CN106075429B - 一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途。本发明的一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗，其有效成分为本发明发明人自行分离且经传代致弱培养后获得的山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒或其传代毒，其中山羊痘病毒为Goatpox Virus HN‑XY2010F43株，绵羊痘病毒为Sheeppox Virus GS‑WW 2010 F44株，羊传染性脓疱病毒为Orf Virus HB‑TS09F65株。攻毒保护试验结果显示，本发明所制备的山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗安全，且能够产生有效的免疫保护力。本发明对于研制安全高效的山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗以及防控羊痘和羊口疮具有重要的现实意义。

Description

一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗及其制备方法 和用途

技术领域

本发明涉及一种弱毒疫苗及其制备方法和用途，特别涉及一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗及其制备方法和用途，本发明属于兽医生物制品领域。

背景技术

羊痘病毒(Capripox virus,CPV)是最重要的动物痘病毒，在分类地位上属于痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)中的羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员，包括山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheep poxvirus,SPPV)和牛结节疹病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、接触性传染病，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为93种必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类传染病。其发病率可达75％以上，死亡率可达50％以上，羔羊死亡率可达100％，同时还可导致母羊流产。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘。后来，陆续在世界其他地区报道了该病。该病广泛分布于非洲、中东、印度次大陆、北欧、地中海各国及德国、澳大利亚、美国等，特别是非洲北部、中东和亚洲的部分国家流行较为严重。与我国接壤的周边国家，如印度、孟加拉、尼伯尔、巴基斯坦、俄罗斯、蒙古等不少国家均有本病的流行。近几年我国的江苏、广东、贵州、山东、浙江、广西、甘肃、黑龙江等地均有本病流行。该病的爆发和流行使家畜的生产力下降，活畜及畜产品贸易停滞，给养羊业的发展造成极大的经济损失。

山羊痘(Goat pox)是山羊的一种高度接触性传染病；绵羊痘病毒(Sheep pox)是绵羊的一种高度接触性传染病。自然状况下，羊痘病毒具有高度的宿主特异性,山羊痘只引起山羊发病；绵羊痘只引起绵羊发病。但这种宿主特异性常随分离株的不同而变化。Davies及Kitehingand Taylor报道，肯尼亚、也门和阿曼的绵羊分离株可同时感染山羊和绵羊。另外，山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)在血清上呈交叉反应。近年来，国内外山羊痘、绵羊痘频繁爆发，而山羊痘、绵羊痘尚无有效的治疗方法，免疫接种是预防山羊痘、绵羊痘唯一行之有效的措施。

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagious pustular dermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的的人兽共患传染病,以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早发现于欧洲，目前，几乎在所有养羊国家和地区均存在。自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。此外，骆驼、牛、鹿、麝牛、猫、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群发性流行的趋势，3～6月龄羔羊最易感染，常引起群体发病，尤其是饲养密集的羊群。范春玲等报道了我国2006年在北京市亚福动物养殖中心暴发该病，该病传播速度快，发病率高达95.4％。近年来随着肉羊产业的发展和羊频繁流动，该病时有发生，甚至在一些大型种羊场都有该病的流行，给养羊业带来了巨大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展。更为严重的是，此病可以通过伤口感染饲养人员，感染者表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。可见，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。

