CN105367646B - 一种奶牛瘤胃utb基因的转录因子gata2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2，所述奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2基因的序列如SEQIDNO.1所示。本发明通过双荧光素酶报告基因系统及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2，对于揭示奶牛瘤胃UTB基因转录机制，探明其瘤胃氮素再循环机理，进而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。

Description

一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2及其应用
技术领域
本发明涉及一种奶牛瘤胃尿素转运因子UTB基因的转录因子GATA2。
背景技术
近年来，反刍家畜肉和奶生产中对环境的污染问题日益受到关注。Meta分析表明，决定奶牛粪污总氮排出的主要因素是饲粮氮摄入量，牛对饲粮氮的有效利用率只有23％，瘤胃代谢已被确定为反刍动物氮利用效率低的最重要原因。瘤胃内产生的氨除被微生物用于合成菌体蛋白外，其余的氨经消化道上皮吸收入门静脉，随血液进入肝脏合成尿素。肝脏中产生的尿素91％可通过再循环重新进入消化道内，这就形成了反刍动物尿素氮的再循环利用。这种氮的再循环对维持反刍动物体内氮的平衡，尤其是在低氮饲粮条件下具有重要意义。研究表明，低氮饲粮条件下，再循环至瘤胃的尿素氮显著增加。探明氮再循环过程中尿素转运的调控机制有利于采取针对性措施提高不同饲粮和生理条件下反刍动物的氮利用。尿素转运因子(UTs)是高选择性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表达的尿素转运因子UTB)通过参与尿素在瘤胃上皮细胞中的跨膜转运，构成了牛瘤胃尿素氮再循环过程的重要部分，对于维持其氮平衡至关重要。UTB介导的经上皮细胞的尿素转运是经刺激后产生的，且不受已知尿素转运因子UTA调控因子的影响。
发明内容
本发明的目的在于探明奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2。
本发明的技术方案是：一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2，所述奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2基因的序列如SEQIDNO.1所示。
所述的奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2的构建方法，(1)构建GATA2转录因子蛋白真核表达载体，将转录因子蛋白表达载体分别与三个缺失片段的UTB基因启动子载体共转染293细胞，荧光素酶报告基因分析转录因子对于UTB启动子的转录调控作用；(2)根据牛UTB(AY838799.1)基因启动子信息，设计两条能够与GATA2蛋白相结合的探针并标记，进行EMSA，确证GATA2与UTB启动子位点的特异结合。
转录因子GATA2应用于对奶牛瘤胃UTB基因的转录调节。
本发明的有益效果是：通过双荧光素酶报告基因系统及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基因的转录因子——GATA2，对于揭示奶牛瘤胃UTB基因转录机制，探明其瘤胃氮素再循环机理，进而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
附图说明
图1为UTB基因测序方向图；
图2为部分UTB-1测序结果；
图3为空质粒转染载体图；
图4为UTB启动子载体图；
图5为PCDNA3.1-GATA2载体图；
图6为部分PCDNA3.1-GATA2测序结果；
图7为EMSA试验结果。
具体实施方式
一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2，所述奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2基因的序列如SEQIDNO.1所示。
所述的奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2的构建方法，(1)构建GATA2转录因子蛋白真核表达载体，将转录因子蛋白表达载体分别与三个缺失片段的UTB基因启动子载体共转染293细胞，荧光素酶报告基因分析转录因子对于UTB启动子的转录调控作用；(2)根据牛UTB(AY838799.1)基因启动子信息，设计两条能够与GATA2蛋白相结合的探针并标记，进行EMSA，确证GATA2与UTB启动子位点的特异结合。
