CN106061949A - 用于检测表达金属‑β‑内酰胺酶的细菌的基于6,7‑反式头孢菌素的探针 - Google Patents

用于检测表达金属‑β‑内酰胺酶的细菌的基于6,7‑反式头孢菌素的探针 Download PDF

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Abstract

本公开内容包括了对金属‑β‑内酰胺酶，特别地碳青霉烯酶的选择性检测有用，从而区分耐受碳青霉烯类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头孢菌素的具有6,7R,R构型的探针容易被β‑内酰胺酶裂解，但不能区分被金属‑β‑内酰胺酶和其他β‑内酰胺酶的裂解。通过修饰头孢菌素的侧基，选择性可被引入，其允许探针区分多种类型的金属‑β‑内酰胺酶，并因此更狭窄地定义细菌的菌株以及产生的金属‑β‑碳青霉烯酶的类型。

Description

用于检测表达金属-β-内酰胺酶的细菌的基于6,7-反式头孢 菌素的探针
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年1月17日提交，标题为“PROBES FOR DETECTION OFCARBAPENEM-RESISTANT BACTERIA”的美国临时专利申请系列号61/928,524以及于2014年3月21日提交，标题为“6,7-TRANS CEPHALOSPORIN-BASED FLUOROGENIC PROBES FORDETECTION OF METALLO-β-LACTAMASE-EXPRESSING BACTERIA”的美国临时专利申请系列号61/968,404的优先权，其在此通过引用以其整体并入。
序列表
本公开内容包括通过引用以其整体并入本文的序列表。
本公开内容的领域
本公开内容涉及对耐受碳青霉烯类的肠杆菌科(enterobacteriaceae)(CRE)特异并基于立体化学修饰的头孢菌素的荧光探针，所述立体化学修饰的头孢菌素被修饰以包括6,7-反式构型。本公开内容还涉及检测由于金属-β-内酰胺酶活性耐受碳青霉烯类的细菌菌株的方法。
背景
由于抗生素的滥用和过度使用，革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)、克雷伯杆菌属物种(Klebsiella species)以及其他肠杆菌科中抗生素耐受性以惊人的速度在全世界出现(Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol.Rev.20:440-458；Richard等，(1994)J.Infect.Dis.170:377-383；Spellberg等，(2013)N.Engl.J.Med.368:299-302)。特别地，针对广谱β-内酰胺类抗生素的耐受性已成为主要公共卫生问题。在许多抗生素中，碳青霉烯类具有针对不同类型的细菌的最广谱的活性和最大的效力，并已成为严重细菌感染的治疗中的"最后手段"(Bradley等，(1999)Int.J.Antimicrob.Agents 11:93-100；Papp-Wallace等，(2011)Antimicrob.Agents Chemother.55:4943-4960)。然而，主要由于获得性碳青霉烯酶，耐受碳青霉烯类的肠杆菌科(CRE)现被频繁地观察到，且病例的数目正稳步增长(Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol.Rev.20:440-458；Nordmann等(2011)Emerg.Infect.Dis.17:1791–1798)。
碳青霉烯酶是一组具有水解几乎所有β-内酰胺类抗生素的能力的β-内酰胺酶，并包括KPC-类型的Ambler A类β-内酰胺酶、VIM-的金属-β-内酰胺酶(MBL)(Ambler B类)、IMP-、新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase)(NDM)、以及OXA-48类型的相对罕见的D类碳青霉烯酶(Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol.Rev.20:440-458；Nordmann等，(2011)Emerg.Infect.Dis.17:1791-1798；Miriagou等，(2010)Clin.Microbiol.Infect.16:112-122)。碳青霉烯酶还被越来越多地报告为医院和社区获得性感染，特别地对于MBL的治疗失败的原因，由于它在不同菌株之间传播和对临床可用抑制剂的不良敏感性(Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol.Rev.20:440-458；Walsh等，(2011)Clin.Microbiol.49:3222-3227)。因此，MBL-的生产者的快速和准确的检测对适当的抗菌化学疗法及严格的感染控制至关重要。
目前，用于检测β-内酰胺酶的标准诊断方法，诸如修改的Hodge测试(MHT)(Nordmann等,(2012)Clin.Microbiol.Infect.18:432-438；Cohen&Leverstein-van(2010)Int.J.Antimicrob.Agents 36:205-210；Bernabeu等，(2012)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.74:88-90；Dortet等，(2012)Antimicrob.Agents.Chemother.56:6437-6440)以及“double-disk synergy test”(DDST)(Arakawa等，(2000)J.Clin.Microbiol.38:40-43)缺乏必要的特异性和灵敏度，并且耗时，通常对于大部分细菌的准确检测要求至少24-48小时，但对于具有慢生长率的那些细菌要求数天。
基于PCR的方法(Poirel等,(2011)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.70:119-125；Avlami等,(2010)J.Microbiol.Methods.83:185-187；Chen等,(2011)J.Clin.Microbiol.49:579-585)及质谱(Burckhardt&Zimmermann(2011)J.Clin.Microbiol.49:3321-3324；Hrabak等,(2011)J.Clin.Microbiol.49:3327-3332)具有高的准确度和灵敏度，但与高成本、沉重仪器要求的缺点相关，且不能检测新进化的碳青霉烯酶基因。最近，由Nordmann开发的Carba-NP测试(CNP)(Nordmann等,(2012)Emerg.Infect.Dis.18:1503-1507；Dortet等，(2012)J.Clin.Microbiol.50:3773-3776；Dortet等,(2012)Antimicrob.Agents Chemother.56:6437-6440)具有高特异性，但它仅可适用于细菌裂解物。
相比之下，基于荧光的生物分析测定提供了高灵敏度、易于使用、快速检测、低成本，且在分析之前很少需要或不需要生物样品处理。许多能够以高灵敏度检测β-内酰胺酶活性的荧光探针已被开发(Gao等，(2003)J.Am.Chem.Soc.125:11146-11147；Zlokarnic等，(1998)Science 279:86-88；Xing等，(2005)J.Am.Chem.Soc.127:4158-4159；Kong等，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 419:9-16；Xie等，(2012)Nat.Chem.4:802-809；Watanabe等，(2010)Bioconjugate Chem.21:2320-2326；Zhang等，(2012)Angew.Chem.Int.51版:1865-1868；Yang等，(2007)J.Am.Chem.Soc.129:266-267)。然而，这些探针的大部分缺乏对碳青霉烯酶的特异性。仅当与某些抑制剂组合时，一些探针已被用于检测碳青霉烯酶(Zhang等,(2012)Angew.Chem.Int.51版:1865-1868)。因此，几乎没有荧光探针可用于特异性检测碳青霉烯酶。本公开内容提供了一系列具有适合于细菌中MBL的特异性检测的6,7-反式构型的、基于头孢菌素的荧光探针。
概述
本公开内容包括了对金属-β-内酰胺酶，特别地碳青霉烯酶的选择性检测有用，从而区分耐受碳青霉烯类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头孢菌素的具有6,7R,R构型的探针容易被β-内酰胺酶裂解，但不能区分被金属-β-内酰胺酶和其他β-内酰胺酶的裂解。β-内酰胺环的6,7位置的由R,R构型至S,R的修饰允许头孢菌素可被金属-β-内酰胺酶，即，碳青霉烯酶裂解，但基本上不可被其他内酰胺酶裂解。另外，通过修饰头孢菌素的侧基，选择性可被引入，其允许探针区分多种类型的金属-β-内酰胺酶，并因此更狭窄地定义细菌的菌株以及产生的金属-β-碳青霉烯酶的类型。
因此，本公开内容的一个方面包括了包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的探针的组合物的实施方案，所述探针包含具有6,7-反式构型的头孢菌素和附连至其的可检测的标记物。在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可具有式I或式II：
其中，R1可选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团及荧光猝灭剂。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，R1可选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-(tosyloxy-)。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)并且可具有结构：
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可选自由以下组成的组：
本公开内容的另一个方面包括了选择性检测金属-β-内酰胺酶活性的方法的实施方案，所述方法包括使怀疑具有金属-β-内酰胺酶活性的样品与包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的探针的组合物接触，所述探针包含具有6,7反式构型的头孢菌素部分和可检测的标记物；允许金属-β-内酰胺酶活性裂解头孢菌素部分的有效时间段，从而从该头孢菌素部分释放可检测的标记物，藉此生成可检测的信号；并且检测该信号，其中可检测的信号指示该样品包含金属-β-内酰胺酶活性或金属-β-内酰胺酶活性的来源。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针具有式I或式II：
其中，R1选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团及荧光猝灭剂。在本公开内容的该方面的一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)并且可具有结构：
并且可选自由以下组成的组：
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可以是萤光素酶底物，并且所述方法还可包括使反应混合物与萤光素酶接触，从而在释放的萤光素酶底物的存在下生成可检测的生物发光信号。
附图简述
本公开内容的各方面在回顾附图后将更容易被理解。附图在下面说明书和实施例中被更详细地描述。
图1A示出了对于本公开内容的荧光探针的实施方案的设计原理。
图1B示出了对于靶向碳青霉烯酶的荧光探针的设计原理及其一般结构。在这些实施方案中，荧光团通过-O-被连接至头孢菌素部分，但此类连接还可以是，例如，-N-或-S-。
图2A-2F是一系列说明本公开内容的探针的β-内酰胺酶选择性的图。指示量的β-内酰胺酶在与探针(10μM)在室温在25μL的1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光。
图2A：探针CDC-1；图2B：(s)-CC-1；图2C：(s)-CC-3；图2D：(s)-CC-4；图2E：(s)-CC-5；以及图2F：(s)-CC-6。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度＝5/7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图3A-3F是一系列说明表达β-内酰胺酶的细菌在与CRE-特异性探针(10μM)在室温在1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光的图。
图3A：探针CDC-1；图3B：(s)-CC-1；图3C：(s)-CC-3；图3D：(s)-CC-4；图3E：(s)-CC-5；以及图3F：(s)-CC-6。在每个图中从左至右：具有IMP-1的大肠杆菌(E.coli)(IMP1-大肠杆菌)、具有VIM-27的肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae)(VIM27-Kp)、具有NDM-1的大肠杆菌(NDM1-大肠杆菌)、具有KPC-3的肺炎克雷伯杆菌(KPC3-Kp)、具有CTX-M的肺炎克雷伯杆菌(CTX-Kp)、具有SHV-18的肺炎克雷伯杆菌(SHV18-Kp)、具有TEM-1Bla的大肠杆菌(TEM1-大肠杆菌)、具有AmpC的大肠杆菌(AmpC-大肠杆菌、用BlaC转化的大肠杆菌(BlaC-大肠杆菌)、具有OXA-48的肺炎克雷伯杆菌(OXA48-Kp)、具有IMI的大肠杆菌(IMI-大肠杆菌)。除了表达AmpC的大肠杆菌以外，所有细菌数目为如所示的，在表达AmpC的大肠杆菌中代替使用107c.f.u.。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度＝5/7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图4示意性地示出了本公开内容的靶向碳青霉烯酶的荧光探针的合成。(a)NaNO2、2N H2SO4、DCM，0℃，1h。(b)ROH、p-TsOH、DCM、0℃至室温(r.t.)过夜。(c)i)：NaI、丙酮，r.t，1h；ii).7-羟基香豆素、K2CO3、CH3CN，r.t.，2.5h。(d)1.0当量(eqv.)m-CPBA、DCM，0℃，0.5h。(e)NaI、TFAA、丙酮，0℃，1h。(f)DCM:TFA:TIPS:H2O＝65:30:2.5:2.5，30min，0℃。
图5示出了一系列说明探针(s)-CC-2的β-内酰胺酶选择性的数字图像。指示量的β-内酰胺酶在与探针(10μM)在r.t在25μL 1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光。在每个图中从左至右内酰胺酶是：VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度＝5/7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图6示出了重组β-内酰胺酶的成像。PBS(1×,pH＝7.4)中指示的探针(10μM)在室温与多种β-内酰胺酶(4nM)孵育2h。图用紫外光(360nm)激发来获得。
图7A-13F示出了一系列探针与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程的图形表示。误差棒是±SD。实心圆，空白；正方形，200飞摩尔(fmoles)，25μl；三角形，20飞摩尔，25μl；倒三角形，5飞摩尔，25μl；菱形，1飞摩尔，25μl。x轴，分钟。