近年来，国内外羊痘、羊口疮频繁爆发，而羊痘、羊口疮尚无有效的治疗方法，免疫接种是预防羊口疮唯一行之有效的措施。目前尚无一种能够一针防三病的山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗。目前羊痘、羊口疮疫苗的研发和应用主要集中在常规疫苗，如灭活疫苗和细胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亚单位疫苗、核酸疫苗和重组疫苗上。但是目前，羊痘、羊口疮新型疫苗的研制还处于试验阶段，且新型疫苗往往制备过程繁琐、技术要求高，应用于临床还有很长一段路要走。羊痘、羊口疮灭活疫苗虽然国内外学者均有研究，但其免疫效果有限，从未真正应用于临床。目前，在临床上应用较为广泛的仍然是羊痘、羊口疮弱毒疫苗，因为它具有用量少，能诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫能力，且产生免疫保护力的时间持久的特点。在国内，虽然羊口疮弱毒疫苗在青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所均有研制，但其生产工艺复杂、落后，冻干保护剂不耐热等诸多生产工艺瓶颈问题，是该疫苗无法量产，目前该疫苗处于有品无苗的局面。另外，该弱毒都是上世纪80年代前后的毒株，目前国内流行毒可能发生变异，很难保证其免疫的有效性。山羊痘弱毒疫苗在国内几家疫苗厂家均有生产，但该疫苗生产过程需要羊睾丸原代细胞，冻干保护剂不耐热等工艺问题，使该疫苗生产、运输及保存成本过高。山羊痘、绵羊、羊口疮病毒三联细胞弱毒疫苗研究，尚属空白。国内外学者现已证实，山羊痘、绵羊痘弱毒疫苗对处于同科的羊口疮病毒具有部分交叉免疫保护。因此，研制一种抗原谱广、免疫原性好、制苗工艺简单的山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗，对预防国内山羊痘、羊口疮爆发和流行具有一加一大于二的现实意义。

本发明选用自行分离获得的GTPV河南信阳市分离毒株(Goatpox virus HN2010株)、SPPV甘肃武威分离毒株(Sheeppox Virus GS-WW 2010株)和ORFV湖北通山县分离毒株(Orf virus HB09株)作为疫苗研制的候选毒株，利用牛/羊睾丸支持细胞系和鸡胚成纤维原代细胞传代致弱，培育出符合“兽用新生物制品质量标准”的GTPV、SPPV和ORFV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐热冻干保护剂制备冻干弱毒疫苗。攻毒保护试验结果显示所制备的山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗能够产生有效的免疫保护力。因此，本发明利用GTPV、SPPV和ORFV流行毒株研制安全、高效的弱毒疫苗对于羊痘、羊口疮的防治具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有羊痘、羊口疮弱毒疫苗的不足，本发明的目的在于提供一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出产量高、抗原谱广、稳定性好、成本低、安全可靠的疫苗。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的一种山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗，其特征在于其有效成分包括山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱，其中，所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCC NO：V201503；所述绵羊痘病毒细胞传代致弱毒为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010F44株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCC NO：V201504；所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年3月19日，保藏编号为CCTCC NO：V201406。

其中，所述的山羊痘毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株已记载在公开号为CN104800842A，发明名称为“一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用”的专利申请中，并于2015年7月29日公开。

其中，所述的绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株已记载在公开号为CN104800842A，发明名称为“一种山羊痘、绵羊痘二价细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用”的专利申请中，并于2015年7月29日公开。

其中，所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，已记载在公开号为CN104017776A，发明名称为“一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用”的专利申请中，并于2016年4月6日公开。

此外，本发明还提供了一种制备山羊痘、绵羊痘以及羊口疮三联细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％接种权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒；选生长良好布满单层的羔羊睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％分别接种权利要求1所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒，绵羊痘病毒细胞传代致弱毒，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且羊传染性脓疱病毒滴度不低于10^-6.0TCID₅₀/0.1ml时，作为以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原；山羊痘、绵羊痘病毒滴度不低于10^-3.5TCID₅₀/0.1ml时，作为山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原，备用；

(2)疫苗的配制和冻干

将步骤(1)制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1：1︰1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、绵羊痘以及羊口疮病毒三联细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下保存。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞系为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201438。该细胞系已记载在公开号为CN103952377A，发明名称为“一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用”的专利申请中，并于2016年3月30日公开。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的羔羊睾丸支持细胞系为羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，分类命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120，保藏时间为2016年6月3日。

