CN105378080A - 用于调节mir-122的微小rna化合物和方法 - Google Patents

用于调节mir-122的微小rna化合物和方法 Download PDF

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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Abstract

在此描述了用于抑制MIR-122活性的组合物和方法。这些组合物具有产生MIR-122活性的有效抑制剂的某些核苷修饰。这些化合物可以包含缀合物以促进向肝脏递送。可以向被丙型肝炎病毒感染的受试者给药这些组合物作为用于丙型肝炎病毒和相关病状的治疗。

Description

用于调节MIR-122的微小RNA化合物和方法
发明领域
在此提供了用于调节miR-122的活性的化合物和方法。此类方法包括治疗与miR-122活性相关的疾病，如HCV感染。
相关技术说明
微小RNA(MicroRNA或microRNA)又称为“成熟微小RNA”，是在植物和动物的基因组中编码的小型(长度为大约18至24个核苷酸)非编码RNA分子。在某些情况下，高度保守的、内源性表达的微小RNA通过结合特定mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)来调节基因的表达。已在植物和动物中鉴定出了多于1000种不同的微小RNA。某些成熟微小RNA似乎起源于长的内源性初级微小RNA转录物(又称为初级微小RNA、pri-mir、pri-miR或初级前体微小RNA)，这些长的内源性初级微小RNA转录物通常长度为数百个核苷酸(李(Lee)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)，2002，21(17)，4663-4670)。
miR-122是一种在肝脏中丰富并且特异性表达的微小RNA，它是丙型肝炎病毒积聚的关键宿主因子(乔普林(Jopling)等人，科学杂志(Science.)2005，309(5740)，1577-81)。miR-122通过结合HCV基因组的5’非编码区中的两个紧密间隔的种子序列位点与HCV相互作用，从而引起HCV基因组的稳定化，支持复制和转录(詹格拉(Jangra)等人，病毒学杂志(JVirol.)，2010，84：6615-6625；Machlin等人，2011)。重要的是，miR-122结合位点在所有基因型和亚型的HCV基因组中是完全保守的(威尔逊(Wilson)等人，病毒学杂志，2011，85：2342-2350)。用抗miR抑制miR-122引起小鼠和食蟹猴体内的总循环胆固醇水平降低以及参与胆固醇体内平衡、脂肪酸和脂质代谢的基因的表达变化(以撒(Esau)等人，2006，细胞代谢(CellMetabolism)，3：87-98)。在慢性HCV感染的黑猩猩中，每周静脉内给药抗miR来长久和可逆性地压制HCVRNA水平并且降低总血清胆固醇(兰德福(Lanford)等人，2010，科学杂志，327：198-201)。在慢性治疗原生HCV感染的患者中，抗miR-122治疗导致血清HCVRNA降低，因此证明了临床概念验证(proof-of-concept)。
丙型肝炎(HCV)是黄病毒科中的一种嗜肝性RNA病毒，并且除了引起HCV感染以外，还是慢性肝病和肝细胞癌的主要病因。目前的标准护理治疗(聚乙二醇化干扰素与病毒唑组合)对于许多患者耐受不良，并且在一些患者中可以具有低达50％的反应率。当前已有若干种直接作用型抗病毒NS3蛋白酶抑制剂被批准用于HCV感染的患者，然而在HCV中出现抗性突变需要使用另外的药剂进行治疗。正在开发的疗法包括NS3/4A蛋白酶抑制剂、NS5A蛋白抑制剂、核苷/核苷酸NS5B聚合酶抑制剂以及非核苷NS5B抑制剂。然而，仍需要另外的疗法来治疗感染的个体，这些感染的个体对目前的治疗没有反应、在成功治疗之后复发或对一种或多种目前使用的药物具有低耐受性。对抗病毒疗法的抗性是与HCV的高突变率相关的主要问题，并且甚至在用通过多种机制起作用的药物的组合时也可见到。因此，靶向保守的、突变抗性病毒宿主因子(如miR-122)的疗法代表了实现更高和更持久的治愈速率的机会。
发明概述
在此提供了包含修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸由16至22个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122(SEQIDNO:1)互补并且其中该修饰的寡核苷酸包含以5’至3’方向具有以下核苷型态I的至少16个连续核苷：
(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y
其中每个R独立地是非双环核苷或双环核苷；
X是从4至10；
每个NB独立地是双环核苷；
每个NQ独立地是非双环核苷；
Y是0或1；并且
NZ是修饰的核苷或未修饰的核苷。
在某些实施例中，在此提供的化合物包含修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸包含具有核苷型态I的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个连续核苷。
在某些实施例中，每个双环核苷独立地选自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。在某些实施例中，至少两个双环核苷彼此不同。在某些实施例中，所有双环核苷具有与另一个双环核苷相同的糖部分。在某些实施例中，每个双环核苷是cEt核苷。在某些实施例中，cEt核苷是S-cEt核苷。在某些实施例中，cEt核苷是R-cEt核苷。在某些实施例中，每个双环核苷是LNA核苷。
在某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个非双环核苷具有相同类型的糖部分。在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷是2’-MOE核苷。在某些实施例中，不多于两个非双环核苷是2’-MOE核苷，其中每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，最5’端和最3’端的非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，两个非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，每个R是2’-MOE核苷。在某些实施例中，X是4、5、6、7、8、9或10。在某些实施例中，Y是0。在某些实施例中，Y是1。
在某些实施例中，X是7，每个R是2’-O-甲氧基乙基核苷，每个NB是S-cEt核苷，每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷，并且Y是0。
在某些实施例中，X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中每个NR1和NR3是S-cEt核苷并且每个NR2和NR4是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1；并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷并且每个NR2和NR3是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1；并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-脱氧核糖核苷，并且NR6是S-cEt核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6是S-cEt核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，X是10；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，X是10；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；并且NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR1和NR3各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR3是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122的核碱基序列(SEQIDNO:1)至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在某些实施例中，其中至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联，或其中每个核苷间键联是修饰的核苷间键联，并且任选地，其中该修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:6，其中每个T独立地选自T和U。
在某些实施例中，相对于miR-122的核碱基序列，该修饰的寡核苷酸具有0、1、2或3个错配。
在某些实施例中，一种化合物具有以下结构：
AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)；
CSCASTTGUSCSACSACSTCSCSA(SEQIDNO:3)；
MeCSCATSTGTS MeCSAMeCSAMeCSTMeCS MeCSAE(SEQIDNO:3)；
AE MeCEAE MeCECASTTGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)；
AE MeCEAE MeCE MeCEASTTGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)；
AE MeCEAE MeCE MeCEAETTGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)；
MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:5)；
MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCSTE(SEQIDNO:6)；
CSCAUSTGUSCSACSACSTCSCSA(SEQIDNO:3)；或
MeCECSAUSTGUSCSACSACSTCSCSAE(SEQIDNO:3)；
其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在一些实施例中，一种化合物具有以下结构：
USTGUSCSACSACSTCSCSAS；或
CSASCSASCSUSCSCS
其中后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。在一些此类实施例中，该化合物是化合物38591、38633、38998或38634。
在此提供的任何这些化合物都可以包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端或3’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上的第一缀合部分和连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端上的第二缀合部分。在某些实施例中，该缀合部分包含选自以下的至少一个配体：碳水化合物、胆固醇、脂质、磷脂、抗体、脂蛋白、激素、肽、维生素、类固醇以及阳离子性脂质。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X1-Nm-X2-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X-Nm-Y-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-Y-Nm-Y-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，如果n大于1，则Ln-接头具有以下结构：
其中每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在某些实施例中，Q’和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
在某些实施例中，一个骨架将2、3、4或5个配体连接至修饰的寡核苷酸上。在某些实施例中，骨架将3个配体连接至修饰的寡核苷酸上。
一种非限制性的示例性结构E是结构E(i)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(ii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1是H或甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iv)：
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(v)：
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vi)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；并且Z和Z’各自独立地选自O和S。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。在一些实施例中，至少一个P原子上的Z或Z’是S，并且另一个Z或Z’是O(即，硫代磷酸酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯键。在一些实施例中，至少一个P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯键。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(viii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
例如PCT公开号WO2013/033230；美国专利号8,106,022B2；美国公开号2012/0157509A1；美国专利号5,994,517；美国专利号7,491,805B2；美国专利号8,313,772B2；马诺哈兰马(Manoharan,M.)，第16章，反义药物技术(AntisenseDrugTechnology)，斯汀克鲁克(Crooke,S.T.)、马塞尔德克尔(MarcelDekker)公司，2001，391-469描述了非限制性的示例性骨架和/或包含骨架的接头及其合成。
在某些实施例中，一种化合物具有以下结构：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；并且
波形线表明连接至这个或这些接头和配体的其余部分。
在某些实施例中，X是磷酸二酯键。
在某些实施例中，n是从1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些实施例中，n是3。
在某些实施例中，至少一个配体是碳水化合物。
在某些实施例中，至少一个配体选自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，至少一个配体选自：N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺以及N-异丁酰基-半乳糖胺。
在某些实施例中，每个配体都是N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，一种化合物具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，在此提供的化合物包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上并且具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，X1和X2中的至少一个是磷酸二酯键。在某些实施例中，X1和X2各自是磷酸二酯键。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2、3、4或5。
在某些实施例中，Nm是N’pN”，其中每个N’独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且p是从0至4；并且N”是包含未修饰的糖部分的核苷。在某些实施例中，p是0。在某些实施例中，p是1、2、3或4。
在某些实施例中，每个N’包含未修饰的糖部分。在某些实施例中，每个未修饰的糖部分独立地是β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。在某些实施例中，N”包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，N”包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，至少一个N’包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，每个嘌呤核碱基独立地选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。在某些实施例中，N”是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。在某些实施例中，至少一个N’包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，每个嘧啶核碱基独立地选自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氢尿嘧啶。
在此描述的任何这些实施例中，每个N的糖部分独立地选自：β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及双环糖部分。在某些实施例中，每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些实施例中，cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，cEt糖部分是R-cEt糖部分。在此描述的任何实施例中，每个N的糖部分可以独立地选自β-D-核糖、β-D-脱氧核糖以及2’-氟糖。
在此提供了包含修饰的核苷酸和缀合部分的化合物，其中该修饰的寡核苷酸具有结构AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)，其中后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联；并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。
在此提供了包含修饰的核苷酸和缀合部分的化合物，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，所有这些CL核苷都是MeCL核苷，其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在此提供了抑制细胞中的miR-122的活性的方法，这些方法包括使细胞与在此提供的任何化合物相接触。在某些实施例中，细胞是在体内的细胞。在某些实施例中，细胞是在体外。
在此提供了向HCV感染的受试者给药在此提供的任何化合物的方法。在某些实施例中，该给药减少了HCV感染的症状。在某些实施例中，该给药防止了血清HCVRNA的回升。在某些实施例中，该给药延缓了血清HCVRNA的回升。在某些实施例中，选择具有HCV感染的受试者用于使用在此提供的化合物进行治疗。在某些实施例中，HCV感染的受试者被选自以下的一种或多种HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。在某些实施例中，在给药在此提供的化合物之前，确定该受试者被选自以下的一种或多种HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。在某些实施例中，该HCV基因型选自：基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型2c、基因型2d、基因型3a、基因型3b、基因型3c、基因型3d、基因型3e、基因型3f、基因型4a、基因型4b、基因型4c、基因型4d、基因型4e、基因型4f、基因型4g、基因型4h、基因型4i、基因型4j、基因型5a以及基因型6a。在某些实施例中，该HCV基因型选自基因型1a、基因型1b和基因型2。
这里提供的任何方法都可以包括给药至少一种另外的治疗剂。在某些实施例中，该至少一种治疗剂选自：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、辅助因子抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、结构蛋白抑制剂、非结构蛋白抑制剂、亲环蛋白抑制剂、进入抑制剂、TLR7激动剂以及干扰素。在某些实施例中，该至少一种治疗剂选自：蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A抑制剂、核苷NS5B抑制剂、核苷酸NS5B抑制剂、非核苷NS5B抑制剂、亲环蛋白抑制剂以及干扰素。在某些实施例中，该至少一种治疗剂选自：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素alfacon-1、聚乙二醇干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a、缓释型干扰素-α-2b、干扰素λ、索菲布韦(sofosbuvir)、利巴韦林(ribavirin)、特拉普韦(telapravir)、波普瑞韦(boceprevir)、伐尼普韦(vaniprevir)、阿森那普韦(asunaprevir)、利托那韦(ritonavir)、斯乔布韦(setrobuvir)、迪卡拉斯他韦(daclastavir)、斯密普韦(simeprevir)、阿拉泊韦(alisporivir)、麦瑞斯他滨(mericitabine)、替格布韦(tegobuvir)、丹诺普韦(danoprevir)、索伐普韦(sovaprevir)以及尼塞普韦(neceprevir)。在某些实施例中，该至少一种治疗剂选自：干扰素、利巴韦林和特拉普韦。
在某些实施例中，受试者被对至少一种治疗剂有抗性的HCV变体感染。在某些实施例中，受试者被对直接作用型抗病毒剂有抗性的HCV变体感染。在某些实施例中，受试者被对选自以下的至少一种治疗剂有抗性的HCV变体感染：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、辅助因子抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、结构蛋白抑制剂、非结构蛋白抑制剂以及亲环蛋白抑制剂。在某些实施例中，受试者被对选自以下的至少一种治疗剂有抗性的HCV变体感染：蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A抑制剂、核苷NS5B抑制剂、核苷酸NS5B抑制剂、非核苷NS5B抑制剂以及亲环蛋白抑制剂。在某些实施例中，受试者被对选自以下的至少一种治疗剂有抗性的HCV变体感染：索菲布韦、利巴韦林、特拉普韦、波普瑞韦、伐尼普韦、阿森那普韦、利托那韦、斯乔布韦、迪卡拉斯他韦、斯密普韦、阿拉泊韦、麦瑞斯他滨、替格布韦、丹诺普韦、索伐普韦以及尼塞普韦。
在某些实施例中，HCV感染的受试者是对至少一种治疗剂无反应者。在某些实施例中，HCV感染的受试者是干扰素无反应者。在某些实施例中，HCV感染的受试者是直接作用型抗病毒性无反应者。
在此提供的任何这些方法都可以包括选择具有每毫升血清大于350,000个拷贝的HCVRNA水平的受试者。在某些实施例中，受试者具有每毫升血清在350,000个与3,500,000个拷贝之间的HCVRNA水平。在某些实施例中，受试者具有每毫升血清大于3,500,000个拷贝的HCVRNA水平。