图7A-7F：CDC-1分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图8A-8F：(s)-CC-1分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图9A-9F：(s)-CC-2分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图10A-10F：(s)-CC-3分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图11A-11F：(s)-CC-4分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图12A-12F：(s)-CC-5分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图13A-13F：(s)-CC-6分别与内酰胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程。
图14A-14G示出了根据本公开内容的探针在缓冲液中的自发水解。
图14A是说明本公开内容的探针在PBS缓冲液中的自发水解以释放伞形酮并从而生成荧光信号的图解。[S]0＝20μM：探针的初始浓度，[P]：形成的伞形酮的浓度(水解产物)。
图14B-14G示出了水解产物的百分比的时间过程的一系列图形表示。误差棒指示三次重复实验的标准差。
图15是说明典型SDS-PAGE分析的数字图像，显示表达的重组酶的制品的纯度。纯化的VIM-27(29.1KDa)被示为代表性实例。其他酶的分子量也是约30KDa(BlaC,29.5KDa；TEM-1,32.4KDa；NDM-1,29.5KDa；KPC-3,32.3KDa；IMP-1,28.2KDa)，且它们显示与以VIM-27的纯度和产量相当的纯度和产量。M，蛋白标准；1，诱导之前的裂解物；2，诱导之后的裂解物；3，细胞裂解之后的可溶性级分；4，Ni-NTA结合之后的流通物(flow-through)；5，洗涤1；6，洗涤2；7，洗涤5；8，通过在PBS中的250mM咪唑洗脱的；9，通过PD-10柱纯化的酶。
图16示出了用作用于生成编码以下的表达载体的模板的核酸序列：重组β-内酰胺酶VIM-27(GenBank登录号HQ858608.1)(SEQ ID NO.:1)、IMP-1(GenBank登录号KC200566.1)(SEQ ID NO.:2)、NDM-1(GenBank登录号AF059836.1)(SEQ ID NO.:3)、KPC-3(GenBank登录号NC_019155.1)(SEQ ID NO.:4)、Oxa-48(SEQ ID NO.:5)和TEM-1(GenBank登录号KC493654.1)(SEQ ID NO.:6)。对于酶的相应氨基酸序列的GenBank登录号在括号中。在图中，用于PCR扩增步骤的引物序列(如表2中所示)在插入进表达载体之前的位置以黑体和下划线来指示。
图17示出了探针(s)-CC-1、(s)-CC-2、(s)-CC-3、(s)-CC-4、(s)-CC-5、(s)-CC-6和(s)-CC-7的式。
图18示出了用于靶向碳青霉烯酶的荧光探针(s)-CC-7的合成的方案。(a)NaNO2、2N H2SO4、DCM，0℃，1h。(b)t-BuOH，p-TsOH，DCM，0℃至r.t，过夜。(c)(i)：NaI、丙酮，r.t，1h；ii).7-羟基香豆素、K2CO3、CH3CN，r.t.，2.5h。(d)1.0当量m-CPBA、DCM，0℃，0.5h。(e)DCM:TFA:TIPS:H2O＝65:30:2.5:2.5，30min，0℃。
图19A和19B是说明探针(s)-CC-7的重组β-内酰胺酶选择性和CRE特异性的图。指示量的β-内酰胺酶(图19A)和表达β-内酰胺酶的细菌(图19B)在与探针(10μM)在室温在25μL 1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光。图19A，左至右在每个浓度的：VIM、IMP、NDM、KPC、TEM-1、BlaC。图19B，左至右：具有IMP-1的大肠杆菌、具有VIM-27的肺炎克雷伯杆菌、具有NDM-1的大肠杆菌、具有KPC-3的肺炎克雷伯杆菌、具有CTX-M的肺炎克雷伯杆菌、具有SHV-18的肺炎克雷伯杆菌、具有TEM-1Bla的大肠杆菌、具有AmpC的大肠杆菌、用BlaC转化的大肠杆菌、具有OXA-48的肺炎克雷伯杆菌、具有IMI的大肠杆菌。除了使用107c.f.u的表达AmpC的大肠杆菌以外，所有细菌数目为如所示的。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶/孵育的荧光强度的差异。荧光用在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度＝5/7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图20是重组β-内酰胺酶(4nM)与(s)-CC-7(10μM)在室温在1x PBS(pH＝7.4)中孵育2h的数字图像。图用紫外光(360nm)激发来生成。
图21A-21F是说明指示的探针与VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的荧光激活的时间过程的图。误差棒是±SD。
图22示出了用于靶向碳青霉烯酶的产生生物发光探针(bioluminogenic probes)(s)-CL-3和(s)-CL-6的合成的方案。
图23是说明探针(s)-CL-3的β-内酰胺酶选择性的图。指示量的β-内酰胺酶在与探针(1μM)在室温在25μL的1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在350nm处激发(频带宽度＝5nm)和在550nm处发射(频带宽度＝7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图24是说明探针(s)-CL-6的β-内酰胺酶选择性的图。指示的量的β-内酰胺酶在与探针(1μM)在室温在25μL的1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在350nm处激发(频带宽度＝5nm)和在550nm处发射(频带宽度＝7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图25是说明表达β-内酰胺酶的细菌裂解物在与探针(s)-CL-3(1μM)在室温在1xPBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光的图。除了表达AmpC的大肠杆菌是在107c.f.u.以外，所有细菌数目为如所示的。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在350nm处激发(频带宽度＝5nm)和在550nm处发射(频带宽度＝7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图26是说明表达β-内酰胺酶的细菌裂解物在与探针(s)-CL-6(1μM)在室温在1xPBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h之后的相对荧光的图。除了表达AmpC的大肠杆菌是在107c.f.u.以外，所有细菌数目为如所示的。相对荧光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的荧光强度的差异。荧光用在350nm处激发(频带宽度＝5nm)和在550nm处发射(频带宽度＝7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
图27是说明生物发光发射对不同量的纯化的NDM-1+在1μM的fLuc.(s)-CL-6]的依赖性的图。
图28是说明生物发光发射对不同浓度的NDM-1裂解物+在1μM的fLuc.(s)-CL-6]的依赖性的图。
图29示出了(s)-CL-6的β-内酰胺酶选择性。400飞摩尔β-内酰胺酶在与探针(1μM)在室温在100μL的1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h随后添加50ng fLuc之后的相对发光。相对发光代表与和不与β-内酰胺酶孵育的发光强度的差异。发光用IVIS 200来测量。误差棒是±SD。
图30示出了(s)-CL-6的β-内酰胺酶选择性。2x 105c.f.u的表达β-内酰胺酶的细菌裂解物在与探针(1μM)在室温在100μL的1x PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育2h随后添加50ngfLuc之后的相对发光。相对发光代表与和不与表达β-内酰胺酶的细菌裂解物孵育的发光强度的差异。图通过IVIS来采集。误差棒是±SD。
详述
在更详细的描述本公开内容之前，要理解，该公开内容并不局限于描述的特定实施方案，并且当然照此可变化。还要理解，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，且并非旨在限制，因为本公开内容的范围将仅被所附的权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定，和在该陈述的范围中的任何其他陈述的或中间的值被包括在本公开内容内。这些较小的范围的上限和下限可独立地被包括于所述较小的范围，并且还被包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限制。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除这些包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容属于的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可以使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文，其程度如同每一单独出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文以公开和描述与被引用的出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认，本发明由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。
如本领域技术人员阅读该公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的个体实施方案中的每个具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其它若干实施方案中的任一个的特征分开或组合，而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可以以事件提及的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
除非另有指示，否则本公开内容的实施方案将使用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。
必须注意，如在说明书和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如提及“支撑物(a support)”包括多个支撑物。在该说明书中以及在之后的权利要求书中，将提及许多术语，其将被定义为具有以下含义，除非相反的意向是明显的。
如本文使用的，以下术语具有归于它们的含义，除非另有说明。在本公开内容中，“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(containing)”和“具有(having)”等可具有在美国专利法中赋予它们的含义，且可意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由......组成”或“基本上包括”等，当应用于被本公开内容包括的方法和组合物时，指像本文公开的那些的组合物，但其可包含另外的结构基团、组合物组分或方法步骤(或其类似物或衍生物，如以上讨论的)。然而，与本文公开的相应组合物或方法的那些比较，这样的另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等，实质上不影响组合物或方法的基本和新颖特征。
在描述多个实施方案之前，提供了以下定义并且应该被使用，除非另有指示。
缩写
TFAA，三氟乙酸酐；MLB，金属-β-内酰胺酶；CRE，耐受碳青霉烯类的肠杆菌科；PBS，磷酸盐缓冲盐水；TsOH，甲苯磺酸(PTSA或pTsOH)或对甲苯磺酸；CPBA，氯过氧苯甲酸；DCM，二氯甲烷；TFA，三氟乙酸；TIPS，SDS，十二烷基硫酸钠；r.t，室温。
定义
在描述和要求保护公开的主题时，以下术语将根据以下陈述的定义被使用。
如本文单独或组合使用的术语“酰基”，意指与选自以下的基键合的羰基或硫代羰基基团：例如，任选地被取代的，氢化(hydrido)、烷基(例如卤代烷基)、烯基、炔基、烷氧基(“酰氧基”，包括乙酰氧基、丁酰氧基、异戊酰氧基、苯基乙酰氧基(phenylacetyloxy)、苯甲酰氧基(berizoyloxy)、对-甲氧基苯甲酰基(p-methoxybenzoyloxy)以及被取代的酰氧基诸如烷氧基烷基和卤代烷氧基)、芳基、卤素、杂环基、杂芳基、磺酰基(例如烯丙基亚磺酰基烷基)、磺酰基(例如烷基磺酰基烷基)、环烷基、环烯基、硫代烷基、硫代芳基、氨基(例如烷基氨基或二烷基氨基)以及芳烷氧基。“酰基”基团的说明性实例是甲酰基、乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、丙二酰基、烟酰基等。如本文所用的术语“酰基”指基团-C(O)R26，其中R26为氢、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基和杂芳烷基。实例包括，但不限于甲酰基、乙酰基、环己基羰基、环己基甲基羰基、苯甲酰基、苯甲基羰基(beozylcarbonyl)等。
如本文所用的术语“酰基氨基”指酰基-NH-基团，其中酰基如先前描述的。
如本文所用的术语“酰氧基”指酰基-O-基团，其中酰基如先前描述的。
单独的或在其他术语诸如本文所用的“硫代烷基”和“芳基烷基”内的术语“烷基”意指可以是直链(即直链(linear))或支链的一价、饱和的烃基。在本公开内容中使用的烷基基通常包括从约1个至20个碳原子，特别地从约1个至10个、1个至8个或1个至7个，更特别地约1个至6个碳原子，或3个至6个。说明性烷基基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、异丁基、异戊基、戊基、仲丁基、叔丁基、叔戊基、正庚基、正乙酰基(n-actyl)、正壬基、正癸基、十一烷基、正十二烷基、正十四烷基、十五烷基、正十六烷基、十七烷基、正十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十二烷基(dosyl)、正二十四烷基等、以及其支链变体。在本公开内容的某些方面，烷基基是包含以下或选自由以下组成的组的C1-C6低级烷基：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基、异丁基、异戊基、戊基、三丁基、仲丁基、叔丁基、叔戊基和正己基。烷基基可在不显著干扰本公开内容的化合物的制备且不显著降低化合物的效力的位置处任选地被如本文定义的取代基取代。在本公开内容的某些方面，烷基基被一个至五个取代基取代，所述取代基包括卤素、低级烷氧基、低级脂肪族、被取代的低级脂肪族、羟基、氰基、硝基、硫代、氨基、酮基、醛、酯、酰胺、被取代的氨基、羧基、磺酰基、硫酰基、亚磺酰基、硫酸盐、亚砜、被取代的羧基、卤代的低级烷基(例如CF3)、卤代的低级烷氧基、羟基羰基、低级烷氧基羰基、低级烷基羰基氧基、低级烷基羰基氨基、脂环族(cycloaliphatic)、被取代的脂环族、或芳基(例如，苯基甲基苄基))、杂芳基(例如，吡啶基)和杂环基(例如，哌啶基、吗啉基)。烷基基团上的取代基可自身被取代。