本发明通过试验发现，所获得的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)，对接种羊痘病毒较为敏感，用该细胞系所增殖的病毒滴度较采用羔羊睾丸原代细胞高约1.5个病毒滴度；比Vero细胞高2.5个病毒滴度；比BHK₂₁细胞高2.3个病毒滴度。利用该细胞系分离羊痘病毒(GTPV或SPPV)可以保证病毒的均一、稳定，同时可以避免因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其他病原的风险。同时利用该传代细胞系制备疫苗，可简化生产工艺、缩短生产周期，降低生产成本，同时还保证了制备得到的羊痘疫苗的质量保持稳定，

在本发明所述的方法中，优选的，按原营养液体积的5％分别接种所述的山羊痘、绵羊痘以及羊口疮病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。

在本发明所述的方法中，优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C 1～5g/L，剩余成分为超纯水。更优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。

所述的耐热冻干保护剂的制备方法包括：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：各组分别将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的免疫保护力；

2、利用本实验室研制的针对GTPV、SPPV和ORFV的耐热冻干保护剂，解决了痘病毒活疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的瓶颈技术，使该疫苗储存、运输更方便。

3、在疫苗的制备方法中分别采用新生牛睾丸支持细胞系NBSC以及羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)制备羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株、绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株以及山羊痘毒细胞传代致弱疫苗株Goatpox Virus HN-XY2010F43株的病毒液，提高了病毒滴度，并且可以保证病毒的均一、稳定，同时可以避免因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其他病原的风险。此外利用该传代细胞系制备疫苗，可简化生产工艺、缩短生产周期，降低生产成本，同时还保证了制备得到的羊痘疫苗的质量保持稳定。

本发明将为临床上针对山羊痘、绵羊痘和羊口疮病的防控以及山羊痘、绵羊痘和羊口疮病毒在羊群中的清除提供了重要的物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为37℃、38.5℃和39.5℃条件下羔羊睾丸原代细胞体外生长曲线；

图2为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的体外培养；

A：消化后培养0小时的支持细胞；B：培养2h的支持细胞；C：培养12h的支持细胞；D：培养72h的支持细胞；E：培养2h的自然传代细胞(LSC)；F：培养72h的自然传代细胞(LSC)；

图3为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的鉴定；

A：分离纯化培养的第3代支持细胞HE染色；B：自然传代第10代LSC细胞HE染色；C：分离纯化培养的第3代支持细胞FasL蛋白检测；D：分离纯化培养的第三代支持细胞FasL蛋白检测结果；E：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测；F：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不多本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。

实施例1羊睾丸支持细胞的分离、培养及鉴定

1.1羊睾丸原代细胞的制备

选健康母羊(体质健康且口蹄疫、布氏杆菌、结核检测为阴性)所生的健康公羔羊，屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75％酒精消毒)，恒温箱内，2小时内送回实验室。用眼科镊子和剪刀将睾丸实质剪切成约1mm×3mm的小块，在D-hanks液中轻轻吹打数次，去除上清，将小组织块放入50mL离心管中加入10倍体积的含0.1wt％IV型胶原酶(GIBCO)、0.25wt％胰酶(GIBCO)的消化液4℃消化12h或过夜，用等体积含10％(v/v)新生牛血清(GIBCO)的DMEM培养液(HyClone)终止消化。用吸管柔和吹打数次后，用200目铜网过滤。收集消化液1000r/min离心10min，弃上清，用无血清DMEM培养液漂洗2次，弃上清，加入含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。

1.2不同培养条件下羊睾丸原代细胞生长曲线测定

将1.1节中制备的羊睾丸原代细胞悬液以1-2×10⁶个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。

将上述制备的新生羊睾丸支持细胞(第三代)以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于6块24孔板中，分别置于37℃、38.5℃和39.5℃5％CO₂、饱和湿度条件下培养(不同温度各培养2块)，试验自接种起，每隔24h各取3个孔细胞，贴壁支持细胞数目计数，取平均值，连续10d。测定不同培养温度条件下支持细胞的生长情况。优化最佳纯化培养温度和羊睾丸支持细胞差速贴壁纯化培养条件。

