发明内容
本发明的目的主要是提供一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分及其制备方法。这种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分是以疏血通注射液为原料,经进一步分离、精制而得到。疏血通属于纯动物类中药注射剂,经多年研究,大类成分物质基础基本明确,但获得具有活性的寡糖类组分并进一步的分离、纯化、鉴定属于行业内的重大突破。本发明对于所获得的寡糖类成分的经PMP衍生化法测定活性寡糖组分中的单糖组成,确认所述的寡糖类组分中单糖单元为葡萄糖、半乳糖、甘露糖,其中主要为葡萄糖。经LC-MS分析,确认所述的寡糖组分主要是由大约2~10个左右单糖单元聚合而成,其分子量范围为200Da~3000Da,其中主要集中在200Da~2000Da。通过血小板聚集试验,确认所述的寡糖组分抗血小板聚集活性主要是对体外ADP诱导和胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。
以上所述的寡糖类组分通过如下步骤制备而得:
a.前处理:取疏血通注射液减压浓缩至一定体积,其中减压浓缩温度为40℃~70℃,其中优选50℃,减压浓缩的最终体积为浓缩前体积的1/2~1/4,其中优选最终体积为浓缩前体积的1/3。
b.醇沉:取浓缩液,加入一定量乙醇醇沉,其中优选加入乙醇后最终含醇量为70%~80%,低温静置,弃去上层含乙醇液体,取沉淀层。
c.柱层析:取沉淀层加适量水溶解后,离心,取上清液通过分子筛排阻的凝胶过滤柱,主要是指葡聚糖凝胶柱,其中,所述的凝胶柱为Sephadex G15、Sephadex G25、SephadexG50或类似填料的类似型号;所述凝胶柱的洗脱溶剂为水,洗脱液收集体积为1/3~1的柱体积,其中优选1/2柱体积。减压浓缩后,再通过预先活化的阴离子交换柱,收集洗脱液,其中,所述阴离子交换柱为DEAE-52或类似填料,所述阴离子交换柱,主要是指弱阴离子交换柱,所述阴离子交换柱的洗脱溶剂为水,洗脱液收集体积为1~3柱体积,其中优选2柱体积,最后经浓缩,冻干即得。
通过本发明提供的技术方案,获得的具有潜在抗血小板聚集活性的寡糖类组分,其分子量大小适中,也可以作为一种潜在的前体物质,进一步通过化学修饰或改造而增强活性,从而开发制成应用于心脑血管疾病领域的抗血小板治疗药物。其也解决了目前中药领域尤其是动物类中药注射剂普遍存在的一些问题,比如中成药临床定位宽泛、药效物质不清、作用机制不明的共性问题。此外,本发明所提供的活性寡糖类组分,不仅可能为本领域临床治疗用药提供一种更多的选择,同时对于其他同类产品进一步掌握糖类物质基础提供了方法和途径。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步说明,所述实施例仅用于对本发明阐述示例,所述方法并不构成对本发明权利要求的限制。
一、寡糖类组分的制备
(1)前处理:取疏血通注射液1L,减压浓缩,温度60℃,浓缩至约300ml。
(2)醇沉:取浓缩液缓慢加入1.2L乙醇(约4倍量),不断搅拌,静置过夜,弃去上层含乙醇液体,取沉淀层约15g(湿重)。
(3)柱层析:取沉淀层,加入约250ml水充分搅拌、溶解,4500rpm离心10min,取上清液通过Sephadex G15葡聚糖凝胶柱(8cm*100cm),用水洗脱,收集1/2柱体积洗脱液约2500ml,减压浓缩后,再通过预先活化的DEAE-52阴离子交换柱(5cm*80cm),用水洗脱,收集2柱体积洗脱液约3000ml,浓缩,冻干即得白色疏松干燥物约2g(寡糖组分提取物)。
二、PMP衍生化法测定活性寡糖组分中的单糖组成
1仪器和实验材料
1.1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪,配备四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;高速离心机,Sigma公司产品;METTLER TOLEDOXP205电子天平;旋转蒸发仪SB-2000型(上海爱朗仪器有限公司);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2实验材料
