CN106563006A - 一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，是以除湿祛痰、活血化瘀、性温的红曲与可益气活血、祛痰化淤、性凉的绞股蓝进行组方，使二者的活性产生协同，加强其调和、理气、化痰、祛瘀的功效，从而强化其抗动脉粥样硬化的效果。为了进一步提高中药复方制剂的药效，可选用经发酵的药用功能性红曲和经提取的绞股蓝总甙进行组方采用药学上可接受的辅料制备成内服制剂。动物实验表明，本发明复方制剂组合有很好的增效作用，与单独使用红曲或绞股蓝总甙相比，复方制剂治疗效果更显著。另外，本发明中药复方制剂未见毒副作用，耐受性好，价格低廉，适合长期治疗使用。

Description

一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂
技术领域
本发明涉及一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，特别涉及一种由药用功能性红曲、药用绞股蓝总甙为活性成分的复方制剂，主要用于抗动脉粥样硬化的治疗，属于医药领域。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)是一种以脂质代谢紊乱为特征的动脉血管炎症反应，As的发生发展包括脂质入侵、血小板活化、血栓形成、内膜损伤、炎性反应、氧化应激、血管平滑肌细胞(VSMC)激活、选择性基质代谢及血管重建等。其发生机理是单核细胞黏附于血管内皮细胞，并移向血管内皮细胞下间隙，转化为巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），成为泡沫细胞；受损内皮细胞释放某些活性因子，导致血管平滑肌细胞增殖和向内皮细胞迁移，也摄取ox-LDL成为泡沫细胞，泡沫细胞的脂质逐渐累积形成脂质条纹，这种反应持续发生和发作终成动脉粥样硬化斑块。常会引起一些心脑血管疾病，如冠心病，脑卒中，心绞痛，心肌梗死，心源性猝死以及外周血管疾病，As及其并发症的危害已超过癌症，成为我国死亡率最高的疾病。据估算，我国每天心脑血管病死亡9590人，每10秒就有1个人死于心脑血管疾病。《全球疾病负担报告2013》显示，在中国，最致命的两种疾病是由As引起的卒中和冠心病。
目前用于治疗动脉粥样硬化的药物主要是治疗高血脂症的药物，有烟酸类、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶抑制药、胆酸结合树脂、贝特类和他汀类等。这些药物都有不同程度的副作用，患者不宜长期服用。
传统中药或中药提取物具有药物来源丰富，安全性高，副作用小，价格低廉且适合长期治疗。因此研发具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂具有很好的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂。
本发明基于发明人对传统中医理论长期研究，认为痰浊与血瘀以及脾气受阻是贯穿动脉粥样硬化发生发展的主要病理因素，痰瘀互结为其主要的病理机制。所以基于此发明人对动脉粥样硬化的治疗方案是除痰祛湿，活血化瘀，养心健脾。
红曲，别名：红曲霉、紫红曲霉、红大米、红糟。来源于曲霉科真菌紫色红曲霉寄生在粳米上而成的红曲米，以菌丝体及孢子入药。药用功能性红曲是以优质无污染非转基因大米为主要原料，利用现代生物发酵工程技术精制而成的一种纯天然的高科技发酵产品，其性甘味温，入肝、脾、大肠经，具有消食和胃，活血止痛，健脾，燥胃之功效。用于饮食停滞，胸膈满闷，消化不良等症。
绞股蓝，别名七叶胆、小苦药、公罗锅底、落地生、遍地生根。为葫芦科植物绞股蓝的全草。味苦、微甘，性凉。归肺；脾；肾经。功效：益气健脾，化痰止咳，清热解毒。临床主要用于老年人高脂血症、病毒性肝炎、慢性胃肠炎、慢性气管炎的治疗。绞股蓝主要有效成份是绞股蓝皂甙、绞股蓝糖甙(多糖)、水溶性氨基酸、黄酮类、多种维生素、微量元素、矿物质等。从绞股蓝全草中可提取的80多种皂甙被称为绞股蓝总甙，均具有四环三萜的达玛烷型结构，糖基均为低聚糖，其中四种与人参皂甙—Rb1、—Rb3、—R4、—F2完全相同，是一种很有价值的高级中药材。