1.3羔羊睾丸支持细胞的分离、纯化培养

将1.1节中制备的细胞悬液以1-2×10⁶个/mL的密度接种到培养瓶中，分三组，每组5瓶，分别置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养6h后，换液，弃未贴壁细胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养液，继续纯化、传代培养3代。然后进行细胞鉴定。

1.4羔羊睾丸支持细胞的鉴定

将1.3节中分离、纯化培养的支持细胞细胞系进行HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定。

免疫组化方法如下：将培养3d的支持细胞用4％多聚甲醛溶液固定10min，PBS漂洗3次×5min，山羊血清室温下封闭孵育20min，加入兔抗大鼠FasL多克隆抗体(abcam公司，1∶100稀释)一抗混合工作液，37℃孵育3h，PBS漂洗3次，加入FITC标记山羊抗兔IgG(abcam公司，1∶50稀释)二抗混合工作液37℃孵育30min，PBS漂洗3次，荧光显微镜下随机选择10个视野，绿色荧光下观察FasL染色结果。计算每视野中FasL阳性细胞和细胞总数，计算阳性细胞百分比，得到支持细胞的纯度。

1.5羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系的建立

1.3节中分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养(每孔培养细胞小于5个)，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的睾丸支持细胞的第3到13代)。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。将该细胞HE染色观察细胞形态，同时，采用FasL蛋白进行支持细胞的免疫组化鉴定；同时对该细胞系进行进一步传代试验，跟踪其传代培养特性。

1.6结果

试验发现，37℃和38.5℃培养条件下，羔羊睾丸原代细胞潜伏期均为2天，之后进入对数生长期；而39.5℃培养条件下的羔羊睾丸原代细胞潜伏期比37℃和38.52培养条件下的短，提前进入对数生长期；随培养温度的升高，对数生长期细胞增殖速率增大；原代接种5天后,37℃组、38.5℃组和39.5℃组支持细胞进入平台期，但39.5℃组支持细胞平台期维持约1天，之后迅速进入退化衰亡期；38.5℃组平台期维持约4天，之后进入衰亡期；而37℃组测定时间区间内一直处于平台期(图1)。在羔羊睾丸原代细胞中数量最多的是睾丸支持细胞，因此，该曲线也可说明在不同温度条件下羊睾丸支持细胞的生长特性。由此证明，纯化羔羊睾丸支持细胞的最佳温度为38.5℃。

经38.5℃高温培养结合6h差速贴壁，进过三代纯化后得到的支持细胞，刚接种细胞为圆点状，折光性强(图2A)；培养2h开始贴壁(图2B)，伸出突起，胞质开始铺展；培养6h后完全贴壁，培养12h后即可进入增殖期，细胞增殖较快，胞质开始扩张，形态呈现多变形状(图2C)；培养24h后，可见胞体较大、呈长柱状贴壁生长、两侧有多个突起、折光性较强的细胞，此即睾丸支持细胞。培养48h后，睾丸支持细胞体积进一步增大，呈膜状生长于瓶壁,细胞相互连接成网状，胞核清晰可见，位于胞体的中央或稍偏位。睾丸支持细胞的折光性随培养时间的延长而降低，圆型的细胞贴壁数量逐渐减少，睾丸支持细胞占细胞总数的95％以上，亦有少量成纤维细胞生长；3-4d后，长满瓶壁，形成单层细胞(图2D)。分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，培养2h开始贴壁(图2E)，72h长满单层(图2F)，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(图2D)，该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系。

经HE染色，分离纯化的支持细胞和自然传代培养的LSC，两者形态基本一致(图3A，3B)，其大多呈卵圆形，胞质完全铺开，染色呈红色，而细胞核染色较深，呈蓝色，形状呈圆形或椭圆形位于细胞质中央或偏位，核仁明显，间接免疫荧光检测睾丸支持细胞和自然传代培养的LSC均高表达FasL蛋白，均可看到绿色荧光，支持细胞阳性率达到95％以上(图3C-3F)。

