CN106261474A - 一种利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的应用，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，所述真菌毒素为AFB1和/或T‑2毒素，通过共培养，研究保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及干酪乳杆菌对AFB1以及T‑2毒素的降解作用的异同；该研究可以有效的应用于实际生活生产当中，将有效地降低AFB1以及T‑2毒素对食品的污染，对食品的现代化生产中降解黄曲霉毒素与T‑2毒素具有理论指导意义和实际价值。
Description
技术领域
本发明涉及毒素降解技术领域，更具体地，涉及一种利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类化学结构相似的化合物的统称，为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）产生的次生代谢化合物，是世界公认的天然致癌性最强的毒素，1993年被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物。我国霉菌毒素污染率高达90%，霉菌污染在我国气候温暖且湿润的南方地区尤为严重。黄曲霉毒素广泛存在于食品、农产品和动物饲料中，严重污染小麦、玉米等粮油制品，在一些发酵腌制产品中也有黄曲霉毒素的检出。黄曲霉毒素不仅致癌性、致畸性居首位，而且结构十分稳定，在食品的热加工环节难以被破坏。
目前已经被人类发现且分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，其中黄曲霉毒素B1致癌性与致畸性高居首位，黄曲霉毒素B1（AFB1）无色、无嗅、无味，在粮食作物中经常能被检测到。
T-2毒素是单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种，主要危害动物体内细胞分裂旺盛的器官，如胸腺、骨髓、淋巴、肝脏等，引起动物造血组织和免疫器官的出血性综合症，抑制DNA的合成、转录与蛋白质的翻译表达，T-2毒素可以使细胞内细胞色素氧化酶活力降低，心肌组织中ATP含量下降，导致心肌细胞不可逆损伤，引起心肌功能紊乱；T-2毒素经口、皮肤、呼吸道暴露，可引起机体器官和组织损伤；其具有较高的稳定性，不易挥发，且具有很强的耐热性和紫外线耐受性。在室温下放置6～7年毒性不减，是食品生产和加工中影响危害很大的一类真菌毒素。
近些年国内外的研究中可以见到利用特定菌株与真菌毒素相结合从而达到降解液体基质中AFB1与T-2毒素，酸奶中的乳酸菌对AFB1以及T-2毒素是否有降解作用，目前尚未有人作出相关研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的应用，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，所述真菌毒素为AFB1和/或T-2毒素。
本发明还提供一种利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法，是将保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌同时加入食品中，培养68～72 h，所述真菌毒素为AFB1和/或T-2毒素。
研究发现将三种乳酸菌加入到食品中，三种菌能够联合降解食品中的毒素，另外还发现三种菌对AFB1的降解能力并不受初始毒素浓度的影响，但三种菌的联合作用对T-2毒素的降解作用中可以看出随着初始浓度的升高，三株菌的联合解毒能力下降，因此，优选地，当真菌毒素为T-2毒素时，其食品中的T-2毒素含量为20～250 ng/mL或40 ng～500 ng/g时，降解效果好。当真菌毒素为AFB1毒素时，其食品中的AFB1毒素含量为5～100ng/mL或者10～200 ng/g时，降解效果好。
优选地，所述食品选自鱼露和腌制鱼肉中的一种或两种。
更优选地，所述腌制鱼肉为腌制罗非鱼。
优选地，上述方法中，保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的添加量为109 cfu/mL，所述保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的添加比例为1:1:1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过提供了乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的应用，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，所述真菌毒素为AFB1和/或T-2毒素，通过共培养，研究保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及干酪乳杆菌对AFB1以及T-2毒素的降解作用的异同。该研究可以有效的应用于实际生活生产当中，将有效地降低AFB1以及T-2毒素对食品的污染，对食品的现代化生产中降解黄曲霉毒素与T-2毒素具有理论指导意义和实际价值。
