CN106047678B - 一种基于阻抗谱法的细胞活性检测方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于阻抗谱法的针对贴壁培养细胞的活性检测方法与装置，培养皿的内部底部是与培养皿底面相平行的叉指电极，叉指电极的两极分别通过导线连接控制器，控制器中的单片机控制DDS频率发生器分别发出从高频到低频n个频率的正弦波，电流激励信号经过压控电流源转换后被输出到叉指电极中，叉指电极的n个响应电压通过差分放大器，模数转换后被输入到单片机中；单片机计算出不同的频率下的复阻抗值，根据等效电路模型和复阻抗值计算出双电层电容值；选取等效电路中双电层电容的电容值作为评估细胞活性的指标，从而获得更准确的细胞活性信息，可以对细胞的活性进行实时的监控，不会破坏细胞的稳态，实现对细胞活性的定量测量。

Description

一种基于阻抗谱法的细胞活性检测方法与装置

技术领域

本发明涉及一种细胞活性监测方法和装置，细胞活性监测特指针对贴壁培养细胞活性的实时在线监测。

背景技术

细胞的研究是医学、生命科学、生物工程等诸多学科的基础，而细胞活性检测技术被广泛地应用在药物筛选、毒理学试验、免疫功能评价、蛋白质组学以及食源和药源成分的活性鉴定等各个领域。随着抗肿瘤研究的不断升温，细胞活性检测在肿瘤细胞敏感性试验中也发挥着重要的作用。

为了适应不同条件下的检测需要，研究人员探索出了多种细胞活性的检测方法。按照检测原理的不同大致可以将实验室中常用的检测手段分为染色计数法和比色法两大类。染色计数法是利用活细胞和死细胞对特定染料的亲合力不同，实现活细胞或者死细胞的选择性标记，再通过显微镜对标记的细胞进行计数，从而算出细胞的存活率。根据染料的不同，染色计数法可以分为化学染色法和荧光染色法。比色法是利用细胞或细胞器的生理活动，使得特定化学物质的颜色发生和细胞的活性成正比的改变这一规律，通过酶标仪等比色仪器测定特定波长的吸收率来定量地测量这一颜色的改变，从而获得细胞活性的量化衡量指标。常用的比色法有MTT法，XTT法，Alamar Blue法，LDH法，SRB法和ATP法等。除了这两大类人工检测活细胞的方法外，一些仪器如液体闪烁计数仪和流式细胞仪也可以进行细胞活性的检测。

现有的细胞活性检测方法主要存在以下问题：

1、侵入性：不管是人工检测还是仪器检测，现有的技术对活细胞和死细胞进行判定之前，都需要利用化学染料、同位素等物质对特定生存状态的细胞进行标记。标记物要么侵入细胞内部，要么改变细胞外部的微环境。标记过程或多或少对细胞的活性有一定的影响。同时标记也增加了实验的复杂性和不确定性，标记染料本身的品质、标记操作的规范程度和标记的时间等因素都有可能影响最终的检验结果。另外某些标记染料价格昂贵，对环境也有一定的危害性。

2、终点检测：所有的检测手段都是在细胞研究的某一个节点取样对细胞进行活性检测，检测完成之后，检测用的细胞无法继续培养。这些检测方式均属于终点检测的范畴，目前尚没有有效的手段能够实现细胞在生长周期内细胞活性的实时监测。

3、对人工操作依赖性：传统检测离不开操作人员的人工操作，不同熟练程度的操作人员对同一个实验的结果有一定的影响。利用流式细胞仪等设备虽然能在分选过程实现自动化操作，但是前期的标记过程依然离不开检验员的人工操作。人工操作的依赖性将直接导致实验的重复精度难以得到突破。

传统的阻抗法，是利用特定频率下电极之间的总阻抗作为测量指标，这一方法虽然操作简便，易于实现。然而，系统的总阻抗除了包括了细胞本身的阻抗，细胞和电极的间隙阻抗以外还包含了电极和溶液界面的容抗，电解液的电阻等。因此总阻抗无法直接地反映细胞和电极之间粘附的紧密程度，选取其作为评估细胞活性的指标，最终的检测结果将会受到电解质、电极、细胞类型等诸多因素干扰。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有细胞活性检测技术存在的问题，提出一种非侵入、无标记、全程自动化操作的基于阻抗谱法的细胞活性检测方法与装置，利用细胞和培养液系统的复阻抗、细胞贴壁性以及细胞活性这三者的内在逻辑关系，实现对细胞活性的检测。