转录因子GATA2应用于对奶牛瘤胃UTB基因的转录调节。
本发明的有益效果是：通过双荧光素酶报告基因系统及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基因的转录因子——GATA2，对于揭示奶牛瘤胃UTB基因转录机制，探明其瘤胃氮素再循环机理，进而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
具体实验过程如下：
1 奶牛瘤胃上皮细胞UTB核心启动子区域的确定
1.1 试验材料
试剂：内切酶(Fermentas)；引物Oligo(Invitrogen合成)；TaqDNAPolymerase(10966034,Invitrogen)；T4DNAligase(1U/μL)(EP0061,Fermentas)；凝胶回收试剂盒(AP-GX_250,Axygen)；GeneRμLerDNALadder(SM0332,Fermentas)等，质粒小抽试剂盒(AP-MN-P-250，Ayxgen)，质粒中抽试剂盒(AP-MD-P-25，Ayxgen)，质粒大抽试剂盒(AP-MX-P-25，Ayxgen)；
293细胞(华大)；DMEM培养基+10％FBS(Invitrogen)；转染试剂：lipofectamine2000(Invitrogen)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)。
仪器：台式冷冻离心机(Neofuge13R,HealForce)，生物安全柜(HFSafe-1800,HealForce)，PCR仪(T100TM,Bio-Rad)，电泳成像系统(Tanon1600，天能)，干式恒温仪(TU-100C，一恒科技)温控摇床(THZ-98，太仓)等；
Mudulus测定仪(TurnerBiosystems)；6孔细胞培养板(Corning)；CO2培养箱(Thermo)；荧光显微镜(Olympus)。
1.2 试验方法
1.2.1 启动子载体构建
启动子载体构建采用PCR法，具体方法如下：
设计引物
根据根据Genbank中公布的UTB序列(AY838799.1)，利用生物信息学方法对奶牛UTB启动子的核酸片段进行了生物学信息分析，每个靶基因序列设计并合成2条PCR扩增引物(带酶切位点)。
1.2.2 目的基因片段准备
(1)DNA提取：采集成年荷斯坦奶牛瘤胃上皮组织，提取基因组DNA并定量。
(2)PCR反应：按照以下表格配制PCR反应体系。
扩增条件：按照以下条件在PCR扩增仪上进行PCR反应；
(3)凝回收：PCR产物割取目的条带后经Axygen凝胶回收试剂盒纯化(按照产品说明书操作)；
(4)定量：纯化后PCR产物进行OD质检并定量；
(5)PCR产物酶切及回收纯化：按如下体系37℃水浴2h，酶切后割胶回收纯化(按照Axygen凝胶回收试剂盒说明书操作)。
(6)纯化后酶切片段进行OD质检并定量。
1.2.3 骨架载体构建
(1)骨架载体酶切反应和回收纯化：按照下述体系37℃水浴2h，酶切后胶回收(按照Axygen胶回收试剂盒说明书操作)。
(2)纯化后酶切片段进行OD质检并定量。
1.2.4 连接转化与测序验证
连接反应：按以下体系于恒温仪上进行连接，连接条件：16℃，过夜。
1.2.5 转化、菌检和测序
(1)将连接产物转化感受态细菌，涂板过夜培养，
(2)从平板上随机挑选完全落单的菌落，用菌检PCR方法检测，
(3)挑取阳性克隆测序验证。
1.2.6 质粒抽提和检验
测序正确的菌液放大培养，利用Axygen质粒抽提试剂盒和方法抽提质粒，抽提的质粒进行OD测定。
1.2.7 启动子载体检测
启动子载体活性检测采用荧光素酶报告基因进行。
(1)细胞培养：于二氧化碳培养箱中用DMEM+10％胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)培养基按常规培养293细胞，维持良好生长状态；
(2)接种：转染前一天接种6孔板，每孔细胞量约5×105，培养过夜；
(3)转染：待细胞融合度达90％以上时，按转染试剂盒说明将1.1构建的载体进行转染，同时设立空质粒转染载体作为对照。
(4)继续培养：转染过夜后换液，并继续培养36h。
(5)裂解细胞：将细胞用PBS洗两遍，加细胞裂解液300μL，置冰上裂解10min，收集裂解液，13000rpm离心5min；
(6)荧光素酶检测：在荧光显微镜下观察空质粒转染载体及UTB启动子载体。
1.3 结果
1.3.1 UTB潜在的转录因子结合位点确定
根据Genebank中公布的UTB序列(AY838799.1)，利用生物信息学方法对奶牛UTB启动子的核酸片段进行了生物学信息分析，初步确定潜在的转录因子结合位点，如：GATA2及HSF等。
1.3.2 UTB启动子载体的构建