本发明以除湿祛痰、活血化瘀、健脾、性温的红曲与可益气活血、祛痰化淤、益气健脾、性凉的绞股蓝进行组方，使二者的活性产生协同，加强其调和、理气、化痰、祛瘀的功效，从而强化其降血脂的效果。
为了进一步提高中药复方制剂的药效，本发明可选用经发酵的药用功能性红曲和绞股蓝总甙进行组方，二者按1.8:1～16.8:1的重量比进行配料，采用药学上可接受的辅料制备成内服制剂（如颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、口服液）。
下面通过动物试验对本发明红曲绞股蓝总甙复方制剂对动脉粥样硬化大鼠模型的治疗效果进行说明。
1、实验材料
（1）动物：Wistar雄性大鼠，清洁级，体重（300±10）g，由兰州大学医学实验中心提供；
（2）主要试剂和药物：功能性红曲粉购自浙江三禾生物工程有限公司，批号：2014012301；绞股蓝总甙购自安康正大制药有限公司，批号：20130704；总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒均购自四川迈克生物股份有限公司；丙二醛（MDA），钙盐，胰岛素，血糖，一氧化氮（NO），白介素-6（IL-6），C反应蛋白（CRP），还原型谷胱甘肽（GSH），超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），总抗氧化能力（T-AOC），Masson染色液，油红O染色液均购自南京建成生物工程研究所；RT-PCR试剂盒及引物均购自宝生物工程（大连）有限公司，包括RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)，Prime Script™RT Master Mix (Perfect Real Time反转录试剂)，SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ(TliRNaseH Plus PCR试剂)；维生素D3为上海通用药业股份有限公司生产；无水醋酸钠（1480P65）、硫酸亚铁七水合物（L5B0P40）、N、N-二乙基对苯二胺（DEPPD）（LG90P53）均购自百灵威试剂公司；胆固醇，猪油，胆酸钠，购自河南天祥食品添加剂有限公司；丙基硫氧嘧啶购自武汉东康源科技有限公司。
2、实验方法
（1）选取80只同一环境饲养的同龄Wistar雄性清洁级大鼠，体重（300±10）g，大鼠的饲养环境温度为23±1℃, 相对湿度55%±5%, 并且每日12h的光/暗循环。所有大鼠在基础饲料喂养一周后随机分为2组，分别为正常对照组（10只）和模型组（70只），正常对照组继续给予基础饲料，模型组的造模方式是在保持自由饮食不变的基础上，每天灌胃5mL/kg的高脂乳剂，并且前三天每天腹腔注射20万U/kg的维生素D3，以后每隔20天腹腔注射一次15U/kg的维生素D3，30天后模型组大鼠分为7组，每组10只，分别是模型对照组，辛伐他汀组，红曲组，绞股蓝总甙组，复方制剂（HJ）低、中、高剂量组。从第31天开始，模型组和给药组继续造模，给药组灌胃给予相应的药物剂量分别为：辛伐他汀1mg/kg，红曲72mg/kg，绞股蓝总甙20mg/kg，HJ低、中、高剂量分别为50、100、200mg/kg。药物均用蒸馏水配制，灌胃前充分分散。
（2）高脂乳剂的配方为：将胆固醇22.5g，胆酸钠3.75g，猪油7.5g，糖37.5g，丙基硫氧嘧啶1.5g加入少量热水中，待猪油全融，再加入30mL的吐温-80，最后定容到500mL。
（3）所有大鼠在80天后处死，眼眶取静脉血，取肝脏，动脉组织。静脉血用于测定血脂和一些血清氧化和炎症因子，肝脏分为4份，一份泡福尔马林做石蜡切片，其他三份冻存于-80℃，分别作冰冻切片，肝脏组织匀浆，抽提RNA用于RT-PCR分析；动脉分为三份，一份泡福尔马林做石蜡切片，另两份冻存于-80℃，分别做冰冻切片，抽提RNA用于RT-PCR分析。
（4）血清脂质水平，MDA，钙盐，胰岛素，血糖，NO，IL-6，CRP，肝脏GSH，SOD，CAT，T-AOC的测定方法均参照各试剂盒的说明书。