本发明一种基于阻抗谱法的细胞活性检测装置采用的技术方案是：包括注有细胞培养液的培养皿，培养皿的内部底部是与培养皿底面相平行的叉指电极，叉指电极的两极分别通过导线连接控制器，所述叉指电极具有两个相互平行且垂直于培养皿底面的电极本体，两个电极本体之间是多个连接两个电极本体、均与培养皿底面平行且上下布置的矩形叉指，上下相邻两个叉指有间距，连接两个电极本体上的叉指数量相同，相互成对上下交叉；所述控制器包括单片机、DDS数字频率合成器、压控电流源、差分放大电路和A/D转换器，单片机的输出端依次连接DDS数字频率合成器、压控电流源和叉指电极，叉指电极的输出端依次连接差分放大电路、A/D转换器和单片机。

本发明一种基于阻抗谱法的细胞活性检测装置的检测方法采用的技术方案是包括以下步骤：

A、由细胞内液电阻R_c和细胞膜电容C_c串接后与溶液电阻R_s并接、并接后的两端再分别串接一个双电层电容C_d构成与细胞溶液相似电学特性的等效电路模型；

B、单片机控制DDS频率发生器，分别发出从高频到低频n个频率的正弦波，经过压控电流源转换为电流激励信号，电流激励信号被输出到叉指电极中；叉指电极的n个响应电压通过差分放大器，模数转换后被输入到单片机中；单片机根据激励电流和响应电压计算出不同的频率f_n下的复阻抗值Z_n，即等于所述等效电路模型的复阻抗值Z_n，根据等效电路模型和复阻抗值Z_n计算出双电层电容C_d值；

C、由细胞增殖及细胞活性测定方法测量不同细胞活性的活细胞数和细胞总数的比例关系，以所计算出的双电层电容C_d值为横坐标，所测量的活细胞数和细胞总数的比例为纵坐标获得曲线，用最小二乘法拟合曲线，将双电层电容C_d值代入曲线方程，求得活细胞占总细胞的百分比。

本发明和现有细胞活性检测技术相比，具有如下优势：

1、本发明选取等效电路中双电层电容的电容值作为评估细胞活性的指标，该参数和细胞的贴壁性能具有直接的联系，从而获得更准确的细胞活性信息，可以对细胞的活性进行实时的监控。

2、非侵入检测手段。本发明不在培养液中添加任何化学试剂，同时阻抗谱法的特性决定检测电压为毫伏范围内正弦波动，基本不会破坏细胞的稳态，因此本检测装置不会对细胞的活性产生任何影响。

3、非标记检测技术。本发明不使用具有放射性的同位素、制备工艺复杂的抗体以及各类化学染料。具有操作简单，低成本，对环境和研究人员无毒无害等优势。

4、全程自动化监测。本发明不需要专业的操作人员进行操作，检测结果不依赖于操作者的熟练程度。检测结果具有良好的可重复性。

5、本发明检测装置体积小巧，可以制成手持式设备。具有应用到POCT即时检测领域的潜质。

6、本发明检测装置中没有光学设备和质谱检测仪器中的精密元器件，成本相对低廉。同时自动化系统不依赖操作人员的操作技巧，对提高偏远地区医疗机构的检测和实验水平具有重要意义。

7、经过优化的阻抗谱等效模型使得本发明能够更直观地表征细胞的活性，获得更高测量精度。从而能实现对细胞活性的定量测量。

8、本发明可以为生物技术、食品科学、医疗诊断等各领域的细胞实验提供低成本、高灵敏度的实时细胞活性监控。

附图说明

图1是本发明一种基于阻抗谱法的细胞活性检测装置的总体结构图；

图2 是图1中叉指电极结构放大图；

图3 是图1中培养皿内部的阻抗谱法等效电路图；

图4 是图1中控制器的内部结构及外接电路原理图；

图5 是细胞活性检测装置的检测方法流程图；

图中：1.培养皿；2.控制器；3.叉指电极；4.开关；5.液晶显示屏；6.导线；7、8.电极本体；9、10.接线柱；11.叉指；12.叉指间距。

具体实施方式

参见图1，本发明一种基于阻抗谱法的细胞活性检测装置包括一个培养皿1，培养皿1中注有细胞培养液，在培养皿1的内部底部是叉指电极3，叉指电极3由生物亲合类材料制成，叉指电极3通过专用的黏合剂紧密粘合在培养皿1底部，使叉指电极3与培养皿1底面相平行。