如本文所用的术语“烯基”指包含至少一个双键的不饱和的、无环支链或直链烃基。烯基基可包含从约2个至24个或2个至10个碳原子，特别地从约3个至8个碳原子，且更特别地约3个至6个或2个至6个碳原子。适合的烯基基包括但不限于乙烯基、丙烯基(例如，丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)和丙-2-烯-2-基)、丁烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、β-1,3-二烯2-3/1、己烯-1-基、3-羟基乙烯-基、庚烯-1-基和辛烯-1-基等。烯基基可类似于烷基任选地被取代。
如本文所用的术语“烷基氨基甲酰基”指R'RN--CO--基团，其中R和R'的一个是氢，且R和R'的另一个是如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
如本文所用的术语“亚烷基”指具有从约1个至10个、1个至8个、1个至6个或2个至6个碳原子并具有两个或更多个共价键的附连点的直链或支链的基。此类基的实例是亚甲基、乙烯、丙烯、丁烯、戊二烯、亚己基、亚乙基、甲基亚乙基和亚异丙基。当亚烯基基作为取代基存在于另一个基上时，它通常被认为是单取代基，而不是由两个取代基形成的基。
如本文所用的术语“亚烯基”指具有从约2个至10个、2个至8个或2个至6个碳原子、至少一个双键并具有两个或更多个共价键的附连点的直链或支链的基。亚烯基基的实例包括1,1-亚乙烯基(--CH2＝C-)、1,2-亚乙烯基(-CH＝CH-)和1,4-丁间二烯基(-CH＝CH-CH＝CH-)。
如本文使用的术语“芳烷氧基羰基”指芳烷基-O--CO--基团。示例性芳烷氧基羰基是苄氧基羰基。
如本文所用的术语“芳烷基”指通过烷基基团诸如苄基直接键合的芳基或取代的芳基基团。被取代的芳基基的其他具体实例包括氯苄基和氨基苄基。示例性的芳烷基包括苄基、苯基乙基、和萘基甲基。
如本文所用的术语“芳烷基氧基”指芳烷基-O-基团，其中芳烷基如先前描述的。示例性芳烷基氧基是苄氧基。
如本文所用的术语“芳酰基”指如以上定义的芳基基，附连至如本文定义的羰基基，包括但不限于苯甲酰基和甲苯甲酰基。芳酰基基可任选地被如本文公开的基团取代。
如本文所用的术语“芳酰基氨基”指芳酰基-NH-基团，其中芳酰基如先前描述的。
如本文所用的术语“芳基”指芳族取代基，其可以是单芳族环，或者被稠合在一起、共价连接或与共同基团，诸如，但不限于，亚甲基或乙烯基部分连接的多个芳族环。共同连接基团还可以是如在二苯基甲酮中的羰基，或如在二苯醚中的氧，或如二苯胺中的氮。术语“芳基”特别包括杂环芳族化合物。芳族环可包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮，以及其他。在特定实施方案中，术语“芳基”意指包含约5个至约10个碳原子，例如，5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子，并包含5元和6元烃和杂环芳环的环状芳族。
芳基基团可任选地被一个芳基基团取代基或更多个可以是相同的或不同的芳基基团取代基取代(“被取代的芳基”)，其中“芳基基团取代基”包括烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰基氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳基硫基、烷基硫基、亚烷基和--NR'R”，其中R'和R”可以各自独立地为氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基和芳烷基。
芳基基团可任选地被一个至四个取代基取代，所述取代基诸如烷基、被取代的烷基、烯基、被取代的烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、卤素、三氟甲氧基、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷酰基、烷酰基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、芳烷基氨基、二烷基氨基、烷酰基氨基、硫醇、烷基硫代、脲基、硝基、氰基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰基、芳基硫羰基(arylthiono)、芳基磺酰基胺基(arylsulfonylamine)、次磺酸、烷基磺酰基(alkysulfonyl)、磺酰氨基、芳基氧基等。取代基可被羟基、卤素、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基或芳烷基进一步取代。在本公开内容的方面，芳基基被羟基、烷基、羰基、羧基、硫醇、氨基和/或卤素取代。
芳基基团的具体实例包括，但不限于，环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
如本文所用的术语“芳基氧基”指附连至氧原子的如以上定义的芳基基。示例性芳基氧基包括萘氧基、喹啉氧基、异喹嗪氧基(isoquiriolizinyloxy)等。
如本文所用的术语“芳基氧基羰基”指芳基-O--CO--基团。示例性的芳基氧基羰基基团包括苯氧基-羰基和萘氧基-羰基。
如本文所用的术语“芳基氧基”指芳基-O--基团，其中芳基基团如先前描述的，包括被取代的芳基。如本文所用的术语“芳基氧基”可以指苯基氧基或己基氧基及烷基、被取代的烷基、卤素或烷氧基取代的苯基氧基或己基氧基。
如本文所用的术语“芳基烷氧基”指被附连至烷氧基基团的芳基基团。芳基烷氧基基团的代表性实例包括，但不限于，2-苯基乙氧基、3-萘-2-基丙氧基和5-苯基戊氧基。
如本文所用的术语“生物发光”指一种类型的化学发光，由生物分子，特别地蛋白的光的发射。生物发光的必要条件是在加氧酶、萤光素酶的存在下的结合或游离的分子氧，加氧酶、萤光素酶在分子氧的存在下对底物萤光素起作用并将底物转化为激发态，其在返回至较低能级时以光的形式释放能量。
如本文所用的术语“碳环(carbocylic)”包括来源于饱和的或不饱和的、被取代的或未被取代的5元至14元有机核的基，其的成环原子(除氢以外)仅是碳。碳环基的实例是环烷基、环烯基、芳基、特别是苯基、萘基、降冰片烷基(norbornanyl)、二环庚二烯基(bicycloheptadienyl)、甲苯酰基、二甲苯基(xylenyl)、茚基、均二苯代乙烯基(stilbenzyl)、三联苯基、二苯基乙烯基(diphenylethylenyl)、苯基环己基、苊烯基(acenapththylenyi)、蒽基、联苯基、联苄基(bibenzylyl)和相关联苄基同系物、八氢萘基(octahydronaphthyl)、四氢萘基(tetrahydronaphthyl)、八氢喹啉基(octahydroquinolinyl)、二甲氧基四氢萘基等。
如本文单独或组合使用的术语“氨基甲酰基”，指附连至羰基基团中的两个非共享键之一的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、单环烷基氨基、烷基环烷基氨基(alkyleycloalkylamino)和二环烷基氨基(dicycloalkylaxaino)基。
如本文所用的术语“氨基甲酰基”指H2N-CO-基团。
如本文所用的术语“碳青霉烯类”是指一类具有广谱抗菌活性的β-内酰胺类抗生素。对大部分β-内酰胺酶高度耐受。碳青霉烯类抗生素最初从碳青霉烯噻烯霉素(卡特利链霉菌(Streptomyces cattleya)的一种天然来源的产物)开发。碳青霉烯类是用于许多细菌感染，诸如大肠杆菌(E.coli)和肺炎克雷伯杆菌的最后手段的抗生素之一。对碳青霉烯类抗生素的药物耐受性在这些大肠杆菌群中的传播通常是由于碳青霉烯酶，包括新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)的产生。目前，不存在对抗耐受碳青霉烯类的细菌的开发中的新抗生素，且耐受性基因的全世界传播被认为是主要问题。与其他β-内酰胺类诸如青霉素类和头孢菌素类相比，这些试剂具有最广的抗菌谱。碳青霉烯类通过以高亲和力结合β-内酰胺酶并酰化酶，使它失活来规避(circumvent)β-内酰胺酶。除了细胞内细菌(非典型)，诸如衣原体(Chlamydiae)以外，碳青霉烯类针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者，以及厌氧菌是活性的。因此，碳青霉烯类也是迄今能够抑制L,D-转肽酶的唯一β-内酰胺类。碳青霉烯类非常类似于青霉素类(青霉烷类)，但结构的位置1中的硫原子已被碳原子代替，且已被引入不饱和。
如本文所用的术语“碳青霉烯酶”指针对氧基亚氨基头孢菌素类、头霉素类是活性的，且但还针对碳青霉烯类是活性的一组β-内酰胺酶。碳青霉烯酶包括诸如是质粒介导的碳青霉烯酶的IMP型碳青霉烯酶(金属–β-内酰胺酶)，且可在细菌物种中被发现，细菌物种诸如肠的革兰氏阴性生物体，假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)和不动杆菌属物种(Acinetobacter spp.)。VIM(维罗纳整合子编码型金属-β-内酰胺酶)包括10个成员，其大部分存在于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，还有恶臭假单胞菌(P.putida)中且很少存在于肠杆菌科中。IMP和VIM两者是整合子缔合的，有时在质粒内。两者水解除了单环β-内酰胺类以外的所有β-内酰胺类，并避开所有β-内酰胺抑制剂。
β-内酰胺酶的OXA组主要存在于不动杆菌属(Acinetobacter)物种中。OXA碳青霉烯酶在体外非常慢地水解碳青霉烯类，且对于一些不动杆菌宿主观察到的高MIC(大于64mg/L)可反映继发性机制。OXA碳青霉烯酶还趋向具有朝向青霉素类和头孢菌素类的降低的水解效率。KPC(肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯酶)目前是产生KPC的肠杆菌科的最常见的碳青霉烯酶，在美国日趋普遍。CMY从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的强毒株中分离。它被携带在质粒pYMG-1上，并因此可传播至其他细菌菌株。NDM-1(新德里金属-β-内酰胺酶)在大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌中较为普遍。
可易受本公开内容的内酰胺酶影响的细菌包括革兰氏阴性细菌，诸如，但不限于，阴沟肠杆菌(E.cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、肠杆菌科，包括埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、克吕沃尔菌属物种(Kluyvera spp.)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)等，以及革兰氏阳性菌，诸如葡萄球菌属物种(Staphylococci spp.)、链球菌属物种(Streptococci spp.)、链杆菌属物种(Streptobacilli spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacilli spp.)等。
如本文所用的术语“羰基”指具有四个共价键中的两个与氧原子共享的碳基。羰基-如本文所用的术语“羰基”指--(C＝O)--基团。
如本文所用的术语“甲酰胺基”是指基团-CONH-。羧基-如本文所用的术语“羧基”指--COOH基团。
如本文单独或组合使用的术语“羧基”，指-C(O)OR25-或-C(-O)OR25，其中R25为可任选地被取代的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、氨基、硫醇、芳基、杂芳基、硫代烷基、硫代芳基、硫代烷氧基、杂芳基或杂环。在本公开内容的方面，羧基基团呈酯化形式，并可包含作为酯化基团的低级烷基基团。在本公开内容的特定方面，-C(O)OR25提供了酯或氨基酸衍生物。酯化形式在本文中也特别称为“羧酸酯”。在本公开内容的方面，“羧基”可被取代，特别地被烯丙基取代，其任选地被氨基、胺、卤素、烷基氨基、芳基、羧基或杂环中的一个或多个取代。羧基基团的实例是甲氧基羰基、丁氧基羰基，叔烷氧羰基(tert.alkoxycarbonyl)诸如叔丁氧基羰基(tert.butoxycarbonyl)、具有一个或两个芳基基的芳基甲氧基羰基，包括但不限于任选被例如低级烷基、低级烷氧基、羟基、卤素和/或硝基取代的苯基，诸如苄氧基羰基、甲氧基苄基羰基、二苯基甲氧基羰基、2-溴代乙氧羰基(2-bromoethoxycarbonyl)、2-碘代乙氧羰基叔丁基羰基(2-iodoethoxycarbonyltert.butylcarborlyl)、4-硝基苄氧羰基、二苯基甲氧基羰基、苄基羟基羰基(benzhydroxycarbonyl)、二-(4-甲氧基苯基-甲氧基羰基、2-溴代乙氧基羰基、2-碘代乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基、或2-三苯基甲硅烷基乙氧基羰基。以酯化形式的另外的羧基基团是甲硅烷基氧基羰基基团，包括有机甲硅烷基氧基羰基。此类化合物中的硅取代基可被低级烷基(例如甲基)、烷氧基(例如甲氧基)和/或卤素(例如氯)取代。硅取代基的实例包括三甲基甲硅烷基(trimethylsilyi)和二甲基叔丁基甲硅烷基(dimethyltert.butylsilyl)。在本公开内容的方面，羧基基团可以是烷氧基羰基，特别是甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔戊氧基羰基、sir庚氧基羰基(sir heptyloxy carbonyl)，特别是甲氧基羰基或乙氧基羰基。
如本文所用的术语“头孢菌素”指其中β-内酰胺环被稠合至6元二氢噻嗪环，由此形成头孢烯核的β-内酰胺化合物。对头孢烯核的侧链修饰可赋予抗菌活性的改进的谱、药代动力学优势以及另外的副作用。基于它们的活性谱，头孢菌素类大致可分为四代。
如本文所用的术语“环的”和“环烷基”指约3个至约10个碳原子，例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个碳原子的非芳族单环或多环系统。环烷基基团可任选地是部分不饱和的。环烷基基团还可任选地被如本文定义的烷基基团取代基、氧代和/或亚烷基取代。可沿着环烷基链任选地插入一个或更多个氧、硫、或被取代或未被取代的氮原子，其中氮取代基是氢、烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基，由此提供杂环基团。代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、十氢萘基、樟脑烷基、莰烯烷基和正金刚烷基。
如本文所用的术语“脂环族”指具有少于8个碳原子或者由不超过三个稠合的脂环族环组成的稠合环系统的环烷烃。此类基团的实例包括但不限于十氢萘基等。
如本文所用的术语“环烯基”指包含约4个至16个、2个至15个、2个至10个、2个至8个、4个至10个、3个至8个、3个至7个、3个至6个或4个至6个碳原子、一个或更多个碳-碳双键、以及的一个、两个、三个或四个环的基，其中此类环可以以悬垂的方式被附连或可被稠合。在本公开内容的某些方面，环烯基基是具有三个至七个碳原子的“低级环烯基”基。环烯基基的实例包括但不限于环丁烯基，环戊烯基、环己烯基和环庚烯基。环烯基基可任选地被如本文公开的基团，特别地可以是相同的或不同的1个、2个或3个取代基取代。
如本文所用的术语“环烷氧基”指附连至氧基基的环烷基基(特别是，具有3个至15个、3个至8个或3个至6个碳原子的环烷基基)。环烷氧基的实例包括环己氧基和环戊氧基。环烷氧基基可任选地被如本文公开的基团取代。