（5）肝脏组织用两种染色方法，分别是石蜡切片HE染色、冰冻切片油红O染色；动脉组织用三种染色方法，分别是石蜡切片HE染色和masson染色，冰冻切片油红O染色。除了HE染色，其他染色方法均参照试剂盒说明书。
（6）血清ROS的测定
将140μL0.1M乙酸钠缓冲液（pH=4.8）和5μL血清或H2O2溶液混合后37℃孵育5min，再加入100μL的混合液（R1:R2=1:25，R1是100μL/mL的DEPPD，R2是4.37μM的硫酸亚铁），在37℃再孵育1min。最后在60-180s内，505nm处每15s检测一次测定吸光度，先用H2O2溶液绘制标准曲线，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，计算每个浓度下的斜率，再以浓度（Units，1Unit=1.0mg H2O2/L）为横坐标，斜率为纵坐标，做标准曲线。最后将血清样品测得的吸光度以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，计算斜率，代入回归方程，求出血清样品ROS浓度。
（7）有关RT-PCR技术：所有大鼠剩余的肝脏不用漂洗，立即放入已经通过0.1%DEPC水处理过的且高压灭菌的15ml的干燥离心管里，用抽提试剂提取RNA，用分析核酸专用分光光度计测定含量，并分析纯度，最后所有的样品用DEPC水稀释到同一水平，用反转录试剂反转录，最后加扩增试剂和引物后用PCR扩增仪扩增。用β-actin做内参，检测的基因有，肝脏中：羟甲戊二酰基辅酶A还原酶（HMGR）、脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶1（ACC-1）、固醇响应原件结合蛋白1c（SREBP-1c）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α ）和肉毒碱棕榈酰基转移酶1（CPT-1）；动脉中有：诱导型一氧化氮合酶（NOS2），细胞间黏附分子-1（ICAM-1），肿瘤坏死因子（TNF-α ），白介素-6（IL-6），单核细胞趋化因子-1（MCP-1），趋化因子配体5（CCL-5），核转录因子kappa B（NF-κ B）的合成引物序列如表1所示。
（8）数据统计及作图用spss16.0软件包；计量资料以X̅±S表示，进行单因素方差分析和组间两两比较。
3、实验结果
3.1脏器指数的测定结果
脏器指数代表了每一种脏器的相对体重的质量大小，如果高于正常组，说明此脏器有肿大，脂肪化或纤维化等。分别将肝脏和肾脏摘除后用滤纸吸干液体后称重，再分别除以对应大鼠的体重的百分比就是脏器指数。结果如图1。结果所示，大鼠的肝脏指数在造模后明显增大，肾脏指数有稍微增大，但无统计学意义。提示造模后大鼠的肝脏明显肿大或有轻微的脂肪肝现象，肾脏也有轻微的损伤。给药后肝脏指数明显减小，肾脏指数除了辛伐他汀组外，其余各组均与正常组接近。说明给药组给药治疗后均可减轻肝脏质量，提示辛伐他汀、红曲、绞股蓝总甙和HJ可能均有保肝作用，而且除了辛伐他汀外其余给药组均无肾脏毒性。
3.2血清脂质的测定结果
甘油三脂的形成，大多来自酦酵类及碳水化合物(米饭、面包等谷类)，当中性脂肪数值偏高，则易患糖尿病、动脉硬化、心肌梗塞、肥胖症。总胆固醇，在肝脏中合成，或外源性吸收而来，可由低密度脂蛋白转运至外周以及血管，过量会引起一系列的血管疾病，也可由高密度脂蛋白从外周或血管转运至肝脏中，减轻血管性疾病的发生的风险。当血清中胆固醇含量过高，易引起高血压、动脉硬化及脑中风;含量太低则可能有贫血、肝障碍及营养不良。高密度脂蛋白-胆固醇，这就是俗称“好的”胆固醇，对血管有保护作用。血中含量不可低于40mg/dl (0.91mmol/L)，否则易患血管硬化。低密度脂蛋白-胆固醇，这就是“坏的”胆固醇，愈高愈不好。是预防冠状动脉心脏病及治疗高脂血症重要指针。
