CN105954417B

CN105954417B - 一种猴头菌片的质量检测方法及其应用

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Publication number: CN105954417B
Application number: CN201610323819.0A
Authority: CN
Inventors: 张慧晔; 唐海明; 王德勤; 李楚源
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd; Guangzhou Baiyun Mountain Hutchison Whampoa Traditional Chinese Medicine (bozhou) Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd; Guangzhou Baiyun Mountain Hutchison Whampoa Traditional Chinese Medicine (bozhou) Co Ltd
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-05-13
Also published as: CN105954417A

Abstract

本发明提供一种猴头菌片的质量检测方法，该方法包括(1)制备混合标准品溶液、(2)制备供试品溶液、(3)色谱条件、(4)绘制标准曲线并回归计算、(5)测定供试品溶液。还提供了根据本发明的质量检测方法所检测得到的猴头菌片剂。本发明的质量检测方法可以有效地全面监控猴头菌片的质量，监控生产工艺的稳定性，从而保障产品的质量稳定、均匀、可控，还可用于鉴定伪造产品，以保证该品种药物的正常生产和流通秩序。

Description

一种猴头菌片的质量检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物的检测方法，具体涉及一种猴头菌片的质量检测方法及其产品。

背景技术

猴头菌片是猴头菌菌丝体水提物制成的片剂，其具有益气补血、扶正培本、养胃护胃的作用，临床上常用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡及慢性胃炎等，对多种消化道疾病均有较好的疗效。猴头菌片含多糖、多肽类、核苷酸类、氨基酸等成分，具有免疫调节，保护胃肠道等作用。

猴头菌片的现有质量控制方法有分光光度法测定蛋白多糖含量、高效液相色谱法测定腺苷含量，而没有一种能全面表征猴头菌片质量的方法。还有一些文献提及了使用HPLC对猴头菌片剂中的腺苷含量进行检测的方法，或者对猴头菌本身的某些成分进行鉴定和检测的方法等等，但是这些方法也未能全面准确地表征猴头菌药物的质量，其中的一些方法甚至不能检测到猴头菌通常含有的有效成分，反而不利于产品的质量控制。

因此，为了规范猴头菌片的质量标准，解决猴头菌片质量参差不齐的问题，对猴头菌片的质量控制方法有待于进一步研究和改善。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种利用猴头菌片的指纹图谱从宏观上、整体上较为全面地检测猴头菌片的质量的方法，还提供了该质量检测方法的应用。

猴头菌片的现有质量控制方法为分光光度法测定蛋白多糖的含量和高效液相色谱法测定腺苷的含量。然而，猴头菌片是以整体为活性物质，因此单靠测定一种或几种有效成分考查猴头菌片的稳定性是不够的，不能解决其成分复杂、产品批次间质量差异的问题，而本发明建立的猴头菌片的HPLC指纹图谱的质量控制方法则解决了这些不足。

为实现上述目的，本发明提供了一种猴头菌片的质量检测方法，该方法的特点在于采用了高效液相色谱法，其具体包括以下步骤：

(1)制备混合标准品溶液：

精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，加水配制成每1mL含胞苷1～20μg、腺嘌呤1～20μg、尿苷20～40μg、腺苷20～40μg、鸟苷1～20μg的混合标准品溶液。可以优选为每1mL含胞苷5～9μg、腺嘌呤3～7μg、尿苷25～35μg、腺苷25～35μg、鸟苷2～6μg的混合标准品溶液。

(2)制备供试品溶液：

取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取，置于具塞锥形瓶中，加水，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(3)色谱条件：

以C₁₈色谱柱，以甲醇-体积百分比0.08～0.30％(下文中以％vol％表示)磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：21～30℃，紫外检测波长：220～280nm，流速：0.40～1.20mL·min^-1，洗脱时间：50～100min。

(4)绘制标准曲线并回归计算：

取所述的混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、25μL，注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，分别得到胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的线性关系。

(5)测定供试品溶液：

精密吸取所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件得到指纹图谱，记录峰面积，并按照步骤(4)得到的各线性关系计算胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的平均含量。

根据本发明的质量检测方法，其中，所述方法还包括：

(6)按照与步骤(1)～(5)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然后使用相似度评价系统对所得10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得到猴头菌片的共有模式图谱，以及这10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。

