctataa gatgggcccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300
acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc 360
tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcggat cgtaaaactc tgttgtaagg 420
gaagaacaag tacagtagta actggctgta ccttgacggt accttattag aaagccacgg 480
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg 540
ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcctttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600
ggagggtcat tggaaactgg gggacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccaagtgt 660
agcggtgaaa tgcgtagaga tttggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg 720
taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
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ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcccgttga ccactgtaga gatatggttt tcccttcggg gacaacggtg 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttgatctta gttgccatca tttagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggac gatacaaacg gttgccaact cgcgagaggg agctaatccg 1260
ataaagtcgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ccggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccttttg gagccagccg 1440
ccgaaggtgt aagagatgg 1459

Claims (6)

1.一株赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)，其特征在于：它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No. 13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. JX-5。
2.赖氨酸芽孢杆菌在降解西维因和/或氯氰菊酯中的用途；所述赖氨酸芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No. 13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. JX-5。
3.一种降解农药的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取赖氨酸芽孢杆菌，复苏制备种子液；
（2）将种子液加入待处理的样品中，混匀，即可；
步骤（1）中，所述赖氨酸芽孢杆菌是保藏号为CGMCC No. 13142的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp. JX-5。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述种子液的浓度不低于106cfu/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述种子液的浓度为106~109cfu/mL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述种子液的按照如下方法制备：取赖氨酸芽孢杆菌，用LB培养基培养，调整浓度，即可。
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