附图说明
图1为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的菌落特征，其中图1A为保加利亚乳杆菌，图1B为嗜酸乳杆菌，图1C为干酪乳杆菌。
图2为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的细胞形态特征，其中图1A为保加利亚乳杆菌，图1B为嗜酸乳杆菌，图1C为干酪乳杆菌。
图3为MRS培养基中三种菌的生长曲线。
图4为鱼露中三种菌的生长曲线。
图5为模拟腌制鱼肉中三种菌的生长曲线。
图6为AFB1的标准曲线。
图7为T-2毒素的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。
具体实施方式中腌制鱼肉为新鲜罗非鱼肉加高浓度盐水溶液腌制食品。
实施例1 保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的分离鉴定
将发酵乳作浓度梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5三个稀释度的液体各0.1mL涂布于已经配置好的MRS培养基上，37℃ 培养48h，48h后观察菌落形态，将保加利亚乳杆菌疑似菌落与嗜酸乳杆菌疑似菌落分别划线接种于MRS培养基上，37℃ 培养48h，48h后观察菌落形态，并拍照。
将乳酸菌乳饮品作浓度梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5三个稀释度的液体各0.1mL涂布于已经配置好的MRS培养基上，37℃ 培养48h，48h后观察菌落形态，并拍照。将干酪乳杆菌菌落划线接种于MRS培养基中，37℃培养48h，观察菌落形态并拍照。
将上述疑似菌落制成涂片，显微镜下观察形态结构并拍照。
将保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌分别转接于斜面MRS培养基中， 37℃培养24h后，保存至4℃ 冰箱。
1、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌在菌落形态方面有一定的区别，保加利亚乳杆菌菌落较大，嗜酸乳杆菌菌落较小，两种菌菌落均为乳白色，表面湿润，光滑，菌落为比较规则的圆形；干酪乳杆菌菌落为乳白色，表面湿润、光滑，边缘整齐的圆形菌落。在添加Ca2+的培养基上，菌落周围能形成明显的、直径约4～8mm的溶Ca2+圈（图1）。
2、挑取保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌的疑似菌落进行革兰氏染色并且在显微镜下观察其形态和结构特征；保加利亚乳杆菌为革兰氏阳性菌，在显微镜下菌体较粗且长，两端圆润，在显微镜下可以明显的观察到异染颗粒；嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性菌，在显微镜下菌体较小且较细，两端圆润；干酪乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，在显微镜下，菌体与保加利亚乳杆菌相比较细，较粗于嗜酸乳杆菌，菌体较长（图2）。
3、经过72h的OD600测定，绘制得到保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌三种菌株在MRS培养基、鱼露、腌制鱼肉匀浆中的生长曲线，三株菌株在不同生长基质中的生长以及相互间的生长趋势都表现出了差异性。
在MRS肉汤中，三种乳酸菌的长势良好，均在20h左右结束对数期并达到最大值，在50h～60h左右结束稳定期，开始有下降的趋势，OD值逐渐下降（图3）。
在鱼露中，三种乳酸菌的长势相比在MRS肉汤中较弱，推测原因可能是由于盐浓度过高，生长缓慢且平稳，生长曲线中并未表现出明显的对数期，在40h左右结束稳定期，开始有下降的趋势，之后OD值有明显的下降（图4）。
在模拟腌制鱼肉过程中，三种乳酸菌的生长趋势相比在MRS肉汤中较弱，推测原因可能是由于盐浓度过高，导致乳酸菌生长迟缓，但由于鱼肉中营养物质丰富，导致其生长情况优于鱼露中乳酸菌的生长情况。由图可知，保加利亚乳杆菌耐盐性较差，在最初的40h生长情况较差，但在40h后，生长趋势与嗜酸乳杆菌及干酪乳杆菌基本相同。在72h生长曲线中并未表现出明显的对数期与衰退期，推测可能由于盐浓度过高，导致乳酸菌的生长趋势有着明显的延滞性（图5）。
实施例2 乳酸菌联合作用对AFB1与T-2毒素混合毒素的降解实验
将1.0mg AFB1毒素标准品用乙腈溶解，置于10mL容量瓶中乙腈定容。配制成浓度均为0.1mg/mL标准储备液。取1mL储备液于10mL容量瓶甲醇定容，得浓度均为10μg/mL的AFB1毒素标准溶液。配得标准溶液均置于-20℃冰箱保存。
根据需要将AFB1标准溶液配制浓度为250、500、1000、2500、5000ng/mL的标准使用液；标准使用液现配现用，溶剂为30%甲醇溶液，配得标准使用液均置于-20℃冰箱保存。