如本文所用的术语“环烷基”指具有约3个至15个、3个至10个、3个至8个或3个至6个碳原子并包含一个、两个、三个或四个环的基，其中此类环可以以悬垂的方式被附连或可被稠合。在本公开内容的方面，“环烷基”指包含1个至2个环及每环3个至7个碳原子的任选地被取代的、饱和的烃环系统，其可与不饱和的C3-C7碳环进一步稠合。环烷基基团的实例包括单环结构诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十二烷基等，或者多环结构诸如金刚烷基等。在本公开内容的某些方面，环烷基基是具有从约3个至10个、3个至8个、3个至6个或3个至4个碳原子的“低级环烷基”基，特别是环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。术语“环烷基”还包括其中环烷基基与芳基基或杂环基基稠合的基。环烷基基可任选地被如本文公开的基团取代。
如本文所用的术语“可检测的部分”指本领域中已知的多种标记部分。所述部分可以是，例如，放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C、32P，等)、可检测的酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶等)、染料、比色标记物诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)、珠或能够生成可检测信号诸如比色、荧光、化学发光或电化学发光(ECL)信号的任何其他部分。因此，“可检测的部分”与“标记物分子”同义地使用。本领域技术人员已知的作为对检测有用的标记物分子包括化学发光分子或荧光分子。适合于用来标记用于本公开内容的方法的核酸的多种荧光分子是本领域已知的。用于此类掺入的方案可取决于使用的荧光分子而变化。对于各自的荧光分子，此类方案是本领域已知的。
在本公开内容的探针的实施方案中，预期可检测的部分可在头孢菌素被碳青霉烯酶的水解裂解之后从探针释放，使得荧光染料，例如，不再被猝灭，因此，是可检测的。进一步预期，可检测的部分诸如光吸收染料或放射性标记物可从未被裂解的探针释放并分离，以用于指示碳青霉烯酶活性的存在的定量检测或定性检测。
如本文所用的术语“可检测的标记的”意指，化合物诸如本公开内容的基于头孢菌素的探针，可包含是放射性的、或被荧光团取代的、或被引发可被裸眼或通过仪器诸如，不限于，闪烁计数器、色度计、紫外分光光度计等观察到或检测到的物理响应或化学响应的一些其他分子物类取代的部分。
光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学工具(means)可用来检测此类标记物。检测装置和方法可包括，但不限于，光学成像、电子成像、用CCD照相机成像、集成光学成像及质谱。另外，与靶结合的被标记的或未被标记的探针的量可被定量。此类定量可包括统计分析。
如本文所用的术语“二烷基氨基”指--NRR'基团，其中R和R'的每个独立地为如先前描述的烷基基团和/或被取代的烷基基团。示例性烷基氨基基团包括乙基甲基氨基、二甲基氨基及二乙基氨基。
如本文所用的术语“二烷基氨基甲酰基”指R'RN--CO--基团，其中R和R'的每个独立地为如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
如本文所用的术语“非对映体”指可包含一个或更多个不对称中心并可产生对映体、非对映体，以及可根据绝对立体化学为(R)-或(S)-被定义的其他立体异构形式的本公开内容的化合物。因此，本公开内容的化合物包括所有可能的非对映体和对映体以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性(R)-异构体和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或者使用常规技术拆分。当本公开内容的化合物包含几何不对称中心时，且除非另有说明，意图是化合物包括E和A几何异构体两者。所有互变异构形式也被包括在本公开内容的化合物的范围之内。
如本文所用的术语“染料”指其的存在可通过它的光吸收或光发射特性来检测的任何报告物基团。例如，Cy5是花青染料家族的反应性水溶性荧光染料。Cy5是在红色区域的荧光(约650nm至约670nm)。它可以被合成为带有在氮侧链的任一或两者上的反应性基团，以便它们可被化学连接至核酸或蛋白分子。标记出于可视化和定量目的而进行。Cy5在约649nm处被最大激发，在约670nm处被最大发射，处在光谱的远红部分中；量子产率是0.28。FW＝792。用于本公开内容的探针的适合的荧光团(色原酮(chromes))可选自，但并不意图被限制为，异硫氰酸荧光素(FITC，绿色)，花青染料Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5Cy7、Cy7.5(范围从绿色至近红外)，德克萨斯红等。用于在本公开内容的实施方案中使用的这些染料的衍生物可以是，但不限于，Cy染料(Amersham Bioscience)、Alexa Fluors(MolecularProbes Inc.,)、HiLYTE.RTM Fluors(AnaSpec)以及DYLITE.RTM Fluors(Pierce,Inc.)。
如本文所用的术语“荧光”指主要在冷的主体中作为光学现象被发现的发光，其中光子的分子吸收触发具有较长(较低能量)波长的光子的发射。吸收的和发射的光子之间的能量差随着分子的旋转、振动或发热而消失。有时吸收的光子在紫外线范围内，且发射的光在可见光范围内，但这取决于特定荧光团的吸光度曲线和斯托克斯位移(Stokes shift)。
如本文所用的术语“荧光团”指导致分子是荧光的分子的组分。如本文所用的术语“荧光团”指其的存在可通过它的光发射特性来检测的任何报告物基团。它是分子中将吸收特定波长的能量并在不同(但同样特定)波长处再发射能量的官能团。所发射的能量的量和波长取决于荧光团和荧光团的化学环境两者。用于在本公开内容的组合物中使用的荧光团包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)，一种荧光素的反应性衍生物，其是化学地附连至其他、非荧光分子以创建新的荧光分子用于多种应用的最常见的荧光团之一。其他历史上常见的荧光团是若丹明(TRITC)、香豆素和花青素的衍生物。更新代的荧光团诸如ALEXAFLUORS.RTM、DYLIGHT FLUORS.rtm以及绿色荧光的荧光团东京绿(Tokyo Green)通常比其他可比的激发和发射的标准染料更耐光、更明亮且较少pH敏感。
如本文所用的术语“FRET”指分子之间的荧光共振能量转移。在FRET方法中，一种荧光团能够作为能量供体，且另一种是能量受体分子。这些有时被分别称为报告物分子和猝灭剂分子。供体分子被特定波长的光激发，对于其，它将通常会表现出荧光发射波长。受体分子也在该波长处被激发，使得它可通过多种距离依赖性能量转移机制接受供体分子的发射能量。通常，当它们很靠近(例如，在相同或相邻的分子上)时，受体分子接受供体分子的发射能量。FRET技术是本领域熟知的，并且可容易地用来检测本公开内容的钛氧化物结合的肽。参见例如，美国专利号5,668,648、5,707,804、5,728,528、5,853,992和5,869,255(对于FRET染料的描述),T Mergny等，(1994)Nucleic Acid Res.22:920-928，以及Wolf等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(对于用于FRET的一般性描述和方法)，其的每个在此通过引用以其整体并入。
如本文所用的术语“杂芳基”指完全不饱和的包含杂原子的环形芳族基，该环形芳族基具有选自碳、氮、硫和氧的至少一个杂原子。杂芳基基可包含一个、两个或三个环，且环可以以悬垂的方式被附连或可被稠合。在本公开内容的方面，该术语指完全不饱和的包含杂原子的环形芳族基，该环形芳族基具有从3个至15个、3个至10个、3个至8个、5个至15个、5个至10个或5个至8个环成员，该环成员选自碳、氮、硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。“杂芳基”基的实例，包括但不限于，包含1个至4个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地，吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基等；包含1个至5个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，特别地吲哚基、异吲哚基、中氮茚基(indolizinyl)、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、喹唑啉基、蝶啶基、喹嗪基、酞嗪基、萘啶基(naphthyridinyl)、喹喔啉基、噌啉基、菲啶基、吖啶基、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吩嗪基(phenazinyl)和咔唑基；嘌呤基、苯并咪唑基、喹啉基(quinolinyl)、异喹啉基、苯并三唑基(beazotriazolyl)、四唑并哒嗪基(tetrazolopyridazinyl)等；包含氧原子的不饱和的3元至6元杂单环基团，特别地，2-呋喃基、吡喃基等；包含硫原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地，噻吩基、2-噻吩基、3-噻吩基等；包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地呋咱基、苯并呋咱基、噁唑基、异噁唑基和噁二唑基(oxadiazolyl)；包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，特别地苯并噁唑基、苯并噁二唑基等；包含1个至2个硫原子和1个至3个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，例如，噻唑基、异噻唑、噻二唑基等；包含1个至2个硫原子和1个至3个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，诸如苯并噻唑基、苯并噻二唑基(benzothiadiazolyl)等。该术语还包括其中杂环基与芳基基，特别地二环基稠合的基，诸如苯并呋喃基、苯并噻吩基、酞嗪基、色烯基、呫吨基等。杂芳基基可任选地以如本文公开的基团，例如以烷基、氨基、卤素等取代，特别地杂芳基胺。该术语可指包含1个至4个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基、四唑基等。杂芳基基可任选地以本文公开的基团，例如以烷基、氨基、卤素等取代，特别地被取代的杂芳基基是杂芳基胺。
如本文所用的术语“杂环基”指具有少于8个碳原子或由不超过三个的稠合环组成的稠合环系统(其中该环碳原子中的至少一个被氧、氮或硫代替)的环烷烃和/或芳环系统。此类基团的实例包括，但不限于，吗啉代等。
如本文所用的术语“杂环的”指饱和的和部分饱和的包含杂原子的环形基，该环形基具有选自碳、氮、硫和氧的至少一个杂原子。杂环基基可包含一个、两个或三个环，其中此类环可以以悬垂的方式被附连或可被稠合。在一个方面，该术语指饱和的和部分饱和的包含杂原子的环形基，该环形基具有从约3个至15个、3个至10个、5个至15个、5个至10个或3个至8个环成员，该环成员选自碳、氮、硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。示例性饱和的杂环基包括但不限于包含1个至4个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团(例如吡咯烷基、咪唑烷基和哌嗪基)；包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团(例如吗啉基；悉尼酮基(sydnonyl)]；以及包含1个至2个硫原子和1个至3个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团[例如，噻唑烷基)等。部分饱和的杂环基基的实例包括但不限于二氢噻吩基、二氢吡喃基、二氢呋喃基和二氢噻唑基。说明性杂环基团包括但不限于氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡咯烷基、氮杂卓基(azepinyl)、1,3-二氧环戊烷基(1,3-dioxolanyl)、211吡喃基、4H-吡喃基、哌啶基、1,4-二噁烷基(1,4-dioxanyl)、吗啉基、吡唑啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、1,2,3,6-四氢吡啶基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢噻喃基、噻噁烷基(thioxanyl)、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧环戊基、吡唑啉基、二氢吡喃基、二氢噻吩基(dihydrothienyl)、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、quinuelidinyl、喹嗪基等。
如本文所用的术语“羟基烷基”指被--OH基团取代的烷基基团。
如本文所用的术语“羟基(hydroxyl)”或“羟基(hydroxy)”指--OH基团。
如本文所用的术语“衔接物”指在本公开内容的化合物的头孢菌素主链上的官能团(例如，胺基团)，或衔接物可包括附连至头孢菌素的单独的部分，分子诸如荧光团或猝灭剂可然后被附连至其。衔接物可包括官能团，诸如，但不限于，胺、羧酸、羟基、硫代及其组合。衔接物可包括化合物，诸如，但不限于，DTPA、EDTA、DOPA、EGTA、NTA及其组合。在一个实施方案中，衔接物和螯合剂化合物是相同的，但在其他实施方案中它们可以是不同的。
在本公开内容的探针的有利的实施方案中，预期，标记物诸如，但不限于，荧光团可通过-O-、-N-或-S-连接被附连至头孢菌素部分。
如本文所用的术语“低级烷基取代的卤素”指包含多达并包括八个碳原子的任何烷基链，其中脂肪族氢原子中的一个被卤素代替。此类的实例包括但不限于氯乙基等。
如本文所用的术语“萤光素酶”指催化光发射反应的加氧酶。例如，细菌萤光素酶催化黄素单核苷酸和脂肪族醛的氧化，该反应产生光。另一类在海洋节肢动物中发现的萤光素酶催化海萤萤光素的氧化，且另一类萤光素酶催化鞘翅目萤光素的氧化。因此，“萤光素酶”指催化生物发光反应的酶或光蛋白(photoprotein)。萤光素酶诸如萤火虫和海肾(Renilla)萤光素酶是充当催化并在生物发光产生反应期间保持不变的酶。萤光素酶光蛋白，诸如被非共价键合至萤光素的水母发光蛋白和螅蛋白光蛋白，在生物发光产生反应期间被萤光素的释放改变。萤光素酶是天然存在于生物体中的蛋白或其变体或突变体，诸如通过诱变产生的具有一个或更多个特性，诸如热稳定性或pH稳定性的变体，即不同于天然存在的蛋白。萤光素酶及其修饰的突变体或变体形式是熟知的。例如，提及“海肾萤光素酶”意指从属海肾的成员分离的酶或从任何其他来源，诸如从另一珊瑚虫纲(Anthozoa)获得或已合成制备的等效分子。
如本文所用的术语“被可操作地连接”指元件的布置，其中如此描述的组分被配置，以执行其通常功能。因此，当适当的酶存在时，被可操作地连接至编码序列的给定的启动子能够实现该编码序列的表达。只要启动子起作用，以引导编码序列表达，启动子不必与编码序列邻接。因此，例如，居间非翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列可仍被认为是“被可操作地连接”至编码序列。
如本文所用的术语“引物”指与待扩增或复制的DNA区段互补的寡核苷酸。通常引物在PCR中被使用。引物与模板DNA杂交(或“退火”)，并被聚合酶酶用作复制/扩增过程的起点。“互补”意指引物序列可与模板形成稳定的氢键络合物。
