CN105891400A - 一种检测恩替卡韦关键中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种检测恩替卡韦关键中间体的方法，本发明采用反相高效液相色谱法测定恩替卡韦关键中间体N-7，该方法对其非对映异构体和有关杂质MMTCl能够有效分离，而且通过流动相的研究改良了流动相的PH，有效的保护柱子，延长柱子寿命，降低分析成本，该方法具有专属性强、精密度好、回收率高、操作简单快速等特点。

Description

一种检测恩替卡韦关键中间体的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及用反相高效液相色谱法测定恩替卡韦关键中间体的方法。
背景技术
慢性乙肝是一种潜在的致命性疾病，困扰着全世界4亿人口。其中75％的患者生活在亚太地区，中国就是乙肝的流行地区。乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，与肝硬化及肝癌的关系密切，是世界范围内重要的公共健康问题，全球人口的30％有血清学证据证实现症或既往感染HBV。在2010年全球疾病负担研究中，HBV感染位居首位，在导致死亡的病因中位列第10，WHO将病毒性肝炎列入主要的公共健康问题。
博路定恩替卡韦片于2005年4月早期在美国推出，恩替卡韦专利由百时美施贵宝公司享有。该药物能够强力抑制乙肝病毒的活性，并减缓慢性乙肝的恶化过程。
其中，恩替卡韦(Entecavir)，化学名2-氨基-9-[(1S，3R，4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮一水合物，分子式C12H15N5O3·H2O，分子量295.3，其化学结构式如下：
在核苷类药物中，恩替卡韦凭借明显的疗效和良好的抗耐药性，占据乙肝病毒一线用药市场上的主导地位。恩替卡韦与原有的核苷类似物比较具有抗病毒作用强、起效快副作用小、临床耐药率低的优点，恩替卡韦能够强效抑制HBV并且具有高耐药基因屏障。恩替卡韦使患者以单药初始治疗并维持长期疗效，摆脱加药换药顾虑。
其中，N-7是恩替卡韦合成过程关键的中间体，其具体结构式如下：
化学名：6-苄氧基-9-((1S,3R,4S)-4-苄氧基-3-苄氧基甲基-2-亚甲基环戊基)-N-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)-9H-嘌呤-2-胺，分子量：819.99。
由上式可见，N-7分子中含有3个手性碳原子，在化学合成中会产生8种立体构型不同的光学异构体，其中一个为对映异构体，另外6个为非对映异构体，如相关杂质没有得到控制，必然影响恩替卡韦成品的质量，所以控制N-7的质量是控制恩替卡韦成品质量的关键保证。鉴于恩替卡韦具有很高的市场价值，因此实现N-7与其各种异构体的分离测定在N-7的质量控制方面具有现实意义。
目前，对恩替卡韦的检测方法多有报道，而对恩替卡韦合成过程中恩替卡韦中间体(如N-6、N-7等)的检测方法的报道较少，其中中国专利(公开号：102305837A)公开了恩替卡韦及其中间体有关物质和异构体含量的检测方法。然而，该方法中TFA为强酸，对柱子损伤比较大，且无法完全分离所有非对映异构体，也无法对工艺杂质进行有效地分离。
本发明进行相关的研究，克服解决了上述的缺点，形成一个能够准确检测恩替卡韦关键中间体(N-7)的分析方法。
发明内容
恩替卡韦关键中间体N-7(SRS)分子中含有3个手性碳原子，在化学合成中会产生8种立体构型不同的光学异构体，其中RSR为对映异构体，另外6个为非对映异构体，8个分子结构式和缩写代号分别如下：
另外，在合成过程中，还会产生基团脱落得杂质4-甲氧基三苯基氯甲烷，即杂质MMTCl，其结构式如下：
含多个手性碳原子的化合物的光学异构体的分离一直是手性药物质量控制的难点，相应的从原料开始合成目标产物的过程中，只有一种结构的中间体最终才能合成(1S，3R，4S)-恩替卡韦目标物，其它结构的中间体异构体则生成光学异构体杂质。所以，寻找一种分离测定N-7及其非对映异构体的方法对于控制N-7的质量、提高药品的疗效、降低毒副作用迫在眉睫。
本发明提供一种能够准确检测恩替卡韦中间体N-7的分析方法。
具体的，通过反相高效液相色谱法分离检测N-7及其非对映异构体的方法具体条件如下：
1、色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2、以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为0.02％～0.08％，优选为0.04％～0.06％，特别优选为0.05％磷酸溶液；
3、磷酸水溶液-乙腈的比例为10-30：70-90，优选磷酸水溶液-乙腈比例10-20：80-90，进一步优选为磷酸水溶液-乙腈18：82；
4、检测波长为210nm～280nm，优选为254nm；
5、柱温为20～45℃，优选为30℃；
6、流动相流速为0.5～2.0ml/min，优选为1.0ml/min。
经过多方研究最终得到本发明所述最优的反相高效液相色谱法，即用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05％磷酸水溶液-乙腈(18:82)为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃。
通过上述反相高效液相色谱法，实现了关键中间体N-7与杂质MMTCl及其非对映异构体的有效分离，并通过具体实验得到了验证。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
综上，上述检测方法具有以下优点：
1、对中间体N-7的几个非对映异构体能够很好的分离；
2、对中间体N-7合成工艺杂质MMTCl能够有效分离；
3、流动相中用0.05％的磷酸，改良了流动相的PH，有效的保护柱子，延长柱子寿命，降低分析成本；
4、该方法具有专属性强、精密度好、回收率高、操作简单快速等特点。
附图说明
图1：MMTCL定位图
图2：RRS定位图
图3：SSR定位图
图4：SSS定位图
图5：RRR定位图
图6：SRR定位图
图7：SSR定位图
图8：N-7定位图
图9：各种样品混合对照图
具体实施例
下面通过几个具体实施例进一步说明本发明，对于实施例中涉及的具体数据和操作等并不构成本发明要求保护范围的限制。
实施例1
仪器：岛津LC-20A
色谱柱：InertSustai C18色谱柱((4.6*250mm，5μm))
流动相：0.05％磷酸水溶液-乙腈(18:82)
柱温：30℃ 流速：1.0ml/min 检测波长：254nm
定位溶液的配制：分别取N-7非对映异构体和杂质MMTCl各适量用乙腈溶解稀释制成15ug/ml的溶液。
样品溶液的配制：取N-7、N-7异构体和杂质MMTCl各适量，用乙腈溶解稀释制成使N-7为0.5mg/ml，N-7异构体和杂质MMTCl为15ug/ml的混合溶液。
测定法：取定位溶液和样品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：MMTCl、RRS和SSR、RRR和SSS、SSR和RRS、N-7(SRS)和RSR
具体图谱出峰情况详见附图1-9。
采用此色谱条件测定N-7与其非对映异构体的分离度均大于1.5，符合中国
药典要求，从而实现了N-7与其非对映异构体的分离测定。
实施例2
仪器：安捷伦1260
色谱柱：CHIRALPAK AD-H色谱柱((4.6*250mm，5μm))
流动相：正己烷-异丙醇(96:4)
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
检测波长：254nm
定位溶液的配制：分别取N-7和N-7对映异构各适量用乙醇制成每1ml含N-70.3mg、对映异构体15μg的混合溶液
样品溶液的配制：本品和对映异构体适量，精密称定，置容量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，用乙醇稀释至刻度，制成每1ml含N-70.3mg、对映异构体15μg的混合溶液
本发明建立了专属性强、精密度好、回收率高、操作简单快速的高效液相色谱法，可有效控制恩替卡韦中间体N-7的质量，从而保证了恩替卡韦的质量。

