CN106119318A - 一种提高s‑腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法 - Google Patents
一种提高s‑腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种提高S‑腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，该方法采用基因敲除技术敲除产朊假丝酵母的线粒体膜上的膜孔蛋白基因，提高线粒体膜通透性，促进NADH进入线粒体，增强通过呼吸链合成ATP的效率，最终实现酵母胞内SAM和GSH联产产量的提高。本发明的方法为真核细胞内类似耗能好氧合成化合物的高产提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高SAM和GSH联产发酵产量的方法。
背景技术
S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)均为生物体内重要的含硫小分子活性化合物。
SAM由底物L-蛋氨酸和ATP经S-腺苷蛋氨酸合成酶(EC 2.5.1.6)酶促合成，是生物体内重要的代谢中间物质，参与生物体内40多种生化反应，具有转甲基、转硫和转氨丙基等作用。SAM可以通过转硫基增加肝内GSH、硫酸根及牛磺酸水平，临床上可用于防止肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌，也可防止酒精、药物和细胞素对肝脏的损伤。SAM还具有消炎、止痛的功能，对于关节炎、纤维性肌肉、偏头痛等疾病也具有很好的治疗效果，而且副作用小。早在上世纪70年代，欧洲已将SAM作为治疗关节炎的处方药使用。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，在美国己成为最畅销的营养品之一。
GSH是一种广泛存在于自然界的活性三肽化合物，是生物体内最重要的活性巯基化合物之一，在生物体内具有多种重要的生理功能：维持生物体适宜的氧化还原环境；保护蛋白质的硫氢基；清除细胞内活性氧自由基等。正因为GSH在细胞内具有如此重要的生理功能，使得其在临床医学、运动保健、食品加工等很多领域都有着广泛的应用前景。临床方面，GSH常作为肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病的辅助治疗药物。GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状也能起到保护作用。同时GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒作用。最新研究还表明，GSH能够纠正体内乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽，另外，GSH在改善性功能方面也有很好作用。近年来，西方科学家发现谷胱甘肽也具有抑制艾滋病病毒的功能。食品加工方面，将GSH加入到面制品中，可起到还原作用，不仅使制造面包的时间大大缩短，劳动条件大幅度改善，而且起到强化食品营养的作用；将其加入到酸奶和婴幼儿食品中，相当于维生素C，可起到稳定剂的作用；将其拌到鱼糕中，可防止色泽加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。
由于SAM和GSH在多方面的作用，特别是医药方面的突出作用，人们对二者的需求量也迅猛增加，但目前国内需求主要依赖进口，且价格居高不下。
SAM和GSH的生产方法有化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中化学合成法由于具有过程复杂、耗时的缺陷，限制了其工业化应用。酶法合成SAM和GSH具有产物纯度高，易提取等优点，但原料腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)价格昂贵成为酶法合成SAM和GSH的限制性因素。目前酵母发酵法被认为是SAM和GSH生物合成最有潜力的方法，然而对于发酵法生产SAM和GSH的已有研究中大都集中在其中一种产物的生产上，而事实上，由于SAM和GSH均是酵母细胞含硫物质代谢网络中的重要节点物质，二者在合成过程中存在着复杂的关联，值得注意的一点是：在SAM的分解代谢过程中会通过转硫作用合成L-半胱氨酸，为GSH的合成提供重要前体从而促进了GSH的合成。近年来，利用一种微生物菌株发酵联产SAM和GSH也逐渐引起了研究者的广泛关注。
在SAM和GSH的生物合成过程中，ATP作为限制性底物和能 量物质，其作用不可替代，胞内ATP含量的多少决定着底物的转化效率以及SAM和GSH能否高效合成。而在实际发酵生产过程中，ATP的供应往往不足，增加ATP的供应能够提高SAM和GSH联产产量。在产朊假丝酵母消耗葡萄糖的好氧代谢过程中，细胞质中产生的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)只有跨过线粒体膜进入线粒体中才能最终被氧化产生ATP。截止到目前，针对SAM和GSH合成菌株的遗传改造主要集中于SAM合成酶基因和GSH合成酶基因的过量表达上。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，该方法提高线粒体膜通透性，促进NADH进入线粒体，增强通过呼吸链合成ATP的效率，最终实现酵母胞内SAM和GSH联产产量的提高。