将冻存于-20℃的血清解冻后测定 “血脂四项”，TC、TG、LDL-C、HDL-C的测定参照四川迈克生物股份有限公司试剂盒提供的说明书，用日立自动生化分析仪测定。血脂升高是引发一切血管代谢性疾病的最初原因，总胆固醇，体内最具代表性的脂肪。结果如图2所示。从图2可知模型组相比于正常组，血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均显著升高，血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平显著降低。说明在80天的造模后，成功地造成了大鼠高血脂症模型。而且中剂量HJ降低三酰甘油的作用要明显优于辛伐他汀，降低TC，LDL-C和升高HDL-C的作用与辛伐他汀几乎相当。单味药物红曲或者绞股蓝总甙的治疗效果均没有复方制剂HJ中剂量的效果好（P <0.05）。提示红曲和绞股蓝总甙组合治疗高脂血症可能有增效作用。
3.3血清活性氧与脂质过氧化产物的测定的测定结果。
活性氧是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，如超氧自由基(·O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)等等，活性氧可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏基因和细胞膜的结构。
MDA为丙二醛，是脂质过氧化的终产物，含量的多少代表了脂质过氧化水平的高低。
本实验中，ROS的测定是以过氧化氢为标准品的，测定方法见试验方法下的（6）。MDA的测定完全参照南京建成试剂盒。结果见图3。结果显示，本实验中，辛伐他汀和红曲对抗活性氧ROS的能力不如绞股蓝总甙和HJ，但是可以减少脂质过氧化的产物MDA，推测可能的机理是，辛伐他汀和红曲从源头上降低了脂质的合成，从而降低了MDA，而绞股蓝总甙虽有一定的抗氧化能力，但是降脂效果可能不如红曲，所以在降低MDA方面效果不如红曲，总体来说，HJ不管是高剂量还是低剂量，都有很好的对抗ROS和降低MDA的作用，究其原因，可能是红曲和绞股蓝总甙从源头上减少了血清脂质水平，而且绞股蓝总甙还有一定的对抗ROS的作用，两者产生了增效作用。
3.4血清中炎症因子测定结果
NO既是免疫系统发挥作用不可缺少的调节因子，又可由于过度产生导致组织损伤，在心血管系统，NO合成异常常导致休克，动脉粥样硬化，高血压，中风等。少量NO可促使血管平滑肌的舒张,舒张的平滑肌不利于动脉粥样硬化斑块的形成。
IL-6有TNF诱导产生，可调节免疫反应的多个方面，也是一种促炎因子。IL-6的血浓度与患者感染的严重程度以及炎症反应的程度正相关。
人类C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性蛋白）。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
NO，IL-6，以及CRP的测定都参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。结果如图4。如图4所示，阳性药辛伐他汀除了对IL-6有一定抵抗作用外，对NO和C-RP都无效。所有大鼠NO的水平均在可损害细胞的浓度以下，说明没有产生调节炎症的NO，此时舒张平滑肌占主要作用，平滑肌舒张的主要作用是降低单核细胞和巨噬细胞在血管内皮的粘附，减缓斑块的形成，造模后NO的水平降低，推测可能是造模后，血管紧张素分泌过多，大鼠血压上升，正反馈抑制了NO的产生。反而给药后，NO均有所增加，除了红曲效果较差，其与药物均有增加NO的作用。造模后IL-6显著升高，说明模型组大鼠血管内皮确实发生了炎症，阳性药虽有作用IL-6还高于正常范围（>1000pg/mL），除了辛伐他汀，其他给药组IL-6均在正常范围之内，尤其HJ组有很明显的抗炎效果。红曲和绞股蓝总甙都有降低CRP的作用，HJ的效果也非常明显。
3.5 肝脏抗氧化能力的测定结果
GSH为还原型谷胱甘肽，它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。