如本文所用的术语“探针”指修饰的头孢菌素，其具有6,7反式构型并被金属-β-内酰胺酶选择性裂解，且可具有来源于醇的允许 探针选择性区分金属-β-内酰胺酶物类的侧基。
如本文所用的术语“被取代的烯基”包括被以下取代的烯基基团：例如，一个至三个取代基，优选地一个至两个取代基，诸如烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷基烷氧基、卤代烷氧基烷基、烷酰基、烷酰基氧基、环烷基、环烷氧基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、烷基氨基、烷酰基氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氰基、卤素、羟基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰基、酮基、硫代酮基、硫醇、烷基硫代、磺酰基、磺酰氨基、硫代烷氧基、芳基、硝基等。
如本文所用的术语“被取代的烷基”可包括被以下取代的烷基基团：例如，一个至五个取代基，且优选地1个至3个取代基，诸如烷基、烷氧基、氧代、烷酰基、芳基、芳烷基、芳基氧基、烷酰基氧基、环烷基、酰基、氨基、羟氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基氨基、芳烷基氨基、氰基、卤素、羟基、羧基、氨基甲酰基、羧基烷基、酮基、硫代酮基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫代、芳烷基硫代、磺酰胺、硫代烷氧基；以及硝基。
如本文所用的术语“被取代的芳基”包括芳族环，或由不多于三个稠合环(其的至少一个是芳族的)组成的稠合芳族环系统，并且其中在环碳上的氢原子中的至少一个已被以下代替：卤素、氨基、羟基、硝基、硫代、烷基、酮、醛、酯、酰胺、低级脂肪族、被取代的低级脂肪族或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的环脂环族)。此类的实例包括，但不限于，羟基苯基、氯苯基烷基氨基、二烷基氨基、硫酸根，巯基等。。
如本文所用的术语“被取代的脂环族”指拥有少于8个碳或由不多于三个稠合环组成的稠合环系统的环烷烃，并且其中脂肪族氢原子中的至少一个已被以下代替：卤素、硝基、硫代、氨基、羟基、酮、醛、酯、酰胺、低级脂肪族、被取代的低级脂肪族，或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的脂环族)。此类基团的实例包括但不限于1-氯癸基(l-chlorodecalyl)等。
如本文所用的术语“被取代的环烷基”包括具有从1个至5个(特别地1个至3个)取代基的环烷基基团，所述取代基包括但不限于烷基、烯基、烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、氰基、卤素、羟基、羧基、羧基烷基、酮基、硫代酮基、硫醇、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、羟基氨基、烷氧基氨基以及硝基。
如本文所用的术语“被取代的杂环基”指拥有少于8个碳或由不多于三个稠合环组成的稠合环系统的环烷烃和/或芳基环系统，其中环碳原子中的至少一个被氧、氮或硫代替，且其中脂肪族氢原子中的至少一个已被以下代替：卤素、羟基、硫代、硝基、氨基、酮、醛、酯、酰胺；低级脂肪族、被取代的低级脂肪族，或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的脂环族)。此类基团的实例包括但不限于2-氯吡喃基。
如本文单独或与其他术语诸如烷基磺酰基或芳基磺酰基结合使用的术语“磺酰基”指二价基-SO2 -。在本公开内容的方面，磺酰基基团可被连接至被取代的或未被取代的羟基、烷基基团、醚基团、烯基基团、炔基基团、芳基基团、环烷基基团、环烯基基团、环炔基基团、杂环基基团、碳水化合物、肽或肽衍生物。
如本文所用的术语“被取代的脂肪族”指具有少于10个碳原子的烷基或烷烃。术语“被取代的脂肪族”指拥有少于10个碳的烷基或烷烃，其中脂肪族氢原子中的至少一个已被以下代替：卤素、氨基、羟基、硝基、硫代、酮、醛、酯、酰胺、低级脂肪族、被取代的低级脂肪族，或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的脂环族等)。此类基团的实例包括但不限于1-氯乙基等。
如本文单独或组合使用的术语“硫代烷氧基”指其中硫原子(S)被键合至烷氧基的化学官能团，具有通用化学式-SR24，其中R24为可被取代的烷氧基基团。“硫代烷氧基”可具有1-6个碳原子即-S-(O)-C1-C6烷基基团，其中C1-C6烷基具有如以上定义的含义。具有从1个至6个碳原子的直链或支链硫代烷氧基基团或基，还被称为C1-C6硫代烷氧基的说明性实例包括硫代甲氧基和硫代乙氧基。
如本文单独或组合使用的术语“硫代烷基”指其中硫原子(5)被键合至可被取代的烷基的化学官能团。硫代烷基基团的实例是硫代甲基、硫代乙基和硫代丙基。硫代烷基可被取代或未取代的羧酸、芳基、杂环基、羰基或杂环基取代。
如本文单独或组合使用的术语“硫代芳基”指其中硫原子(S)被键合至芳基基团的化学官能团，具有通用化学式-SR23，其中R23为可被取代的芳基。硫代芳基基团和被取代的硫代芳基基团的说明性实例是苯硫基、氯苯硫酚、对-氯苯硫酚、硫代苄基、4-甲氧基-硫代苯基、4-硝基-硫代苯基和对-硝基硫代苄基。
如本文所用的术语“硫醇”意指-SH。硫醇可被本文公开的取代基，特别地烷基(硫代烷基)、芳基(硫代芳基)、烷氧基(硫代烷氧基)或羧基取代。硫醇可被以下取代：取代的或未取代的杂芳基或杂环基，特别地包含1个至4个氮原子的被取代的或未被取代的饱和的3元至6元杂单环基团(例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基和哌嗪基)或包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团(例如吗啉基；悉尼酮基(sydrionyl))，特别地被取代的吗啉基或哌啶基。
讨论
碳青霉烯类对大部分β-内酰胺酶高度耐受，并在其C-6位置处具有S构型和在C-5位置处具有R构型，如在图1B所示。β-内酰胺环在C-5位置和C-6位置处的这一反式构型提供了具有针对β-内酰胺酶的良好稳定性的抗生素(Basker等，(1980)J.Antibiot.(Tokyo)33:878-884)。相比之下，其他内酰胺诸如头孢菌素类，一类最初来源于真菌枝顶孢属(Acremonium)的、通常已被用作开发用于β-内酰胺酶的探针的支架的β-内酰胺抗生素(Gao等，(2003)J.Am.Chem.Soc.125:11146-11147；Zlokarnic等，(1998)Science279:86-88；Xing等,(2005)J.Am.Chem.Soc.127:4158-4159；Kong等，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA419:9-16；Xie等，(2012)J.Nat.Chem.4:802-809)通常具有在对应C-7位置处的R构型。
本公开内容包括了对金属-β-内酰胺酶，特别地碳青霉烯酶的选择性检测有用，从而区分耐受碳青霉烯类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头孢菌素的用于检测耐受抗生素的细菌的具有6,7R,R构型的探针容易被β-内酰胺酶裂解，但不能区分被金属-β-内酰胺酶和其他β-内酰胺酶的裂解。现已发现，通过β-内酰胺环的6,7位置由R,R构型至S,R的修饰允许头孢菌素可被金属-β-内酰胺酶，即，碳青霉烯酶裂解，但基本上不可被其他内酰胺酶裂解。另外，已发现了通过修饰头孢菌素的侧基，选择性可被引入，其允许本公开内容的探针区分多种类型的金属-β-内酰胺酶，并因此更狭窄地定义细菌的菌株以及产生的金属-β-碳青霉烯酶的类型。因此，本公开内容提供了对鉴定耐受碳青霉烯类的细菌菌株的存在并进一步表征菌株为针对特定类型的酶有用的探针。
特别地，本公开内容的探针的实施方案可通过在C-7位置处的取代来修饰，所述修饰通过改变在合成步骤中使用的醇。本公开内容的实例由此掺入通过氧基-键附连至头孢菌素的侧基，其大小从简单的甲基部分变化至取代的苯基基团。然而，预期了可选择可允许金属-β-内酰胺酶的进一步定义的其他侧基。
本公开内容的探针对检测生物样品诸如体液，包括血液、唾液、尿液等，在受试者人或动物中的或者从其分离的组织，或者细菌的培养的群体的悬液或培养物中的细菌金属-β-内酰胺酶有用。
探针可游离在溶液中，或被拴系(tethered)至用于与测试样品接触的固体支撑物。将探针拴系至此类支撑物的此类方法以及为检测释放的标记部分选择的和/或调整的检测系统是本领域已知的。
因此，本公开内容的修饰的头孢菌素类已被工程化以包括头孢菌素的R构型至S构型的转化以使得它对碳青霉烯酶特异，即可被碳青霉烯酶裂解，但不可被其他内酰胺酶裂解，或基本上较少程度地可被其他内酰胺酶裂解。
如图1A和1B中所示，本公开内容的碳青霉烯酶特异的探针还可包括可检测的标记部分诸如，但不限于，荧光团。可被有利地掺入进本公开内容的探针的适合的荧光团包括，但不限于，诸如在其3'-位置处被附连至头孢菌素的烷基化的伞形酮(7-羟基香豆素)。当在363nm处激发时，此类附连的标记部分几乎不发荧光。然而，在头孢菌素被碳青霉烯酶水解后，荧光团被释放，导致可检测的荧光发射。可被掺入进本公开内容的探针的其他有利标记物是萤光素。特别有利的萤光素及其衍生物是具有式(4S)-2-(6-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸的萤火虫D-萤光素，其可例如通过6-羟基位置被连接至探针。然而，预期了，在从探针裂解之后是可检测的任何荧光团可有用地被掺入进本公开内容的探针。
几种荧光探针(各自包含在C-7位置处具有S构型的头孢菌素部分)根据如图4中所示的方案来合成。头孢菌素中构型的反转通过醇和重氮酮中间体之间的SN2反应来实现，如已被Doherty等(1990)J.Med.Chem.33:2513-2521描述的，其通过引用以其整体并入本文，该重氮酮中间体在酸性条件下由7-氨基头孢菌酸(1)的对甲氧基苄基(PMB)酯与NaNO2以定量产率来制备。醇的R基团可被改变，以产生对确定碳青霉烯酶的底物偏好有用的一组探针变体。在用于生物测定中之前，所有探针通过HPLC来纯化并通过NMR和质谱(MS)在结构上表征。
本公开内容的荧光探针实施方案相对于其他内酰胺酶选择性检测碳青霉烯酶的特异性使用重组β-内酰胺酶进行检查。四种碳青霉烯酶，即金属-β-内酰胺酶VIM-27、IMP-1和NDM-1以及A类β-内酰胺酶KPC-3遵循如在Wang等，(2006)Antimicrob.AgentsChemother.50:2762–2771中描述的方案来表达，其通过引用以其整体并入本文。两种非碳青霉烯酶的A类β-内酰胺酶，TEM-1Bla和BlaC也被表达，以用作阴性对照。
在使用在约1飞摩尔至约200飞摩尔的范围内的酶浓度来在酶处理之前和之后，测量探针的荧光。如图2、5和6中所示，探针显示了对六种β-内酰胺酶VIM-27、IMP-1和NDM-1、A类β-内酰胺酶KPC-3和非碳青霉烯酶的A类β-内酰胺酶TEM-1Bla和BlaC的不同特异性和灵敏度。在暴露于任何和所有的酶包括TEM-1Bla和BlaC对照之后，如被Xie等(2012)J.Nat.Chem.4:802-809描述的被采用作为阳性对照的先前报道的用于β-内酰胺酶的非特异性探针CDC-1，给出阳性荧光增强。然而，当用碳青霉烯酶处理时，本公开内容的多种基于修饰的头孢菌素的探针表现出不同程度的荧光。
例如，当用碳青霉烯酶VIM-27、IMP-1、NDM-1和KPC-3处理时，对于(s)-CC-1、(s)-CC-2和(s)-CC-5，高的荧光信号被记录，但当所述探针用内酰胺酶TEM-1Bla和BlaC处理时，几乎未观察到荧光增强。因此，探针(s)-CC-1、(s)-CC-2和(s)-CC-5可被称为是对碳青霉烯酶特异性的底物，即可特异性地检测碳青霉烯酶。相比之下，当用低至1飞摩尔的所有四种碳青霉烯酶处理时，通过提供可检测的荧光，(s)-CC-1和(s)-CC-5显示比(s)-CC-2更大的灵敏度，表明(s)-CC-1和(s)-CC-5可以是对总体碳青霉烯酶特异性的但对其他内酰胺酶不是特异性的探针。
仅对于三种MBL VIM-27、IMP-1和NDM-1，探针(s)-CC-3和(s)-CC-6显示荧光增强，表明(s)-CC-3和(s)-CC-6对金属-β-内酰胺酶的一般特异性。然而，探针(s)-CC-6显示比(s)-CC-3更好的灵敏度，由于对于(s)-CC-6，用低至1.0飞摩尔的酶，荧光增强被清楚地观察到。当在测定中使用的KPC-3的量上升至200飞摩尔时，两种探针产生荧光信号，如图2C和2F中所示。
如在图2D中所示，荧光探针(s)-CC-4显示对IMP-1的高特异性，且荧光信号以浓度依赖性方式逐渐增加。随着在约200飞摩尔的量暴露于NDM-1，荧光增加仅是可检测的。结果指示，头孢菌素的C-7位置由R构型向S构型的立体化学的反转足以增强相对于其他内酰胺酶物类对碳青霉烯酶是选择性的探针特异性。
本公开内容的探针与不同β-内酰胺酶的动力学参数由林-贝氏(Lineweaver-Burk)曲线确定并总结于图7A-13F和表1中。
表1
所有探针表现出高稳定性与范围从0.7至5.9x 10-7s-1的低自发水解速率，如图14B-14G中所示。动力学参数的比较指示，对于是最常见的金属-β-内酰胺酶并具有全世界的分布的IMP-1(Oelschlaeger等，(2010)J.Med.Chem.53:3013–3027；Griffin等，(2011)Biochemistry 50:9125–9134)，所有的探针显示最佳动力学效率(kcat/Km＝0.2-2.5×106s-1M-1)。
具有大体积(bulky)叔丁基侧基的探针(s)-CC-4显示对于IMP-1的高的特异性和动力学效率(kcat/Km)(2.2×105s-1M-1)，与对其他碳青霉烯酶的相比的50至100倍。未检测到被非碳青霉烯酶的内酰胺酶的水解。对于被VIM-27和KPC-3水解，较小的R基团是优选的，但对于IMP-1和NDM-1是较不优选的。
与VIM-27和NDM-1(分别为2.6×104s-1M-1和1.0×104s-1M-1)相比，对于IMP-1和KPC-3(分别为1.2×106s-1M-1和2.2×105s-1M-1)，探针(s)-CC-5表现出高得多的动力学效率。未观察到被非碳青霉烯酶的内酰胺酶的水解。然而，对于IMP-1、NDM-1和VIM-27(分别为6.6×105s-1M-1、4.0×105s-1M-1和2.8×105s-1M-1)，探针(s)-CC-6显示高的动力学效率，水平比KPC-3(2.0×104s-1M-1)高从约14倍至约33倍。这些动力学测量值与如图2A-2F中所示的以重组β-内酰胺酶的特异性/灵敏度结果一致。
还证实了这些探针用于检测表达碳青霉烯酶的活的细菌的有用性。评价了产生碳青霉烯酶或其他临床流行的β-内酰胺酶的十一种细菌菌株，包括A类β-内酰胺酶KPC-3和IMI，B类MBL VIM-27、IMP-1和NDM-1，D类β-内酰胺酶OXA-48，以及临床上重要的非碳青霉烯酶CTX-M、SHV-18、TEM-1、BlaC和AmpC。探针(各自10μM，除非指明)对在从104c.f.u.至106c.f.u.的范围内不同数目的活的细菌的荧光响应示于图3A-3F中。作为阳性对照，对于所有的细菌菌株，CDC-1是持续阳性的，表明所有的细菌是β-内酰胺酶活性的。
对于表达VIM-27、IMP-1、NDM-1和KPC-3的细菌(>＝105c.f.u.)，探针(s)-CC-1和(s)-CC-5显示高的荧光增强。然而，对于104c.f.u的细菌，仅表达IMP-1的细菌可被探针(s)-CC-1检测到。仅对于VIM-27、IMP-1和NDM-1，探针(s)-CC-3和(s)-CC-6具有强的荧光响应，与如图2A-2F中所示的从重组酶研究获得的结果一致。相比之下，需要至少1.0x105c.f.u.至约1.0x 106c.f.u.细菌，以使用(s)-CC-3和(s)-CC-6探针并在2h孵育之后可靠地检测MBL细菌。另外，(s)-CC-4显示对于产生IMP的菌株的特异性偏好，具有约1×105c.f.u.细菌的检测限值。