本发明的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，包括以下步骤：采用产朊假丝酵母(Candida utilis CCTCC M 209298，以下简称C.utilis)为出发菌株，敲除其线粒体膜上膜孔蛋白基因(Por1)后获得突变菌株(C.utilisΔPor1)，并利用所述突变菌株进行发酵培养。
进一步的，敲除所述Por1基因包括Por1基因上、下游片段、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)的启动子序列以及kan基因片段重组的步骤。
进一步的，所述敲除技术包括以下步骤：
(1)以酿酒酵母的GAP的启动子序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)为模板，比对找出C.utilis的GAP启动子序列，设计引物 GAP-for和GAP-rev，以C.utilis基因组为模板扩增出C.utilis的GAP启动子序列，
其中，GAP-for的核苷酸序列为：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；
GAP-rev的核苷酸序列为：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；
(2)将扩增出的GAP启动子片段与含kan基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)的质粒经过酶切、连接、转化后，拼接到一起后，设计引物Kan-for和Kan-rev，进行重叠PCR，获得到GAP-kan片段，
其中Kan-for的核苷酸序列为：TCAGCTTTGAGACCTGGGGTCAAAGCATCAGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAAT；
Kan-rev的核苷酸序列为：GCCTTTTTTGCCCTCGAGCTGTTTTCTTAGGCCTGGGACCCGTGGGCCGCCGTCGGAC；
(3)找出C.utilis的Por1基因位置，调出其上、下游各1000bp的片段，设计引物por1up-for、por1up-rev和por1down-for、por1down-rev，以C.utilis基因组为模板，分别扩增出Por1基因上、下游片段Por1-up和Por1-down(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示)，其中，por1up-for的核苷酸序列为：TGAAGGCTGAAGAAAATGTTGTCGC；
por1up-rev的核苷酸序列为：ATTTGAGTGCTCGCTGTAAGCTTGGATCTGATGCTTTGACCCCAGGTCTCAAAGCTGA；
por1down-for的核苷酸序列为：GTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTAAGAAAACAGCTCGAGGGCAAAAAAGGC；
por1down-rev的核苷酸序列为：CAGGTTCCATTCGGTGGTTACAAGG；
(4)将所述Por1-up、Por1-down和GAP-kan三片段按摩尔比1:0.8-1.2:0.8-1.2的比例混合后，利用引物por1up-for、por1down-rev 进行overlap PCR，获得Por1基因敲除组件Por1-up-GAP-kan-Por1-down；
(5)利用电转化法将Por1基因敲除组件转入C.utilis感受态细胞中，在斜面培养基平板上进行培养，筛选阳性单克隆；
(6)将获得的单克隆进行复苏，提取基因组，在Por1基因上游同源臂片段Por1-up上游、下游同源臂片段Por1-down下游以及kan基因中间设计引物up-for、up-rev和down-for、down-rev，进行PCR验证和测序验证，验证均正确的突变菌株即为构建成功的Por1基因敲除菌株，
其中，up-for的核苷酸序列为：AAGTGTTAAAAATGTAAACAAAGCA；
up-rev的核苷酸序列为：CACACCGGACGGGGGCCACTACATC；
down-for的核苷酸序列为：GATGTAGTGGCCCCCGTCCGGTGTG；
down-rev的核苷酸序列为：GTTGGATCAACACTTACAACGATCT。
进一步的，所述突变菌株经活化、培养获得种子培养液后进行发酵培养。
进一步的，所述突变菌株经种子培养活化4-6小时。
进一步的，活化后的所述突变菌株接入装有种子培养基的容器中振荡培养20-28小时，获得种子培养液。
进一步的，所述种子培养温度为25-35℃，摇床转速180-230rpm。
进一步的，所述种子培养液接种到装有发酵培养基的容器中或发酵罐中发酵培养20-40小时。所述发酵培养基温度为25-35℃，摇床转速为180-230rpm；所述发酵罐的培养温度为25-35℃，搅拌转速为300-400rpm，通气量为2-4L/min，pH值为4.8-5.2。
进一步的，所述种子培养液的接种量为9-11％(v/v)。