由上证明，用分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，进一步传代培养，将持续培养的细胞消化，有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC。该细胞系已于2016年6月3日送交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2016120。

实施例2羊痘病毒的增殖

羊痘病毒可在牛、绵羊、山羊源的组织细胞上生长，其中对原代或次代羔羊睾丸细胞(LT)和羔羊肾细胞(LK)最为敏感；病料接种细胞后最早可在感染后3d出现少量细胞病变效应(CPE),之后4-6天CPE迅速扩展到整个细胞层，观察是否出现CPE最多持续到14d。典型的CPE为细胞变圆、细胞聚集呈束状结构、细胞收缩或膨胀、细胞核空泡化、染色质片段化、细胞单层失去连贯性、细胞浆中出现包涵体(Adl a等，1971；Joshi等，1994)。除此之外，羊痘病毒也可以在BHK-21细胞和Vero细胞上增殖。一些毒株还能在胎牛肌肉细胞、犊牛肾细胞和牛肾上皮(MDBK)细胞系中生长。

因此，本发明人选用Vero细胞、BHK-21细胞、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)五种细胞接种同一毒株、同一代次的羊痘病毒进行平行对比，来比较这三种细胞对该病毒的增殖情况。同时，将分离纯化培养的新生牛睾丸支持细胞进行传代培养，进一步研究该细胞系的传代培养特性及利用该细胞系增殖病毒的特性。

2.1羊痘病毒对Vero细胞、BHK-21细胞、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)敏感性试验

将生长良好铺满单层的BHK-21细胞、Vero细胞上增殖、羔羊睾丸原代细胞、分离纯化的睾丸支持细胞和羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)各三瓶(营养液体积为10ml)，倾去营养液，按原营养液体积的10％接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株(保藏号：CCTCC V201503)制苗弱毒1ml/瓶，另外一瓶做对照。病毒吸附30分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养，培养40～72h，逐日观察细胞的生长和细胞病变(Cytopathic effect,CPE)情况。当CPE达到75％时收获病毒，置-20℃冰箱冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后，用Reed-Muench法测定利用三种不同细胞增殖病毒的TCID₅₀/0.1ml。结果见表1所示：

表1三种细胞对GTPV病毒的敏感性试验结果

试验发现，Vero细胞在接种病毒后60h出现细胞即呈现折光性增强、变圆、聚堆等细胞病变(Cytopathic effect,CPE)，后期细胞发生皱缩，甚至脱落，CPE达到75％以上，需要140h；BHK₂₁细胞出现CPE在72h左右，CPE达到75％以上，需要144h；羔羊牛睾丸原代细胞和羔羊睾丸支持细胞出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE)时间相当都在接种病毒后36小时，但羔羊睾丸原代细胞CPE病变速度较睾丸支持细胞慢。CPE达到约75％羔羊睾丸原代细胞约96小时左右，而分离纯化的羔羊睾丸支持细胞在72小时左右；分离纯化的羔羊睾丸支持细胞和本发明的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)，其生长特性，接种羊痘病毒后的CPE出现时间和收获病毒时间等各项参数都无差异。收获病毒，冻融两次后用Reed-Muench法测定利用三种不同细胞增殖病毒的TCID₅₀/0.1ml。结果发现：Vero细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为2.0；BHK₂₁细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为2.2；羔羊睾丸原代细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为3.0；羔羊睾丸支持细胞增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为4.50；本发明的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)增殖GTPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml为4.50。

以上实验证明，本发明的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)与分离纯化的睾丸支持细胞对羊痘病毒在试验所选五株细胞中最为敏感，且病毒增殖效率最高，病毒滴度比试验和生产常用的羔羊睾丸原代细胞高1.5个滴度，同时比采用BHK21、Vero传代细胞系分别高2.3和2.5个滴度。