在某些实施例中，HCV感染的受试者具有HCV相关性疾病。在某些实施例中，HCV相关性疾病是肝硬化、肝纤维化、脂肪性肝炎、脂肪变性或肝细胞癌。
在某些实施例中，HCV感染的受试者具有不是HCV相关性疾病的一种或多种疾病。在某些实施例中，HCV感染的受试者被除HCV以外的一种或多种病毒感染。在某些实施例中，HCV感染的受试者被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括给药另外的治疗剂，该另外的治疗剂是在治疗HIV感染中使用的抗病毒剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。在某些实施例中，另外的治疗剂是核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)。在某些实施例中，另外的治疗剂是蛋白酶抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是进入抑制剂或融合抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是整合酶抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂选自：依法韦仑、依曲韦林、奈韦拉平、阿巴卡韦、恩曲他滨、替诺福韦、拉米夫定、齐多夫定、阿扎那韦、地瑞那韦、福沙那韦、利托那韦、恩夫韦地、马拉维诺以及雷特格韦。
在此提供的任何这些方法都可以包括给药足以降低HCVRNA水平的剂量的化合物。在某些实施例中，该给药剂量的化合物使HCVRNA水平降低至每毫升血清40个拷贝以下。在某些实施例中，该给药剂量的化合物实现HCVRNA水平降低至少2个对数。在某些实施例中，给药在此提供的化合物实现了持续的病毒反应。在某些实施例中，该给药剂量的化合物足以实现HCVRNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍。在某些实施例中，在第一次给药该化合物两周、三周、四周、五周或六周之后实现HCVRNA水平降低。在某些实施例中，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次给药在此提供的化合物。在某些实施例中，每两个月一次或每三个月一次给药在此提供的化合物。在一些实施例中，每四周一次给药在此提供的化合物。
在某些实施例中，所给药化合物的剂量是小于或等于每周5mg/kg、小于或等于5mg/kg、小于或等于4.5mg/kg、小于或等于4.0mg/kg、小于或等于3.5mg/kg、小于或等于3.0mg/kg、小于或等于2.5mg/kg、小于或等于2.0mg/kg、小于或等于1.5mg/kg、或小于或等于1.0mg/kg。在某些实施例中，化合物的给药剂量在1mg/kg至5mg/kg、或1mg/kg至4mg/kg、或2mg/kg至5mg/kg、或2mg/kg至4mg/kg范围内。在某些实施例中，所给药化合物的剂量是小于或等于10mg/kg、小于或等于7.5mg/kg、小于或等于每周10mg/kg、或小于或等于每周7.5mg/kg。
在某些实施方案中，给药在此提供的化合物使肝酶水平正常化，其中该肝酶任选地是丙氨酸转氨酶。
在此提供的任何这些实施例中，该化合物存在于药物组合物中。
在此提供了用于治疗HCV-感染的受试者的化合物。
在某些实施例中，受试者是人。
附图简要说明
图1A和1B.抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。(A)在指定剂量下单次给药化合物之后抗miR-122作用的起效和持续时间。(B)在指定剂量下单次剂量的抗miR-122化合物七天后ALDOA的去阻抑。
图2.包含三个GalNAc配体的缀合部分的结构。
图3A、3B和3C.缀合的修饰的寡核苷酸结构。
图4A、4B和4C.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图5A和5B.反义抑制miR-122减小了HCV滴度。
图6A和6B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图7A和7B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图8A和8B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图9A和9B.抗miR-122化合物的药物动力学。
详细说明
除非以另外的方式定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。除非提供了具体定义，否则与在此描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的术语以及其程序和技术是本领域中熟知并且通常使用的。针对在此的术语存在多个定义的情况下，此部分中的定义优先。化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗受试者可以使用标准技术。某些此类技术和程序可以例如在桑薇(Sangvi)和科克(Cook)编辑的“反义研究中的碳水化合物修饰(CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch)”，美国化学学会(AmericanChemicalSociety)，华盛顿哥伦比亚特区(WashingtonD.C.)，1994；和“雷明顿的药物科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)，”麦克出版有限公司(MackPublishingCo.)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(Pa.)，第18版，1990中找到；并且出于任何目的，这些参考文件特此通过引用结合。在允许的情况下，贯穿在此的整个披露内容所涉及的所有的专利、专利申请、公布的申请和出版物、GENBANK序列、网站以及其他公开的材料，除非另外指出，否则通过引用以其全部内容结合。应当理解，在提及URL或其他此类标识符或地址的情况下，此类标识符会变化，并且因特网上的具体信息也会变化，但是等效信息可以通过搜索因特网来找到。如此提及证明了此种信息的可用性和公众传播。
在披露和描述本发明的这些组合物和方法之前，应当理解在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的而不欲具有限制性。必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文另外清楚地指明。
定义
“HCV感染”意指被丙型肝炎病毒的一种或多种基因型感染。
“HCV感染的受试者”意指已被丙型肝炎病毒的一种或多种基因型感染的受试者。HCV感染的受试者可能或可能不展现出HCV感染的症状。HCV感染的受试者包括已被HCV的一种或多种基因型感染的受试者，但是该受试者的血液中的HCVRNA是在可检测水平以下。
“HCV相关性疾病”意指由HCV感染所介导的病理性过程。HCV相关性疾病包括但不限于肝硬化、肝纤维化、脂肪性肝炎以及肝细胞癌。
“血液HCVRNA”意指存在于HCV感染的受试者的血液中的丙型肝炎病毒RNA。血液包括全血和血清。
“血清HCVRNA回升”意指在先前HCVRNA水平降低之后的HCVRNA水平增加。
“HCVRNA水平”意指在给定体积的受试者的血液中的HCVRNA的量。HCVRNA水平可以表达为每毫升的RNA拷贝数。“HCVRNA水平”也可以称为“HCV病毒载量”或“HCVRNA滴度”。
“持续的病毒反应”意指在治疗的整个过程结束时和在另外六个月后受试者的血液中的丙型肝炎病毒RNA不可检测。在某些实施例中，HCVRNA在每毫升血液40个拷贝以下被认为是不可检测的。
“无反应者”意指已接受治疗但是没有经历疾病标志或症状上的临床上可接受的改善的受试者。
“干扰素无反应者”意指已接受用干扰素治疗但是没有经历HCVRNA水平上的临床上可接受的降低的HCV感染的受试者。
“直接作用型抗病毒剂”意指抑制HCV酶的活性的药剂。
“直接作用型抗病毒性无反应者”意指已接受用直接作用型抗病毒剂治疗但是没有经历HCVRNA水平上的临床上可接受的降低的HCV感染的受试者。在某些实施例中，病毒已发展出对该直接作用型抗病毒剂的抗性。
“miR-122相关性病状”意指可以通过调节miR-122来治疗、预防或改善的任何疾病、病症或病状。miR-122相关性疾病不需要特征在于过量的miR-122。miR-122相关性疾病包括但不限于HCV感染、胆固醇升高和铁负载过高病症。
“铁负载过高病症”意指特征在于身体内的铁过量的任何疾病、病症或病状。“受试者”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“有需要的受试者”意指被鉴定为有疗法或治疗需要的受试者。
“疑似患有的受试者”意指展现出疾病的一个或多个临床指标的受试者。
“给药”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专家给药和自给药。
“肠胃外给药”意指通过注射或输注给药。
肠胃外给药包括但不限于皮下给药、静脉内给药和肌肉内给药。
“皮下给药”意指在皮肤下方给药。
“静脉内给药”意指给药进入静脉中。
“同时给药”是指以任何方式向受试者共同给药两种或更多种药剂，其中每种药剂的药理学作用都存在于受试者体内。同时给药不要求以单一的药物组合物、以相同剂型或通过相同的给药途径来给药两种药剂。这两种药剂的作用不需要同时存在。这些作用仅需要一段时间重叠并且不需要共延。
“持续时间”意指活性或事件持续的一段时间。在某些实施例中，治疗的持续时间是给药多个剂量的药剂或药物组合物的一段时间。
“疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施例中，疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法或给药药剂。
“治疗”意指施加用于治愈或改善疾病的一种或多种特定程序。在某些实施例中，该特定程序是给药一种或多种药剂。
“改善”意指减轻病状或疾病的至少一个指标的严重性。在某些实施例中，改善包括延缓或减慢病状或疾病的一个或多个指标的进展。可以通过本领域技术人员已知的主观测量或客观测量来确定指标的严重性。
“处于发展的风险”意指受试者易于发展病状或疾病的状态。在某些实施例中，处于发展病状或疾病的风险的受试者展现出该病状或疾病的一种或多种症状，但是没有展现出诊断患有该病状或疾病的足够数量的症状。在某些实施例中，处于发展病状或疾病的风险的一个受试者展现出该病状或疾病的或多种症状，但达到诊断该病状或疾病所要求的更小程度。
“预防发作”意指在处于发展该疾病或病状的风险的一个受试者中预防病状或疾病的发展。在某些实施例中，处于发展该疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“延缓发作”意指在处于发展该疾病或病状的风险的受试者中延缓病状或疾病的发展。在某些实施例中，处于发展该疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“治疗剂”意指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。
“剂量”意指在单次给药中提供的药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂形式给药。例如，在某些实施例中，在希望皮下给药的情况下，所希望的剂量要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施例中，可以使用两次或更多次注射达到所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以两次或更多次注射给药以使个体体内的注射部位反应减到最小。在某些实施例中，剂量通过缓慢输注给药。
“剂量单位”意指提供药剂的形式。在某些实施例中，剂量单位是含有冻干的寡核苷酸的小瓶。在某些实施例中，剂量单位是含有复原的寡核苷酸的小瓶。
“治疗有效量”是指对动物提供治疗益处的药剂的量。
“药物组合物”意指包括药剂的适合用于向个体给药的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含无菌水溶液。
“药剂”意指当向受试者给药时提供治疗作用的物质。
“活性药物成分”意指药物组合物中提供希望的作用的物质。
“改善的器官功能”意指趋向于正常限制的器官功能变化。在某些实施例中，通过测量存在于受试者的血液或尿液中的分子来评价器官功能。例如，在某些实施例中，通过血液肝转氨酶水平降低来测量改善的肝功能。在某些实施例中，通过血液尿素氮减少、蛋白尿减少、清蛋白尿减少等来测量改善的肾功能。
“可接受的安全性特征”意指处于临床上可接受的限制之内的副作用的型态。
“副作用”意指除希望的作用以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施例中，副作用包括但不限于：注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常以及肌病。此类副作用可以被直接或间接检测。例如，血清中的转氨酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以表明肝毒性或肝功能异常。
“注射部位反应”意指在个体的注射部位处的皮肤的炎症或异常发红。
“受试者依从性”意指受试者对建议或规定的疗法的顺从性。
“遵从”意指受试者对建议的疗法顺从。
“建议的疗法”意指医学专家建议的治疗、改善、延缓或预防疾病的治疗。
“miR-122”意指具有核碱基序列UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQIDNO:1)的微小RNA。
“miR-122茎环”意指具有核碱基序列CCUUAGCAGAGCUGUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUGUCUAAACUAUCAAACGCCAUUAUCACACUAAAUAGCUACUGCUAGGC(SEQIDNO:2)的微小RNA前体。
“抗miR”意指具有与微小RNA互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR是修饰的寡核苷酸。
“抗miR-122”意指具有与miR-122互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR-122与miR-122完全互补(即，100％互补)。在某些实施例中，抗miR-122是至少90％、至少93％、至少94％、至少95％或100％互补。在某些实施例中，抗miR-122是修饰的寡核苷酸。
“靶核酸”意指低聚化合物被设计与其进行杂交的核酸。
“靶向”意指将与靶核酸杂交的核碱基序列的设计和选择过程。
“对......靶向”意指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。
“调节”意指干扰功能、量或活性。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性增加。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性减少。
“表达”意指基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中起作用的结构所借助的任何功能和步骤。
“5’靶位点”意指与特定寡核苷酸的最3’端核碱基互补的靶核酸的核碱基。
“3’靶位点”意指与特定寡核苷酸的最5’端核碱基互补的靶核酸的核碱基。
“区”意指核酸内的连接的核苷的一部分。在某些实施例中，寡核苷酸具有与靶核酸的区互补的核碱基序列。例如，在某些此类实施例中，寡核苷酸与微小RNA序列的区互补。在某些此类实施例中，寡核苷酸与微小RNA的区完全互补。
“区段”意指区的较小或子部分。
“核碱基序列”意指无关任何糖、键联和/或核碱基修饰，典型地以5’至3’方向列出的低聚化合物或核酸中的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”意指在核酸中彼此紧邻的核碱基。
“核碱基互补性”意指两个核碱基经由氢键结非共价配对的能力。
“互补”意指一个核酸能够与另一个核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施例中，互补是指寡核苷酸能够与靶核酸杂交。
“完全互补”意指寡核苷酸的每个核碱基能够与靶核酸中的每个对应位置上的核碱基配对。在某些实施例中，寡核苷酸与微小RNA完全互补，即，该寡核苷酸的每个核碱基与该微小RNA中的对应位置上的核碱基互补。在某些实施例中，其中每个核碱基与微小RNA序列的区内的核碱基互补的寡核苷酸与该微小RNA序列完全互补。
“互补性百分比”意指寡核苷酸中与靶核酸的等长部分互补的核碱基百分比。通过将该寡核苷酸中与该靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的核碱基数除以该寡核苷酸中的核碱基总数来计算互补性百分比。
“同一性百分比”意指第一核酸中与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同的核碱基数除以该第一核酸中的核碱基总数。在某些实施例中，该第一核酸是微小RNA并且该第二核酸是微小RNA。在某些实施例中，该第一核酸是寡核苷酸并且该第二核酸是寡核苷酸。
“杂交”意指通过核碱基互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”意指第一核酸中不能够与第二核酸的对应位置上的核碱基发生沃森-克里克(Watson-Crick)配对的碱基。
在核碱基序列背景下的“相同”意指无关糖、键联和/或核碱基修饰和无关存在的任何嘧啶的甲基状态，具有相同的核碱基序列。
“微小RNA”意指长度介于18与25个之间的核碱基的内源性非编码RNA，该内源性非编码RNA是由酶Dicer裂解前体微小RNA的产物。成熟的微小RNA的实例可在称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA数据库中找到。在某些实施例中，微小RNA缩写为“微小RNA”或“miR”。
“前体微小RNA”或“前体miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，该非编码RNA是由称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶裂解前体miR的产物。
“茎环序列”意指具有发夹结构并且含有成熟微小RNA序列的RNA。前体微小RNA序列和茎环序列可以重叠。茎环序列的实例可在称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA数据库中找到。
“初级微小RNA”或“初级miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，该非编码RNA是双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物。
“微小RNA前体”意指起源于基因组DNA并且包含含有一个或多个微小RNA序列非编码结构RNA的转录物。例如，在某些实施例中，微小RNA前体是前体微小RNA。在某些实施例中，微小RNA前体是初级微小RNA。
“微小RNA调节的转录物”意指由微小RNA调节的转录物。
“单顺反子转录物”意指含有单个微小RNA序列的微小RNA前体。
“多顺反子转录物”意指含有两个或更多个微小RNA序列的微小RNA前体。
“种子序列”意指包含成熟微小RNA序列的5’-末端的核碱基1至9的6至8个连续核碱基的核碱基序列。
“种子匹配序列”意指与种子序列互补并且长度与该种子序列相同的核碱基序列。
“低聚化合物”意指包含多个连接的单体亚单元的化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物，这些连接的核苷可以各自独立地是修饰或未修饰的。
“天然存在的核苷间键联”意指核苷之间的3’至5’磷酸二酯键。
“天然糖”意指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖。
“核苷间键联”意指相邻核苷之间的共价键。
“连接的核苷”意指通过共价键联接的核苷。
“核碱基”意指能够与另一个核碱基非共价配对的杂环部分。
“核苷”意指连接至糖部分的核碱基。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“包含由许多连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物”意指包括具有指定数目的连接的核苷的修饰的寡核苷酸的化合物。因此，该化合物可以包括另外的取代基或缀合物。除非另外指明，否则该化合物不包括超出该修饰的寡核苷酸的核苷的任何另外的核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指相对于天然存在的末端、糖、核碱基和/或核苷间键联具有一个或多个修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸可以包含未修饰的核苷。
“单链修饰的寡核苷酸”意指不与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。
“修饰的核苷”意指与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。修饰的核苷可以具有修饰的糖和未修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有天然糖和修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核苷是双环核苷。在某些实施例中，修饰的核苷是非双环核苷。
“2’-修饰的核苷”意指当位置是在2-脱氧核糖或核糖中编号时，包含在等效于呋喃糖基环的2’位置的位置上具有任何修饰的糖的核苷。应当理解，2’-修饰的核苷包括但不限于包含双环糖部分的核苷。
“修饰的核苷间键联”意指与天然存在的核苷间键联相比的任何变化。
“硫代磷酸酯核苷间键联”意指其中非桥联原子之一是硫原子的核苷之间的键联。“硫代磷酸酯键”意指具有与硫代磷酸酯核苷间键联例如-OP(O)(S)O-相同的结构的两个化学部分之间的键联。
“磷酸二酯键”意指具有与磷酸二酯核苷间键联例如-OP(O)2O-相同的结构的两个化学部分之间的键联。
“未修饰的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含连接至5位置上的甲基的胞嘧啶。
“非甲基化的胞嘧啶”意指不具有连接至5位置上的甲基的胞嘧啶。
“修饰的核碱基”意指不是未修饰的核碱基的任何核碱基。
“呋喃糖基”意指包含由四个碳原子和一个氧原子组成的5元环的结构。
“天然存在的呋喃糖基”意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的呋喃脱氧核糖基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或修饰的糖部分。
“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
“取代的糖部分”意指不是天然存在的呋喃糖基的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在天然存在的呋喃糖基的2’-位置、5’-位置和/或4’-位置上包含修饰的糖部分。某些取代的糖部分是双环糖部分。
“糖替代物”意指不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的呋喃糖基的结构，这样使得所得到的核苷能够(1)结合到寡核苷酸中并且(2)与互补核苷进行杂交。此类结构包括该呋喃糖基的相对简单的变化，如环包含不同的原子数(例如，4元环、6元环或7元环)；该呋喃糖基的氧置换为非氧原子(例如，碳、硫或氮)；或原子数和氧置换这两种变化。此类结构还可以包含与针对取代的糖部分所描述的那些取代相对应的取代(例如，6元碳环双环糖替代物任选地包含另外的取代基)。糖替代物还包括更复杂的糖置换(例如，肽核酸的非环体系)。糖替代物包括但不限于吗啉化合物、环己烯化合物和环己六醇化合物。