过氧化氢酶（CAT），是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%。存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不至于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的·OH。
超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白，是生物体内清除自由基的首要物质，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基·O2-。
总抗氧化能力（TAC）是评价体内各种抗氧化物质抗氧化能力总和的标志，可直接反映机体抗氧化水平能力的强弱。
以上四种物质的测定以肝脏的生理盐水匀浆为样品，参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。结果如图5。
在本实验中，GSH出现了与预期相反的结果，推测可能造模后，大鼠体内的活性氧水平升高，反馈性地增加了体内的GSH来抵抗体内多余的活性氧，给药后GSH的水平有所下降，推测可能一方面药物可能本身具有抗氧化能力，所以不需要机体本身产生太多的GSH，另一方面，药物降低了体内的脂质水平，减弱了炎症水平，相应地减少了ROS水平，同样机体也减少了GSH的产生。这说明药物虽有抗氧化能力，但并不能增加体内GSH的产生。而且HJ组的降低幅度要大于其他给药组，这从侧面说明了HJ本身可能有更好的抗氧化能力。CAT的测定结果也和预期的有出入，造模后，CAT的酶活力升高，推测和前面的GSH一样，大鼠体内的活性氧水平升高，反馈性地增加了体内的CAT的酶活力来抵抗体内多余的活性氧，但是给药后CAT的酶活力都升高了，除了辛伐他汀、红曲和低剂量HJ没有明显的效果外，其余给药组的CAT的酶活力均增加，推测，绞股蓝总甙，中，高剂量的HJ都有增加CAT酶活力的作用。造模后，模型组SOD的活力没有什么太大的变化，给药后，除了辛伐他汀、红曲和低剂量HJ没有明显的效果外，其余给药组的SOD的酶活力均增加，推测，绞股蓝总甙，中，高剂量的HJ都有增加SOD酶活力的作用。TAC由酶促系统和非酶促系统组成，TAC在造模后相比正常组，明显降低，综合前面三个指标，GSH，CAT，SOD均为酶促系统，推测其降低的原因可能非酶促系统降低的幅度要大于酶促系统。所以综合后TAC降低。但给药后，只有HJ组有所增加，提示只有红曲和绞股蓝总甙合用后才能增加机体的总抗氧化能力。
3.6 肝脏和动脉组织中相关基因的表达。
羟甲戊二酰基辅酶A还原酶（HMGR）为胆固醇合成过程的限速酶。
脂肪酸合成酶（FAS）乙酰CoA + 7丙二酸CoA + 14NADPH + 14H+ → 棕榈酸+7CO2 + 8CoA + 14NADP+ + 6H2O，催化上述反应的酶称为脂肪酸合成酶。
乙酰辅酶A羧化酶1（ACC-1）乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase）催化乙酰辅酶A+ATP+HCO3 -→丙二酰辅酶A+ADP+Pi反应的生物素酶。广泛存在于生物界，此反应制约着脂肪酸合成第一阶段的速度。
固醇响应原件结合蛋白1c（SREBP-1c）是一种重要的核转录因子，它主要调控脂肪合成和葡萄糖代谢相关酶的基因表达。
过氧化物酶体增殖物激活受体α （PPAR-α ）通过对肝内脂肪酸氧化相关基因表达的调控，在肝脏脂肪细胞分化、脂质储存、转运和脂肪酸氧化中发挥重要作用。肝脏脂肪酸水平的增高被PPAR-α 感知后引起PPAR-α 的激活,然后转录激活参与脂肪酸氧化的基因，主要包括线粒体和过氧化物酶体的β 氧化系统及微粒体ω 氧化系统，增加对脂肪酸氧化的能力。
肉毒碱棕榈酰基转移酶1（CPT-1）存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。
诱导型一氧化氮合酶（NOS2）利用一氧化氮的氧化应激（自由基），协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体。它亦存在于心血管系统内。与建构型一氧化氮合酶不同，它只是在细胞受到刺激而被激活後才发挥功效，并且所生成的一氧化氮数量亦较多。