根据T-2毒素的最低检出量标准，同样设置5个浓度梯度。将1.0mg T-2毒素标准品用乙腈溶解，置于10mL容量瓶中乙腈定容。配制成浓度均为0.1mg/mL标准储备液。取2mL储备液于10mL容量瓶甲醇定容，得浓度均为20μg/mL的T-2毒素标准溶液。配得标准溶液均置于-20℃冰箱保存。
根据需要将T-2毒素标准溶液配制浓度为1000、2500、5000、10000、12500 ng/mL的标准使用液；标准使用液现配现用，溶剂为30%甲醇溶液，配得标准使用液均置于-20℃冰箱保存。
为测定乳酸菌之间的相互作用对降解毒素的影响，以及乳酸菌对联合毒性的降解作用，设置将两种毒素混合，三种乳酸菌菌液混合，共同培养。
将AFB1与T-2毒素标准使用液回温至室温，并根据下表进行培养管的设置（如表1，表1中基液为鱼露或鱼肉与盐水1:1混合制得的匀浆液）。每个浓度梯度设置一个平行，每组设置一个空白对照。
1、AFB1与T-2毒素的提取和检测
培养管在37℃培养72小时后，对培养管中的毒素进行提取。配制30%的甲醇溶液，待用。
用移液枪分别吸取0.5mL培养液于已灭菌的1.5mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，使用旋涡混合仪震荡60s，用离心机离心（7000 rpm，5min），用移液枪提取上层清液于5mL已灭菌的离心管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液于60℃的全自动氮吹仪下空气吹干。用移液枪吸取1mL 30%的甲醇溶液于离心管中，旋涡混合仪上震荡30s溶解，用一次性无菌注射器吸取，并经过滤膜过滤在进样小瓶中，编号，待测。
AFB1以及T-2毒素的检测：1、质谱条件：喷雾电压：4500V；鞘气压力：35au；辅助气压：15au；毛细管温度：270°C；碰撞压：1.5mTorr。采用MRM多反应监测方式，各参数见表2。
色谱条件：色谱柱：Hypersil Gold（100mm × 2.1mm，5μL）；流动相：甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）。进样量：10μL；针头到瓶底距离：1.0mm；进样速度：10.0μL/s；淋洗体积：1500μL；淋洗速度：100.00μL/s；冲洗体积：1500μL；进样速度：250.0μL/min。梯度洗脱条件见表3。流动相：A、甲醇 B：超纯水。
将进样小瓶按编号排列放置于进样板上，通过LC-MS/MS检测，记录并分析实验数据。
2、鱼露与三种乳酸菌共培养对毒素的解毒能力实验
将分离得到的三种乳酸菌与AFB1以及T-2毒素共同在鱼露中共培养，72h后测定的结果如下。
由表4可知，在鱼露中，三株乳酸菌对T-2毒素的联合解毒能力弱于AFB1。相比较于三株菌的单独解毒作用，三株菌的联合解毒能力更好。
3、模拟腌制鱼肉中三种乳酸菌对毒素的解毒能力实验
将分离得到的三种乳酸菌与AFB1以及T-2毒素共同在模拟腌制鱼肉中共培养，72h后测定的结果如下。
由表5可知，在模拟腌制鱼肉中，低浓度下三株菌对T-2毒素的联合解毒能力优于对AFB1的联合解毒能力，随着毒素浓度的增高，三株菌对AFB1的解毒能力逐渐高于T-2毒素的解毒能力；对比三株菌的单独解毒作用，三株菌的联合解毒能力更好。
经过试验可知，从酸奶中分离得到的保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌对AFB1以及T-2毒素均有不同程度的降解作用。
三株菌的联合作用对T-2毒素的降解作用中可以看出随着初始浓度的升高，三株菌的降解能力出现下降。但三株菌对AFB1的降解能力并不受初始毒素浓度的影响。
Claims (6)
1.乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的应用，其特征在于，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，所述真菌毒素为AFB1和/或T-2毒素。
2. 一种利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法，其特征在于，是将保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌同时加入食品中，培养68～72 h，所述真菌毒素为AFB1和/或T-2毒素。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当真菌毒素为T-2毒素时，其食品中的T-2毒素含量为20～250ng/mL或者40~500 ng/g；当真菌毒素为AFB1毒素时，其食品中的AFB1毒素含量为5～100ng/mL或者10～200 ng/g。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述食品选自鱼露和腌制鱼肉中的一种或两种。
5. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的添加量为109 cfu/mL。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的添加比例为1：1：1。
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