叉指电极3的两极分别通过导线6连接控制器2，控制器2位于培养皿1外部。在控制器2的外表面安装用于启动检测装置的开关4和用于显示细胞活性数值的液晶显示屏5。

参见图2，叉指电极3由电极本体、叉指和接线柱组成。叉指电极3有两个电极本体，分别是电极本体7和电极本体8，两个电极本体7、8面对面布置，相互平行并且都垂直于培养皿1底面，每个电极本体7、8向外侧方延伸有一个接线柱，电极本体7向外侧方延伸接线柱9、电极本体8向外侧方延伸接线柱10。两个接线柱9、10分别连接一根导线6的一端，导线6的另一端均穿过培养皿1底部连接外部的控制器2。

在两个垂直的电极本体7、8之间是多个叉指11，叉指11是两个电极本体由内侧面延伸的上下布置且相互平行的矩形结构。每个叉指11左右长度方向是长边，为叉指的长。上下相邻两个叉指11之间的间距是叉指间距12，所有叉指11均与培养皿1底面平行，均与电极本体7、8垂直。连接两个电极本体上的叉指11数量相同，相互成对交叉。图2中只示出了3对叉指，实际应用中叉指的对数一般在50对左右。根据所测量细胞的形状和体积的不同，叉指的对数，叉指间距等参数可针对性地进行优化。

根据不同的细胞特性，叉指11本身的上下高度和叉指间距12这两个尺寸均在几十微米到几百微米之间。叉指电极3采用黄金制成，金不仅是良好的导电材料，还具有独特的生物亲合性，便于细胞贴壁生长，同时其化学性质稳定性，使得电极本体7、8不会和溶液中的成分发生反应，不易被腐蚀。相对于传统的平板电极，微米级的叉指电极3通过降低自身的阻抗，缩小电极间距，提高比表面积等方式大大提高检测的灵敏性。

根据电化学理论，固态电极和液体电解质的两相接触界面会形成具有电容特性的双电层结构。当细胞具有较高活性而紧密贴附在电极表面时。此时电极和培养液的接触表面很小，相当于等效平板电容的极板的截面积很小，双电层的电容值对应的也处于很低的数值。反之细胞丧失活性时，会逐渐脱离电极表面，此时大量培养液开始充斥到细胞和电极的间隙之间，电极和培养液的接触面积增大，相当于等效平板电容的极板的截面积变大，双电层电容值随之变大。因此电极和培养液两相接触面的双电层的电容值可以定量的反映细胞的贴壁程度，并以此来间接地表征细胞的活性。参见图3的阻抗谱法等效电路图，电极和溶液界面形成的双电层，其电学特性可以等效为电容值为C_d的电容元件。R_s代表溶液的电阻，R_c和C_c分别表征细胞内液的电阻和细胞膜的电容。细胞培养时，在叉指电极3的两个叉指11之间，密密麻麻地贴附着贴壁细胞。在低频激励下，电流难以通过绝缘的细胞膜，大多数从细胞之间间隙的溶液中通过。此时溶液电阻R_s在培养液的阻抗中占较大的权重。高频激励时，高频电流可以通过具有电容特性的细胞膜穿过细胞内液。细胞内液电阻R_c和细胞膜电容C_c串联支路将在溶液总阻抗中占较大的权重，而电容C_c的等效电容正好体现了细胞阻碍低频电流，导通高频电流的特性。

参加图1和图4，控制器2包括单片机、DDS数字频率合成器、压控电流源、差分放大电路和A/D转换器，单片机通过显示接口电路连接外部的液晶显示屏5，由开关4控制单片机的电源。单片机的输出端依次连接DDS数字频率合成器、压控电流源和叉指电极3，叉指电极3的输出端依次连接差分放大电路、A/D转换器和单片机。单片机整个控制器2的中枢，不仅控制整个设备的运行，也是等效电路模型匹配算法和关键因子参数计算的核心硬件。开关4启动控制器2运行时，单片机将激励源的频率信号发送给DDS数字频率合成器，DDS数字频率合成器根据收到的指令，发出相应频率的正弦波信号，该正弦波信号经过压控电流源电路转化为电流激励信号输入到叉指电极3。差分放大电路用于放大叉指电极3响应的电压信号，并最终通过A/D转换器模数转换，输入到单片机中进行数据处理。本发明采用电流激励、电压响应的方式测量电阻抗谱。相对于电压激励而言，电流激励的方式可以有效提高输入电阻，最大限度减小接触电阻和极化电势所引起的误差。