Claims (10)

1.一种检测恩替卡韦关键中间体的方法，采用高效液相色谱法，其特征在于，所述方法，步骤如下，将恩替卡韦关键中间体(N-7)SRS配成溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
其中色谱条件如下：
1)色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2)以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为0.02％～0.08％；
3)磷酸水溶液-乙腈的比例为10-30：70-90；
4)检测波长为210nm～280nm；
5)柱温为20～45℃；
6)流动相流速为0.5～2.0ml/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中色谱条件如下：
1)色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2)以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为为0.04％～0.06％；
3)磷酸水溶液-乙腈的比例为10-20：80-90；
4)检测波长为254nm；
5)柱温为30℃；
6)流动相流速为1.0ml/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中色谱条件如下：
1)色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2)以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；
3)磷酸水溶液-乙腈的比例为18：82；
4)检测波长为254nm；
5)柱温为30℃；
6)流动相流速为1.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中(N-7)SRS中含有多种杂质，其出峰时间顺序为MMTCl、RRS和SSR、RRR和SSS、SSR和RRS、N-7(SRS)和RSR，分离度均大于1.5，各杂质结构式如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，恩替卡韦关键中间体(N-7)SRS溶液的配制方法为：取N-7适量用乙腈溶解。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，恩替卡韦关键中间体(N-7)SRS溶液的配制方法为：取N-7适量用乙腈溶解，稀释制成15ug/ml的溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在注入色谱仪前，需要配制定位溶液和样品溶液，其中定位溶液的配制方法如下：分别取N-7非对映异构体和杂质MMTCl各适量用乙腈溶解稀释制成15ug/ml的溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，需要配制定位溶液和样品溶液，其中样品溶液的配制方法如下：样品溶液的配制：取N-7、N-7异构体和杂质MMTCl各适量，用乙腈溶解稀释制成使N-7为0.5mg/ml，N-7异构体和杂质MMTCl为15ug/ml的混合溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
定位溶液的配制：分别取N-7非对映异构体和杂质MMTCl各适量用乙腈溶解稀释制成15ug/ml的溶液；
样品溶液的配制：取N-7、N-7异构体和杂质MMTCl各适量，用乙腈溶解稀释制成使N-7为0.5mg/ml，N-7异构体和杂质MMTCl为15ug/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为：MMTCl、RRS和SSR、RRR和SSS、SSR和RRS、N-7(SRS)和RSR其中的色谱条件如下：
1)色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2)以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；
3)磷酸水溶液-乙腈的比例为18：82；
4)检测波长为254nm；
5)柱温为30℃；
6)流动相流速为1.0ml/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
定位溶液的配制：分别取N-7非对映异构体和杂质MMTCl各适量用乙腈溶解稀释制成15ug/ml的溶液；
样品溶液的配制：取N-7、N-7异构体和杂质MMTCl各适量，用乙腈溶解稀释制成使N-7为0.5mg/ml，N-7异构体和杂质MMTCl为15ug/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为：MMTCl、RRS和SSR、RRR和SSS、SSR和RRS、N-7(SRS)和RSR其中的色谱条件如下：
1)色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
2)以磷酸水溶液-乙腈为流动相，其中磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；
3)磷酸水溶液-乙腈的比例为18：82；
4)检测波长为254nm；
5)柱温为30℃；
6)流动相流速为1.0ml/min，
根据色谱图，计算各峰面积，得到各组分的含量。
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