三氟醋酸(TFA)购于TEDIA公司,色谱级;1-苯基-3-甲基5-吡唑啉酮(PMP),分析纯,购于天津市大茂化学试剂厂;氯仿,购于美国MREDA TECHNOLOGY公司,色谱级;NaOH,HCI均为分析纯,购于北京化工厂;磷酸二氢钾,分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;甲醇及乙腈购于美国Honeywell Burdick&Jackson公司,色谱级;水,去离子水;糖对照品D-甘露糖(Man)、D-无水葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)均购于中检院,Man批号:140651-200602,Glc批号:110833-200904,Gal批号:100226-200404;寡糖提取物,自制。
2实验方法
2.1分析条件和系统适用性实验
Phenomenex C18(4.6×250mm,5μm);流速:1.2ml/min;流动相:20mmol/L醋酸铵(A)-乙腈(B);采用梯度洗脱,洗脱程序如下:0-25min,A:85%-72.5%,B:15%-27.5%;25-30min,A:72.5%-60%,B:27.5%-40%;柱温为25℃;进样量:5μL;检测波长:245nm。理论塔板数以葡萄糖峰计算,不低于3000,各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均符合2010版中国药典相关规定。
2.2溶液及对照品配制
12.5%的磷酸盐缓冲液配制:精密称取12.5g磷酸二氢钾,置于100mL容量瓶中,加水溶解,并稀释定容至刻度,即得。
0.5mol/L PMP甲醇溶液的配制:精密称取PMP 0.5g,置于5ml容量瓶中,加甲醇使溶解并定容至刻度,摇匀即得。
0.3mol/L NaOH溶液的配制:精密称取固体NaOH 0.12g,加适量水溶解后,转移至10ml容量瓶中,加水稀释并定容至刻度,摇匀即得,转入塑料离心管中待用。
0.3mol/L HCl溶液的配制:精密吸取12N HCl 0.25ml,置于10ml容量瓶中,加水稀释并定容至刻度,摇匀即得。
混合对照品的配置:精密称取4mg甘露糖对照品,2.5mg半乳糖对照品,分别置于10mL容量瓶中,加水溶解,稀释并定容至刻度。精密称取5mg葡萄糖对照品,置于10mL容量瓶中,加入1mL半乳糖对照品溶液和1mL甘露糖对照品溶液,再加入适量水溶解,加水稀释并定容至刻度,即得到混合对照品溶液,溶液中各对照品的浓度为:葡萄糖2mg/mL,半乳糖0.1mg/mL,甘露糖0.2mg/mL。
0.4mg/mL寡糖待测样品的配置:精密称取10mg寡糖样品置于25mL容量瓶中,加水溶解,稀释并定容至刻度,即得寡糖供试品溶液。
2.3寡糖的水解及衍生化反应
寡糖水解:精密吸取1mL浓度为0.4mg/mL的寡糖待测样品,置于5mL安瓿中,加入6%的TFA溶液2mL,充氩气后封口(充气15s),110℃水解3h,将反应后的溶液转入鸡心瓶中,在旋转蒸发仪上,60℃减压蒸至无TFA味,加入1mL水溶解残渣,即得多糖水解液。
PMP衍生化反应:精密量取100μL多糖水解液,置于10mL塑料离心管中,加入0.3mol/LNaOH溶液100μL和0.5mol/L PMP甲醇溶液200μL,用0.3mol/L NaOH溶液将pH调至7.2至8.5之间;涡旋混匀,于70℃水浴反应45min,冷却至室温后,加入与上述0.3mol/LNaOH溶液使用量相当的0.3mol/L HCI溶液,涡旋混匀;加入12.5%的磷酸盐缓冲液,稀释反应溶液至1.0mL,涡旋混匀后,加入5mL氯仿,涡旋30s,4500rpm离心5min,取上层水层,10000rpm高速离心5min,取上清液,即得糖水解衍生化后供试品溶液,进行HPLC检测,同时进样未水解衍生化样品。
3.实验结果
实验结果表明,所制备寡糖的主要单糖种类为葡萄糖、半乳糖、甘露糖,其中主要为葡萄糖,结果见附图1~附图3。
三、寡糖类组分的LC-MS分析
1仪器与实验材料
仪器:UHPLC:Agilent 1290:MS:Agilent 6540 Q-TOF;
试药:水为超纯水;乙腈Honeywell Burdick&Jackson公司,色谱级;甲酸(LC-MS用);寡糖提取物,自制。
2分析条件
色谱条件:采用C18短柱(2.1*50mm,1.8μm)。
流速采用0.1ml/min。
流动相:A:水(含0.1%FA) B:乙腈(含0.1%FA)。
梯度条件如表1:
表1:梯度条件
Time(min) |
A% |
B% |
0 |
95 |
5 |
2 |
92 |
8 |
13.34 |
70 |
30 |
15 |
40 |
60 |
16 |
20 |
80 |
18.67 |
20 |
80 |
19.33 |
95 |
5 |
21.67 |
95 |
5 |
质谱条件:正离子模式。