细胞间黏附分子-1（ICAM-1）ICAM及VCAM在活化的血管内皮细胞表达。炎症时，活化的内皮细胞表面的I-CAM可与白细胞表面的α Lβ 2及巨噬细胞表面的α Mβ 2相结合；V-CAM则可与白细胞的α 4β 1整合素相结合。它们继上述选择素介导的白细胞与内皮细胞的粘合作用之后使在内皮上滚动的白细胞固着于炎症部位的脉管内皮，并发生铺展，进而分泌水解酶而穿出脉管壁。
肿瘤坏死因子（TNF-α ）主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生，可使肿瘤细胞坏死，作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死。
白介素-6（IL-6）能够刺激参与免疫反应的单核细胞的增殖、分化并提高其功能。参与炎症反应和发热反应。IL-6家族在多种心血管疾病病理生理过程中起核心作用。
单核细胞趋化因子-1（MCP-1）可由内皮细胞，血管平滑肌细胞，单核细胞，以及成纤维细胞分泌，可趋化单核细胞，调节血管的生成。
趋化因子配体5（CCL-5）具有对多种细胞的趋化作用、强烈地激活淋巴细胞作用、参与炎症反应的发生等众多生物学功能，与动脉粥样硬化的形成密切相关。
核转录因子kappa B（NF-κ B）参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κ B的调控，包括：TNF-α 、IL-1β 、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、NOS2、COX2、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。
总的RNA根据说明书用RNAiso Plus试剂抽提，反转录反应用PrimeScript RTMaster Mix cDNA synthesis 试剂盒，10 μL的反应体系包括500ng的RNA，PCR扩增反应用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒，以β -actin为内参，在Corbett Research Rotor-Gene RG3000 Real Time PCR System中反应，反应包括10μL的SYBR Premix Ex Taq II，1.6μL的10μM的引物链，6μL的双蒸水，0.4μL的Rox Reference Dye (50×)和2μL的反转录得到的模板DNA。反应条件为95℃变性30秒，95℃下扩增40个循环，60℃复性30秒。最后每个基因都以正常组的的表达量为单位1来统计结果，将肝脏中个基因的表达与动脉中的分开来统计，结果如图6所示。横坐标为各个基因的名称，纵坐标为基因的相对表达量。
如图6A所示，对比模型组，辛伐他汀和HJ都很显著地抑制了HMGR，FAS，ACC-1，SREBP-1c的表达，而且除了HMGR，HJ的效果均优于辛伐他汀，在抑制HMGR和ACC-1的表达上，红曲和绞股蓝总甙表现出了增效作用。辛伐他汀对PPAR-α 和CPT-1的表达没有显著影响，红曲对PPAR-α 也没有明显的治疗效果，从HJ中剂量的治疗效果来看，红曲和绞股蓝总甙合用可有增效作用，显著增加PPAR-α 的表达。而且除了HMGR，HJ对肝脏中其他基因的作用都表现出了剂量依耐性。从以上结果可以说明HJ可以很明显地抑制有关脂质合成的基因的表达，增加了有关脂质氧化的基因的表达，从而抑制了脂质的合成，增加了脂质的氧化，减轻了动脉粥样硬化发生的风险。
从图6B中可知，诱导型一氧化氮合酶（NOS2）的表达在造模和治疗后都没有明显的变化，说明在炎症发生的过程中没有产生诱导型的一氧化氮，其余各组中HJ的治疗效果要好于辛伐他汀，尤其对ICAM-1，TNF-α ，IL-6的治疗，HJ的效果要比辛伐他汀显著。但是，除了HJ的中，高剂量组，其他药物对MCP-1的治疗不显著，除了MCP-1外，红曲和绞股蓝总甙对其他基因的作用都没有表现出明显的增效作用，但从柱形图看有一定的增效趋势。以上结果可以说明，HJ可有效地减少动脉粥样硬化发生过程的有关炎症和免疫的基因的表达，从而减轻炎症，减缓或消除动脉粥样硬化的发生和发展。