“β-D-脱氧核糖”意指天然存在的DNA糖部分。
“β-D-核糖”意指天然存在的RNA糖部分。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”意指在2’位置上具有O-甲基修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”意指在2’位置上具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2’-O-氟基”或“2’-F”意指在2’位置上具有氟基修饰的糖。
“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，该修饰的糖部分包含连接该4至7元环的两个原子的桥联以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施例中，该4至7元环是糖环。在某些实施例中，该4至7元环是呋喃糖基。在某些此类实施例中，该桥联连接该呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。非限制的示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“锁核酸(LNA)糖部分”意指在4’呋喃糖环原子与2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥联的取代的糖部分。
“ENA糖部分”意指在4’呋喃糖环原子与2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥联的取代的糖部分。
“约束乙基(cEt)糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。在某些实施例中，该CH(CH3)-O桥联约束为S方向。在某些实施例中，该CH(CH3)-O桥联约束为R方向。
“S-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含S-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含R-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。
“2’-O-甲基核苷”意指具有2’-O-甲基糖修饰的修饰的核苷。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修饰的修饰的核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“2’-氟核苷”意指具有2’-氟基糖修饰的修饰的核苷。2’-氟核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“双环核苷”意指具有双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷可以具有饰或未修饰的核碱基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。
“非双环核苷”意指具有除双环糖以外的糖的核苷。在某些实施例中，非双环核苷包含天然存在的糖。在某些实施例中，非双环核苷包含修饰的糖。在某些实施例中，非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，非双环核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷。
“β-D-脱氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“基序”意指寡核苷酸中的修饰和/或未修饰的核碱基、糖和/或核苷间键联的型态。在某些实施例中，基序是核苷型态。
“核苷型态”意指在修饰的寡核苷酸或其区中的核苷修饰的型态。核苷型态是描述核苷修饰在寡核苷酸中的排列的基序。
“完全修饰的寡核苷酸”意指每个核碱基、每种糖和/或每个核苷间键联都被修饰。
“均一修饰的寡核苷酸”意指每个核碱基、每种糖和/或每个核苷间键联在整个该修饰的寡核苷酸中具有相同的修饰。
“稳定性修饰”意指在核酸酶存在下，相对于通过由磷酸二酯核苷间键联连接的2’-脱氧核苷提供的稳定性，为修饰的寡核苷酸提供增强的稳定性的对核苷的修饰。例如，在某些实施例中，稳定性修饰是稳定性核苷修饰。在某些实施例中，稳定性修饰是核苷间键联修饰。
“稳定性核苷”意指相对于2’-脱氧核苷提供的核酸酶稳定性，被修饰以对寡核苷酸提供增强的核酸酶稳定性的核苷。在一个实施例中，稳定性核苷是2’-修饰的核苷。
“稳定性核苷间键联”意指相对于磷酸二酯核苷间键联提供的核苷酶稳定性，为寡核苷酸提供提高的核酸酶稳定性的核苷间键联。在一个实施例中，稳定性核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
如在此所使用的“连接基团”是指经由一个或多个共价键将第一化学实体连接至第二化学实体的原子或原子团。
如在此所使用的“接头”是指经由一个或多个共价键将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷的原子或原子团。该修饰或未修饰的核苷可以是如在此所描述的修饰的寡核苷酸的部分，或可以通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接至修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的3’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的5’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，该修饰或未修饰的核苷被连接至修饰的寡核苷酸的3’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，该修饰或未修饰的核苷被连接至修饰的寡核苷酸的5’末端。当该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的3’末端或被连接至修饰的寡核苷酸的3’末端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施例中，该接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的3’碳。当该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的5’末端或被连接至修饰的寡核苷酸的5’末端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施例中，该接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的5’碳。
综述
为了鉴定miR-122的有效抑制剂，设计并且合成了许多抗miR-122化合物。这些化合物包含长度以及双环核苷和非双环核苷的数目、位置以及特性不同的修饰的寡核苷酸。在体外荧光素酶测定中测试一系列初始化合物，该体外荧光素酶测定将一个子集的化合物鉴定为体外活性化合物。然后在体内测定中测试这些体外活性化合物以鉴定作为体内miR-122的有效抑制剂的那些化合物。通过初始的体外和体内筛选，某些化合物被选择为用于设计另外的化合物的基础。实验观察到的结构与活性之间的相关性(在体外和在体内两者中)用来为这些另外化合物的设计提供信息，其中另外在长度和双环与非双环核苷的选择和安排方面有所变化。对这些另外化合物重复进行这些体外和体内筛选测定。还测试了某些化合物的其他特性，例如对核酸外切酶活性的敏感性、组织积累和组织半衰期。
在这个过程中体外筛选的超过400种化合物中，大约150种化合物被鉴定为在体外荧光素酶测定中具有活性。进一步评估大约70种这些化合物的体内效力和安全性。通过设计和筛选化合物的这种反复过程，观察到某些化合物(未缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸和缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸两者)是体内miR-122的有效抑制剂。因此，这些化合物适用于调节由miR-122的活性促进的细胞过程。另外，此类化合物适用于治疗、预防和/或延缓与miR-122相关的疾病发作。此类疾病包括但不限于HCV感染和HCV相关性并发症，如肝硬化、肝纤维化、脂肪性肝炎、脂肪变性以及肝细胞瘤。
某些抗miR-122化合物
在此提供了具有双环和非双环核苷的某些型态的修饰的寡核苷酸。具有在此鉴定的这些型态的修饰的寡核苷酸是miR-122活性的有效抑制剂。
在此说明的这些核苷型态各自以5’至3’方向示出。
在某些实施例中，在此提供了包含由16至22个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122(SEQIDNO:1)互补，并且其中该修饰的寡核苷酸按5’至3’方向包含具有以下核苷型态I的至少16个连续核苷：
(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y
其中每个R独立地是非双环核苷或双环核苷；
X是从4至10；
每个NB独立地是双环核苷；
每个NQ独立地是非双环核苷；
Y是0或1；并且
NZ是修饰的核苷或未修饰的核苷、非双环核苷或双环核苷。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含具有核苷型态I的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个连续核苷。
在某些实施例中，每个双环核苷独立地选自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。
在某些实施例中，至少两个双环核苷彼此不同。
在某些实施例中，所有双环核苷具有相同类型的糖部分。
在某些实施例中，每个双环核苷是cEt核苷。在某些实施例中，该cEt核苷是S-cEt核苷。在某些实施例中，该cEt核苷是R-cEt核苷。
在某些实施例中，每个双环核苷是LNA核苷。
在某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个非双环核苷具有相同类型的糖部分。
在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷是2’-MOE核苷。
在某些实施例中，不多于两个非双环核苷是2’-MOE核苷。在某些实施例中，不多于两个非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，5’-末端和3’-末端的非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，两个非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，R的每个核苷是2’-MOE核苷。
在某些实施例中，X是4、5、6、7、8、9或10。
在某些实施例中，Y是0。在某些实施例中，Y是1。
在某些实施例中，R由七个连接的核苷组成，其中每个核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，R由四个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4组成，其中NR1和NR3各自是S-cEt核苷并且NR2和NR4各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1；并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，R由四个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4组成，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷并且NR2和NR3各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1；并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，R由七个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7组成，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-脱氧核糖核苷，并且NR6是S-cEt核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，R由七个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7组成，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6是S-cEt核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，R由七个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7组成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，R由十个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10组成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0。
在某些实施例中，R由十个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10组成，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；并且NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，R由四个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4组成，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR1和NR3各自是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，R由四个连接的核苷NR1-NR2-NR3-NR4组成，其中NR1是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR3是β-D-脱氧核糖核苷；每个NB是S-cEt核苷；每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122的核碱基序列(SEQIDNO:1)至少90％、至少93％、至少94％、至少95％或100％互补。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122互补，这样使得SEQIDNO:2的位置1与该寡核苷酸的3’-末端核碱基配对。例如：
5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’(miR-122；SEQIDNO:1)
||||||||||||||||||
3’-CCTCACACTGTTACCACA-5’(抗miR-122；SEQIDNO:4)
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122互补，这样使得SEQIDNO:1的位置1与该寡核苷酸的3’-末端核碱基配对。例如：
5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’(miR-122；SEQIDNO:1)
||||||||||||||||||
3’-ACCTCACACTGTTACC-5’(抗miR-122；SEQIDNO:3)；以及
5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’(miR-122；SEQIDNO:1)
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3’-TCCTCACACTGTTACCACAAAC-5’(抗miR-122；SEQIDNO:6)
在某些实施例中，至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的至少一个嘧啶包含5-甲基基团。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的至少一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，包含胞嘧啶的每个修饰的核苷酸都包含5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，包含胞嘧啶的每个2’-O-甲氧基乙基核苷都包含5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:6，其中每个T独立地选自T和U。
在某些实施例中，相对于miR-122的核碱基序列，该修饰的寡核苷酸具有0、1、2或3个错配。在某些实施例中，相对于miR-122的核碱基序列，该修饰的寡核苷酸具有0个错配。在某些实施例中，相对于miR-122的核碱基序列，该修饰的寡核苷酸具有1个错配。在某些实施例中，相对于miR-122的核碱基序列，该修饰的寡核苷酸具有2个错配。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由多于22个连接的核苷组成，并且包含具有核苷型态I的至少8个连接的核苷。除了由核苷型态I描述的这些核苷以外的存在的核苷是修饰或未修饰的。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由少于16个连接的核苷组成，并且包含具有核苷型态I的至少8个连接的核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有如在表1中所示的核碱基序列和修饰。核苷酸和核碱基指明如下：上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
表1：抗miR-122化合物
在一些实施例中，修饰的寡核苷酸具有如下所示的核碱基序列和修饰：
USTGUSCSACSACSTCSCSAS(SEQIDNO:8)；或
CSASCSASCSUSCSCS(SEQIDNO:9)；
其中后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。在一些此类实施例中，化合物是38591、38633、38998或38634。
包含缀合物的抗miR-122化合物
在某些实施例中，在此提供的化合物包含缀合至一个或多个部分的修饰的寡核苷酸，该一个或多个部分增强该寡核苷酸的活性、细胞分布和/或细胞摄取。例如，可以通过使用作为细胞表面受体的配体的缀合物来实现化合物的细胞摄取增加。缀合至外源分子(例如，药物)的配体与它的细胞表面受体结合导致该缀合的分子内化，从而增强该外源分子的跨膜转运。在此提供的任何这些抗miR-122修饰的寡核苷酸可以连接至一个或多个部分以形成包含缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的化合物。
在某些实施例中，在此提供的化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端或3’末端的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端的第一缀合部分和连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端的第二缀合部分。
在某些实施例中，缀合部分包含选自以下的至少一个配体：碳水化合物、胆固醇、脂质、磷脂、抗体、脂蛋白、激素、肽、维生素、类固醇或阳离子性脂质。
配体可以通过任何适合的接头共价连接至修饰的寡核苷酸上。各种接头是本领域中已知的，并且例如在PCT公开号WO2013/033230和美国专利号8,106,022B2中描述了某些非限制的示例性接头。在一些实施例中，可以选择在体内对酶裂解有抗性的接头。在一些实施例中，可以选择在体内对水解裂解有抗性的接头。在一些实施例中，可以选择将在体内经受酶裂解的接头。在一些实施例中，可以选择将在体内经受水解裂解的接头。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有以下结构：
L-X1-Nm-X2-MO；
其中每个L是配体；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。在某些实施例中，m是1并且X1和X2各自是磷酸二酯。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构A：
Ln-接头-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构B：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构C：
Ln-接头-X-Nm-Y-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构D：
Ln-接头-Y-Nm-Y-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在一些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，当n大于1时，该接头包含能够将多于一个L连接至该化合物的其余部分上(即，连接至该修饰的寡核苷酸(MO)上、连接至X1-Nm-X2-MO上、连接至X-Nm-Y-MO上，等等)的骨架。在一些此类实施例中，该化合物(如结构A、结构B、结构C或结构D的化合物)的Ln-接头部分包含结构E：
其中每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在某些实施例中，每个Q’和Q”独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
在某些实施例中，骨架将2、3、4或5个配体连接至修饰的寡核苷酸上。在某些实施例中，骨架将3个配体连接至修饰的寡核苷酸上。
一种非限制性的示例性结构E是结构E(i)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(ii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1是H或甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iv)：
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(v)：
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vi)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；并且Z和Z’各自独立地选自O和S。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。在一些实施例中，至少一个P原子上的Z或Z’是S，并且另一个Z或Z’是O(即，硫代磷酸酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯键。在一些实施例中，至少一个P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯键。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(viii)：
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