2.2羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)的传代及其对GTPV的增殖试验

用分离纯化的羔羊睾丸支持细胞，在传代至17-18代时，细胞分裂增殖能力下降(羔羊睾丸支持细胞张满单层需要4-5d)时，每周换液一次，持续一个月后，将持续培养的细胞消化，用有限稀释后在96孔板上培养，挑选生长良好，传代后依然生长良好的细胞，且生长能力接近低代次睾丸支持细胞(分离纯化的LSC第3到13代)。该细胞即羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)。

将分离的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)继续传代(每代细胞都按1:2进行消化传代)，每隔5代细胞，将铺满单层细胞以1ml/瓶(25ml细胞瓶，营养液体积为10ml)接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株(保藏号：CCTCC V201503)细胞毒液各两瓶，一瓶做对照，进行细胞传代试验，方法同2.1节。每个试验代次细胞统计生长时间(铺满单层)、接种病毒后病变时间、以及测定传代细胞接种病毒后收获病毒毒价，比较不同代次的传代细胞对GTPV增殖差异，结果见表2。

表2自然传代分离的羔羊睾丸支持细胞系(LSC)生长特性及病毒增殖情况

由上表可以看出，羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)继续传代可以传代30代以上，其生长特性维持不变，细胞长满单层时间维持在65h左右，并且随着传代次数的增加，其对GTPV病毒增殖能力维持不变，致细胞病变(CPE)时间及最后CPE达到75％以上收获病毒所需时间差异不大，基本维持在65～70h以内；接种同一代次的GTPV病毒，其毒价基本维持在4.20-4.60。结果说明，该分离的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)在传代30代时，其生长性能及其对病毒的增殖效率均维持在良好状态。采用绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株进行上述实验也得到了基本相同的结果。由此可以证明，该细胞系生物学特性比较稳定，该细胞系无论对于分离培养羊痘病毒，还是生产羊痘疫苗来说都是比较好的细胞系。

实施例3山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗实验室试制

3.1山羊痘、绵羊痘、羊传染性脓疱病毒弱毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸支持细胞系NBSC(CCTCC NO：C201438，接BT细胞)，倾去营养液，按原营养液体积的5％接种羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，选生长良好布满单层的羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)，倾去营养液，按原营养液体积的5％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43(CCTCC NO：V201503，接LT细胞)、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒Sheeppox VirusGS-WW 2010F44(CCTCC NO：V201504，接LT细胞)，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。培养48h，细胞病变(CPE)达到80％时收获，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定Goatpox Virus HN-XY2010F43的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)为10^4.5/0.1ml；Sheeppox Virus GS-WW 2010F44的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)为10^4.0/0.1ml；Orf Virus HB-TS09F65的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)为10^6.5/0.1ml。各制备山羊痘、羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒病毒液3000ml作为制备疫苗的病毒抗原。

3.2疫苗的配制和冻干

先将3.1制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘和羊传染性脓疱病毒细胞弱毒抗原，以体积比1︰1︰1的比例混匀后，再与耐热冻干保护剂(海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水，经无菌处理得到的保护剂。)以1︰1的比例混和，搅拌均匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干。即为成品弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下温度保存。共制备弱毒冻干疫苗三批每批1700瓶，批号为：20151201、20151202、20151203。

实施例4山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联疫苗成品检验

4.1物理性状

产品为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

4.2无菌检验

从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行，疫苗成品无细菌生长。

4.3支原体检验

从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长；

4.4外源病毒检验

从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。

4.5冻干山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗剩余水分测定

从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录38页进行测定，三批疫苗均符合规定。

4.6冻干山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗真空度测定

从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录48页进行测定，三批疫苗均符合规定。

实施例5山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗安全试验

将实施例3制备的所有指标都达到“兽用新生物制品质量标准”的三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗，随即取样，以山羊痘、绵羊痘和羊口疮病毒不小于10000个TCID50免疫剂量，(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)接种1年龄左右健康绵羊和3月龄左右的绵羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康绵羊)各4只；以10000个TCID50的接种剂量(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)分别接种1年龄左右健康山羊和3月龄左右的山羊羔羊(从未患过羊痘、也未注射过羊痘疫苗的符合实验动物标准的健康山羊)各4只，共接种12组。随机挑选绵羊、山羊各一只以1mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。口腔粘膜划线接种后每日测定接种羊和对照羊的体温和口腔粘膜的病变情况，观察15日，进行致弱毒株安全性评价。