3.7 病理学的改变
3.7.1 动脉组织病理学分析
将每个组的大鼠动脉组织分别泡福尔马林和-80℃冷冻，再进行石蜡切片和冰冻切片，最后分别用HE、Masson和油红O染色，显微镜观察。
从图7动脉横截面HE常规染色中可以发现，模型组大鼠的动脉内膜明显增厚，内膜细胞核排列紊乱，并且推测空洞的部分可能为泡膜细胞，颜色变深的部位可能为钙盐的沉积，推测动脉内皮已经出现了明显的动脉粥样硬化的斑块，其余各组动脉形态均无异常；Masson染色为弹性纤维的专一然色，可将其染成深蓝色或紫色。从图8动脉横截面Masson染色可以明显地看出模型组动脉内膜的弹性纤维排列紊乱，内膜增厚，形态异常，此外绞股蓝总甙组也出现了轻微的动脉内膜弹性纤维排列紊乱的现象，但无明显的内膜增厚，其余各组形态正常；油红O染色为脂肪的专一染色，可将其染成红色，细胞核或其余部位为蓝色。从图9中可以看出，模型组，绞股蓝总甙组，低剂量HJ组动脉横截面都出现了不同程度的红色斑点，推测可能为脂肪组织，或泡沫细胞，而且可以明显地看到模型组有内膜增厚的现象，可能由于冰冻切片太薄，染色过程中脂肪有些许丢失，没有完全染出脂肪斑块的红色，但可以看出斑块边缘有深红色斑点，而绞股蓝总甙组，低剂量HJ组虽在内膜间隙有红色斑点出现，但未出现斑块样形状，而且内膜形状较模型组平整。其余各组未见明显红色斑点。从以上结果可推断通过高脂乳剂和注射维生素D3已经造成大鼠的动脉粥样硬化病理模型，而且通过药物中途干预治疗后都有明显好转。HJ中，高剂量也有很明显的治疗作用。
3.7.1 肝脏组织病理学分析
将每个组的大鼠肝脏组织分别泡福尔马林和-80℃冷冻，再进行石蜡切片和冰冻切片，最后分别用HE和油红O染色，显微镜观察。
从图10肝脏HE染色中看出，模型组的细胞已经完全脂肪化（正常细胞间隙的脂肪空洞），辛伐他汀组也出现了此种情况但脂滴数量明显要低于模型组，除了正常组，其余各组在细胞间隙无脂肪空洞，但细胞内都出现了不同程度的小脂肪滴，HJ低，中，高剂量组细胞内小脂肪滴数量较绞股蓝总甙组和红曲组要少。图11为大鼠肝脏组织油红O病理染色图。由图11可见，模型组被染色的完全脂肪化的细胞或较大脂滴和细胞内较小的脂肪滴最多，正常组和HJ治疗组较少出现。这个结果是和附图5中肝脏油红O染色的结果一致的，模型组出现了大片红色斑点，一些红色斑点为细胞内脂滴，一部分为完全脂肪化的细胞，辛伐他汀组完全脂肪化的细胞较少，但细胞内红色小脂滴较多，红曲组和绞股蓝总甙组的也有较多的细胞内小脂滴，但未见完全脂肪化的细胞，HJ组随着剂量的增大，也出逐渐现了较好的治疗效果，尤其高剂量组，肝脏形态已经与近于正常组。以上结果说明，通过高脂乳剂和维生素D3造成了大鼠轻度脂肪肝模型，辛伐他汀较其它治疗组效果较差，红曲和绞股蓝总甙的合用互相增强了其治疗脂肪肝的效果。
附图说明
图1为脏器指数的测定结果，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组。
图2 为血清脂质的测定结果，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组，§ P <0.05，HJ中剂量组vs红曲组、绞股蓝总甙组。
图3 血清活性氧与脂质过氧化产物的测定结果，* P <0.05，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组，§ P <0.05，HJ中剂量组vs红曲组、绞股蓝总甙组。
图4 血清炎症因子的测定结果，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组，§ P <0.05，§§ P <0.01，HJ中剂量组vs红曲组、绞股蓝总甙组。
图5 肝脏抗氧化能力的测定结果，* P <0.05，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组，§ P <0.05，§§ P <0.01，HJ中剂量组vs红曲组、绞股蓝总甙组。
