CN105734005A - 利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：(1)将甘草的根、茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养；(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养4?6天，离心得到菌体，将菌体干燥，研成粉末加入水配成悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养33?37天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为100?300mg/L，继续培养4?6天，收获。本发明的方法具有操作简单，能显著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量，生长周期短，生产成本低，便于甘草酸的工业化大规模生产。

Description

利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法
技术领域
本发明涉及一种利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸化合物积累的组培方法，属于中药甘草组织培养领域。
背景技术
甘草酸(Glycyrrhizic acid)属于E型皂苷的一种，是甘草中含量最丰富的皂苷。作为甘草中最主要的活性成分，甘草酸主要有以下几种用途：
(1)医药工业：甘草酸具有抗炎保肝、抗病毒、抗肿瘤、干扰素诱生剂，调节免疫功能等作用，临床应用于慢性肝炎、支气管炎和艾滋病及多种癌症的防治。(2)食品及卷烟业：甘草酸是一种高甜度低热值的保健甜味剂，其甜度约为蔗糖的250倍以上，添加于食品，饮料，糖果中作甜味剂，可克服多用糖而引起的发酵，酸败等缺点，而且有杀菌、洁齿、消炎、润喉等功用。(3)化妆品工业：甘草酸分子中含有亲水性基团和亲油性基团，能降低水溶液表面张力，有很强的发泡力，具有乳化、分散、保湿润发、软化皮肤、抗皱、抗皮脂、防治色素沉积、消炎止痒及洗涤去污的效果。
尽管甘草酸有如此之多的用途，但从甘草或甘草不定根中进行提取，其收率较低，难于满足工业生产的需要。
但目前尚未有利用毕赤酵母促进甘草不定根中甘草酸积累的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的甘草不定根组培方法中甘草酸化合物含量较低的不足，提供一种利用真菌诱导子提高甘草不定根中甘草酸化合物含量的组培方法。
本发明的技术方案概述如下：
利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的根、茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养33-37天；所述固体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，加入琼脂使质量浓度为0.65％，调节pH＝5.8-6.0；所述液体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.8-6.0；
(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养4-6天，离心得到菌体，将菌体于58-62℃干燥，研成粉末加入水配成浓度为1mg/ml的悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；
(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养33-37天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为100-300mg/L，继续培养4-6天，收获。
步骤(3)诱导子的终浓度优选为200mg/L。
本发明的优点：
本发明的方法具有操作简单，能显著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量，生长周期短，生产成本低，便于甘草酸的工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
毕赤酵母来源：上海丹曦化工科技有限公司。
MS培养基，商品化。
PDA培养基，(20％土豆+2％葡萄糖+2％琼脂)
所述固体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，加入琼脂使质量浓度为0.65％，调节pH＝6.0，(也可以是pH＝5.8)；
所述液体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节pH＝6.0，(也可以是pH＝5.8)。
实施例1
利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的根接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养35天；
(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养5天，离心得到菌体，将菌体于60℃干燥，研成粉末加入水配成浓度为1mg/ml的悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；
(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养35天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为200mg/L，继续培养5天，收获。
实施例2
利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的茎接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养33天；
(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养6天，离心得到菌体，将菌体于58℃干燥，研成粉末加入水配成浓度为1mg/ml的悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；
(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养33天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为300mg/L，继续培养6天，收获。
实施例3
利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，包括如下步骤：
(1)将甘草的叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养37天；
(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养4天，离心得到菌体，将菌体于62℃干燥，研成粉末加入水配成浓度为1mg/ml的悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；
(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养37天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为100mg/L，继续培养4天，收获。
实施例4
甘草不定根的组培方法(对照组)，包括如下步骤：
将甘草根接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养40天，收获。
实施例5
本发明获得的甘草不定根中甘草酸化合物的提取及含量测定：
(1)色谱条件
液相色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相A：乙腈，B：0.05％磷酸；梯度洗脱程序：0～8min，A：19％；8～35min，A为19～50％；35～36min，A为50～100％；36～40min，A为100～19％。检测波长237nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样体积为20μL。
(2)标准品溶液的制备
精密称取甘草酸标品1mg，加少量甲醇超声溶解后置于5mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，分别得到甘草酸对照品储备液。对照品储备液用0.22μm微孔滤膜过滤后密封，置冰箱中保存备用。
(3)样品溶液的制备
精密称取0.2g各实施例获得干燥的甘草不定根样品分别置于50mL具塞三角瓶中，各加入20mL甲醇，超声提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振荡器振荡90min，过滤，滤渣再加入20mL甲醇，超声提取(250W，40kHz)30min，然后60℃水浴振荡器振荡90min，过滤，合并滤液。挥干(提取物)，再加入1mL甲醇超声溶解，再加甲醇定容至1mL，用高效液相色谱仪。
实验结果：实施例1-4获得的产物中的甘草酸含量依次为0.81mg/g、0.61mg/g、0.66mg/g、0.16mg/g。

Claims (2)

1.利用真菌诱导子促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将甘草的根、茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成，将甘草不定根接种于液体培养基中，培养33-37天；所述固体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，加入琼脂使质量浓度为0.65％，调节pH＝5.8-6.0；所述液体培养基的配方为：在1/2MS培养基中加入蔗糖使质量浓度为3％，加入吲哚丁酸使浓度为1.0mg/L，调节pH＝5.8-6.0；
(2)将毕赤酵母在PDA培养基中，常温发酵培养4-6天，离心得到菌体，将菌体于58-62℃干燥，研成粉末加入水配成浓度为1mg/ml的悬浮液，灭菌，即为诱导子悬浮液；
(3)将诱导子悬浮液加入到步骤(1)已培养33-37天甘草不定根的液体培养基中，使诱导子的终浓度为100-300mg/L，继续培养4-6天，收获。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(3)诱导子的终浓度为200mg/L。
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