Gas temp:350℃;Drying Gas:10L/min;Nebulizer:35psig;fragmentor:175V;Vcap:4000V;Collision Energy:25。
取少量寡糖用超纯水溶解过滤后,进样分析。
3实验结果
LC-MS分析结果表明,所述寡糖类组分为中性寡糖(M+Na峰),主要是二糖~十二糖,分子量范围为200Da~3000Da,其中主要集中在200Da~2000Da。分析鉴定结果见附图4。
四、寡糖对血小板聚集试验
1试验材料
(1)药物:寡糖,现用现配,临用前用生理盐水配制成20mg/mL母液。阳性药物,替格瑞洛原料药和阿司匹林原料药,用无水乙醇配制成100μmol/L和5mmol/L母液,生理盐水稀释至所需终浓度。
(2)动物:SD大鼠,清洁级,雄性,体重220-250g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,生产质量合格证号:SCXK(京)2014-0004。
(3)试剂:二磷酸腺苷钠盐(adenosine-5--diphosphate,ADP),美国Sigma公司生产,国内分装,500mg/瓶;胶原(Collagen from rat tail),美国Sigma公司生产,国内分装,50mg/瓶;氯化钠注射液,四川科伦药业股份有限公司,批号:20151004;二水合柠檬酸钠,分析纯,西陇化工股份有限公司,批号:150715。
(4)实验仪器
SC-2000血小板聚集测试仪,北京赛科希德科技发展有限公司;
YP3001N电子天平,上海精密科学仪器有限公司;
2实验方法
选用成年健康SD大鼠,雄性,适应环境后,腹主动脉采血,以3.8%枸橼酸钠与血液1∶9的比例抗凝,然后以110g/min离心10min,制备富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP),剩余部分以1100g/min离心10min制备贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP),以PPP调零,用PPP调整PRP的血小板计数为400×109/L,与药物或生理盐水37℃孵育30min,然后加入ADP(终浓度为5μM/L)或胶原(终浓度为30μg/mL)诱导聚集。用血小板聚集仪检测血小板最大聚集率,按下列公式计算血小板聚集抑制率(AIR):
AIR=[(空白对照组最大聚集率一给药组最大聚集率)/空白对照组最大聚集]*100%
3试验结果和评价
结果见表2和表3。
表2寡糖对体外ADP诱导血小板聚集的影响
样品 |
终浓度 |
N |
血小板最大聚集率(%) |
抑制率(%) |
生理盐水 |
- |
10 |
60.3±9.6 |
- |
替格瑞洛 |
0.8μM/L |
10 |
35.8±3.6*** |
40.7 |
寡糖 |
4mg/mL |
10 |
4.6±4.2*** |
92.3 |
寡糖 |
2.3mg/mL |
10 |
34.5±3.5*** |
42.8 |
寡糖 |
1.33mg/mL |
10 |
50.1±5.7* |
16.9 |
注:与生理盐水比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
表3寡糖对体外胶原诱导血小板聚集的影响
样品 |
终浓度 |
N |
血小板最大聚集率(%) |
抑制率(%) |
生理盐水 |
- |
10 |
65.5±3.6 |
- |
阿斯匹林 |
0.05mM/L |
10 |
18.4±2.6*** |
72 |
寡糖 |
5mg/mL |
10 |
13.4±4.2*** |
79.5 |
寡糖 |
3.5mg/mL |
10 |
35.1±2.6*** |
46.4 |
寡糖 |
2mg/mL |
10 |
44.8±3.0** |
31.6 |
注:与生理盐水比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
通过研究发现:寡糖终浓度为1.33~4mg/mL对体外ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用(P<0.05),4mg/mL、2.3mg/mL和1.33mg/mL抑制率分别为92.3%、42.8%和16.9%;寡糖终浓度为2~5mg/mL对体外胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用(P<0.05),5mg/mL、3.5mg/mL和2mg/mL抑制率分别为79.5%、46.4%和31.7%,5mg/mL抑制率强于阳性对照组抑制率72%。