根据本发明的质量检测方法，其中，所述方法还包括：

(7)按照与步骤(1)～(5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的含量；和/或

(8)按照与步骤(1)～(5)相同的方法测定任意批次的猴头菌片的指纹图谱，并使用相似度评价系统计算其与步骤(6)的共有模式图谱的相似度。

根据本发明的质量检测方法，其中，在步骤(1)中，精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，分别加水配制为每1mL含168.80μg胞苷、57.50μg腺嘌呤、199.20μg尿苷、198.00μg腺苷、51.60μg鸟苷的五份溶液，然后从这五份溶液中分别取适量并混合，加水配制为每1mL含胞苷6.75μg、腺嘌呤4.60μg、尿苷31.87μg、腺苷31.68μg、鸟苷4.13μg的混合标准品溶液。

根据本发明的质量检测方法，其中，所述步骤(2)可以优选为：取猴头菌片10片，去包衣，研细，精密称取0.25～1.50g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取20～60min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。优选地，精密称取0.5g，超声提取30min。更优选地，4000r·min^-1离心，0.22μm滤膜滤过。

根据本发明的质量检测方法，其中，所述步骤(3)可以优选为：以C₁₈色谱柱，以甲醇-0.1％vol％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：26℃，紫外检测波长：260nm，流速：0.5mL·min^-1，洗脱时间：60min。

根据本发明的质量检测方法，其中，步骤(3)中的梯度洗脱条件为：0分钟时，流动相A为占流动相总体积0％的甲醇、流动相B为占流动相总体积100％的0.1％vol％磷酸水溶液；25分钟时，流动相A为占流动相总体积0.2％的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.8％的0.1％vol％磷酸水溶液；30分钟时，流动相A为占流动相总体积0.5％的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.5％的0.1％vol％磷酸水溶液；35分钟时，流动相A为占流动相总体积3.5％的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.5％的0.1％vol％磷酸水溶液；45分钟时，流动相A为占流动相总体积3.8％的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.2％的0.1％vol％磷酸水溶液；60分钟时，流动相A为占流动相总体积4.2％的甲醇、流动相B为占流动相总体积95.8％的0.1％vol％磷酸水溶液。

梯度洗脱条件具体如下表所示：

根据本发明的质量检测方法，其中，步骤(4)中的回归计算的结果为：胞苷的回归方程为Y＝3621.9X+0.6092，r为0.9999，线性范围为0.01～0.17μg；腺嘌呤的回归方程为Y＝11776x-2.3814，r为0.9999，线性范围为0.01～0.12μg；尿苷的回归方程为Y＝5862.9x+5.3668，r为0.9999，线性范围为0.06～0.80μg；腺苷的回归方程为Y＝6191.1x+6.2911，r为0.9999，线性范围为0.06～0.80μg；鸟苷的回归方程为Y＝4327.6x+0.7886，r为0.9999，线性范围为0.01～0.10μg。

该回归计算的结果具体如下表所示：

根据本发明的质量检测方法，其中，所述共有模式图谱中有16个特征共有峰，其中2号峰为胞苷、8号峰为腺嘌呤、9号峰为尿苷、12号峰为腺苷、13号峰为鸟苷；优选地，其中9号峰为参照峰，也是最强色谱峰；更优选地，所述共有模式图谱的总长度为60min，其中单峰面积超过总峰面积1％的峰有10个，它们是1～16号峰，单峰面积超过总峰面积5％的峰有6个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、12号峰、15号峰，单峰面积超过总峰面积15％的有2个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超过总峰面积25％的有1个，它是9号峰；进一步优选地，所述16个特征共有峰具体如下，