本发明的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法在真核细胞内通过耗能好氧代谢合成化合物中的应用。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明采用基因敲除手段对C.utilis细胞进行遗传改造，获得了线粒体膜上膜孔蛋白基因Por1敲除的突变菌株C.utilisΔPor1，使NADH通往呼吸链的效率增强，提高了ATP的合成速率，促进了SAM和GSH在产朊假丝酵母胞内的合成和积累；为SAM和GSH联产发酵过程的优化增添了新的方法；同时也为真核细胞内类似耗能合成化合物的高产提供了新的思路。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为本发明中原始菌株(WT)和突变菌株(2A)进行PCR验证结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中的培养基：
斜面培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、遗传霉素0.1g/L、琼脂粉15g/L、pH值6.0。
种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、pH值6.0。
发酵培养基：葡萄糖35g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾12.3g/L、L-蛋氨酸4.6g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钙0.05g/L、pH5.0。
实施例一：利用原始菌株C.utilis CCTCC M 209298(WT)摇瓶发酵培养
将原始菌株C.utilis CCTCC M 209298按10％(v/v)的接种量接种到50mL发酵培养基中，于30℃，200rpm下摇床培养30小时。
酵母生物量的测定：以细胞干重(DCW)表示酵母生物量。取10mL发酵液，4000rpm下离心5min，蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70℃烘干至恒重。
胞内GSH的提取及测定：发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，30℃下在40％乙醇溶液中处理2小时，离心取上清液作为待测样品。样品中的GSH浓度采用5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)[DTNB]-谷胱甘肽还原酶循环法进行测定。
胞内SAM的提取及测定：发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，在4℃下用0.35mol/L稀硫酸处理2小时，离心，上清液经0.22μm滤膜过滤作为待测样品。SAM浓度采用HPLC法测定，流动相为0.5mol/L甲酸铵溶液(pH 4.0)，流速1mL/min，柱温25℃
经测试，利用原始菌株摇瓶发酵培养的实验结果：
细胞干重：11.53-11.89g/L；SAM产量：130.5-137.7mg/L；GSH产量：157.5-163.1mg/L；SAM和GSH联产产量：288.2-300.8mg/L；胞内SAM含量：1.12-1.25％；胞内GSH含量：1.29-1.37％。
实施例二：利用突变菌株C.utilisΔPor1(2A)摇瓶发酵培养
实施例中的引物序列如下列表1所示：
表1：引物序列表
1、产朊假丝酵母线粒体膜上Por1基因的敲除
(1)在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索到C.utilis的全基因组序列，以酿酒酵母的GAP启动子序列为模板，比对找出C.utilis的GAP启动子序列，设计引物GAP-for、GAP-rev，以C.utilis CCTCC M 209298基因组为模板扩增出C.utilis的GAP启动子序列，片段大小1000bp左右；
(2)将扩增出的GAP启动子片段与含kan基因片段的质粒经过酶切、连接、转化后，拼接到一起后，利用引物kan-for、kan-rev进 行PCR扩增，获得到GAP-kan片段，片段大小1800bp左右；
(3)找出Por1基因的位置，调出Por1基因上、下游各1000bp的片段，设计引物por1up-for、por1up-rev和por1down-for、por1down-rev，以C.utilis CCTCC M 209298基因组为模板，分别扩增出Por1基因上、下游片段Por1-up和Por1-down，片段大小均为1000bp左右；
(4)再将Por1-up、Por1-down和GAP-kan三片段按摩尔比1:1:1的比例混合后，利用引物por1up-for、por1down-rev进行overlap PCR，获得Por1基因敲除组件Por1-up-GAP-kan-Por1-down，片段大小3800bp左右；
(5)利用电转化法将Por1基因敲除组件转入C.utilis CCTCC M 209298感受态细胞中，在含有100mg/L的遗传霉素(G418)的种子培养基平板上进行培养，筛选阳性单克隆；
(6)将获得的单克隆进行复苏，提取基因组。在Por1基因上游同源臂片段Por1-up上游，下游同源臂片段Por1-down下游，以及kan基因中间设计引物up-for、up-rev和down-for、down-rev，进行PCR验证。