本发明的检测原理首先是基于细胞的活力和细胞的贴壁性之间存在着密切的关系。当细胞处于活跃状态时，会分泌大量促进贴壁的贴壁蛋白。贴壁蛋白将细胞粘附在电极表面，此时细胞和电极之间的间距很小。当细胞受到急性损伤发生坏死或者受到调控信号控制开始凋亡时，其活性逐渐下降，分泌贴壁蛋白的能力也随之受到影响。贴壁蛋白的减少使得细胞和电极表面的间隙不断增大，直至细胞彻底死亡后将完全脱离电极表面。本发明将贴壁类细胞植入培养皿1后，细胞贴壁生长。在外界刺激或自身的调节下，细胞的活性会发生改变，而这一改变将导致其贴壁性发生变化，并导致双电层电容的电容值发生改变。利用检测电路测量阻抗谱不同频率下的复阻抗的改变，再通过电化学阻抗谱中的等效电路分析方法，计算出界面双电层电容的具体的数值，并以此为指标来评估细胞的活性情况。

参见图1-5，本发明细胞活性检测装置工作时，按下启动开关4后，单片机控制DDS频率发生器发出频率为f₁的高频正弦波，经过压控电流源转换后，电流激励信号i₁被输出到叉指电极3中。当贴附在电极表面的细胞的数量以及细胞和电极之间的间隙大小不同时，叉指11之间的阻抗值是不同的，因此对于相同的激励电流，不同活力的细胞对应的响应电压是不同的。叉指电极3的响应电压v₁通过差分放大器，模数转换后被输入到单片机中。单片机根据激励电流i₁和响应电压v₁的关系计算出频率f₁下的阻抗值，具体公式如下：

导纳 ，阻抗 ；

随后单片机控制DDS频率发生器改变输出频率，发出频率为f₂的激励电流，测得阻抗值Z₂。如此往复从高频到低频遍取频谱中的所有的n个频率后，得到不同频率下f_n的n个阻抗值Z₁，Z₂，Z₃···Zn。

等效电路法是电阻抗谱测量技术中最经典的分析方法之一，等效电路并不是实际存在的电路，而是假象的和被描述模型具有相同或相近电学特性的虚拟电路。图3是所构建的评估细胞活性的等效电路，等效电路具有和被测量的细胞溶液相似的电学特性，等效电路是细胞内液电阻R_c和细胞膜电容C_c串接后与溶液电阻R_s并接，并接后的两端再分别串接一个双电层电容C_d形成。当频率f_n的激励电流i_n输入到图3的等效电路中时，理论上其输出电压应该为v_n，在此频率下，虚拟等效电路的复阻抗应该和实际测量细胞溶液的复阻抗测量值相同，即也为Z_n。根据电路原理，由等效电路模型可以得到如下的公式：

，

其中R_s、R_c的单位为欧姆; R_s是溶液电阻值，R_c是细胞内液电阻值，C_d和C_c单位为法拉第，C_d是等效的双电层电容，C_c是细胞膜电容， ，j为虚数单位。Z_n为复阻抗，其实部为a，虚部为b。

由于需要获得的是双电层电容C_d的电容值，因此只需要对公式的虚部进行计算即可，将复阻抗的虚部提取出来，得到双电层电容C_d值：

，

其中R_s是溶液阻抗，其计算公式为：

，

其中ρ为溶液的电阻率，是培养液的固有属性，有专用的溶液电导测量仪测量出电导率后取倒数即可。l为两个叉指11之间的间距，即叉指间距12的垂直高度，S为叉指11的水平截面积，即上下相邻两叉指11正对面的面积，也是与培养皿1底面平行的截面积，均有设备本身决定。

当通入兆赫兹以上的高频激励时，不论是双电层电容还是细胞膜电容，在极高的频率下，均可以看成是短路导线。此时，电路中只有细胞内液电阻R_c和溶液电阻R_s两电阻并联，细胞内液电阻R_c的计算公式为：

，

其中I为激励电流值，U为激励电流I下测量得到的响应电压值。

虽然细胞群落呈现的的总体电学特性和细胞的数量密切相关，但是对于同一种细胞而言，细胞内液的电阻值和细胞膜的电容值呈现固定的比例k，这一特性和细胞的数量无关，这一比例k的关系可以通过查询常用的生物阻抗学文献资料获得，也可以实现通过常规的实验标定，因此细胞膜电容C_c的计算公式为：

，

k是细胞内液电阻值和细胞膜电容值的固定的比例值，不同的细胞选择不同的固定的k值；因此，利用测量得到的阻抗值结合等效电路模型可以计算出双电层电容C_d值，表征细胞活性的双电层电容C_d值根据公式计算得到：。

由于细胞的活性传统上一般用活细胞占全部细胞的百分比来表征，因此需要建立传统细胞活性指标和双电层电容C_d值之间的函数关系，这一过程叫做仪器的标定，由双电层电容C_d值推算细胞的活性。本发明装置在第一次使用前，需要进行标定，当标定完成后，今后再检测同种细胞，无需再进行标定工作。