1号峰的平均保留时间RT为10.46min，RSD为0.33％，峰面积为125.982，RSD为35.38％；

2号峰的平均保留时间RT为12.04min，RSD为0.38％，峰面积为198.013，RSD为41.68％；

3号峰的平均保留时间RT为12.09min，RSD为0.24％，峰面积为88.825，RSD为70.37％；

4号峰的平均保留时间RT为12.62min，RSD为0.15％，峰面积为257.720，RSD为59.50％；

5号峰的平均保留时间RT为13.09min，RSD为0.34％，峰面积为625.366，RSD为42.44％；

6号峰的平均保留时间RT为15.51min，RSD为0.32％，峰面积为102.070，RSD为51.89％；

7号峰的平均保留时间RT为17.19min，RSD为0.31％，峰面积为353.710，RSD为60.76％；

8号峰的平均保留时间RT为18.31min，RSD为0.61％，峰面积为675.391，RSD为27.70％；

9号峰的平均保留时间RT为23.26min，RSD为0.39％，峰面积为1959.539，RSD为46.88％；

10号峰的平均保留时间RT为24.96min，RSD为0.49％，峰面积为178.417，RSD为25.76％；

11号峰的平均保留时间RT为27.29min，RSD为0.26％，峰面积为141.349，RSD为27.14％；

12号峰的平均保留时间RT为34.36min，RSD为0.50％，峰面积为1170.988，RSD为26.76％；

13号峰的平均保留时间RT为43.95min，RSD为0.37％，峰面积为282.908，RSD为87.40％；

14号峰的平均保留时间RT为45.09min，RSD为0.40％，峰面积为194.799，RSD为64.99％；

15号峰的平均保留时间RT为46.49min，RSD为0.41％，峰面积为501.655，RSD为33.34％；

16号峰的平均保留时间RT为48.19min，RSD为0.44％，峰面积为237.035，RSD为36.89％。

本发明还提供了根据本发明的质量检测方法所检测得到的猴头菌片剂。

需说明的是，在本发明构思的前提下对色谱条件进行进一步优化或改进的技术方案均属于本发明的保护内容。

本发明的质量检测方法相对于现有技术可以获得如下有益效果：

1、本发明的检测方法不仅构建了猴头菌片的指纹图谱技术标准及共有模式图谱，还能检测猴头菌片中胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷等有效成分的含量，可以有效地全面监控猴头菌片的质量，监控生产工艺的稳定性，从而保障产品的质量稳定、均匀、可控。另外，该质量检测方法可用于鉴定伪造产品，以保证该品种药物的正常生产和流通秩序。

2、在本发明的基础上，可以开展指纹图谱、有效成分与功效活性的相关性研究，从而有助于阐明内在化学成分的功效作用。

3、本发明的方法还具有良好的可行性、稳定性和重现性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例1得到的混合标准品溶液(A)和供试品溶液(B)的色谱图；

图2为本发明实施例2得到的10批猴头菌片的HPLC图谱和共有模式图谱。其中R为共有模式图谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中涉及的仪器与试剂为：

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、色谱柱为ZORBAX SB-Aq(5μm,4.6X250mm)柱、CP225D十万分之一电子天平(Sartoryus公司)、BT214D万分之一电子天平(Sartoryus公司)、SB25-12DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)及锥形瓶、漏斗、滤纸等。

试剂：甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。胞苷(批号100914316，美国SIGMA公司)、腺嘌呤(批号110886-200001，中国药品生物制品检定所)、尿苷(批号1001157075，中国药品生物制品检定所)、腺苷(批号110879-201202，中国药品生物制品检定所)、鸟苷(批号106K1848，美国SIGMA公司)。猴头菌片(长春迪瑞制药有限公司，批号：140401，141001；上海华源安徽仁济制药有限公司，批号：140701，140528；上海雷允上药业有限公司，140213；湖北襄阳隆中药业集团有限公司，批号：140501，140325；广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：140325，140408，140522，140528，150322)。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。

采用本发明的质量检测方法对1批猴头菌片的进行如下步骤的检测，可以得到该批猴头菌片的指纹图谱及其胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的含量。

(1)制备混合标准品溶液：

精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，分别加水配制为每1mL含168.80μg胞苷、57.50μg腺嘌呤、199.20μg尿苷、198.00μg腺苷、51.60μg鸟苷的五份溶液，然后从这五份溶液中分别取适量并混合，以得到每1mL含胞苷6.75μg、腺嘌呤4.60μg、尿苷31.87μg、腺苷31.68μg、鸟苷4.13μg的混合标准品溶液。

基于本发明提供的技术方案，混合标准品溶液中的胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的浓度可以分别在一定范围内选择。合适的范围可以为每1mL含胞苷1～20μg、腺嘌呤1～20μg、尿苷20～40μg、腺苷20～40μg、鸟苷1～20μg；可以优选为每1mL含胞苷5～9μg、腺嘌呤3～7μg、尿苷25～35μg、腺苷25～35μg、鸟苷2～6μg。本实施例所采用的浓度仅为优选的实施方式。

(2)制备供试品溶液：

取猴头菌片(批号：140325，广州白云山和记黄埔中药有限公司)10片，去包衣，研细，精密称取0.5g，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，4000r·min^-1离心，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，得到供试品溶液。