验证结果如图1所示，结果显示，原始菌株(WT)上下游均为出现条带，而突变菌株(2A)上下游均出现条带，条带大小基本与目标条带一致，故GAP-kan片段成功插入Por1基因上、下游(2A-up和2A-down)之间，将Por1基因替换。将2A-up和2A-down测序拼接后，测序验证也与原导入序列一致，进一步说明GAP-kan片段成功将Por1基因替换。因此，2A为所需要的Por1基因敲除菌株，其中2A-up和2A-down的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
2、种子活化、培养
突变菌株在种子培养基中活化4小时后接入装有50mL种子培养 基的500mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时，获得种子培养液。
3、摇瓶发酵培养，其方法步骤与实施例一中相同，其区别在于将新鲜种子培养液按10％(v/v)的接种量接种到50mL发酵培养基中。
采用与实施例一相同的酵母生物量测定、胞内GSH的提取及测定、胞内SAM的提取及测定方法，经测试，利用突变菌株摇瓶发酵培养的实验结果：
细胞干重：11.07-11.70g/L；SAM产量：150.5-160.6mg/L；GSH产量：185.8-195.5mg/L；SAM和GSH联产产量：336.3-356.1mg/L；胞内SAM含量：1.31-1.45％；胞内GSH含量：1.67-1.73％。
实施例三：利用原始菌株C.utilis CCTCC M 209298分批发酵培养
将原始菌株C.utilis CCTCC M 209298按10％(v/v)的接种量接种至5L发酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司)中，装液量3L，接种量10％，温度30℃，搅拌转速350rpm，通气量3L/min，pH 5.0，培养时间30小时。
采用与实施例一相同的酵母生物量测定、胞内GSH的提取及测定、胞内SAM的提取及测定方法，经测试，利用原始菌株分批发酵培养的实验结果：
细胞干重：12.67～12.99g/L；SAM产量：184.7～194.1mg/L；GSH产量：205.8～216.9mg/L；SAM和GSH联产产量：390.5～411.0mg/L；胞内SAM含量：1.55～1.63％；胞内GSH含量：1.63～1.69％。
实施例四：利用突变菌株C.utilisΔPor1分批发酵培养
1、产朊假丝酵母线粒体膜上Por1基因的敲除、其方法步骤与实施例二中相同。
2、种子活化、培养，其方法步骤与实施例二中相同。
3、分批发酵培养，其方法步骤与实施例三中相同，其区别在于：将新鲜种子培养液接种至5L发酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司)中。
采用与实施例一相同的酵母生物量测定、胞内GSH的提取及测定、胞内SAM的提取及测定方法，经测试，利用突变菌株分批发酵培养的实验结果：
细胞干重：14.16～14.88g/L；SAM产量：237.0～249.2mg/L；GSH产量：286.7～301.4mg/L；SAM和GSH联产产量：523.7～549.6mg/L；胞内SAM含量：1.78～1.87％；胞内GSH含量：2.06～2.17％。
综上所述，本发明采用基因敲除手段对C.utilis细胞进行遗传改造，通过与采用原始菌株的实验数据对比，采用突变菌株的实验数据表明：线粒体膜上Por1基因的敲除促进了SAM和GSH在C.utilis胞内的合成和积累；为SAM和GSH联产发酵过程的优化增添了新的方法；同时也为真核细胞内类似耗能合成化合物的高产提供了新的思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用产朊假丝酵母为出发菌株，敲除其线粒体膜上膜孔蛋白基因后获得突变菌株，所述突变菌株进行发酵培养得到S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：敲除所述膜孔蛋白基因包括膜孔蛋白基因上、下游片段、三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子序列以及kan基因片段重组的步骤。
3.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：敲除所述膜孔蛋白基因包括以下步骤：
(1)以酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)为模板，比对找出产朊假丝酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子序列，设计引物GAP-for和GAP-rev，以产朊假丝酵母基因组为模板扩增出产朊假丝酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶的启动子序列，
其中，GAP-for的核苷酸序列为：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；
GAP-rev的核苷酸序列为：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；