因此，通过反转头孢菌素在C7位置处的立体化学，已开发了可特异性检测碳青霉烯酶，且特别地由CRE细菌产生的金属-β-内酰胺酶的荧光探针。在C7位置处的取代基团可进一步调节对碳青霉烯酶之间的选择性，以进一步区分碳青霉烯酶的类型。因此，(s)-CC-3和(s)-CC-6显示总体相比于其他内酰胺酶对MBL的特异性和灵敏度。然而，探针(s)-CC-4显示对IMP-1的高特异性。
尽管本公开内容的探针(s)-CC-1至(s)-CC-6使用蓝色荧光团香豆素，预期了，其他荧光团包括，但不限于，具有较长发射波长的那些可被用作本公开内容的荧光团，以改进灵敏度，如报道的如报道的(Xie等，(2012)J.Nat.Chem.4:802-809)。预期了本公开内容的探针，包括荧光团中的变化形式，对耐受碳青霉烯类的肠杆菌科(CRE)的快速和准确检测有用，以用于具有CRE感染的患者的早期诊断和治疗。
还预期了，多种可检测的标记部分可被掺入进本公开内容的修饰的头孢菌素探针，使得多于一种的细菌菌株(各自产生可区分的物类的金属-β-碳青霉烯酶)可以同时是可检测的。最有利地，在碳青霉烯类被碳青霉烯酶的水解后，此类可检测的部分提供可检测的信号增加。在本公开内容的探针的一些实施方案中，标记物是荧光标记物。通过标记物至头孢菌素的附连，存在由激发辐射诱发的荧光的猝灭。在其他实施方案中，标记物可以是从探针释放并进入周围的液体介质的染料，或甚至是放射性标记物。被释放的染料然后可从未裂解的探针分离，用于检测。
因此，本公开内容的一个方面包括了包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的可检测的探针的组合物的实施方案，所述探针包含具有6,7-反式构型的头孢菌素和附连至其的可检测的标记物。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可具有式I或式II：
其中，R1可选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团及荧光猝灭剂。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，R1可选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可通过-O-、-N-或-S-连接被附连至头孢菌素。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)并且可具有结构：
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可选自由以下组成的组：
以及
本公开内容的另一个方面包括了选择性检测金属-β-内酰胺酶活性的方法的实施方案，所述方法包括使怀疑具有金属-β-内酰胺酶活性的样品与包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的可检测的探针的组合物接触，所述探针包含具有6,7反式构型的头孢菌素部分和可检测的标记物；允许金属-β-内酰胺酶活性裂解头孢菌素部分的有效时间段，从而从该头孢菌素部分释放可检测的标记物，藉此生成可检测的信号；并且检测该信号，其中可检测的信号指示样品包含金属-β-内酰胺酶活性或金属-β-内酰胺酶活性的来源。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针具有式I或式II：
其中，R1可选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团、萤光素酶底物及荧光猝灭剂。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可以是染料、荧光标记物、放射性标记物或猝灭剂。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可通过-O-、-N-或-S-连接被附连至探针。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)并且可具有结构：
在一些实施方案中，探针可选自由以下组成的组：
以及
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可以是细菌培养物。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可从动物受试者或人受试者分离。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可以是从来自人受试者或动物受试者的样品产生的细菌培养物。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可包含克雷伯杆菌属物种或埃希氏杆菌属物种中的至少一种。
在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可以是萤光素酶底物，并且所述方法还可包括使反应混合物与萤光素酶接触，从而在释放的萤光素酶底物的存在下生成可检测的生物发光信号。
应注意，比率、浓度、量和其他数值数据可以以范围格式在本文中表示。应该理解，为方便和简洁，使用这样的范围格式，并且因此，应该以灵活的方式解释为不仅包括明确列举作为范围的界限的数值，而且还包括在该范围内包括的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地列举。为了说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应被解释为不仅包括约0.1wt％至约5wt％的明确列举的浓度，而且还包括在指示的范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％、和4％)以及子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％、和4.4％)。术语“约”可包括被修饰的数值的±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％或更多。另外，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。
应强调，本公开内容的以上描述的实施方案仅仅是实现的可能的实例，并且仅为了对本公开内容的原理的清楚理解而提出。可对本公开内容的以上描述的实施方案进行许多变化和修改，而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有此类修改和变化都意图在本文中被包括在本公开内容的范围内。
提出以下实施例，以便对本领域普通技术人员提供如何进行本文公开并要求保护的方法和使用探针的完整的公开内容和描述。已经做出努力以确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，温度是以℃，并且压力是在大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
实施例
实施例1
碳青霉烯酶和非碳青霉烯酶的内酰胺酶的克隆：用于将全长β-内酰胺酶克隆进pBAD/Myc-His载体(Invitrogen)的引物，如表2中所示。
表2：用于克隆β-内酰胺酶的引物
引物 序列
NDM-1F atttccatggaattgcccaatattatgcaccc(SEQ ID NO:7)
NDM-1R aaaagcttgtcgacgcgcagcttgtcggccat(SEQ ID NO:8)
KPC-3F atttccatggaatcactgtatcgccgtctagttc(SEQ ID NO:9)
KPC-3R aaaagcttgtcgacctgcccgttgacgcccaatc(SEQ ID NO:10)
VIM-27F atttccatgggattaaaagttattagtagtttattggtctacatgaccg(SEQ ID NO:11)
VIM-27R aaaagcttgtcgacctcggcgactgagcgatttttgtg(SEQ ID NO:12)
IMP-1F atttccatgggaagcaagttatctgtattctttatatttttgttttgtagc(SEQ ID NO:13)
IMP-1R aaaagcttgtcgacgttgcttggttttgatggttttttactttc(SEQ ID NO:14)
OXA-48F atttccatgggacgtgtattagccttatcggctgtg(SEQ ID NO:15)
OXA-48R aaaagcttgtcgacgggaataattttttcctgtttgagcacttc(SEQ ID NO:16)
TEM-1F atttccatgggccatcatcatcatcatcatagtattcaacatttccgtgtcgcccttatt(SEQ ID NO:17)
TEM-1R aaaagcttgtcgacttaccaatgcttaatcagtgaggc(SEQ ID NO:18)
基因组DNA或质粒DNA从各自过表达特定酶的细菌菌株(肺炎克雷伯杆菌或大肠杆菌)纯化作为用于PCR的模板。利用对于各自酶的F(正向)引物、R(反向)引物和模板DNA(其序列示于图16和表2中)使用Pf x 50DNA聚合酶和制造商的方案(Invitrogen)来进行PCR。纯化的PCR产物用NcoI和SalI限制性内切酶消化并使用T4DNA连接酶(Invitrogen)克隆进pBAD/Myc-His载体。连接的质粒DNA被转化进细菌BL21或Top10细胞中。插入的DNA序列通过测序分析来证实。
实施例2
酶从细菌细胞的纯化：所有的酶如Doherty等，(1990)J.Med.Chem.33:2513–2521中描述的来纯化，其通过引用以其整体并入本文。简言之，包含6x His的β-内酰胺酶(在BL21或Top10细菌中的pBAD/Myc-His载体)在30℃通过0.2％阿拉伯糖诱导超过6h进行过表达，直到在600nm处的光密度(OD600)达到0.8。蛋白然后用制造商的方案使用BUGBUSTER.RTM蛋白提取试剂(Novagen)和Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen)来纯化(洗涤缓冲液1：在pH 7.4，0.01M PBS、150mM NaCl；用于3-次洗涤的洗涤缓冲液2：在pH 7.4 0.01M PBS中的20mM咪唑；洗脱缓冲液，在pH 7.4 0.01M PBS中的250mM咪唑)。在纯化之后，洗脱的蛋白使用PD-10柱(GE healthcare)纯化。纯度通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，如在图15中所示)来确定且然后浓度通过Bradford测定试剂盒(BioRad)来确定。
实施例3
实验部分：所有的化学品购自商业来源(例如Aldrich、Alfa Aesar和TCIAmerica)，且不经进一步纯化地使用。分析性TLC用荧光指示器(254nm)用0.25mm硅胶60F板来进行。板用紫外光来可视化。HPLC在配备有GP50梯度泵和内联二极管阵列UV-Vis检测器的Dionex HPLC系统(Dionex Corporation)上来进行。反相C18(Phenomenax,5μm,4.6x250mm或Dionex,5μm,21.2x 250mm)柱与包含0.1％三氟乙酸的MeCN/H2O梯度流动相以1mL/min或12mL/min的流一起使用，用于分析或纯化。1H和13C NMR谱在Varian 400MHz磁共振谱仪上来获取。对于1H NMR谱的数据报告如下：化学位移被报告为相对于氯仿-d(δ7.26,s)的δ，以百万分率(ppm)为单位；多重性报告如下：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、dd(双二重峰)、m(多重峰)或br(加宽)；偶合常数被报告为以Hertz(Hz)计的J值；对于给定共振的质子数目(n)被指示nH，且基于频谱集成值。动力学实验在M1000酶标仪(TECAN,research triangle park,NC)中来进行。
实施例4
4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-重氮基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯化合物2的制备：
化合物2根据先前公开的程序来制备(Doherty等，(1990)J.Med.Chem.33:2513–2521，通过引用以其整体并入本文)。将在水中的NaNO2(0.35g,5mmol)的混合物(20mL)添加至在20mL CH2Cl2中的ACLE(2.0g,5mmol)的溶液。将所得的两相混合物冷却至0℃，然后伴随剧烈搅拌在30min内逐滴添加2NH2SO4水溶液(3.8mL)。将反应在0℃连续地搅拌1小时。随后，将有机层分离，且用CH2Cl2洗涤两次水层。将有机层合并，用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并过滤，以获得2的黄色溶液。将该溶液在下一步中立即使用。
实施例5
(6R,7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-烷氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3)的制备.在0℃，将多种醇(约10当量至约100当量)添加至化合物2在CH2Cl2中的溶液。对甲苯磺酸(1当量)随后在20min伴随搅拌成批地添加(气体逸出)。然后除去冰浴并且在室温继续搅拌反应过夜。反应通过TLC监测。在反应完成之后，浓缩反应混合物并用乙酸乙酯稀释，且随后用饱和的NaHCO3水溶液、水和盐水萃取。有机层经无水MgSO4干燥，并在真空中浓缩。剩余物最后在快速柱上用己烷/EtOAc(4:1)色谱分析，以获得所期望的化合物3。通过使用醇类甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、苄醇和甲苯磺酰酸合成的化合物3的实例分别是化合物3-1至3-6：