基于本发明提供的技术方案，合适的精密称取的质量范围可以是0.25～1.50g，超声提取的时间范围可以是20～60min。本实施例所采用的条件仅为优选的实施方式。

(3)色谱条件：

采用的C₁₈色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱(4.6×250mm，5μm)，以甲醇-0.1％vol％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：26℃，紫外检测波长：260nm，流速：0.5mL·min^-1，洗脱时间：60min，具体梯度洗脱的条件如下表1：

表1梯度洗脱条件

梯度洗脱条件也可以表述为：

0分钟时，流动相A为流动相总体积0％的甲醇、流动相B为流动相总体积100％的0.1％vol％磷酸水溶液；

25分钟时，流动相A为流动相总体积0.2％的甲醇、流动相B为流动相总体积99.8％的0.1％vol％磷酸水溶液；

30分钟时，流动相A为流动相总体积0.5％的甲醇、流动相B为流动相总体积99.5％的0.1％vol％磷酸水溶液；

35分钟时，流动相A为流动相总体积3.5％的甲醇、流动相B为流动相总体积96.5％的0.1％vol％磷酸水溶液；

45分钟时，流动相A为流动相总体积3.8％的甲醇、流动相B为流动相总体积96.2％的0.1％vol％磷酸水溶液；

60分钟时，流动相A为流动相总体积4.2％的甲醇、流动相B为流动相总体积95.8％的0.1％vol％磷酸水溶液。

基于本发明提供的技术方案，磷酸水溶液的浓度可以为0.08～0.30％vol％，柱温可以为21～30℃，紫外检测波长可以为220～280nm，流速可以为0.40～1.20mL·min^-1，洗脱时间可以为50～100min。本实施例所采用的条件仅为优选的实施方式。

(4)绘制标准曲线并回归计算：

取步骤(1)的混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、25μL注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰(见图1，其中A为混合标准品溶液的色谱图)，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，从而分别得到胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的线性关系。计算结果如下表2：

表2胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷、鸟苷五种成分的线性关系

(5)测定供试品溶液：

精密吸取步骤(2)的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件得到指纹图谱(见图1，其中B为供试品溶液的色谱图)，记录峰面积，并按照步骤(4)得到的各线性关系计算胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的平均含量。

其中的2号峰为胞苷、8号峰为腺嘌呤、9号峰为尿苷、12号峰为腺苷、13号峰为鸟苷。经测定，作为供试品的每片猴头菌片中胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷、鸟苷的平均含量分别为27.25μg、28.78μg、166.66μg、94.06μg、32.60μg。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。

本实施例在实施例1的基础上进一步说明通过本发明的质量检测方法可以测定猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。

(6)按照与实施例1的步骤(1)～(5)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然后使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对得到的10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得到猴头菌片的共有模式图谱(请见图2，其中R为共有模式图谱，S1至S10分别为10批猴头菌片的指纹图谱)，以及这10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度(结果见表3)，相似度均大于0.90。

表3猴头菌片HPLC指纹图谱相似度评价

注：S1批号140401，S2批号141001，为长春迪瑞制药有限公司的猴头菌片；

S3批号140701，S4批号140528，为上海华源安徽仁济制药有限公司的猴头菌片；

S5批号140213，为上海雷允上药业有限公司的猴头菌片；

S6批号140501，S7批号140325，为湖北襄阳隆中药业集团有限公司；

S8批号140408，S9批号140522，S10批号140528，为广州白云山和记黄埔中药有限公司的猴头菌片。

步骤(6)的共有模式图谱中有16个特征共有峰，其中2号峰为胞苷、8号峰为腺嘌呤、9号峰为尿苷、12号峰为腺苷、13号峰为鸟苷，其中的9号峰为参照峰，也是最强色谱峰。

共有模式图谱的总长度为60min，其中单峰面积超过总峰面积1％的峰有10个，它们是1～16号峰，单峰面积超过总峰面积5％的峰有6个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、12号峰、15号峰，单峰面积超过总峰面积15％的有2个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超过总峰面积25％的有1个，它是9号峰。

上述16个特征共有峰具体如下，

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的猴头菌片的质量检测方法。

在实施例1和2的基础上，本实施例通过采用本发明的质量检测方法，测定了其他1批猴头菌片的胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的含量，以及其与共有模式图谱的相似度。具体步骤如下：

取猴头菌片(批号：150322，广州白云山和记黄埔中药有限公司)，按照实施例1的步骤(1)～(5)相同的方法，测定该猴头菌片的胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的含量分别为26.98μg、29.02μg、167.11μg、94.45μg、32.88μg。