图6 肝脏和动脉组织基因的测定结果，A为肝脏中基因的表达结果，B为动脉中基因的表达结果。* P <0.05，** P <0.01，正常组vs模型组，# P <0.05，## P <0.01，模型组vs给药组，§ P <0.05，§§ P <0.01，HJ中剂量组vs辛伐他汀组、红曲组、绞股蓝总甙组。
图7 为大鼠主动脉横截面HE病理染色图。1=正常组，2=模型组，3=辛伐他汀组，4=红曲组，5=绞股蓝总甙组，6=HJ低剂量组，7=HJ中剂量组，8=HJ高剂量组。
图8 为大鼠主动脉横截面Masson病理染色图，1=正常组，2=模型组，3=辛伐他汀组，4=红曲组，5=绞股蓝总甙组，6=HJ低剂量组，7=HJ中剂量组，8=HJ高剂量组。
图9 为大鼠主动脉横截面油红O病理染色图，1=正常组，2=模型组，3=辛伐他汀组，4=红曲组，5=绞股蓝总甙组，6=HJ低剂量组，7=HJ中剂量组，8=HJ高剂量组。
图10 为大鼠肝脏组织HE病理染色图，1=正常组，2=模型组，3=辛伐他汀组，4=红曲组，5=绞股蓝总甙组，6=HJ低剂量组，7=HJ中剂量组，8=HJ高剂量组。
图11为大鼠肝脏组织油红O病理染色图，1=正常组，2=模型组，3=辛伐他汀组，4=红曲组，5=绞股蓝总甙组，6=HJ低剂量组，7=HJ中剂量组，8=HJ高剂量组。由图可见模型组被染色的完全脂肪化的细胞或较大脂滴和细胞内较小的脂肪滴最多，正常组和HJ治疗组较少出现。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明中药复方制剂的制备和用法、用量进行说明。
实施例1、颗粒剂药物的制备
按1.8:1的重量比称取取功能性红曲粉和绞股蓝总甙，以药剂学制备颗粒剂的常规工艺和辅料制备而成；规格：5g/袋；
用法用量：每天3次，每次服5-10g；90天为一疗程，根据个人具体情况服用2-3个疗程。
实施例2、胶囊剂药物的制备
按5:1的重量比称取取功能性红曲粉和绞股蓝总甙，以药剂学制备胶囊剂的常规工艺和辅料制备而成；规格：200mg/粒；
用法用量：每天3次，每次服2-3粒；90天为一疗程，根据个人具体情况服用2-3个疗程。
实施例3、片剂药物的制备
按10:1的重量比称取取功能性红曲粉和绞股蓝总甙，以药剂学制备片剂的常规工艺和辅料制备而成；规格：350mg/片；
用法用量：每天2次，每次服350-700mg；90天为一疗程，根据个人具体情况服用2-3个疗程。
实施例4、丸剂药物的制备
按15:1的重量比称取取功能性红曲粉和绞股蓝总甙，以药剂学制备颗粒剂的常规工艺和辅料制备而成；规格：200mg/粒；
用法用量：每天3次，每次服2-3粒；90天为一疗程，根据个人具体情况服用2-3个疗程。
实施例5、口服液的制备
制备工艺：按药剂学制备口服液的常规工艺和辅料制备而成；规格：每瓶10ml；
按18:1的重量比称取取功能性红曲粉和绞股蓝总甙，以药剂学制备颗粒剂的常规工艺和辅料制备而成；规格：10ml/瓶；
用法用量：每天3次，每次服10-20ml；90天为一疗程，根据个人具体情况服用2-3个疗程。
上述实施例中，功能性红曲可通过红曲酶发酵制得或商业采购得到；绞股蓝总甙可由七叶或五叶绞股蓝全草或地上部分提取得到或商业购得。

Claims (4)

1.一种具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，是以红曲、绞股蓝为原料，按药学上可接受的辅料制备成的内服制剂。
2.如权利要求1所述具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，其特征在于：所述红曲为药用功能性红曲，绞股蓝为绞股蓝总甙。
3.如权利要求2所述具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，其特征在于：药用功能性红曲与药用绞股蓝总甙以1.8:1～18:1的重量比进行配料。
4.如权利要求1所述具有抗动脉粥样硬化功能的中药复方制剂，其特征在于：所述内服制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、口服液。
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