例如PCT公开号WO2013/033230；美国专利号8,106,022B2；美国公开号2012/0157509A1；美国专利号5,994,517；美国专利号7,491,805B2；美国专利号8,313,772B2；马诺哈兰马(Manoharan,M.)，第16章，反义药物技术(AntisenseDrugTechnology)，斯汀克鲁克(Crooke,S.T.)、马塞尔德克尔(MarcelDekker)公司，2001，391-469描述了非限制性的示例性骨架和/或包含骨架的接头及其合成。
在某些实施例中，该化合物的Ln-接头部分包含结构F：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；并且
波形线表明连接至这个或这些接头和配体的其余部分。
在某些实施例中，波形线表明连接至以上结构E。
在某些实施例中，n是从1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些实施例中，n是1。在某些实施例中，n是2。在某些实施例中，n是3。在某些实施例中，n是4。在某些实施例中，n是5。
在某些实施例中，该化合物的Ln-接头部分包含结构G：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；
每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在某些实施例中，每个Q’和Q”独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
化合物的一个非限制的示例性Ln-接头部分(例如，具有结构F或结构G)在以下结构H中示出：
其中波形线表明连接至该修饰的寡核苷酸(MO)上、例如结构B中的X1上或例如结构C或结构D中的X或Y上。
在某些实施例中，每个配体都是碳水化合物。当被细胞表面凝集素识别时，包含碳水化合物缀合的修饰的寡核苷酸的化合物转运穿过细胞膜进入细胞中。在某些实施例中，细胞表面凝集素是C型凝集素。在某些实施例中，该C型凝集素存在于枯否细胞(Kuppfercell)上。在某些实施例中，C型凝集素存在于巨噬细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于内皮细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于单核细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于白细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于树突状细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于B细胞上。缀合物可以促进抗miR-122化合物摄取到表达C-型凝集素的任何细胞类型中。
在某些实施例中，C型凝集素是无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在某些实施例中，缀合物包含对该ASGPR具有亲和性的一个或多个配体，包括但不限于半乳糖或半乳糖衍生物。在某些实施例中，对该ASGPR具有亲和性的配体是N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺或N-异丁酰基半乳糖胺。此类缀合物促进化合物摄取到表达该ASGPR的细胞中，例如肝细胞和树突状细胞。
在某些实施例中，配体是选自以下的碳水化合物：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸以及N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，配体选自：N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺以及N-异丁酰基-半乳糖胺。
在某些实施例中，配体是N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
其中X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中,化合物包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上并且具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，所有这些CL核苷都是MeCL核苷，其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在一些实施例中，化合物具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，X1和X2中的至少一个是磷酸二酯键。在某些实施例中，X1和X2各自是磷酸二酯键。
在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在此描述的任何这些实施例中，Nm可以是N’pN”，其中每个N’独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且p是从0至4；并且N”是包含未修饰的糖部分的核苷。
在某些实施例中，p是0。在某些实施例中，p是1、2、3或4。在某些实施例中，当p是1、2、3或4时，每个N’包含未修饰的糖部分。
在某些实施例中，未修饰的糖部分是β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
在某些实施例中，在p是1、2、3或4的情况下，N’包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，N”包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，嘌呤核碱基选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。在某些实施例中，N’是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。在某些实施例中，N”是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。
在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过磷酸二酯核苷间键联连接。在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过磷酸二酯核苷间键联连接。在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施例中，在p是1、2、3或4的情况下，N’包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，N”包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，嘧啶核碱基选自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氢尿嘧啶。
在某些实施例中，每个N的糖部分独立地选自：β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及双环糖部分。在某些实施例中，每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是R-cEt糖部分。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是2；每个N是β-D-脱氧核糖腺苷；N的核苷通过磷酸二酯核苷间键联连接；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，化合物包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS(SEQIDNO:4)，其中后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联；并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中,化合物包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，所有这些CL核苷都是MeCL核苷，其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有如在表2中所示的核碱基序列和修饰。核苷酸和核碱基指明如下：上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，在此提供的化合物包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CSASCSASCSUSCSCS(SEQIDNO:9)，其中下标“S”表明S-cEt并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端并且具有以下结构：
其中X1和X2是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；并且MO是修饰的寡核苷酸。
用于缀合至修饰的寡核苷酸的另外的部分包括吩嗪、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明(rhodamine)、香豆素以及染料。在某些实施例中，缀合基团是直接连接至修饰的寡核苷酸上。
某些代谢产物
当在体外或体内暴露于核酸外切酶和/或核酸内切酶时，化合物可以经受在整个化合物的不同位置上的裂解。此种裂解的产物可以保留一定程度的母体化合物的活性，并且因此被认为是活性代谢物。因此，化合物的代谢产物可以用于在此描述的这些方法中。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸(未缀合或缀合的)经受5’末端和/或3’末端上的裂解，从而产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端和/或3’末端上少1个、2个或3个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受5’末端上的裂解，释放5’-末端的核苷酸并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端上少1个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受5’末端上的裂解，释放两个5’-末端的核苷并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端上少两个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受3’末端上的裂解，释放3’-末端的核苷酸并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在3’末端上少一个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受3’末端上的裂解，释放两个3’-末端的核苷并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在3’末端上少两个核苷酸的代谢产物。
包含连接至缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物还可以经受该修饰的寡核苷酸与配体之间的接头内的一个位点上的裂解。在某些实施例中，裂解产生包含一部分缀合部分的母体修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，裂解产生在修饰的寡核苷酸与配体之间包含接头的一个或多个亚单位的母体修饰的寡核苷酸。例如，在化合物具有结构Ln-接头-Nm-P-MO的情况下，在一些实施例中，裂解产生包含Nm的一个或多个核苷酸的母体修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，缀合的修饰的寡核苷酸的裂解产生母体修饰的寡核苷酸。在一些此类实施例中，例如，在化合物具有结构Ln-接头-Nm-P-MO的情况下，在一些实施例中，裂解产生不包含Nm的任何核苷酸的母体修饰的寡核苷酸。
某些核碱基序列
成熟miR-122的核碱基序列和它的对应茎环序列可在miRBase(在microrna.sanger.ac.uk中找到的微小RNA序列和注释的可在线搜索数据库)中找到。该miRBase序列数据库中的条目代表微小RNA转录物的预测的发夹部分(茎环)，具有成熟微小RNA序列的位置和序列方面的信息。该数据库中的这些微小RNA茎环序列不是严格地前体微小RNA(前体微小RNA)，并且在一些情况下可以包括前体微小RNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。在此描述的这些微小RNA核碱基序列涵盖任何型式的微小RNA，包括在miRBase序列数据库的发布版15.0中描述的序列和在miRBase序列数据库的任何早期发布版中描述的序列。一个序列数据库发布版可能引起某些微小RNA重新命名。本发明涵盖与在此描述的这些微小RNA的任何核碱基序列型式互补的修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，靶向miR-122的修饰的寡核苷酸的每个核碱基都能够经受与miR-122或其前体的核碱基序列中的对应位置上的核碱基进行碱基配对。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列可以相对于它的靶微小RNA或前体序列具有一个或多个错配的碱基对，并且仍保持能够与它的靶序列杂交。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有与miR-122前体的核碱基序列(如miR-122茎环序列)互补的核碱基序列。当miR-122被包含在miR-122前体序列内时，具有与miR-122互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸也与miR-122前体的区互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有与SEQIDNO:1的核碱基1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21或1至22互补的核碱基序列。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有与SEQIDNO:1的核碱基2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至21或2至22互补的核碱基序列。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有与SEQIDNO:1的核碱基3至17、3至18、3至19、3至20、3至21或3至22互补的核碱基序列。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数小于该miR-122或其前体的长度。在某些此类实施例中，寡核苷酸具有与miR-122或其前体的区互补的核碱基序列。具有小于miR-122长度的连接的核苷数的修饰的寡核苷酸(其中修饰的寡核苷酸的每个核碱基与miR-122核碱基序列中的对应位置上的每个核碱基互补)被认为是具有与miR-122完全互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。例如，由19个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中核苷1至19的核碱基各自与miR-122的对应位置互补，其中miR-122长度为22个核碱基)与miR-122的19个连续核碱基完全互补。这种修饰的寡核苷酸具有与miR-122的核碱基序列100％互补的核碱基序列。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比miR-122的长度小1。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在5’末端上少一个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在3’末端上少一个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在5’末端上少两个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在3’末端上少两个核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的15个连续核碱基各自与miR-122的15个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的16个连续核碱基各自与miR-122的16个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的17个连续核碱基各自与miR-122的17个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的18个连续核碱基各自与miR-122的18个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的19个连续核碱基各自与miR-122的19个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的20个连续核碱基各自与miR-122的20个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的21个连续核碱基各自与miR-122的21个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的22个连续核碱基各自与miR-122的22个连续核碱基互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含与种子序列互补的核碱基序列，即修饰的寡核苷酸包含种子匹配序列。在某些实施例中，种子序列是六聚体种子序列。在某些此类实施例中，种子序列是miR-122的核碱基1-6。在某些此类实施例中，种子序列是miR-122的核碱基2-7。在某些此类实施例中，种子序列是miR-122的核碱基3-8。在某些实施例中，种子序列是七聚体种子序列。在某些此类实施例中，七聚体种子序列是miR-122的核碱基1-7。在某些此类实施例中，七聚体种子序列是miR-122的核碱基2-8。在某些实施例中，该种子序列是八聚体种子序列。在某些此类实施例中，八聚体种子序列是miR-122的核碱基1-8。在某些实施例中，八聚体种子序列是miR-122的核碱基2-9。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数大于miR-122序列的长度。在某些此类实施例中，另外的核苷的核碱基与miR-122茎环序列的核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比miR-122的长度大1。在某些此类实施例中，该另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的5’末端上。在某些此类实施例中，该另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比miR-122的长度大2。在某些此类实施例中，这两个另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的5’末端上。在某些此类实施例中，这两个另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些此类实施例中，一个另外的核苷位于修饰的寡核苷酸的5’末端上并且一个另外的核苷位于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些实施例中，寡核苷酸的区可以与miR-122的核碱基序列完全互补，但是整个修饰的寡核苷酸不与miR-122完全互补。例如，由23个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中核苷1至22的核碱基各自与长度为22个核碱基的miR-122的对应位置互补)具有与miR-122的核碱基序列完全互补的22个核苷部分。
在某些实施例中，化合物包含通过包含一个或多个核苷的接头连接至配体的修饰的寡核苷酸。出于计算互补性百分比的目的，该接头的任何另外的核苷都被认为是该接头的部分而不是该修饰的寡核苷酸的部分。因此，缀合化合物的修饰的寡核苷酸的核碱基序列可以仍然与miR-122100％互补，甚至在该接头包含不与miR-122互补的一个或多个核苷的情况下。
在此列出的这些miR-122核碱基序列(包括但不限于在实例中和在序列表中找到的那些)与对核酸的任何修饰无关。因此，由SEQIDNO定义的核酸可以独立地包含对一个或多个糖部分、对一个或多个核苷间键联和/或对一个或多个核碱基的一个或多个修饰。
虽然本文件所附序列表将每个核碱基序列根据需要鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上那些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域技术人员将易于领会，如“RNA”或“DNA”这样的名称描述修饰的寡核苷酸在一定程序上是任意的。例如，包含含有2′-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的修饰的寡核苷酸可以被描述为具有修饰的糖(针对DNA的天然2′-H为2′-OH)的DNA或具有修饰的碱基(针对RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。
因此，在此提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些)旨在涵盖含有天然或修饰的RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为实例而不是限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的修饰的寡核苷酸涵盖具有此种核碱基序列的任何寡核苷酸，无论是修饰的或未修饰的，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些化合物和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些化合物以及具有其他修饰的碱基如“ATmeCGAUCG”的寡核苷酸，其中meC表明5-甲基胞嘧啶。类似地，具有核碱基序列“AUCGAUCG”的修饰的寡核苷酸涵盖具有此种核碱基序列的任何寡核苷酸，无论是修饰的或未修饰的，包括但不限于包含DNA碱基的此类化合物，如具有序列“ATCGATCG”的那些化合物和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些化合物以及具有其他修饰的碱基如“ATmeCGAUCG”的寡核苷酸，其中meC表明5-甲基胞嘧啶。
miR-122组合物的某些用途
微小RNAmiR-122是肝脏表达的微小RNA，该微小RNA是用于HCV复制的关键内源性“宿主因子”，并且靶向miR-122的寡核苷酸阻断HCV复制(乔普林等人(2005)科学杂志309，1577-81)。在被丙型肝炎病毒慢性感染的黑猩猩中抑制miR-122降低了HCVRNA水平。在HCV感染的患者中，抑制miR-122引起5个每周剂量抗miR-122化合物之后HCVRNA水平降低平均2个对数。在此描述的这些化合物是miR-122活性的有效抑制剂。因此，这里提供了用于治疗HCV感染的方法，这些方法包括向HCV感染的受试者给药在此提供的化合物。
在此提供了用于治疗HCV感染的受试者的方法，这些方法包括向该受试者给药在此提供的化合物。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括选择HCV感染的受试者。在某些实施例中，该受试者是人。
在某些实施例中，该给药减少了HCV感染的症状。HCV感染的症状包括但不限于肝脏疼痛、黄疸、恶心、食欲不振以及疲劳。