取该批猴头菌片，按照实施例1的步骤(1)～(5)相同的方法测定其指纹图谱，并使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算其与实施例2中的步骤(6)的共有模式图谱的相似度，其相似度为0.92。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims

1.一种猴头菌片的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)制备混合标准品溶液：

精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，加水配制成每1mL含胞苷1～20μg、腺嘌呤1～20μg、尿苷20～40μg、腺苷20～40μg、鸟苷1～20μg的混合标准品溶液；

(2)制备供试品溶液：

取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取，置于具塞锥形瓶中，加水，密塞，称定重量，超声提取，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)色谱条件：

以C₁₈色谱柱，以甲醇-0.1％体积百分比磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0分钟时，流动相A为占流动相总体积0％的甲醇、流动相B为占流动相总体积100％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

25分钟时，流动相A为占流动相总体积0.2％的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.8％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

30分钟时，流动相A为占流动相总体积0.5％的甲醇、流动相B为占流动相总体积99.5％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

35分钟时，流动相A为占流动相总体积3.5％的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.5％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

45分钟时，流动相A为占流动相总体积3.8％的甲醇、流动相B为占流动相总体积96.2％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

60分钟时，流动相A为占流动相总体积4.2％的甲醇、流动相B为占流动相总体积95.8％的0.1％体积百分比磷酸水溶液；

柱温：21～30℃，紫外检测波长：220～280nm，流速：0.40～1.20mL·min-1，洗脱时间：50～100min；

(4)绘制标准曲线并回归计算：

取所述混合标准品溶液，分别进样2、5、10、15、20、25μL注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件重复进样测定3次，记录色谱峰，以μg计的进样量X为横坐标，峰面积平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，分别得到胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷的线性关系；

(5)测定供试品溶液：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)为，精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，加水配制成每1mL含胞苷5～9μg、腺嘌呤3～7μg、尿苷25～35μg、腺苷25～35μg、鸟苷2～6μg的混合标准品溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：

(6)按照与步骤(1)～(5)相同的方法测定10批猴头菌片的指纹图谱，然后使用指纹图谱相似度评价系统对所得10批猴头菌片的指纹图谱进行分析，得到猴头菌片的共有模式图谱，以及这10批猴头菌片的指纹图谱与共有模式图谱的相似度。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，精密称取适量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鸟苷对照品，分别加水配制为每1mL含168.80μg胞苷、57.50μg腺嘌呤、199.20μg尿苷、198.00μg腺苷、51.60μg鸟苷的五份溶液，然后从这五份溶液中分别取适量并混合，加水配制为每1mL含胞苷6.75μg、腺嘌呤4.60μg、尿苷31.87μg、腺苷31.68μg、鸟苷4.13μg的混合标准品溶液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)为：

取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取0.25～1.50g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取20～60min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)为：

取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，离心，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)为：

取猴头菌片，去包衣，研细，精密称取0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20mL水，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称重量，用水补足减失的重量，4000r·min_-1离心，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)为：

以C₁₈色谱柱，以甲醇-0.1％体积百分比磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，柱温：26℃，紫外检测波长：260nm，流速：0.5mL·min_-1，洗脱时间：60min。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中的回归计算的结果为：胞苷的回归方程为Y＝3621.9X+0.6092，r为0.9999，线性范围为0.01～0.17μg；腺嘌呤的回归方程为Y＝11776x-2.3814，r为0.9999，线性范围为0.01～0.12μg；尿苷的回归方程为Y＝5862.9x+5.3668，r为0.9999，线性范围为0.06～0.80μg；腺苷的回归方程为Y＝6191.1x+6.2911，r为0.9999，线性范围为0.06～0.80μg；鸟苷的回归方程为Y＝4327.6x+0.7886，r为0.9999，线性范围为0.01～0.10μg。

11.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述共有模式图谱中有16个特征共有峰，其中2号峰为胞苷、8号峰为腺嘌呤、9号峰为尿苷、12号峰为腺苷、13号峰为鸟苷。

12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述共有模式图谱中，其中9号峰为参照峰，也是最强色谱峰。

13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，所述共有模式图谱中，所述共有模式图谱的总长度为60min，其中单峰面积超过总峰面积1％的峰有10个，它们是1～16号峰，单峰面积超过总峰面积5％的峰有6个，它们是5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、12号峰、15号峰，单峰面积超过总峰面积15％的有2个，它们是9号峰和12号峰，单峰面积超过总峰面积25％的有一个，它是9号峰。

14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述共有模式图谱中，所述16个特征共有峰具体如下，