CN105936651A - 纳米级透明质酸提纯工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米级透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:(1)将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5‑5.5,加入絮凝剂絮凝后,过滤,得到滤液;(2)将滤液采用硅藻土脱色,然后采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0‑6.5,再经乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;(3)将乙醇沉淀物用0.05‑0.15mol/L氯化钠溶液溶解后,加入络合剂进行络合沉淀,沉淀物用盐解离,过滤,滤液再经乙醇沉淀,最后将沉淀物经脱水,干燥;(4)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。本发明纳米级透明质酸提纯工艺,采用絮凝剂絮凝、硅藻土脱色去除透明质酸中的杂质,添加剂常见易得,操作相对简单,杂质含量更低。生产易于控制,适合工业化大规模生产,收率高,并且大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物多糖提取技术领域,具体涉及一种纳米级透明质酸提纯工艺。
背景技术
透明质酸即玻璃酸(Sodium Hyaluronate)、玻尿酸,简称HA,是一种酸性粘多糖。其分子结构是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1,4和β-1,3糖苷键反复交替连接而成,分子量在10万至400百万之间。分子中两种单糖即β-D-葡萄糖醛酸(glucuronicacid)和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)按1:1的摩尔比组成。
自然界中,透明质酸广泛的存在于动物的各种组织内,如结缔组织、肪带、皮欣、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡赃、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中以哺乳动物的玻璃体、挤带和关节滑液屮透明质酸产量最高。在这些组织中,透明质酸长与蛋白质结合,并与其它點多糖共存,以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中,而以凝胶的形式存在于鸡冠与肪带中。
透明质酸具有很大粘性,对骨关节具有润滑作用。还能促进物质在皮肤中的扩散率、调节细胞表面和细胞周围的Ca2+,Mg2+,K+,Na+离子运动。在组织中的强力保水作用是其最重要的生理功能之一,故被称为理想的天然保湿因子,其理论保水值高达800ml/g,在结缔组织中的实际保水值为80ml/g。此外,透明质酸还有促进纤维增生、加速创伤愈合作用。
透明质酸作为药物主要应用于眼科治疗手术,如晶体植入、摘除,角膜移植,抗青光眼手术等,还用于治疗骨关节炎、外伤性关节炎和滑囊炎以及加速伤口愈合。透明质酸在化妆品中的应用更为广泛,它能保持皮肤湿润光滑、细腻柔嫩,富有弹性,具有防皱,抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状,不易溶解。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米级透明质酸提纯工艺。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
一种纳米级透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:
(1)将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5-5.5,加入絮凝剂絮凝后,过滤,得到滤液;
(2)将滤液采用硅藻土脱色,然后采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再经乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(3)将乙醇沉淀物用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液溶解后,加入络合剂进行络合沉淀,沉淀物用盐解离,过滤,滤液再经乙醇沉淀,最后将沉淀物经脱水,干燥;
(4)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。
优选地,所述的步骤(1)中絮凝剂的添加量为15-25mg/L,絮凝温度为60-80℃,絮凝时间为40-50min。
优选地,所述步骤(1)中絮凝剂为海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中一种或多种的混合物。
更优选地,所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸混合而成,所述海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
优选地,所述步骤(2)中硅藻土脱色,硅藻土的添加量为5.5-7.5g/L,脱色温度为65-75℃,脱色时间为40-50min。
优选地,所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵1-5份、氯化十六烷基吡啶1-5份、十二烷基三甲基氯化铵1-5份、水80-100份。
优选地,所述步骤(3)中沉淀物用盐解离时,先用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次,然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。
优选地,所述脱水采用乙醇脱水。
优选地,所述干燥采用真空干燥,干燥温度为40-60℃,干燥时间为2-4小时。
本发明纳米级透明质酸提纯工艺,采用絮凝剂絮凝、硅藻土脱色去除透明质酸中的杂质,添加剂常见易得,操作相对简单,杂质含量更低。生产易于控制,适合工业化大规模生产,收率高,并且大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例中各原料介绍:
发酵液采用专利申请号:201310351005.4中实施例1的方法制备,其中发酵液中透明质酸含量为1.17g/L,透明质酸中蛋白质含量为0.025wt%。
三氯乙酸,CAS号:76-03-9。
硅藻土,CAS号:61790-53-2,采用灵寿县沃源矿产品加工厂提供的型号为WY-200的食品级硅藻土,粒径325目。
氢氧化钠,CAS号:1310-73-2。
乙醇,CAS号:64-17-5。
氯化钠,CAS号:7647-14-5。
海藻酸钠,CAS号:31581-02-9,采用珠海味佳食品添加剂有限公司提供的食品级海藻酸钠。
木质素,CAS号:9005-53-2,采用山东高唐多元木质素有限公司提供的纯度为99.6%的优级品木质素。
聚天冬氨酸,CAS号:25608-40-6,采用广东翁江化学试剂有限公司提供的聚天冬氨酸。
十六烷基三甲基溴化铵,CAS号:57-09-0。
氯化十六烷基吡啶,CAS号:123-03-5。
十二烷基三甲基氯化铵,CAS号:112-00-5。
实施例1
纳米级透明质酸提纯工艺,包括以下步骤:
(1)取25L发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.7,加热至70℃后加入絮凝剂搅拌混合均匀进行絮凝,保温30min后真空抽滤,得到24L滤液;