在HCV治疗方案之后，HCV感染的受试者可能经历HCVRNA水平降低，接着是HCVRNA水平增加，该后续增加称为HCVRNA水平回升。在某些实施例中，在此提供的这些化合物和方法预防HCVRNA水平回升。在某些实施例中，在此提供的这些化合物和方法延缓HCVRNA水平回升。
HCVRNA水平可以用来诊断HCV感染，监测疾病活性并且监测受试者对治疗的反应。在某些实施例中，给药在此提供的化合物降低了HCVRNA水平。在某些实施例中，以足以降低HCVRNA水平的剂量给药在此的化合物。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括选择具有每毫升血清大于350,000个拷贝、每毫升血清在350,000个与3,500,000个拷贝之间或每毫升血清大于3,500,000个拷贝的HCVRNA水平的受试者。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括降低HCVRNA水平。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括将HCVRNA水平降低至每毫升血清200个拷贝以下、每毫升血清100个拷贝以下或每毫升血清40个拷贝以下。HCVRNA水平可以称为“病毒载量”或“HCVRNA滴度”。
HCVRNA水平的变化可以被描述为对数变化。例如，从60,000下降至600将是HCVRNA水平下降2个对数。在某些实施例中，在此提供的这些方法实现了大于或等于2个对数的HCVRNA水平降低。在某些实施例中，在此提供的这些方法实现了HCVRNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍。
在某些实施例中，在此提供的这些方法包括实现持续的病毒反应。
HCV感染的受试者可能发展HCV相关性疾病。HCV感染的主要肝脏病学后果是肝硬化及其并发症，包括出血、肝功能不全和肝细胞癌。另外的并发症是纤维化，该纤维化是引起细胞外基质组分沉积的慢性炎症的结果，这导致肝架构变形并且阻断微循环和肝功能。随着肝硬化进展和纤维化组织形成，接着发生严重的坏死性炎症活性并且脂肪变性开始。脂肪变性导致肝外病变，包括糖尿病、蛋白质营养不良、高血压、细胞毒素、肥胖以及缺氧。随着纤维化和脂肪变性变得严重，肝将最终衰竭并且需要肝移植。HCV感染的受试者还可能发展肝细胞癌。在某些实施例中，HCV感染的受试者具有HCV相关性疾病。在某些实施例中，该HCV相关性疾病是肝硬化、纤维化、脂肪性肝炎、脂肪变性和/或肝细胞癌。
在某些实施例中，HCV感染的受试者具有一种或多种疾病。在某些实施例中，HCV感染的受试者被除HCV以外的一种或多种病毒感染。在某些实施例中，HCV感染的受试者被人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在此提供的这些化合物可以与一种或多种另外的治疗剂同时给药。在某些实施例中，该一种或多种另外的治疗剂包括：免疫疗法、免疫调节剂、治疗性疫苗、抗纤维化剂、抗炎剂、支气管扩张剂、粘液溶解剂、抗毒蕈碱剂、抗白三烯剂、细胞粘附抑制剂、抗氧化剂、细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、肺表面活性剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗HCV剂、抗癌剂、抗miR-122化合物、RNAi剂或亲环蛋白抑制剂。
在某些实施例中，该一种或多种另外的治疗剂可以选自：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、辅助因子抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、结构蛋白抑制剂、非结构蛋白抑制剂、亲环蛋白抑制剂、进入抑制剂、TLR7激动剂以及干扰素。
在某些实施例中，该另外的治疗剂是具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)的修饰的寡核苷酸，其中后面没有下标的核苷表明β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“L”的核苷表明LNA核苷；并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，治疗剂是GalNAc缀合的CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL(SEQIDNO:7)。在一些实施例中，所有这些CL核苷都是MeCL核苷，其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，该另外的治疗剂选自：蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A抑制剂、核苷NS5B抑制剂、核苷酸NS5B抑制剂、非核苷NS5B抑制剂、亲环蛋白抑制剂以及干扰素。
在某些实施例中，该另外的治疗剂选自：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素αcon-1、聚乙二醇干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a、缓释的干扰素-α-2b、干扰素λ、索菲布韦、利巴韦林、特拉普韦、波普瑞韦、伐尼普韦、阿森那普韦、利托那韦、斯乔布韦、迪卡拉斯他韦、斯密普韦、阿拉泊韦、麦瑞斯他滨、替格布韦、丹诺普韦、索伐普韦以及尼塞普韦。在某些实施例中，该另外的治疗剂选自帕拉德福韦(faldaprevir)、ABT-450、MK-5172、麦瑞斯他滨、雷迪帕韦(ledipasvir)、欧姆比斯他韦(ombitasvir)、GS-5816、MK-8742、达撒布韦(dasabuvir)、BMS-791325以及ABT-072。
在某些实施例中，该另外的治疗剂选自：干扰素、利巴韦林和特拉普韦。在某些实施例中，该干扰素选自：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素αcon-1、聚乙二醇干扰素α-2b以及聚乙二醇干扰素α-2a。
在某些实施例中，该另外的治疗剂包括聚乙二醇干扰素α-2b和利巴韦林。例如，受试者可以接受包含在此提供的化合物、聚乙二醇干扰素α-2b和利巴韦林的疗法。在某些实施例中，该至少一种另外的治疗剂包括聚乙二醇干扰素α-2a和利巴韦林。例如，受试者可以接受包含在此提供的化合物、聚乙二醇干扰素α-2a和利巴韦林的疗法。在某些实施例中，这些另外的治疗剂是欧姆比斯他韦和ABT-450。在某些实施例中，这些另外的治疗剂是阿森那普韦、迪卡拉斯他韦和BMS-791325。在某些实施例中，这些另外的治疗剂是索菲布韦和雷迪帕韦。在某些实施例中，这些另外的治疗剂是MK-8742和MK-5172。
接受特定疗法(例如干扰素或利巴韦林疗法)的某些受试者可能不经历显著的或治疗上有益的HCVRNA水平降低。此类受试者可以获益于给药一种或多种另外的治疗剂。在某些实施例中，在此提供的这些方法的受试者是无反应者。在某些实施例中，受试者是干扰素无反应者。在某些实施例中，受试者是直接作用型抗病毒性无反应者。
在某些实施例中，另外的治疗剂是在治疗HIV感染中使用的抗病毒剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。在某些实施例中，另外的治疗剂是核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)。在某些实施例中，另外的治疗剂是蛋白酶抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是进入抑制剂或融合抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是整合酶抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂选自：依法韦仑、依曲韦林、奈韦拉平、阿巴卡韦、恩曲他滨、替诺福韦、拉米夫定、齐多夫定、阿扎那韦、地瑞那韦、福沙那韦、利托那韦、恩夫韦地、马拉维诺以及雷特格韦。
被HCV感染的受试者可能经历异常肝功能，该异常肝功能通过测量胆红素、白蛋白和凝血酶原时间中的一种或多种来评价。进行这些肝酶(丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST))的测量来评价肝脏炎症。这些标记物的一种或多种异常水平可以表明异常肝功能。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括使肝功能正常化。在某些实施例中，在此提供的这些方法包括使肝酶水平正常化。
在此提供的任何这些方法中，化合物可以存在于药物组合物中。
在此提供的这些化合物可以用于疗法。在某些实施例中，化合物用于治疗HCV感染的受试者。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，用于治疗HCV感染的受试者的化合物可以用于在此描述的任何治疗方法。
在此提供了包括向患有miR-122相关性病状的受试者给药在此提供的化合物的方法。在某些实施例中，miR-122相关性病状是HCV感染。
在某些实施例中，miR-122相关性病状是胆固醇升高。在某些实施例中，向受试者给药抗miR-122化合物引起血清胆固醇降低。因此，在某些实施例中，在此提供了降低受试者的胆固醇的方法，这些方法包括向受试者给药在此提供的化合物。在某些实施例中，胆固醇水平可以单独地或结合另一种效力指示剂(例如，HCVRNA水平降低)用作评价在此提供的抗miR-122化合物的活性的生物标记物。因此，在此提供了包含向受试者给药在此提供的化合物、从该受试者收集血液样品并且测量来自该受试者的血液样品中的胆固醇的方法。胆固醇的水平可以用作该受试者体内的抗miR-122化合物活性的指示剂。
在某些实施例中，miR-122相关性病状是脂肪变性。因此，在某些实施例中，在此提供了减少受试者的脂肪变性的方法，这些方法包括向该受试者给药在此提供的化合物。
在某些实施例中，miR-122相关性病状是铁负载过高病症。铁负载过高病症可以因为引起身体吸收过量铁的基因突变而发生。铁负载过高病症还可以具有非基因病因，包括但不限于长期输血、慢性肝炎或摄入过量铁。在某些实施例中，铁负载过高病症选自输血铁负载过高、膳食铁负载过高、遗传性血色病、镰形细胞贫血病、地中海贫血、伴X染色体的铁粒幼红细胞性贫血、丙酮酸激酶缺乏症以及葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶缺乏症。在某些实施例中，铁负载过高病症是选自以下的遗传性血色病：1型血色病、2A型血色病、2B型血色病、3型血色病、4型血色病(或膜铁转运蛋白疾病)、亚洲血色病、新生儿血色病、遗传性铜蓝蛋白缺乏症以及缺转铁蛋白血。在某些实施例中，向患有铁负载过高病症的受试者给药在此提供的化合物引起该受试者身体体内的过量铁减少。
某些修饰
修饰的寡核苷酸可以包含对核碱基、糖和/或核苷间键联的一种或多种修饰。可以因为希望的特性(例如像细胞摄取增强、对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和性增强以及在核酸酶存在下的稳定性增加)选择修饰的核碱基、糖和/或核苷间键联优先于未修饰的形式。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷。在某些实施例中，修饰的核苷是稳定性核苷。稳定性核苷的一个实例是2’-修饰的核苷。
在某些实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，包含修饰的糖部分的修饰的核苷包含未修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的糖包含修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核苷是2’-修饰的核苷。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含双环糖部分。在某些此类实施例中，该双环糖部分是呈α构型的D糖。在某些此类实施例中，该双环糖部分是呈β构型的D糖。在某些此类实施例中，该双环糖部分是呈α构型的L糖。在某些此类实施例中，该双环糖部分是呈β构型的L糖。
在某些实施例中，该双环糖部分在2'碳原子与4'碳原子之间包含桥联基团。在某些此类实施例中，该桥联基团包含1至8个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含1至4个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含2个或3个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含2个连接的双基团。此类4’至2’糖取代基的实例包括但不限于：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'；4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'及其类似物(参见，例如于2008年7月15日颁予的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见，例如于2009年1月8日公布的WO2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如于2008年12月11日公布的WO2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如于2004年9月2日公布的US2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见，于2008年9月23日颁予的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如查多帕迪亚亚(Chattopadhyaya)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，2009，74，118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，于2008年12月8日公布的公布PCT国际申请WO2008/154401)。
在某些实施例中，此类4’至2’桥联独立地包含1个或2至4个连接的基团，这些连接的基团独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
其中：
X是0、1或2；
n是1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。在某些实施例中，双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(又称为约束的乙基或cEt)；(G)亚甲基硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH2-OMe-2’)BNA以及(K)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA。
其中Bx是核碱基部分，并且R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-、S-或N(Rm)-烷基；O-、S-或N(Rm)-烯基；O-、S-或N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团或取代或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可以进一步被独立地选自以下的一个或多个取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羰基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH＝CH2、O-CH2-CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙酰胺(O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷是4’-硫代修饰的核苷。在某些实施例中，2’-修饰的核苷是4’-硫代-2’-修饰的核苷。4’-硫代修饰的核苷具有β-D-核糖核苷，其中4’-O被4’-S替代。4'-硫代-2'-修饰的核苷是2'-OH置换为2'-取代基的4'-硫代修饰的核苷。适合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一种或多种核苷间修饰。在某些此类实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，修饰的核苷间键联包含磷原子。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，修饰的核苷间键联不包含磷原子。在某些此类实施例中，核苷间键联由短链烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由环烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由混合的杂原子与烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由混合的杂原子与环烷基核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由一个或多个短链杂原子核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联由一个或多个杂环核苷间键联形成。在某些此类实施例中，核苷间键联具有酰胺骨架。在某些此类实施例中，核苷间键联具有混合的N、O、S和CH2组分部分。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核碱基选自7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的核碱基包含多环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含三环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含吩嗪衍生物。在某些实施例中，该吩嗪可以进一步被修饰以形成本领域中称为G-夹的核碱基。
在某些此类实施例中，该化合物包含具有一个或多个稳定性基团的修饰的寡核苷酸，该一个或多个稳定性基团连接至修饰的寡核苷酸的一个或两个末端以增强例如像核酸酶稳定性的特性。稳定性基团中包括帽结构。这些末端修饰保护修饰的寡核苷酸免受核酸外切酶降解，并且可以帮助递送和/或定位在细胞内。该帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或可以存在于这两个末端上。帽结构包括例如反向脱氧无碱基帽。
适合的帽结构包括：4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏式呋喃戊糖基核苷酸、无环3',4'-开环核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向无碱基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥联的甲基磷酸酯部分和非桥联的甲基磷酸酯部分5'-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、5'-5'-反向核苷酸部分、5'-5'-反向无碱基部分、5'-氨基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-氨基、桥联和未桥联的5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯以及5'-巯基部分。
某些合成方法
可以使用本领域中已知的自动化固相合成方法来制得修饰的寡核苷酸。在固相合成过程中，亚磷酰胺单体依次与共价连接至固体载体上的核苷偶联。此核苷是该修饰的寡核苷酸的3’末端核苷。典型地，该偶联循环包括四步：脱三苯甲基(用酸去除5’-羟基保护基团)、偶联(将活化的亚磷酰胺连接至载体结合的核苷或寡核苷酸)、氧化或硫化(用氧化剂或硫化剂转化新形成的亚磷酸三酯)，并且加帽(乙酰化未反应的5’-羟基)。在最后的偶联循环之后，使该固体载体结合的寡核苷酸经受脱三苯甲基步骤，接着是裂解和去保护步骤，该裂解和去保护步骤同时使寡核苷酸从固体载体上释放并且使保护基团从碱基上去除。通过过滤去除固体载体，浓缩滤液并且测试所得到的溶液的特性和纯度。然后例如使用填充有阴离子交换树脂的柱来纯化寡核苷酸。
可以使用与产生未缀合的寡核苷酸的固相合成类似的自动固相合成来制得GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸。在合成GalNAc缀合的寡核苷酸过程中，这些亚磷酰胺单体依次与共价连接至固体载体上的GalNAc缀合物偶联。GalNAc缀合物和GalNAc缀合物固体载体的合成例如在美国专利号8,106,022和国际申请公开号WO2013/033230中描述，为了描述含碳水化合物的缀合物(包括包含一个或多个GalNAc部分的缀合物)的合成和共价连接至固体载体上的缀合物的合成，每个这些参考文件通过引用以其全部内容结合在此。
某些药物组合物
在此提供的任何这些化合物都可以制备成药物组合物。在某些实施例中，以剂量单位(例如，片剂、胶囊、大丸剂等等)的形式给药药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含选自以下的范围内的剂量的在此提供的化合物：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg以及400mg至600mg。在某些实施例中，此类药物组合物包含以选自以下的剂量存在的在此提供的化合物：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg以及800mg。在某些此类实施例中，药物组合物包含选自以下的剂量的在此提供的化合物：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg以及800mg。
在某些实施例中，药物组合物包含在以下剂量下给药的在此提供的化合物：10mg/kg或更少、9mg/kg或更少、8mg/kg或更少、7.5mg/kg或更少、7mg/kg或更少、6.5mg/kg或更少、6mg/kg或更少、5.5mg/kg或更少、5mg/kg或更少、4.5mg/kg或更少、4mg/kg或更少、3.5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、2.5mg/kg或更少、2mg/kg或更少、1.5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.75mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.25mg/kg或更少。
在某些实施例中，药剂是用适合的稀释剂(例如，注射用无菌水或注射用无菌盐水)复原的无菌冻干化合物。在稀释到盐水中之后，复原的产品以皮下注射或静脉内输注形式给药。冻干的药物产品由化合物组成，该化合物已在注射用水中或在注射用盐水中制备，在制备过程中用酸或碱调节至pH7.0-9.0，并且然后冻干。冻干的化合物可以是25mg至800mg的寡核苷酸。应当理解，这涵盖了25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg以及800mg的修饰的冻干寡核苷酸。此外，在一些实施例中，冻干的化合物以在以下范围内的量存在：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg、或400mg至600mg。冻干的药物产品可以被包装在2mLI型透明玻璃小瓶(经过硫酸铵处理的)中，用溴丁基橡胶封闭件塞住并且用铝密封件密封。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含治疗有效量的化合物。在某些实施例中，该治疗有效量足以预防、缓解或改善疾病的症状或延长正治疗的受试者的存活期。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力之内。