试验结果发现，各批次疫苗的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗对绵羊及羔羊、山羊及羔羊均安全、无致病性。证明山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗对羊只安全。

实施例6山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗效力试验

6.1从制备保存的20151201、20151202、20151203三批山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按原量稀释混合，用犊牛(羔羊)睾丸原代细胞测定半数感染量(TCID₅₀)，要求羊传染性脓疱病毒TCID₅₀不低于10⁶/0.1mL，山羊痘、绵阳痘病毒TCID₅₀不低于10^3.5/0.1mL。

6.2每批疫苗免疫成年绵羊及羔羊，成年山羊及羔羊各5只，成年羊接种0.6ml(口腔粘膜划线接种0.2ml/只和尾根皮内接种0.4ml/只)，羔羊减半。随机挑选绵羊、山羊各一只以0.6mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜和尾根皮内接种)做对照。免疫集中21日后，连同条件相同的对照羊，随机等量分为山羊痘组和羊口疮组,山羊痘组用山羊痘细胞强毒第16代(Goatpox virus HN-XY 2010F16)细胞强毒；绵羊痘组用绵羊痘细胞强毒第16代(Sheeppox Virus GS-WW 2010F16)；羊口疮组用羊口疮细胞强毒第15代(Orf Virus HB-TS09F15)，以100个ID50的剂量，进行攻毒试验。观察10～15天，结果如表3和4所示。效力试验证明利用山羊痘弱毒株(Goatpox Virus HN-XY 2010株F43)、绵羊痘弱毒株(SheeppoxVirus GS-WW 2010F44株)和羊口疮细胞弱毒株(Orf Virus HB-TS09F65株)所制备的三联细胞弱毒疫苗对绵羊和山羊免疫保护力好，可用临床免疫预防羊痘和羊口疮病毒的感染。

表3山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗成年羊效力检验

表4山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗羔羊效力检验

Claims (4)

1.一种制备山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％接种羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒；选生长良好布满单层的羔羊睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％分别接种山羊痘病毒细胞传代致弱毒以及绵羊痘病毒细胞传代致弱毒，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且羊传染性脓疱病毒滴度不低于10^-6.0TCID₅₀/0.1ml时，作为以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原；山羊痘、绵羊痘病毒滴度不低于10^-3.5TCID₅₀/0.1ml时，分别作为山羊痘、绵羊痘病毒细胞传代致弱毒抗原，备用；

其中，所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒为山羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株GoatpoxVirus HN-XY2010F43株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCC NO：V201503；所述的绵羊痘病毒细胞传代致弱毒为绵羊痘病毒细胞传代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2015年1月14日，保藏编号为CCTCC NO：V201504，所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年3月19日，保藏编号为CCTCC NO：V201406；

其中，所述的新生牛睾丸支持细胞系为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C201438；所述的羔羊睾丸支持细胞系为羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系，命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120；

(2)疫苗的配制和冻干

将步骤(1)制备的各项指标都合格的山羊痘、绵羊痘以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原以体积比1：1︰1混合，再与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为山羊痘、绵羊痘、羊口疮三联细胞弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按原营养液体积的5％分别接种所述的山羊痘病毒细胞传代致弱毒，绵羊痘病毒细胞传代致弱毒以及羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附10分钟后加DMEM维持液，调pH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO₂浓度培养箱中进行培养。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C1～5g/L，剩余成分为超纯水。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C 2.5g/L，剩余成分为超纯水。

Images