MTT法是细胞增殖及细胞活性测定方法，广泛应用于细胞活性的检测，其原理是利用特定的染料可以对活细胞进行选择性染色，而死细胞由于没有新陈代谢活动，因此无法被其染色。根据染色后的吸光度值来推算活细胞占全部细胞百分比。标定时，使用MTT法和本发明装置同时测量不同细胞活性的例如10份细胞样本。MTT的测量的是活细胞数和细胞总数的比例关系，结果是一个百分数。本发明装置的测量结果是等效的双电层电容C_d值。测量完成后将会得到10组数据，每组数据由一个MTT测量得到的百分数和对应的双电层电容C_d这两个部分构成，以双电层电容值C_d为横坐标，MTT的测量值为纵坐标，可以得到坐标平面上的10个点，绘制出特性曲线，再用最小二乘法进行曲线拟合，最小二乘法是用来进行曲线拟合的常规方法，它可以根据这10个点的分布，拟合出一条曲线，这条曲线与这10个点的距离的平方和最小，通过单片机采用最小二乘法拟合曲线，将双电层电容C_d值代入拟合曲线方程，求得MTT法的理论测量结果，即活细胞占总细胞的百分比。并以此作为衡量细胞活性的指标显示在液晶显示屏上，由此实现双电层电容C_d值推算出细胞的活性。

由于生物材料的非线性特性，每一种细胞适合的最优测量频率不尽相同。在标定时一般使用多个频率进行，获得多组拟合曲线，拟合度最高的频率为该种细胞的测量频率。

Claims (3)

1.一种基于阻抗谱法的细胞活性检测装置，包括注有细胞培养液的培养皿（1），其特征是：培养皿（1）的内部底部是与培养皿（1）底面相平行的叉指电极（3），叉指电极（3）的两极分别通过导线（6）连接控制器（2），所述叉指电极（3）具有两个相互平行且垂直于培养皿（1）底面的电极本体（7、8）， 两个电极本体（7、8）之间是多个连接两个电极本体（7、8）、均与培养皿（1）底面平行且上下布置的矩形叉指（11），上下相邻两个叉指（11）有间距，连接两个电极本体上的叉指（11）数量相同，相互成对上下交叉；所述控制器（2）包括单片机、DDS数字频率合成器、压控电流源、差分放大电路和A/D转换器，单片机的输出端依次连接DDS数字频率合成器、压控电流源和叉指电极（3），叉指电极（3）的输出端依次连接差分放大电路、A/D转换器和单片机。

2.根据权利要求1所述基于阻抗谱法的细胞活性检测装置，其特征是：叉指电极（3）由生物亲合类材料制成，控制器（2）的外表面装有开关（4）和液晶显示屏（5），单片机通过显示接口电路连接液晶显示屏（5）。

3.一种如权利要求1所述基于阻抗谱法的细胞活性检测装置的检测方法，其特征是包括以下步骤：

A、由细胞内液电阻R_c和细胞膜电容C_c串接后与溶液电阻R_s并接、并接后的两端再分别串接一个双电层电容C_d构成与细胞溶液相似电学特性的等效电路模型；

B、单片机控制DDS频率发生器分别发出从高频到低频n个频率的正弦波，经过压控电流源转换为电流激励信号被输出到叉指电极（3）中；叉指电极（3）的n个响应电压信号通过差分放大器，模数转换后被输入到单片机中；单片机根据激励电流和响应电压计算出不同的频率f_n下的复阻抗值Z_n，即等于所述等效电路模型的复阻抗值Z_n，根据等效电路模型和复阻抗值Z_n计算出双电层电容C_d值；

等效电路模型的复阻抗值，

R_s、R_c的单位为欧姆，R_s是溶液电阻值，R_c是细胞内液电阻值，C_d和C_c单位为法拉第，C_d是双电层电容，C_c是细胞膜电容， ，j为虚数单位；Z_n为复阻抗，a为实部，b为虚部；

双电层电容，，，；ρ为溶液电阻率；k是根据不同细胞选定的固定比值，l为两个叉指（11）之间的间距，S为叉指（11）与培养皿（1）底面平行的截面积；I为激励电流值；U为激励电流I下测量得到的响应电压值；

C、由细胞增殖及细胞活性测定方法测量不同细胞活性的活细胞数和细胞总数的比例关系，以所计算出的双电层电容C_d值为横坐标，所测量的活细胞数和细胞总数的比例为纵坐标获得曲线，用最小二乘法拟合曲线，将双电层电容C_d值代入曲线方程，求得活细胞占总细胞的百分比。