在某些实施例中，在此提供的这些药物组合物可以另外包含其他本领域熟知用量的在药物组合物中常规存在的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包含另外的、可相容的药物活性材料，例如像止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含对物理配制本发明的这些组合物的各种剂型有用的另外的材料，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类材料时，它们不应当过度干扰本发明的这些组合物的组分的生物活性。可以对这些配制品进行灭菌并且必要时与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的这个或这些寡核苷酸发生有害的相互作用。
脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在一个方法中，核酸被引入到预形成的脂质体或由阳离子性脂质与中性脂质的混合物制成的脂质复合物中。在另一个方法中，在没有中性脂质存在的情况下形成与单阳离子性脂质或聚阳离子性脂质的DNA复合物。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向脂肪组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向肌肉组织的分布。
在某些实施例中，使用英脱利匹特(INTRALIPID)来制备包含寡核苷酸的药物组合物。英脱利匹特是制备用于静脉内给药的脂肪乳液。它由10％大豆油、1.2％蛋黄磷脂、2.25％甘油以及注射用水组成。另外，添加氢氧化钠以调节pH使得最终产品pH范围是6至8.9。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含聚胺化合物或与核酸复合的脂质部分。此类制备描述在PCT公布WO/2008/042973中，为了披露脂质制备该文献通过引用以其全部内容结合在此。某些另外的制备描述在埃克里克(Akinc)等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)26，561-569(2008年5月1日)中，为了披露脂质制备，该参考文件通过引用以其全部内容结合在此。
在某些实施例中，在此提供的多种药物组合物包含一种或多种化合物和一种或多种赋形剂。在某些此类实施例中，赋形剂选自：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物使用已知的技术，包括但不限于混合、溶解、造粒、制糖丸、粉碎、乳化、囊封、截留或压片工艺来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是液体(例如，混悬液、酏剂和/或溶液)。在某些此类实施例中，液体药物组合物使用本领域已知的成分，包括但不限于水、二醇、油、醇、芳香剂、防腐剂以及着色剂来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是固体(例如，散剂、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施例中，包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物使用本领域已知的成分，包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂以及崩解剂来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物被配制成储积型(depot)制剂。某些此类储积型制剂典型地比非储积型制剂作用更长。在某些实施例中，此类制剂通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来给药。在某些实施例中，储积型制剂使用适合的聚合材料或疏水材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物(例如作为微溶性盐)来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳液。某些递送系统适用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的那些组合物。在某些实施例中，使用了某些有机溶剂，如二甲亚砜。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含被设计成将在此提供的一种或多种化合物递送至特定组织或细胞类型的一种或多种组织特异性递送分子。例如，在某些实施例中，药物组合物包括涂有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水不可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施例中，此类共溶剂系统用于疏水化合物。这种共溶剂系统的一个非限制性实例是VPD共溶剂系统，该VPD共溶剂系统是包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。此类共溶剂系统中的比例可以在不显著改变它们的溶解性和毒性特征的情况下大幅度改变。此外，共溶剂组分的特性可以改变：例如，可以使用其他表面活性剂代替聚山梨醇酯80TM；聚乙二醇的部分大小可以改变；其他生物可相容聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含持续释放系统。这种持续释放系统的一个非限制性实例是固体疏水聚合物的半渗透基质。在某些实施例中，持续释放系统可以取决于它们的化学性质在数小时、数天、数周或数月的时间里释放药剂。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物被制备用于口服给药。在某些此类实施例中，药物组合物通过将包含修饰的寡核苷酸的一种或多种化合物与一种或多种药学上可接受的载剂组合来配制。某些此类载剂能够使药物组合物配制成用于由受试者口服摄入的片剂、大丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、混悬剂等。在某些实施例中，用于口服使用的药物组合物通过将寡核苷酸与一种或多种固体赋形剂混合来获得。适合的赋形剂包括但不限于：填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如像玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施例中，任选地研磨这种混合物并且任选地添加助剂。在某些实施例中，使药物组合物成形以获得片剂或糖衣丸芯。在某些实施例中，添加崩解剂(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠)。
在某些实施例中，糖衣丸芯具有涂层。在某些此类实施例中，可以使用浓缩的糖溶液，这些浓缩的糖溶液可以任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸涂层中。
在某些实施例中，用于口服给药的药物组合物是由明胶制成的推入配合胶囊。某些此类推入配合胶囊包含与一种或多种填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或乳化剂如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳定剂相混合的本发明的一种或多种药剂。在某些实施例中，用于口服给药的药物组合物是由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。在某些软胶囊中，本发明的一种或多种药剂被溶解或悬浮在适合的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于经颊给药。某些此类药物组合物是以常规方式配制的片剂或锭剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)来给药。在某些此类实施例中，药物组合物包含载剂并且被配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液(Hanks'ssolution)、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或生理盐水缓冲液。在某些实施例中，包括其他成分(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施例中，使用适当的液体载剂、悬浮剂等来制备可注射混悬液。某些注射用药物组合物以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中。某些注射用药物组合物是油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于：亲脂性溶剂和脂肪油，如芝麻油；合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；以及脂质体。水性注射混悬液可以包含增加该混悬液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，此类混悬液还可以包含适合的稳定剂或增加药剂溶解性以允许制备高浓度溶液的试剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于透粘膜给药。在某些此类实施例中，在配制品中使用了适合于透过屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的。
在某些实施例中，在此提供的一种或多种修饰的寡核苷酸以前药形式给药。在某些实施例中，当体内给药时，前药以化学或酶促方式转化为寡核苷酸的生物学上、药学上或治疗上更有活性的形式。在某些实施例中，前药是有用的，因为它们比对应的活性形式更容易给药。例如，在某些情况下，前药可以是比对应的活性形式更具有可生物利用性(例如，通过口服给药)。在某些实施例中，前药具有优良的跨细胞膜传输。在某些实施例中，前药有利于修饰的寡核苷酸递送至所希望的细胞类型、组织或器官。在某些实施例中，前药是包含缀合的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施例中，与对应的活性形式相比，前药可以具有提高的溶解性。在某些实施例中，前药比对应的活性形式的水溶性小。在某些实施例中，前药是酯。在某些此类实施例中，当给药时，该酯被代谢水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物是对应的活性形式。在某些实施例中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施例中，当给药时，该肽裂解以形成对应的活性形式。在某些实施例中，通过修饰药物活性化合物以使得该活性化合物在体内给药时将再生来产生前药。该前药可以被设计成改变药物的代谢稳定性或运输特征，掩蔽副作用或毒性，改进药物的香味或改变药物的其他特征或特性。凭借体内的药物动力学过程和药物代谢的知识，本领域技术人员一旦已知药物活性化合物，就可以设计该化合物的前药(参见，例如诺甘地(Nogrady)(1985)药物化学A生物化学方法(MedicinalChemistryABiochemicalApproach)，牛津大学出版，纽约，第388-392页)。
某些给药途径
在某些实施例中，向受试者给药包括肠胃外给药。在某些实施例中，向受试者给药包括静脉内给药。在某些实施例中，向受试者给药包括皮下给药。
在某些实施例中，向受试者给药包括动脉内、肺部、口服、直肠、透粘膜、肠内、小肠内、局部、透皮、栓剂、鞘内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肌肉内、髓内以及瘤内给药。
某些miR-122试剂盒
本发明还提供了试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含在此提供的一种或多种化合物。在一些实施例中，在此提供的化合物存在于小瓶内。在例如分配包装中可以存在多个小瓶，如10个。在一些实施例中，小瓶制造成注射器可接近。试剂盒还可以包含在此提供的这些化合物的使用说明书。
在一些实施例中，这些试剂盒可以用于向受试者给药在此提供的化合物。在此类情况下，除了包含在此提供的至少一种化合物以外，该试剂盒可以进一步包括以下中的一个或多个：注射器、酒精棉签、棉球和/或纱布垫。在一些实施例中，与miR-122互补的这些化合物可以存在于预填充注射器(如具有例如带针保护器的27号、1/2英寸针头的单剂量注射器)中，而不是小瓶中。在例如分配包装中可以存在多个预填充注射器，如10个。试剂盒还可以包含在此提供的化合物的给药说明书。
某些实验模型
在某些实施例中，本发明提供了在实验模型中使用和/或测试在此提供的化合物的方法。本领域技术人员能够选择和修改用于这些实验模型的方案以评估在此提供的化合物。
在给药抗miR化合物之后反义抑制微小RNA的作用可以通过本领域已知的各种方法来评价。在某些实施例中，这些方法用来定量体外或体内细胞或组织中的微小RNA水平。在某些实施例中，通过微阵列分析来测量微小RNA水平的变化。在某些实施例中，通过若干商业上可获得的PCR测定之一如微小RNA测定(应用生物系统，生命科技品牌)来测量微小RNA水平的变化。
可以使用荧光素酶细胞培养测定来评价抗miR化合物的体外活性。在这个测定中，微小RNA荧光素酶传感器构建体被工程改造成包含融合至荧光素酶基因的相关微小RNA的一个或多个结合位点。当微小RNA结合该荧光素酶传感器构建体中它的同源位点时，荧光素酶表达被压制。当将适当的抗miR引入到细胞中时，它结合靶微小RNA并且解除荧光素酶表达的压制。因此，在这个测定中，作为相关微小RNA的有效抑制剂的抗miR将引起荧光素酶表达增加。
可以通过测量微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质水平来评价抗miR化合物的活性。微小RNA结合一个或多个靶RNA内的互补位点，导致靶RNA被压制，因此抑制微小RNA引起该微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质的水平增加(即，去阻抑)。可以在体内或体外测量一个或多个靶RNA的去阻抑。例如，miR-122的靶标是醛缩酶A(ALDOA)。抑制miR-122引起ALDOAmRNA的水平增加，因此ALDOAmRNA水平可以用来评估抗miR-122化合物的抑制活性。
可以在HCV复制子测定中测量抗miR-122化合物对HCV复制的作用。在这个测定中，化合物被引入到细胞系(例如，人肝细胞癌细胞系)中，该细胞系包含具有稳定的荧光素酶报道体和三个细胞培养适应突变(luc-ubi-neo/ET)的HCV的亚基因组复制子。该荧光素酶报道体用作HCV复制的间接指标。所使用的复制子可以是亲本HCV基因型或具有赋予抗病毒剂抗性的突变的HCV基因型。可以单独地或与用于治疗HCV感染的其他药剂组合来评估抗miR-122化合物。在一些实施例中，可以在体内或体外测定中测试修饰的寡核苷酸，并且随后缀合以形成用于在此描述的这些方法中使用的化合物。
实例
提出以下实例以便更完全地说明本发明的一些实施例。然而，这些实例决不应当解释为对本发明的宽泛范围的限制。本领域普通技术人员将易于在不背离本发明的精神的情况下，采用本发现的基本原理来设计各种化合物。
实例1：抗miR-122化合物的设计和评估
为了鉴定miR-122的有效抑制剂，设计和合成了许多抗miR-122修饰的寡核苷酸。这些修饰的寡核苷酸在长度以及在双环核苷和非双环核苷的数目、位置以及特性上不同。在许多测定中评估这些化合物以鉴定出作为适用于治疗HCV感染的治疗剂的抗miR。以反复的方式进行这些化合物的评估，其中通过设计变化进一步优化高度活性的化合物，并且接着使得到的化合物受到另外的筛选。化合物评估过程包括评价效力、安全性以及物理化学特征。
在第一荧光素酶细胞培养活性测定中，总共设计和测试了超过400种抗miR-122修饰的寡核苷酸。在另一个荧光素酶测定之后并且为了测量某些化合物的代谢稳定性，选择大约70种这些化合物用于进一步体内测试。这70种化合物中大约有10种化合物被鉴定为具有适合的体内效力(例如，小于5mg/kg的ED50)。这些化合物的一个子集被鉴定为在啮齿动物和非人灵长类动物中具有特定的安全性特征。因此，筛选的数百种化合物中，仅初始超过400种化合物中的一个小子集满足某些效力、安全性以及物理化学标准。
某些抗miR-122化合物在表A中示出。“miR-122上的位置”是从5’末端SEQIDNO:1计数，在该列中的核苷与SEQIDNO:1互补的位置。
糖部分指明如下：后面没有下标的核苷表明β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷表明2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷表明S-cEt核苷；后面有下标“L”的核苷表明LNA核苷。每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。上标“Me”表明在核苷的碱基上的5-甲基基团。
效力
体外和体内效力
使用体外荧光素酶测定来测量每种化合物抑制细胞培养物中的miR-122的活性的能力。在这个测定中，对微小RNA荧光素酶传感器构建体进行工程改造以包含融合至荧光素酶基因的多个miR-122结合位点。当miR-122结合该荧光素酶传感器构建体中它的靶位点时，荧光素酶表达被压制。当将活性抗miR-122化合物引入到细胞中时，它结合miR-122并且解除荧光素酶表达的压制。因此，在这个测定中，作为miR-122的有效抑制剂的抗miR-122化合物将引起荧光素酶表达增加。
将荧光素酶传感器构建体和表达miR-122的第二构建体引入到海拉细胞(Helacell)中。将若干不同浓度的抗miR-122化合物转染到细胞中。使具有小于100nM的EC50的化合物经受另一个荧光素酶测定(抗miR浓度的范围比初始荧光素酶测定宽)来证实活性。如在表B中所指明，在两个分开的实验中测试化合物。每种化合物的平均EC50在表B中示出。结果证明了糖部分或核碱基的改变可以影响抗miR-122化合物的体外效力。
表B：荧光素酶细胞培养测定中的平均EC50
为了确定体内效力，评估某些化合物使通常受到miR-122活性压制的基因肝脏醛缩酶A(ALDOA)表达去阻抑的能力。抑制miR-122导致ALDOA表达增加，因此ALDOAmRNA水平可以用来测量体内的miR-122抑制活性。在表C指明的量下以单次剂量向小鼠给药化合物，并且在研究终止7天后，通过定量PCR测量从肝脏分离的RNA中的ALDOAmRNA水平。除了化合物38910以外，在同一研究中测试表C中的每种化合物。相对于盐水，计算ALDOAmRNA的倍数变化以确定体内效力(“ND”表明“未确定”)。
表C：抗miR-122化合物结构和效力的比较
如在表C中可以看出，糖部分或核碱基的位置的单一变化可以对体内效力具有影响。例如，38872与38011之间仅有的差异是cEt糖部分的位置，然而0011的体内效力显著低于38872的体内效力，其中相当水平的ALDOA去阻抑仅在38011的较高剂量10mg/kg下达到，相比之下化合物38872的剂量为3mg/kg。相对于38016，化合物38021具有LNA代替cEt糖部分，并且具有与38016类似的效力，因此这种差异不影响效力。在这组化合物中，化合物38012、38016、38021和38872被鉴定为活性化合物。
进行另外的研究以评估某些另外的抗miR-122化合物。这些研究的结果在表D中示出。在一个体内研究中一同测试了化合物38646、38647、38648、38649、38650、38651和38652，并且在另一个体内研究中一同测试了化合物38659和38660。
表D：抗miR-122化合物结构和效力的比较
如上，这些数据说明了糖部分的位置的单一变化可以对体内效力具有相当大的影响。此外，表明体外和体内效力不一定相关。例如，化合物38659具有低体外效力，但确是体内miR-122的非常有效的抑制剂。
抗miR-122化合物结构和体内效力的比较揭示与一组活性抗miR-122共有的11个核苷的核心序列。这个核心序列(其中B-D-脱氧糖部分和双环糖部分位于抗miR-122核苷酸序列上的相同位置)在表D-2中突出显示。具有该11个核苷核心的核碱基序列与miR-122(SEQIDNO:1)的核碱基2至12互补。
这些数据说明了产生体内miR-122的有效抑制剂的某一核心核苷型态的发现。
HCV复制子研究
使用HCV复制子测定来确定抗miR-122化合物抑制HCV(包括亲本HCV基因型和具有赋予抗病毒剂抗性的突变的HCV基因型)复制的能力。在这个测定中测试化合物38649以确定它抑制基因型1a(H77病毒株)、基因型1b以及基因型1b的若干变体(A156T、A156S、D168a和V36M)的HCV亚基因组复制子复制的能力。
针对这个测定，使用的细胞系是细胞系ET，一种包含具有稳定的荧光素酶报道体和三个细胞培养适应性突变的HCV的亚基因组复制子(luc-ubi-neo/ET)的Huh7人肝细胞癌细胞系。荧光素酶报道体用作HCV复制的间接指标。HCV复制子抗病毒评估测定检验处于每种化合物6次半对数浓度的化合物的作用。纳入人干扰素α-2b作为阳性对照化合物。将ET系的亚融合培养物铺放到96孔板中，并且第二天用阳离子性脂质将抗miR-122化合物转染到细胞中。72小时后在这些细胞仍然是亚融合时对细胞进行处理。HCV复制子水平被评价为HCVRNA复制子产生的荧光素酶活性。计算每种HCV基因型的EC50(观察到50％抑制时的浓度)，并且在表E中示出。还计算了选择性指数(SI50，病毒复制的EC50与固有细胞毒性的EC50的比率)并且在表E中示出。
表E：化合物38649的抗病毒活性
来自该复制子测定的结果证明了化合物38649针对多种HCV基因型的抗病毒活性。该抗病毒活性持续该测定进行的时间段(18天)。化合物38649的活性针对包含已知对治疗HCV感染开处的某些蛋白酶抑制剂有抗性的突变的HCV复制子同样有效。
抗miR-122的单一剂量研究
在小鼠中，在单一剂量研究中测试化合物38649以确定在0.3mg/kg至30mk/kg范围内的剂量下的作用起效、最大靶标去阻抑以及作用持续时间。也从这个研究中计算出ED50。
向每组5只小鼠腹膜内给药0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量的抗miR化合物。针对0.3mg/kg和1.0mg/kg剂量，各组动物在第3天、第7天和第28天处死。针对3.0mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量，各组动物在第3天、第5天、第7天、第14天、第21天和第2838649天处死。通过定量PCR来测量肝脏中的ALDOAmRNA水平，并且与盐水处理过的小鼠的肝脏中的ALDOAmRNA水平进行比较来计算ALDOA表达的倍数变化。
如在图1A中所示，早在第3天就观察到ALDOA去阻抑，并且在给予化合物38649之后维持多于28天。最大靶标去阻抑在10mg/kg下达成。从第7天的数据计算出6.7mg/kg的ED50(图1B)。
物理化学特征
物理化学特征的评估可以包括：测量粘度，确定抗miR的溶液是否适合用于经由某些类型的肠胃外给药来进行给药，例如皮下给药；计算肝脏中的抗miR半衰期，以便估计在人受试者中可以给药抗miR-122化合物的频率；以及代谢稳定性测定，以鉴定可能易受核酸酶裂解的化合物。
通过将抗miR-122化合物与非人灵长类动物肝脏溶胞产物一起孵育来评估代谢稳定性。通过使用参比寡核苷酸来证实肝脏组织匀浆中的核酸酶活性，这些参比寡核苷酸包括对核酸酶活性具有已知抗性的化合物，易受3’-核酸外切酶活性影响的化合物以及易受核酸内切酶活性影响的化合物。使用内标物化合物来控制萃取效率。在0小时和24小时时间点，对每个样品进行高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC-TOFMS)以测量寡核苷酸长度和量。通过在0小时和24小时时间点比较全长化合物的量来确定损失百分比。化合物38646、38647、38648、38649、38650、38651、38652、38659和38660在24小时时间点展示出10％或更少的损失百分比。化合物38012在24小时时间点展现出大约50％的损失百分比。