(2)将24L滤液加热至72℃后添加144g硅藻土,以转速为100转/分搅拌脱色45min后真空抽滤,得到24L脱色液,用2.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5,加入72L 95%乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(3)将乙醇沉淀物用25L 0.1mol/L氯化钠溶液溶解,在以转速为300转/分搅拌条件下加入络合剂,加入络合剂后搅拌5min,再静置1小时后母液上排,沉淀再用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤3次,每次洗涤0.1mol/L氯化钠溶液用量为1L,然后向沉淀中加入25L 0.5mol/L氯化钠溶液中以转速为150转/分搅拌解离16小时,真空抽滤,滤液再经75L 95%乙醇沉淀3小时,用无水乙醇脱水后,将沉淀物置于旋转式真空干燥器中,在干燥温度为60℃下真空干燥3小时,得到干燥后的沉淀物;
(4)将干燥后的沉淀物采用超细研磨机(超细研磨机为无锡市飞鸣机械有限公司生产的型号为CXM的超细研磨机)进行超细研磨至500nm。得到实施例1的纳米级透明质酸。
所述的步骤(1)中絮凝剂的添加量为20mg/L,絮凝温度为70℃,絮凝时间为45min。
所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸按质量比为1:1:1搅拌混合均匀得到。
所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵3份、氯化十六烷基吡啶3份、十二烷基三甲基氯化铵3份、水91份。将十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。
实施例2
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由木质素、聚天冬氨酸按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的纳米级透明质酸。
实施例3
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、聚天冬氨酸按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的纳米级透明质酸。
实施例4
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的纳米级透明质酸。
实施例5
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:氯化十六烷基吡啶4.5份、十二烷基三甲基氯化铵4.5份、水91份。将氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例5的纳米级透明质酸。
实施例6
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵4.5份、十二烷基三甲基氯化铵4.5份、水91份。将十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例6的纳米级透明质酸。
实施例7
与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵4.5份、氯化十六烷基吡啶4.5份、水91份。将十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例7的纳米级透明质酸。
测试例1
将实施例1-7得到的纳米级透明质酸得率进行统计。计算方法:得率(%)=纳米级透明质酸质量/25L发酵液中透明质酸质量×100,具体测试结果见表1。
表1:成活率结果表
得率,% | |
实施例1 | 96.2 |
实施例2 | 92.4 |
实施例3 | 91.9 |
实施例4 | 89.5 |
实施例5 | 89.7 |
实施例6 | 91.3 |
实施例7 | 89.6 |
比较实施例1和实施例2-4,实施例1(海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸复配)得率明显高于实施例2-4(海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中任意二者复配)。比较实施例1与实施例5-7,实施例1(十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵复配)得率明显高于于实施例5-7(十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵中任意二者复配)。
Claims (9)
1.一种纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5-5.5,加入絮凝剂絮凝后,过滤,得到滤液;
(2)将滤液采用硅藻土脱色,然后采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再经乙醇沉淀,得到乙醇沉淀物;
(3)将乙醇沉淀物用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液溶解后,加入络合剂进行络合沉淀,沉淀物用盐解离,过滤,滤液再经乙醇沉淀,最后将沉淀物经脱水,干燥;
(4)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。
2.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述的步骤(1)中絮凝剂的添加量为15-25mg/L,絮凝温度为60-80℃,絮凝时间为40-50min。
3.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(1)中絮凝剂为海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中一种或多种的混合物。
4.如权利要求3所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸混合而成,所述海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。
5.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(2)中硅藻土脱色,硅藻土的添加量为5.5-7.5g/L,脱色温度为65-75℃,脱色时间为40-50min。
6.如权利要求1或3所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵1-5份、氯化十六烷基吡啶1-5份、十二烷基三甲基氯化铵1-5份、水80-100份。
7.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述步骤(3)中沉淀物用盐解离时,先用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次,然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。
8.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述脱水采用乙醇脱水。
9.如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺,其特征在于:所述干燥采用真空干燥,干燥温度为40-60℃,干燥时间为2-4小时。
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