(6R,7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-甲氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-1)：产率＝38％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝8.6Hz,2H)、6.89(d,J＝8.7Hz,2H)、5.30(d,J＝11.8Hz,1H)、5.22(d,J＝11.8Hz,1H)、4.69(d,J＝1.6Hz,1H)、4.52(d,J＝1.8Hz,1H)、4.42(d,J＝11.9Hz,1H)、4.31(d,J＝11.7Hz,1H)、3.81(s,3H),3.65(d,J＝18.1Hz,1H)、3.56–3.49(m,3H),3.40(d,J＝18.1Hz,1H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.32、161.25、160.15、130.96、127.09、126.92、122.48、114.20、90.18、68.52、58.50、56.41、55.52、43.62、28.69。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-乙氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-2)：产率＝20％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝8.4Hz,2H)、6.89(d,J＝8.6Hz,2H)、5.30(d,J＝11.8Hz,1H),5.21(d,J＝11.8Hz,1H)、4.67(d,J＝1.8Hz,1H)、4.55(dd,J＝1.8,0.4Hz,1H)、4.41(d,J＝11.8Hz,1H)、4.31(d,J＝11.8Hz,1H)、3.81(s,3H)、3.77-3.68(m,2H)、3.64(d,J＝18.0Hz,1H)、3.40(d,J＝18.0Hz,1H),1.29–1.23(m,4H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.56、161.35、160.14、130.98、127.17、126.95、122.31、114.19、89.02、68.51、67.27、57.12、55.52、43.65、28.71、15.34。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-异丙氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-3)：产率＝23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝8.6Hz,2H)、6.87(d,J＝8.6Hz,2H)、5.26(d,J＝5.6Hz,1H)、5.20(d,J＝4.4Hz,1H)、4.73(d,J＝1.7Hz,1H)、4.68(d,J＝1.8Hz,1H)、4.40(d,J＝11.8Hz,1H)、4.33(d,J＝11.8Hz,1H),3.77(s,3H)、3.60(d,J＝18.1Hz,1H)、3.42(d,J＝22.2Hz,1H),1.21(dd,J＝17.6,6.1Hz,6H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ167.94、160.92、158.69、130.95、130.90、126.84、124.72、122.25、114.23、114.19、87.81、74.69、68.55、61.17、59.24、55.51、43.29、28.67、22.58。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-(叔丁氧基)-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-4)：产率＝33％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(d,J＝2.1Hz,2H)、6.89(d,J＝3.9Hz,2H)、5.30(d,J＝11.8Hz,1H)、5.20(d,J＝11.8Hz,1H)、4.74(d,J＝1.9Hz,1H)、4.68(d,J＝1.9Hz,1H)、4.42(d,J＝11.8Hz,1H)、4.33(d,J＝18.2Hz,1H)、3.78(s,3H)、3.61(d,J＝18.1Hz,1H)、3.42(d,J＝23.2Hz,1H)、1.25(s,9H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.01、162.66、158.68、130.97、130.91、126.84、124.70、122.02、114.24、83.09、76.69、68.57、61.19、55.52、43.30、28.70、28.10。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-(苄氧基)-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-5)：产率＝18％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝8.4Hz,2H)、7.41–7.31(m,5H)、6.88(d,J＝8.8Hz,2H)、5.22(dd,J＝34.3,11.8Hz,2H)、5.11(d,J＝1.8Hz,1H)、4.74(d,J＝1.8Hz,1H)、4.67(s,1H)、4.36(dd,J＝27.1,11.9Hz,2H)、3.79(s,3H)、3.59(d,J＝18.1Hz,1H)、3.38(d,J＝18.1Hz,1H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.85、160.19、156.85、146.53、131.82、131.00、130.54、128.76、128.55、127.80、127.20、126.73、126.67、125.12、114.25、83.70、68.63、65.45、57.31、55.53、28.52、22.04。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-8-氧代-7-(甲苯磺酰氧基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(3-6)：产率＝20％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝8.2Hz,1H)、7.36(dd,J＝22.4,8.3Hz,3H)、7.02(d,J＝8.1Hz,1H)、6.89(d,J＝8.6Hz,2H)、6.74(d,J＝8.4Hz,1H)、5.23(dd,J＝35.8,11.7Hz,2H)、5.11(dd,J＝1.8,1.2Hz,1H)、4.79–4.73(m,1H)、4.37(dd,J＝34.3、11.9Hz,2H)、3.81(s,3H)、3.61(d,J＝18.1Hz,1H)、3.40(d,J＝18.1Hz,1H)、2.47(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ171.44、160.84、160.16、156.87、146.56、131.78、130.97、130.56、128.81、128.50、126.66、125.21、114.14、83.68、68.58、64.97、57.25、55.49、43.19、28.46、22.01。
实施例6
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-烷氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6)的制备：化合物6根据Bradley等，(1999)Int.J.Antimicrob.Agents 11:93-100及Papp-Wallace等，(2011)Antimicrob.Agents Chemother.55:4943-4960来合成，其通过引用以其整体并入本文。将碘化钠(1.0当量)添加至3(1.0当量)在丙酮中的溶液。将所得的混合物在室温搅拌一小时，并然后在减压下去除溶剂。添加水并用乙酸乙酯萃取三次。然后将合并的有机层用Na2S2O3水溶液和盐水洗涤，经MgSO4干燥。将粗产物在下一步直接使用。在室温，将以上产物(1.0当量)、K2CO3(3.0当量)和7-羟基香豆素(2.0当量)在乙腈中的混合物搅拌2.5小时。溶剂随后在减压下被去除，且剩余物被溶解于水中并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用Na2S2O3水溶液和盐水洗涤，经MgSO4干燥。使用在短硅胶柱上的快速层析去除无机杂质和过量的7-羟基香豆素的大部分。将所得的包含两种异构体的化合物4溶解于CH2Cl2中，并且然后在0℃，以数批添加3-氯过氧苯甲酸(m-CPBA,68％,1.0当量)。在0℃搅拌30min之后(用TLC监测)，将反应混合物用CH2Cl2稀释，并随后用Na2S2O3(水溶液)、NaHCO3(水溶液)和盐水洗涤。经MgSO4干燥，随后用在短硅胶柱上的快速层析纯化，以获得化合物5。将三氟乙酸酐(TFAA)(5.0当量)逐滴添加至在0℃在无水丙酮中的化合物5(1.0当量)和NaI(5.0当量)的混合物。将所得的混合物在0℃搅拌一小时，并然后在减压下去除溶剂和挥发性试剂。将剩余物溶解于NaHCO3(水溶液)中并用乙酸乙酯萃取。在硅胶柱上的快速层析纯化之后，获得作为固体的标题化合物6。化合物6的实施方案(化合物6-1至6-6)分别分别通过使用醇类甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、苄醇和甲苯磺酰酸合成：
(6R,7S)-4--甲氧基苄基7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-1)：产率＝33％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝9.5Hz,1H)、7.32(d,J＝8.2Hz,3H)、6.82(d,J＝8.7Hz,2H)、6.75(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H)、6.70(d,J＝2.3Hz,1H)、6.24(d,J＝9.5Hz,1H)、5.24(s,2H),4.81(q,J＝12.4Hz,2H)、4.68(d,J＝1.7Hz,1H)、4.52(d,J＝1.7Hz,1H)、3.75(s,3H)、3.63(d,J＝18.3Hz,2H)、3.52(s,3H)、3.46(d,J＝18.3Hz,2H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.34、160.15、155.88、143.50、131.00、129.19、126.94、122.72、114.20、113.81、113.34、112.79、102.09、90.32、68.47、67.29、58.47、56.29、55.51、27.82。
(6R,7S)-4--甲氧基苄基7-乙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-2)：产率＝30％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.63(d,J＝9.6Hz,1H)、7.34(dd,J＝8.6,3.1Hz,3H)、6.84(d,J＝8.7Hz,2H)、6.76(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H)、6.72(d,J＝2.3Hz,1H)、6.27(d,J＝9.5Hz,1H)、5.25(d,J＝1.8Hz,2H)、4.82(q,J＝12.5Hz,2H)、4.67(d,J＝1.8Hz,1H)、4.56(d,J＝1.8Hz,1H)、3.77(s,3H)、3.76-3.62(m,2H)、3.62(d,J＝18.3Hz,1H)、3.46(d,J＝18.3Hz,1H)、1.26(t,J＝7.0Hz,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ171.30、161.71、161.62、161.23、160.17、155.91、143.45、131.04、129.15、126.92、122.53、114.21、113.87、113.35、112.77、102.16、89.19、68.48、67.32、67.25、60.65、57.03、55.51、27.83、15.34。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-异丙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-3)：产率＝29％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(d,J＝9.5Hz,1H)、7.43–7.27(m,3H)、6.86(dd,J＝10.8,5.4Hz,2H)、6.80–6.69(m,2H)、6.28(dd,J＝9.5,2.6Hz,1H)、5.26(dt,J＝16.6,8.4Hz,2H)、4.96–4.79(m,2H)、4.74(dd,J＝25.3,1.8Hz,1H)、4.58(dd,J＝21.2,1.8Hz,1H)、3.78(s,3H),3.64(d,J＝7.3Hz,1H)、3.58(d,J＝17.2Hz,1H)、3.46(d,J＝18.3Hz,1H)、1.24(dd,J＝18.7,6.1Hz,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.89、162.69、161.47,160.14、155.66、144.40、131.08、131.01、129.33、127.08、126.87、123.25、114.27、114.23、113.48、113.38、113.29、102.15、87.76、74.92、68.58、67.31、58.40、55.52、27.84、22.63、22.52。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-(叔丁氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-4)：产率＝33％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝9.5Hz,1H)、7.34(t,J＝8.0Hz,3H)、6.84(d,J＝8.5Hz,2H)、6.79–6.71(m,2H)、6.26(d,J＝9.5Hz,1H)、5.28–5.19(m,2H)、4.85–4.75(m,2H)、4.65(d,J＝1.4Hz,1H)、4.55(d,J＝1.4Hz,1H)、3.77(s,3H)、3.61(d,J＝18.1Hz,1H)、3.46(dd,J＝9.4,8.8Hz,2H)、1.26(s,9H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ171.37、167.94、162.76、161.74、161.18、161.09、160.17、158.79、155.89、143.45、131.02、129.19、127.34、126.89、126.57、125.21、122.18、114.22、113.86、113.38、112.74、102.15、83.25、68.57、67.12、61.35、59.11、55.51、28.09、21.29。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基7-(苄氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-5)：产率＝23％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝9.5Hz,1H)、7.36(d,J＝0.5Hz,4H)、7.34(s,1H),7.33(d,J＝3.2Hz,1H)、6.85(d,J＝8.7Hz,3H)、6.80–6.64(m,3H)、6.27(d,J＝9.5Hz,1H)、5.26(d,J＝1.5Hz,2H)、4.87(t,J＝3.8Hz,1H)、4.83(d,J＝4.1Hz,1H)、4.80(d,J＝3.1Hz,1H)、4.79–4.76(m,1H)、4.64(d,J＝1.8Hz,1H)、4.59(d,J＝1.8Hz,1H)、3.77(s,3H)、3.58(d,J＝18.2Hz,1H)、3.42(d,J＝18.3Hz,1H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.59、161.50、161.22、161.16、160.18、155.91、143.42、136.23、131.05、129.14、128.94、128.79、128.60、126.92、122.93、114.26、114.22、113.88、113.36、112.74、102.17、88.52、83.92、73.55、68.49、67.28、57.12、55.51、27.75。