在小鼠中进行另一个单一剂量研究来估计化合物38649的半衰期。估计肝脏中的半衰期为至少两周。
安全性
为了评价各种安全性参数，针对某些在此描述的化合物在啮齿动物体内进行体内研究来评估这些化合物引发促炎性反应的潜力。评价的参数包括：器官重量变化，如脾重量和肝重量；和肝脏中的干扰素诱导基因的表达，如IFIT和OASL。还评估了血清化学性质。另外，针对某些化合物，在非人灵长类动物中评估了安全性参数，并且包括血液学端点、血清化学性质、器官重量、凝结、补体激活、细胞因子/趋化因子变化以及促炎性基因表达。
虽然这些测试的化合物在评估的这些安全性参数之中展现出一些可变性，但是发现若干化合物(包括化合物38649)具有特别适合的安全性特征。
实例2：缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸
将抗miR-122修饰的寡核苷酸缀合至含GalNAc的部分上，以确定该缀合是否将提高这些寡核苷酸的效力。
通过将图2中的结构缀合至38649修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含GalNAc的化合物。该含GalNAc的部分与38649的3’-末端之间的键联有所不同，如在表F-1中所示。例如，在化合物38368中，该含GalNAc的部分通过磷酸二酯键直接连接至38649的3’-末端核苷上，如在图3C中所示，其中X是磷酸二酯键并且MO是化合物38649。在化合物38458中，该含GalNAc的部分通过β-D-脱氧核苷连接至38649的3’-末端核苷上，其中在38649的3’-末端核苷之间具有硫代磷酸酯键并且在该β-D-脱氧核苷与该含GalNAc的部分之间具有磷酸二酯键，如在图3A中所示，其中X2是硫代磷酸酯键，m是1，Nm是β-D-脱氧核苷，X1是磷酸二酯键，并且MO是化合物38649。
表F-1：含GalNAc的化合物
评价GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸的体内效力，未缀合的修饰的寡核苷酸从该GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸的释放以及肝脏和组织浓度。
根据以上描述的用来评估这些未缀合的修饰的寡核苷酸的方案来进行效力研究。将化合物注射到小鼠体内，并且在第7天通过测量ALDOA的去阻抑来评价体内效力。缀合化合物的剂量表明所给药的修饰的寡核苷酸的剂量。
如在图4中所示，测试的这三种GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸中的每一种都比未缀合的修饰的寡核苷酸更有效。相对于未缀合的38649，化合物38368和38371展现出效力增加大约3倍(图4A)。化合物38458和38459(每种化合物均具有β-D-脱氧核糖核苷连接基团)展现出效力增加至少10倍(图4B)。化合物38597和38598(每种化合物均具有2’-糖修饰的连接基团)也展现出效力增加至少10倍(图4C)。在另外的研究中，针对化合物38459、38458、38597和38598，已观察到效力增加高达20倍。
进行另一个实验以包括更宽范围的化合物38459的剂量。向小鼠给药化合物38459(n＝6)或化合物38649(n＝3)，并且七天后测量肝脏中的ALDOA水平和血液中的胆固醇水平。计算平均ALDOA和胆固醇水平并且在表F-2中示出。如在表F-2中所示，关于增加ALDOA水平和降低胆固醇水平，化合物38459的单次皮下剂量展示出相对于未缀合的化合物38649效力有所增加。在这个实验中，化合物38459的计算ED50是0.19mg/kg，并且化合物38649的计算ED50是3.5mg/kg(效力相差18倍)。
表F-2：缀合的抗miR-122化合物的效力增加
还测量了在1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38368和38371以及在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38458和38459第7天后的肝脏和肾脏组织中的未缀合的修饰的寡核苷酸的量。对每个样品进行高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC-TOFMS)以测量寡核苷酸长度和量。由这种方法定量的下限(LLOQ)是0.2μg/g至1.0μg/g。
发现这些GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸具有不同的未缀合的修饰的寡核苷酸的形成速率。例如，在给药化合物38368之后，在肝脏中检测到小于10％的化合物38649(一种未缀合的修饰的寡核苷酸)。在给药化合物38371之后，在化合物38371的任一剂量下，在肝脏中都检测不到化合物38649。相反地，在皮下给药化合物38459七天后，仅检测到的未缀合的修饰的寡核苷酸种类是未缀合的38649；未检测到母体化合物38459。在给药化合物38458之后，检测到两种形式的未缀合的修饰的寡核苷酸：38649以及38649-PO-A(化合物38458的一种代谢物)。在高于未缀合的38649的水平处检测到这种代谢物。
还测量了在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38458和38459之后24小时肝脏中的未缀合的修饰的寡核苷酸的量。通过LC-TOF测量抗miR水平。由这种方法定量的下限(LLOQ)是0.2μg/g至1.0μg/g。观察到在给药化合物38459之后，存在于肝脏中的总化合物的90％是未缀合的化合物38649。在给药38458之后，存在于肝脏中的总化合物的大约46％是未缀合的化合物38649。因此，未缀合的化合物38649从化合物38459的释放从化合物38458的释放快。这些数据表明缀合的化合物的代谢作用受接头与修饰的寡核苷酸之间的连接影响。
寡核苷酸一般在肾脏组织中的积累水平最高，接着是肝脏组织。关于未缀合的化合物，为了确定GalNAc缀合物相比于肾脏组织是否改变了化合物在肝脏组织中的积累，还测量了肾脏组织中未缀合的38649的量。如上所述，在给药化合物38459之后，在肝脏中发现的总化合物的100％都是未缀合的38649，这表明38649从该GalNAc缀合的化合物38459中完全释放。在给药化合物38459之后，关于给药化合物38649之后化合物38649的积累，与肝脏相比化合物38649在肾脏中积累较少(即展现出较低的肾脏:肝脏比率)。因此，与未缀合的38649相比，38459可以优先将化合物38649递送至肝脏，同时使向肾脏的递送减至最少。
在体内研究中评估了化合物38459的作用的起效和持续时间。给予各组小鼠0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的化合物38459的单次皮下(SC)剂量。对另一组小鼠给药10mg/kg剂量的化合物38649。来自每种治疗的一组动物在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第14天、第21天、第28天和第56天的每一天处死。从肝脏中分离出RNA，并且通过实时PCR测量ALDOAmRNA水平。计算每组的平均ALDOA水平。相对于对照组(PBS处理过的)的倍数变化在表G中示出。
表G：化合物38459的作用的起效和持续时间
表G中的数据证明化合物38459以及化合物38649具有快速的作用起效，如通过早在单次给予化合物1天后的ALDOA去阻抑所证实。另外，在单次给予化合物之后，ALDOA去阻抑维持至少8周。
这些数据证明：效力比未缀合的38649化合物高至少10倍的GalNAc缀合的化合物38459在显著更低的肝脏组织浓度下即可实现这种效力，其中优先递送至肝脏组织。另外，化合物38459展现出快速的作用起效和至少8周的作用持续时间。
还测试了在表H中示出的含LNA的未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸。
表H：含LNA的化合物
糖和键联部分指明如下：其中后面没有下标的核苷表明β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“L”的核苷表明LNA核苷；并且每个核苷间键联是一种硫代磷酸酯核苷间键联。
根据与以上所述相同的方案测试化合物36848和36852的体内效力，以评估这些化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表达的能力。虽然每种化合物均是miR-122的有效抑制剂，但是GalNAc缀合的化合物36852展现出比未缀合的化合物36848高的效力(大约高3倍)。
根据与以上所述类似的方案，在0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg和10.0mg/kg的剂量下，在单一剂量给药研究中还测试了化合物36632的体内效力。相对于PBS处理过的对照，化合物36632证明ALDOA表达分别增加1.6、2.7、3.7、4.3、4.7、6.0倍。在1.0mg/kg、3.0mg/kg和10mg/kg的剂量下，化合物36848引起ALDOA表达分别增加1.6、2.5和5.3倍。相对于未缀合的化合物，对于缀合的化合物而言，化合物36632与化合物36848的比较揭示效力增加大约30倍。
实例3：HCV感染的小鼠模型
由于宿主病原体特异性，HCV仅可以感染人和黑猩猩。因此，典型地用于体内研究实验的较小物种(如小鼠)不能被HCV感染用来测试用于治疗HCV感染的候选药剂。为了解决这个问题，可以使用人肝脏嵌合小鼠模型(参见，例如毕思吉(Bissig)等人，美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)，2007，104：20507-20511；毕思吉等人，临床研究杂志(JClinInvest.)，2010，120：924-930)。在这个模型中，用人肝细胞重新填充免疫缺陷的小鼠的肝脏，产生大多数肝细胞是人肝细胞的嵌合肝脏。然后用HCV感染该小鼠并且用抗HCV剂治疗。这个小鼠模型可以从例如PhoenixBio商购获得。
在具有已被感染HCV的人嵌合肝脏的小鼠中测试抗miR-122化合物。各组动物(n＝5-10)接受一个或多个剂量的抗miR-122化合物，例如在由治疗方案研究确定剂量下。为了药物动力学分析和测量HCVRNA水平，在不同时间点收集血浆。当研究终止时，收集肝脏组织。
在一些实施例中，通过测量人ALDOAmRNA水平来证实miR-122的抑制。预料到，给药抗miR-122化合物降低小鼠血清中的HCVRNA水平。
实例4：响应于miR-122抑制的HCVRNA水平降低
使用人嵌合小鼠肝脏模型来评估miR-122抑制对miR-122靶基因表达和HCV病毒滴度的影响。
人嵌合肝脏小鼠
在不具有HCV感染的人嵌合肝脏小鼠中评估miR-122抑制对靶基因表达的影响。用单次剂量的PBS、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg或10mg/kg的化合物38459处理各组小鼠(n＝6)。处理七天后，终止研究并且收集肝脏组织用于测量ALDOA表达和化合物组织浓度。相对于PBS处理过的小鼠中的ALDOAmRNA水平，ALDOAmRNA水平有所增加，然而，ALDOA表达的去阻抑比在野生型小鼠中观察到的ALDOA表达的去阻抑低3倍至5倍。相对于野生型小鼠中的浓度，嵌合肝脏小鼠中的化合物38459水平低3倍。相对于野生型小鼠，这些观察与人嵌合肝脏小鼠中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的表达减少一致。因为化合物在肝脏细胞中的积累是取决于ASGPR的摄取，所以ASGPR的表达减少预料将引起GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸积累减少和因此对化合物38459去阻抑miR-122的内源性靶标(如ALDOA)的能力的敏感性降低。因此，该人嵌合肝脏小鼠模型可能低估ASGPR表达得到维持的受试者体内化合物38459的活性。初步数据表明：相对于未受HCV感染的受试者的肝脏，HCV感染的患者的肝脏中ASGPR表达维持在类似水平。
HCV感染的人嵌合肝脏小鼠的处理
在HCV感染的人嵌合肝脏小鼠模型中测试抗miR-122化合物。用人肝细胞重新填充免疫缺陷的小鼠的肝脏，产生大多数肝细胞是人肝细胞的嵌合肝脏。在用HCV基因型1a接种之后大约3.5周，选择HCVRNA水平>1×106个拷贝/毫升的小鼠用于包括在本研究中(第-7天)。
针对单周研究，在第0天用单次10mg/kg剂量的38459处理一组3只动物。在第-7天、第0天、第3天和第7天收集血液。当除了血液以外还收集肝脏组织和肾脏组织时，在第7天终止该研究。在这个研究中，HCVRNA水平在第3天和第7天降低。
针对多周研究，每组5只动物如下处理：PBS(n＝5)；3mg/kg38459(n＝5)；10mg/kg38459(n＝4-5)；或30mg/kg38459(n＝4-5)。用10mg/kg未缀合化合物36848处理另一组动物(n＝5)。在第0天给药单次皮下注射处理。在第-7天、第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第24天、第28天和第35天收集血液。根据常规方法通过实时PCR来测量血液中的HCVRNA水平，并且在表I中示出。除非另外指明，否则每个治疗组包含5只动物。如在表I中所示，早在第3天，在用10mg/kg或30mg/kg的化合物38459处理的组中，HCVRNA水平显著降低，该降低持续直到至少第35天。通过归一化为PBS处理的动物中的平均HCVRNA水平的化合物处理的动物中的平均HCVRNA水平的双向ANOVA分析来计算统计显著性。在本研究中，未缀合的化合物36848没有降低HCVRNA水平。这些结果还以图形形式在图5A中图示。
表I：GalNAc缀合的抗miR-122减小HCV滴度
****p<.0001；***p<0.0005；*p<0.05
这些结果证明：单次给药GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸38459之后，在HCV感染的动物中HCV病毒滴度显著降低，而作用起效早和作用持续时间延长。
进行另一个研究来评估化合物38459在HCV感染的人嵌合肝脏小鼠模型中的作用，其中这些小鼠被HCV基因型3a感染。每组5只动物处理如下：PBS(n＝4)；10mg/kg38459(n＝5)；或30mg/kg38459(n＝5)。用HCV基因型3a接种小鼠。在处理前七天，从小鼠中收集血液用于测量病毒滴度。在第0天给药单次皮下注射处理。在处理后第0天、第3天、第7天、第10天、第14天、第17天、第21天、第24天和第28天收集血液。根据常规方法通过实时PCR来测量血液中的HCVRNA水平。如在图5B中所示，早在第3天，在用10mg/kg或30mg/kg的化合物38459处理的组中HCVRNA水平显著降低，并且这种降低维持直到至少第28天。
还观察到在用化合物38459处理的小鼠的肝脏中脂肪变性实质性减少。在被HCV感染的小鼠中和在未感染的小鼠中观察到脂肪变性减少，表明抑制miR-122可以减少存在和不存在HCV感染这两种情况下的脂肪变性。
实例5：缀合的较短修饰寡核苷酸
通过将图3中的结构缀合至表J中示出的修饰的寡核苷酸的3’末端来形成含GalNAc的化合物。糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
表J：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
为了确定体内效力，评估这些化合物使肝脏醛缩酶A(ALDOA)的表达去阻抑的能力。向小鼠给药化合物，并且通过定量PCR测量从肝脏中分离出的RNA中的ALDOAmRNA水平。相对于盐水，计算ALDOAmRNA的倍数变化以确定体内效力(图6A和6B以及图7A和7B)。从那些实验的结果计算的ED50(ALDOA去阻抑是最大值的50％时的化合物浓度)和ED90(ALDOA去阻抑是最大值的90％时的化合物浓度)在表K和表L中示出。
表K：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
表L：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
如在表K中所示，根据本发明的GalNAc缀合使8聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少100倍。如在表L中所示，根据本发明的GalNAc缀合使13聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少10倍。
还确定了化合物38634和38998对另一种miR-122靶基因CD320的去阻抑。结果类似于针对在表K中示出的ALDOA所获得的结果：根据本发明的GalNAc缀合分别使实验1和实验2中的ED50提高343倍和272倍，并且分别使实验1和实验2中的ED50提高492倍和545倍。
在此描述的GalNAc缀合还提高了针对包含GalNAc的这些化合物所观察到的胆固醇下降效力。来自实验1的示例性结果在图8A和8B中示出。作为GalNAc缀合物的化合物38633和38634比缺乏GalNAc的化合物38591和38998更有效。针对实验2获得类似结果(数据未示出)。
实例6：抗miR-122化合物在非人灵长类动物中的药效学活性
在正常的非人灵长类动物(食蟹猴)中测试了抗miR-122化合物。皮下给药单次剂量的GalNAc缀合的化合物38459或未缀合的化合物38649(对于每种化合物，n＝3)。给药PBS作为对照处理(n＝5)。在给药化合物后第4天和第8天，收集肝脏组织，并且分离RNA用于测量ALDOA水平。在第8天测量血液中的总胆固醇。如在表L中所示，在每种剂量的化合物38459(包括最低剂量1mg/kg)下，在第4天和第8天观察到ALDOA去阻抑。使用最低剂量的化合物38459也观察到胆固醇下降。因此，相对于未缀合的化合物38649，GalNAc缀合的化合物38459在非人灵长类动物中显著更有效。另外，在非人灵长类动物中单次剂量之后，这两种化合物均具有至少一周的作用持续时间。
表L：非人灵长类动物中的miR-122的抑制
实例7：缀合的抗miR-122化合物的药物动力学活性
在小鼠和非人灵长类动物中评估抗miR-122化合物的血浆和组织药物动力学。
向CD-1小鼠给药单次皮下剂量的化合物38649或GalNAc缀合的化合物38459。在给药之后，持续24小时时间段在多个时间点收集血液，并且通过基于杂交的ELISA测量该血液中的化合物的总量。
向非人灵长类动物给药单次皮下剂量的化合物38649或GalNAc缀合的化合物38459。在给药之后，持续24小时时间段在多个时间点收集血液，并且通过LC-MS测量该血液中的化合物的总量。
如在图9中所示，在小鼠(图9A)和非人灵长类动物(图9B)中，与未缀合的化合物38649相比，GalNAc缀合的化合物38459更快速地从血浆中清除。在给药GalNAc缀合的化合物38459之后，没有检测到未缀合的化合物38649，表明缀合的化合物38459在血液中没有代谢(数据未示出)。
在本研究中，还在小鼠(表M)和非人灵长类动物(表N)的肝脏和肾脏中测量了化合物的组织水平。
表M：单次剂量后24小时小鼠体内的化合物组织水平
表N：单次剂量后72小时非人灵长类动物体内的化合物组织水平
在给药之后，化合物38459在肝脏和肾脏中快速地代谢成未缀合的化合物38649。另外，与来自以上描述的小鼠研究的数据一致，化合物38459的肾脏与肝脏比率显著低于化合物38649的肾脏与肝脏比率。
基于给药后24小时肝脏中的化合物的浓度，估计大约6μg/g的GalNAc缀合的化合物38459和大约30μg/g的未缀合的化合物38459在第7天产生90％的最大效力(如通过ALDOA去阻抑所测量)。因此，相对于未缀合的化合物38649，化合物38459在更低的肝脏组织浓度下产生更大的效力。
这些数据证明在非人灵长类动物和小鼠中，缀合至含GalNAc部分使得修饰的寡核苷酸向肝脏的递送显著增强。此外，低ED50结合较低肾脏与肝脏比率表明GalNAc缀合的化合物38459可以具有高治疗指数。
实例8：抗miR-122化合物的毒理学和安全性研究
在小鼠、啮齿动物和非人灵长类动物中进行多个研究以评估GalNAc缀合的化合物38459的安全性和耐受性。
例如，在大鼠中，在促炎性研究中评估化合物38459。对雄性斯普拉道来大鼠(SpragueDawleyrat)给药单次皮下剂量的化合物38459。在给药后第14天，在肝脏中测量ALDOA和CXCL13(一种干扰素诱导性基因)的表达。
如在表O中所示，在高达100mg/kg的剂量下没有检测到CXCL13表达增加，而在1mg/kg剂量下ALDOA水平开始上升。还测试了一种已知的炎性抗miR-122化合物，并且在10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg剂量下引起CXCL13水平增加2倍至2.5倍。
表O：化合物38459不增加促炎性基因表达
在小鼠和非人灵长类动物(食蟹猴)中进行另外的毒理学研究，并且在治疗相关的剂量下没有观察到显著的不良作用。
实例9：缀合的较短修饰寡核苷酸
通过将胆固醇缀合至在表P中示出的修饰的寡核苷酸的3’末端来形成含胆固醇的化合物。糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联，除了由下标(O)指示的核苷间键联以外，这些核苷间键联是磷酸二酯键。
表P：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
为了确定体内效力，评估这些化合物使肝脏醛缩酶A(ALDOA)的表达去阻抑的能力。向小鼠给药化合物，并且通过定量PCR测量从肝脏中分离出的RNA中的ALDOAmRNA水平。相对于盐水，计算ALDOAmRNA的倍数变化以确定体内效力。从那些实验的结果中计算的ED50(ALDOA去阻抑是最大值的50％时的化合物浓度)和ED90(ALDOA去阻抑是最大值的90％时的化合物浓度)在表Q中示出。
表Q：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
如在表Q中所示，根据本发明的胆固醇缀合使8聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少30倍。
还确定了化合物38070和38998对另一种miR-122靶基因CD320的去阻抑。结果类似于针对ALDOA所获得的结果(数据未示出)。
在此描述的胆固醇缀合还提高了胆固醇下降效力。在测试的大多数浓度下，化合物38070使胆固醇降低的程度比相同浓度的化合物38998大(数据未示出)。
除了在此描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。意欲此类修改也处于所附权利要求书的范围之内。本申请中引用的每个参考文件(包括，但不限于杂志文章、美国专利和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、保藏编号等)通过引用以其全部内容明确结合在此。

Claims (114)

1.一种化合物，其包含由16至22个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122(SEQIDNO:1)互补并且其中该修饰的寡核苷酸以5’至3’方向包含具有以下核苷型态I的至少16个连续核苷：
(R)X-NQ-NQ-NB-NB-NQ-NB-NQ-NB-NQ-NB-NB-(NZ)Y
其中每个R独立地是非双环核苷或双环核苷；
X是从4至10；
每个NB独立地是双环核苷；
每个NQ独立地是非双环核苷；
Y是0或1；并且
NZ是修饰的核苷或未修饰的核苷。
2.如权利要求1所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包含具有核苷型态I的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或22个连续核苷。
3.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中每个双环核苷独立地选自LNA核苷、cEt核苷和ENA核苷。
4.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中至少两个双环核苷彼此不同。