(2)将扩增出的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列片段与含kan基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)的质粒经过酶切、连接、转化后，拼接到一起后，设计引物Kan-for和Kan-rev，进行重叠PCR，获得到GAP-kan片段，
其中Kan-for的核苷酸序列为：TCAGCTTTGAGACCTGGGGTCAAAGCATCAGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAAT；
Kan-rev的核苷酸序列为：GCCTTTTTTGCCCTCGAGCTGTTTTCTTAGGCCTGGGACCCGTGGGCCGCCGTCGGAC；
(3)找出产朊假丝酵母的膜孔蛋白基因位置，调出其上、下游各1000bp的片段，设计引物por1up-for、por1up-rev和por1down-for、por1down-rev，以产朊假丝酵母基因组为模板，分别扩增出膜孔蛋白基因上、下游片段Por1-up和Por1-down(其核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示)，
其中，por1up-for的核苷酸序列为：TGAAGGCTGAAGAAAATGTTGTCGC；
por1up-rev的核苷酸序列为：ATTTGAGTGCTCGCTGTAAGCTTGGATCTGATGCTTTGACCCCAGGTCTCAAAGCTGA；
por1down-for的核苷酸序列为：GTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTAAGAAAACAGCTCGAGGGCAAAAAAGGC；
por1down-rev的核苷酸序列为：CAGGTTCCATTCGGTGGTTACAAGG；
(4)将所述Por1-up、Por1-down和GAP-kan三片段按摩尔比1:0.8-1.2:0.8-1.2的比例混合后，利用引物por1up-for、por1down-rev进行重叠PCR，获得膜孔蛋白基因敲除组件Por1-up-GAP-kan-Por1-down；
(5)利用电转化法将膜孔蛋白基因敲除组件转入产朊假丝酵母感受态细胞中，在斜面培养基平板上进行培养，筛选阳性单克隆；
(6)将获得的单克隆进行复苏，提取基因组，在膜孔蛋白基因上游同源臂片段Por1-up上游、下游同源臂片段Por1-down下游以及kan基因中间设计引物up-for、up-rev和down-for、down-rev，进行PCR验证和测序验证，验证均正确的突变菌株即为构建成功的膜孔蛋白基因敲除菌株，
其中up-for的核苷酸序列为：AAGTGTTAAAAATGTAAACAAAGCA；
up-rev的核苷酸序列为：CACACCGGACGGGGGCCACTACATC；
down-for的核苷酸序列为：GATGTAGTGGCCCCCGTCCGGTGTG；
down-rev的核苷酸序列为：GTTGGATCAACACTTACAACGATCT。
4.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：所述突变菌株经活化、培养获得种子培养液后进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：所述突变菌株经种子培养基活化4-6小时。
6.根据权利要求5所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：活化后的所述突变菌株接入装有种子培养基的容器中摇床培养20-28小时，获得种子培养液。
7.根据权利要求6所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：培养温度为25-35℃。
8.根据权利要求4或6所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：所述种子培养液接种到装有发酵培养基的容器中发酵培养20-40小时。
9.根据权利要求8所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：所述种子培养液的接种量为9-11％。
10.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法，其特征在于：所述方法用于在真核细胞内通过耗能好氧代谢合成化合物。
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| CN201610519265.1A CN106119318B (zh) | 2016-07-05 | 2016-07-05 | 一种提高s-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵产量的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王玉磊等: "基于能量代谢分析的S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产方法", 《化工学报》 * |
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