(6R,7S)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(甲苯磺酰氧基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯(6-6)：产率＝12％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H)、7.84(d,J＝8.5Hz,2H)、7.63(d,J＝9.6Hz,1H)、7.42–7.27(m,5H)、6.85(d,J＝8.7Hz,2H)、6.76(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H)、6.72(d,J＝2.4Hz,1H)、6.28(d,J＝9.5Hz,1H)、5.28–5.17(m,2H),5.12(d,J＝1.8Hz,1H)、4.86(q,J＝12.7Hz,2H)、4.78(d,J＝1.7Hz,1H)、4.62(s,1H)、3.78(s,3H)、3.62(d,J＝18.3Hz,1H)、3.46(d,J＝18.3Hz,1H)、2.47(s,3H)。
实施例7
最终的荧光探针的制备：将化合物6添加至CH2Cl2：TFA:TIPS:H2O＝30:65:2.5:2.5的溶液(4mL)，并且在0℃搅拌混合物30min(用HPLC监测)。在C18柱上RP-HPLC纯化，获得所期望的最终探针。
(6R,7S)-7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-1).产率＝77％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.97(d,J＝9.6Hz,1H)、7.62(d,J＝8.6Hz,1H)、7.01(d,J＝2.2Hz,1H)、6.95(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H)、6.28(d,J＝9.5Hz,1H)、5.01(d,J＝1.6Hz,1H)、4.86(dd,J＝26.5,11.9Hz,2H)、4.75(d,J＝1.7Hz,1H)、3.70(d,J＝18.1Hz,1H)、3.55(d,J＝18.1Hz,1H),3.43(s,3H)。13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ163.45、161.94、161.80、160.89、155.93、144.93、132.96、130.26、128.14、121.16、113.46、102.18、89.60、67.80、57.99、55.90、27.65。MS:对于C18H15NNaO7S+([M-H]+)计算值：412.37；发现值(Found):412.06。
(6R,7S)-7-乙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-2).产率＝80％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.98(d,J＝9.6Hz,1H)、7.63(d,J＝8.6Hz,1H)、7.01(d,J＝2.4Hz,1H)、6.96(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H)、6.29(d,J＝9.5Hz,1H)、4.95(d,J＝1.6Hz,1H)、4.85(d,J＝15.7Hz,2H)、4.77(d,J＝1.4Hz,1H)、3.74–3.65(m,2H),3.62(d,J＝7.0Hz,1H)、3.55(d,J＝18.1Hz,1H)、1.16(t,J＝7.0Hz,3H)。MS:对于C19H16NO7S-([M-H]-)计算值：402.41；发现值:402.00。
(6R,7S)-7-异丙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-3).产率＝83％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.98(d,J＝9.2Hz,1H)、7.62(d,J＝8.7Hz,1H)、7.01(d,J＝2.4Hz,1H)、6.95(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H)、6.29(d,J＝9.5Hz,1H)、4.89(d,J＝11.9Hz,1H)、4.84(d,J＝1.7Hz,1H)、4.81(d,J＝11.9Hz,1H)、4.77(d,J＝1.7Hz,1H)、3.82(dd,J＝12.2,6.1Hz,1H)、3.70(d,J＝18.0Hz,1H)、3.54(d,J＝18.1Hz,1H)、1.15(dd,J＝9.3,6.1Hz,6H)。13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ163.48、162.50、161.81、160.90、155.94、144.95、130.26、128.23、121.00、113.48、102.19、87.32、74.02、67.80、58.05、40.81、40.60、40.39、40.18、39.97、39.77、39.56、27.67、22.97、22.89。MS:对于C20H18NO7S-([M-H]-)计算值：416.43；发现值:416.03。
(6R,7S)-7-(叔丁氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-4).产率＝75％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.98(d,J＝9.2Hz,1H)、7.62(d,J＝8.7Hz,1H)、7.01(d,J＝2.4Hz,1H)、6.95(dd,1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.98(d,J＝9.6Hz,1H)、7.62(d,J＝8.7Hz,1H)、7.01(d,J＝2.3Hz,1H)、6.98–6.92(m,1H)、6.29(d,J＝9.5Hz,1H)、4.89(d,J＝12.0Hz,1H)、4.83(d,J＝1.7Hz,1H)、4.80(s,1H),4.76(d,J＝1.6Hz,1H)、3.68(d,J＝18.0Hz,1H)、3.53(d,J＝18.0Hz,1H)、1.19(s,9H)。13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ163.53、163.14、161.81、160.91、155.93、144.96、130.26、121.16、113.50、102.19、82.72、76.56、67.79、59.09、28.16、27.61。MS:对于C21H20NO7S-([M-H]-)计算值：430.46；发现值:430.00。
(6R,7S)-7-(苄氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-5).产率＝72％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.98(d,J＝9.4Hz,1H)、7.63(d,J＝8.4Hz,1H)、7.36(dd,J＝12.8,4.2Hz,4H)、7.01(s,1H),6.95(d,J＝8.9Hz,1H)、6.29(d,J＝9.5Hz,1H)、4.94(s,1H),4.91(s,1H)、4.87(d,J＝1.7Hz,1H)、4.82(d,J＝11.9Hz,1H)、4.73(d,J＝11.4Hz,1H)、4.63(d,J＝11.5Hz,1H)、3.60(dd,J＝52.7,18.1Hz,2H)。13C NMR(101MHz,CD3OD)δ162.23、146.95、144.47、143.24、129.39、128.46、128.31、128.24、126.45、124.31、113.02、112.59、101.55、88.27、72.94、67.09、56.94、26.94。MS:对于C24H18NO7S-([M-H]-)计算值：464.48；发现值:464.17。
(6R,7S)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-7-(甲苯磺酰氧基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸((s)-CC-6).产率＝70％。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.98(d,J＝9.5Hz,1H)、7.88(d,J＝8.4Hz,2H)、7.62(d,J＝8.6Hz,1H)、7.52(d,J＝8.4Hz,2H)、7.00(d,J＝2.4Hz,1H)、6.94(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H)、6.29(d,J＝9.5Hz,1H)、5.62(d,J＝1.5Hz,1H)、5.06(d,J＝1.7Hz,1H)、4.90(dd,J＝36.4,12.3Hz,2H)、3.60(dd,J＝41.3,18.1Hz,3H)、2.43(s,3H)。MS:对于C24H18NO9S2 -([M-H]-)计算值：528.54；发现值:527.88。
(6R,7S)-7-(叔丁氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸5-氧化物((s)-CC-7)1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.87(d,J＝9.6Hz,1H)、7.54(d,J＝8.4Hz,1H)、6.95(dd,J＝11.6,3.1Hz,2H)、6.25(d,J＝9.5Hz,1H),5.44–4.98(m,2H),4.61(d,J＝50.3Hz,2H)、4.15(d,J＝16.5Hz,1H)、4.06(d,J＝18.8Hz,1H)、3.90(d,J＝16.0Hz,1H)、3.74–3.59(m,1H)、1.31(s,1H)。MS:对于C21H20NO8S([M-H]-)计算值：446.46；发现值:445.98。
实施例8
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.09(d,J＝9.1Hz,1H)、7.98(s,1H)、7.86(d,J＝7.8Hz,2H)、7.51(d,J＝8.1Hz,2H)、7.32(dd,J＝9.2,1.6Hz,1H)、5.41(s,1H)、4.96(dd,J＝25.3,11.6Hz,2H)、4.84(s,1H),3.52(d,J＝17.4Hz,1H)、3.35(d,J＝17.0Hz,4H)、2.42(s,3H)。13CNMR(101MHz,CD3OD)δ172.08、166.42、162.95、158.54、157.99、157.77、147.87、146.62、137.69、131.99、130.37、128.19、127.43、126.52、124.76、117.30、105.14、84.02、78.20、67.01、57.19、48.50、48.29、48.08、47.87、47.65、47.44、47.23、34.79、26.87、20.66。MS:对于C26H21N3O9S4([M+H]+)计算值：648.02；发现值:648.40。
实施例9
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.04(d,J＝9.1Hz,1H)、7.79(d,J＝2.3Hz,1H)、7.20(dd,J＝9.1,2.5Hz,1H)、5.47–5.36(m,1H)、4.88–4.82(m,2H)、4.77(d,J＝1.0Hz,1H)、3.88–3.80(m,1H)、3.80–3.75(m,1H)、3.73(s,1H)、3.68(d,J＝8.3Hz,1H)、3.58(d,J＝18.1Hz,2H)、1.15(dd,J＝8.7,6.1Hz,6H)。MS:对于C22H21N3O7S3([M+H]+)计算值：536.05；发现值:536.40。

Claims (18)

1.一种组合物，所述组合物包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的探针，所述探针包含具有6,7-反式构型的头孢菌素和附连至其的可检测的标记物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述探针具有式I或式II：
其中，R1选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团及荧光猝灭剂。
3.如权利要求1所述的组合物，其中R1选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记物通过-O-、-N-或-S-连接被附连至所述头孢菌素。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记物是具有以下结构的(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)：
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述探针选自由以下组成的组：
，以及
7.一种选择性检测金属-β-内酰胺酶活性的方法，所述方法包括使怀疑具有金属-β-内酰胺酶活性的样品与包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的探针的组合物接触，所述探针包含具有6,7-反式构型的头孢菌素部分和可检测的标记物；允许金属-β-内酰胺酶活性裂解所述头孢菌素部分的有效时间段，从而从所述头孢菌素部分释放所述可检测的标记物，藉此生成可检测的信号；并且检测所述信号，其中可检测的信号指示所述样品包含金属-β-内酰胺酶活性或金属-β-内酰胺酶活性的来源。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述探针具有式I或式II：
其中R1选自由以下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光团及荧光猝灭剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中R1选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基-及甲苯磺酰氧基-。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物是染料、荧光标记物、放射性标记物、萤光素酶底物或猝灭剂。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物通过-O-、-N-或-S-连接被附连至所述探针。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物是具有以下结构的(2-氧代-2H-色烯-7-基)(III)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并噻唑-2-基)-4,5-二氢噻唑-4-羧酸(IV)：
13.如权利要求7所述的方法，其中所述探针选自由以下组成的组：
14.如权利要求7所述的方法，其中所述样品是细菌培养物。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述样品已从动物受试者或人受试者分离。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述样品是由来自人受试者或动物受试者的样品产生的细菌培养物。
17.如权利要求所述的方法，其中所述样品包含克雷伯杆菌属物种(Klebsiella sp.)或埃希氏杆菌属物种(Escherichia sp.)中的至少一种。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述可检测的标记物是萤光素酶底物，并且所述方法还包括使反应混合物与萤光素酶接触，从而在释放的萤光素酶底物的存在下生成可检测的生物发光信号。
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