5.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所有双环核苷具有彼此相同的糖部分。
6.如权利要求5所述的化合物，其中每个双环核苷是cEt核苷。
7.如权利要求6所述的化合物，其中该cEt核苷是S-cEt核苷。
8.如权利要求6所述的化合物，其中该cEt核苷是R-cEt核苷。
9.如权利要求5所述的化合物，其中每个双环核苷是LNA核苷。
10.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。
11.如权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中每个非双环核苷具有相同类型的糖部分。
12.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。
13.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。
14.如权利要求1至9和11中任一项所述的化合物，其中每个非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
15.如权利要求1至9和11中任一项所述的化合物，其中每个非双环核苷是2’-MOE核苷。
16.如权利要求1至10、12和13中任一项所述的化合物，其中不多于两个非双环核苷是2’-MOE核苷，其中每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
17.如权利要求16所述的化合物，其中最5’端和最3’端的非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
18.如权利要求16所述的化合物，其中两个非双环核苷是2’-MOE核苷，并且每个其他非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。
19.如权利要求1至13和15至18中任一项所述的化合物，其中每个R是2’-MOE核苷。
20.如权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中X是4、5、6、7、8、9或10。
21.如权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中Y是0。
22.如权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中Y是1。
23.如权利要求1所述的化合物，其中：
a)X是7；
每个R是2’-O-甲氧基乙基核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0；
b)X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR3各自是S-cEt核苷，并且NR2和NR4各自是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；
Y是1；并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷
c)X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR2和NR3各自是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；
Y是1；并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷
d)X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3和NR4各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR5和NR7各自是β-D-脱氧核糖核苷，并且NR6是S-cEt核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0；
e)X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4和NR5各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR6是S-cEt核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0；
f)X是7；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，并且NR7是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0；
g)X是10；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；并且Y是0；
h)X是10；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4-NR5-NR6-NR7-NR8-NR9-NR10，其中NR1、NR2、NR3、NR4、NR5和NR6各自是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR7和NR9各自是S-cEt核苷；并且NR8和NR10各自是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；
Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷；
i)X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR1和NR3各自是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；
Y是1并且NZ是β-D-脱氧核糖核苷；
j)X是4；(R)X是NR1-NR2-NR3-NR4，其中NR1是2’-O-甲氧基乙基核苷，NR2和NR4各自是S-cEt核苷，并且NR3是β-D-脱氧核糖核苷；
每个NB是S-cEt核苷；
每个NQ是β-D-脱氧核糖核苷；
Y是1并且NZ是2’-O-甲氧基乙基核苷。
24.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与miR-122的核碱基序列(SEQIDNO:1)至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
25.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联，或其中每个核苷间键联是修饰的核苷间键联，并且任选地，其中该修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
26.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列是选自SEQIDNO:3至SEQIDNO:6，其中每个T独立地选自T和U。
27.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸相对于miR-122的核碱基序列具有0、1、2或3个错配。
28.如权利要求1所述的化合物，具有以下结构：
a)AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS；
b)CSCASTTGUSCSACSACSTCSCSA；
c)MeCSCATSTGTS MeCSAMeCSAMeCSTMeCS MeCSAE；
d)AE MeCEAE MeCECASTTGUSCSACSACSTCSCS；
e)AE MeCEAE MeCE MeCEASTTGUSCSACSACSTCSCS；
f)AE MeCEAE MeCE MeCEAETTGUSCSACSACSTCSCS；
g)MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCS
h)MeCEAEAEAE MeCEAECSCASTTGUSCSACSACSTCSCSTE；
i)CSCAUSTGUSCSACSACSTCSCSA；或
j)MeCECSAUSTGUSCSACSACSTCSCSAE
其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
29.如以上权利要求中任一项所述的化合物，其中该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端或3’末端的缀合部分。
30.如权利要求29所述的化合物，其中该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端的缀合部分。
31.如权利要求29所述的化合物，其中该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端的缀合部分。
32.如权利要求29所述的化合物，其中该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端的第一缀合部分和连接至该修饰的寡核苷酸的5’末端的第二缀合部分。
33.如权利要求29至32中任一项所述的化合物，其中该缀合部分包含选自以下的至少一个配体：碳水化合物、胆固醇、脂质、磷脂、抗体、脂蛋白、激素、肽、维生素、类固醇以及阳离子性脂质。
34.如权利要求29至33中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
Ln-接头-MO
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；并且MO是修饰的寡核苷酸。
35.如权利要求29至33中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
Ln-接头-X-MO
其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
36.如权利要求29至33中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
37.如权利要求29至33中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
Ln-接头-X-Nm-Y-MO
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
38.如权利要求29至33中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
Ln-接头-Y-Nm-Y-MO
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
39.如权利要求34至38中任一项所述化合物，其中如果n大于1，则Ln-接头具有以下结构：
其中每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
40.如权利要求39所述的化合物，其中Q’和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
41.如权利要求39或40所述的化合物，其中该骨架将2个、3个、4个或5个配体连接至修饰的寡核苷酸。
42.如权利要求41所述的化合物，其中该骨架将3个配体连接至修饰的寡核苷酸。
43.如权利要求34至42中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；并且
波形线表明连接至这个或这些接头和配体的其余部分。
44.如权利要求35、37、39和43中任一项所述的化合物，其中X是磷酸二酯键。
45.如权利要求34至43中任一项所述的化合物，其中n是从1至5、1至4、1至3、或1至2。
46.如权利要求34至43中任一项所述的化合物，其中n是3。
47.如权利要求34至46中任一项所述的化合物，其中至少一个配体是碳水化合物。
48.如权利要求34至47中任一项所述的化合物，其中至少一个配体选自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙酰基半乳糖胺。
49.如权利要求34至47中任一项所述的化合物，其中至少一个配体选自N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺以及N-异丁酰基-半乳糖胺。
50.如权利要求34至47中任一项所述的化合物，其中每个配体是N-乙酰基半乳糖胺。
51.如权利要求34至50中任一项所述的化合物，其中该化合物具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
52.一种化合物，其包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端并且具有以下结构：
其中每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
53.如权利要求51或权利要求52所述的化合物，其中X1和X2中的至少一个是磷酸二酯键。
54.如权利要求51至53中任一项所述的化合物，其中X1和X2各自是磷酸二酯键。
55.如权利要求35至54中任一项所述的化合物，其中m是1。
56.如权利要求35至54中任一项所述的化合物，其中m是2、3、4或5。
57.如权利要求35至56中任一项所述的化合物，其中Nm是N’pN”，其中每个N’独立地是修饰或未修饰的核苷，并且p是从0至4；并且N”是包含未修饰的糖部分的核苷。
58.如权利要求57所述的化合物，其中p是0。
59.如权利要求57所述的化合物，其中p是1、2、3或4。
60.如权利要求55至59中任一项所述的化合物，其中每个N’包含未修饰的糖部分。
61.如权利要求57至60中任一项所述的化合物，其中每个未修饰的糖部分独立地是β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
62.如权利要求57至61中任一项所述的化合物，其中N”包含嘌呤核碱基。
63.如权利要求57至61中任一项所述的化合物，其中N”包含嘧啶核碱基。
64.如权利要求57或59至62中任一项所述的化合物，其中至少一个N’包含嘌呤核碱基。
65.如权利要求62或64所述的化合物，其中每个嘌呤核碱基独立地选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。
66.如权利要求57至62、64和65中任一项所述的化合物，其中N”是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。
67.如权利要求57或59至66中任一项所述的化合物，其中至少一个N’包含嘧啶核碱基。
68.如权利要求63或67所述的化合物，其中每个嘧啶核碱基独立地选自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氢尿嘧啶。
69.如权利要求35至68中任一项所述的化合物，其中每个N的该糖部分独立地选自：β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及双环糖部分。
70.如权利要求69所述的化合物，其中每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。
71.如权利要求70所述的化合物，其中该cEt糖部分是S-cEt糖部分。
72.如权利要求70所述的化合物，其中该cEt糖部分是R-cEt糖部分。
73.一种化合物，其包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS，其中后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷，后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联；并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。
74.一种化合物，其包含修饰的核苷酸和缀合部分，其中该修饰的寡核苷酸具有结构CLCALTTGLTLCACLACLTCLCL，其中下标“L”表明LNA并且后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷，并且每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中该缀合部分连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端并且具有以下结构：
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是该修饰的寡核苷酸。
75.一种抑制细胞中的miR-122的活性的方法，该方法包括使细胞与如以上权利要求1至74中任一项所述的化合物相接触。
76.如以上权利要求75所述的方法，其中该细胞是在体内。
77.如以上权利要求75所述的方法，其中该细胞是在体外。
78.一种方法，包括向HCV感染的受试者给药如权利要求1至74中任一项所述的化合物。
79.如权利要求78所述的方法，其中该给药减少HCV感染的症状。
80.如权利要求78或权利要求79所述的方法，其中该给药预防血清HCVRNA回升。
81.如权利要求78或权利要求79所述的方法，其中该给药延缓血清HCVRNA回升。
82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，包括选择患有HCV感染的受试者。
83.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中该受试者被选自以下的一种或多种HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。
84.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中在给药该化合物之前，确定该受试者被选自以下的一种或多种HCV基因型感染：基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5以及基因型6。
85.如权利要求83或权利要求84所述的方法，其中该HCV基因型选自：基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型2c、基因型2d、基因型3a、基因型3b、基因型3c、基因型3d、基因型3e、基因型3f、基因型4a、基因型4b、基因型4c、基因型4d、基因型4e、基因型4f、基因型4g、基因型4h、基因型4i、基因型4j、基因型5a以及基因型6a。
86.如权利要求83或权利要求84所述的方法，其中该HCV基因型选自：基因型1a、基因型1b以及基因型2。
87.如权利要求78至86中任一项所述的方法，包括给药至少一种另外的治疗剂。
88.如权利要求78至87中任一项所述的方法，其中该受试者被对至少一种治疗剂有抗性的HCV变体感染。
89.如权利要求87或权利要求88所述的方法，其中该至少一种治疗剂选自：蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、辅助因子抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、结构蛋白抑制剂、非结构蛋白抑制剂、亲环蛋白抑制剂、进入抑制剂、TLR7激动剂以及干扰素。
90.如权利要求87或权利要求88所述的方法，其中该至少一种治疗剂选自：蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A抑制剂、核苷NS5B抑制剂、核苷酸NS5B抑制剂、非核苷NS5B抑制剂、亲环蛋白抑制剂以及干扰素。
91.如权利要求87或权利要求88所述的方法，其中该至少一种治疗剂选自：干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素alfacon-1、聚乙二醇干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素α-2a、缓释的干扰素-α-2b、干扰素λ、索菲布韦(sofosbuvir)、利巴韦林(ribavirin)、特拉普韦(telapravir)、波普瑞韦(boceprevir)、伐尼普韦(vaniprevir)、阿森那普韦(asunaprevir)、利托那韦(ritonavir)、斯乔布韦(setrobuvir)、迪卡拉斯他韦(daclastavir)、斯密普韦(simeprevir)、阿拉泊韦(alisporivir)、麦瑞斯他滨(mericitabine)、替格布韦(tegobuvir)、丹诺普韦(danoprevir)、索伐普韦(sovaprevir)以及尼塞普韦(neceprevir)。
92.如权利要求87或权利要求88所述的方法，其中该至少一种治疗剂选自：干扰素、利巴韦林和特拉普韦。
93.如权利要求78至92中任一项所述的方法，其中该受试者是对至少一种治疗剂无反应者。
94.如权利要求93所述的方法，其中该受试者是干扰素无反应者。
95.如权利要求93或权利要求94所述的方法，其中该受试者是直接作用型抗病毒性无反应者。
96.如权利要求78至95中任一项所述的方法，包括选择具有每毫升血清大于350,000个拷贝的HCVRNA水平的受试者。
97.如权利要求78至95中任一项所述的方法，包括选择具有每毫升血清在350,000个与3,500,000个拷贝之间的HCVRNA水平的受试者。
98.如权利要求78至95中任一项所述的方法，包括选择具有每毫升血清大于3,500,000个拷贝的HCVRNA水平的受试者。
99.如权利要求78至98中任一项所述的方法，其中该受试者患有HCV相关性疾病。
100.如权利要求99所述的方法，其中该HCV相关性疾病是肝硬化、肝纤维化、脂肪性肝炎、脂肪变性或肝细胞癌。
101.如权利要求78至100中任一项所述的方法，包括给药足以降低HCVRNA水平的剂量的该化合物。
102.如权利要求101所述的方法，包括给药使HCVRNA水平降低至每毫升血清40个拷贝以下的剂量的该化合物。
103.如权利要求101所述的方法，包括给药足以实现HCVRNA水平降低至少2个对数的剂量的该化合物。
104.如权利要求78至103中任一项所述的方法，其中该给药实现了持续的病毒反应。
105.如权利要求78至104中任一项所述的方法，包括给药足以实现HCVRNA水平降低至少0.5倍、至少1.0倍、至少1.5倍、至少2.0倍或至少2.5倍的剂量的该化合物。
106.如权利要求105所述的方法，其中在第一次给药该化合物两周、三周、四周、五周或六周之后实现该HCVRNA水平降低。
107.如权利要求78至106中任一项所述的方法，其中每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两月一次或每三月一次给药该化合物。
108.如权利要求78至107中任一项所述的方法，其中该化合物的剂量小于或等于10mg/kg、小于或等于7.5mg/kg、小于或等于每周5mg/kg、小于或等于4.5mg/kg、小于或等于4.0mg/kg、小于或等于3.5mg/kg、小于或等于3.0mg/kg、小于或等于2.5mg/kg、小于或等于2.0mg/kg、小于或等于1.5mg/kg、或小于或等于1.0mg/kg。
109.如权利要求78至108中任一项所述的方法，其中该给药使肝酶水平正常化，其中该肝酶任选地是丙氨酸转氨酶。
110.如权利要求78至109中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
111.如权利要求78至110中任一项所述的方法，其中该化合物存在于药物组合物中。
112.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，用于疗法中。
113.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，用于治疗HCV感染的受试者。
114.一种化合物，用于根据权利要求113所述的用途，其中该受试者是人。
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