从奶牛的瘤胃上皮组织中提取基因组DNA，根据Genebank中公布的UTB序列(AY838799.1)分别设计三段引物，引物信息见表1，在引物的两端加上xhoI和HindIII的酶切位点，以DNA为模板扩增包含不同区域的UTB启动子序列，分别采用xhoI和HindIII进行双酶切，克隆进入PGL3-basic荧光素酶报告基因载体，测序验证重组序列的方向正确，见图1、图2，获得正确的载体：UTB-1、UTB-2及UTB-3。
表1 引物序列及预计扩增片段长度
1.3.3 UTB启动子载体的检测
在荧光显微镜下观察空质粒转染载体及UTB启动子载体，见图3及图4，可见构建的质粒转染效果较好，转染效率较高，可用于后续试验。
2 GATA2转录因子对UTB启动子的作用
构建GATA2转录因子蛋白真核表达载体，将转录因子蛋白表达载体分别与不同缺失片段的UTB基因启动子载体共转染293细胞，荧光素酶报告基因分析转录因子对于UTB启动子的转录调控作用。
2.1 试验材料
试验材料同1.1。
2.2 试验方法
(1)GATA2全基因合成：分析牛的GATA2基因(GenBank:NM_001192114)cds序列，因其基因中GC含量超过70％，故进行全基因合成。
(2)与T载体(PCDNA3.1)连接转化、测序验证获得正确的载体PCDNA3.1-GATA2。
(3)细胞培养同1.2。
(4)将PCDNA3.1-GATA2分别与2.1.2构建的UTB-1、UTB-2及UTB-3共转染293细胞，具体分组如表2。
表2 共转染试验设计
(5)继续培养、裂解并收集细胞。
(6)荧光素酶报告基因活性检测：每个样品取100μL裂解液，加100μLfirefly检测试剂，记录RLU(relativelightunit)值；再加100μL检测工作液，记录第二个RLU值。
(7)结果计算：计算萤火虫荧光酶素RLU和Renilla荧光素酶素RLU的比值；计算三个平行样的RLU比值。
2.3 结果
2.3.1 GATA2载体的构建
全基因合成牛GATA2基因(1464bp)，与骨架载体(PCDNA3.1)连接、测序验证获得正确的载体PCDNA3.1-GATA2，见图5、6，可用于后续试验。
2.3.2 GATA2对UTB启动子的影响
GATA2对UTB启动子的影响见表3，从荧光素酶结果上纵向比较，启动子越长F/RRatio值越高，横向UTB-1组，UTB-2组的P＜0.05，说明GATA2的转录因子对UTB启动子一号和二号区域存在调控作用。
表3 GATA2真核表达载体对不同缺失片段UTB启动子载体的影响
3 GATA2转录因子与UTB启动子位点的特异结合
利用电泳迁移变动分析，确证GATA2与UTB启动子位点的特异结合。
3.1 试验材料
主要试剂：
LightshiftChemiluminescentEMSAKit：20148，ThermoSciemtific；
NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagents：78833，ThermoSciemtific；
HaltProteaseInhibitorCocktail，EDTA-free(100×)：87785，ThermoSciemtific；
EMSA生物素探针标试剂盒：GS008，碧云天。
主要仪器设备：
Allegra21R台式高速冷冻离心机：美国BECKMAN公司；台式高速离心机：德国SORVAL公司；
GelDoc2000成像系统、垂直电泳系统：美国BIO-RAD公司；320-SpH计：美国MettlerToledo公司；
AR5120电子天平：美国AHOMS公司；
MultiTempIII恒温水浴锅；
雪花状制冰机：日本SANYO公司；
超净工作台：中国苏净集团。
3.2 试验方法
3.2.1 核蛋白的提取
参考ThermoSciemtific试剂盒NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagents：
(1)采用预冷的PBS冲洗细胞；
(2)将奶牛的瘤胃组织移至1.5mL离心管中，500×g，离心3min；
(3)小心弃去上清，留牛的瘤胃组织沉淀备用；
(4)加入预冷的CERI(含ProteaseInhibitor)100μL；
(5)剧烈votex15s，冰浴10min；
(6)加入预冷的CERII5.5μL；
(7)剧烈votex5s，冰浴1min；
(8)剧烈votex5s，16000×g，离心10min；
(9)立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的牛的瘤胃组织浆蛋白；
(10)加入预冷的NER(含ProteaseInhibitor)40μL；
(11)剧烈votex15s，置于冰上，每10min剧烈votex15s，共40min；
(12)16000×g，离心10min；
(13)立即吸取上清至一预冷的离心管中，即为抽提得到的牛的瘤胃组织核蛋白。
3.2.2 探针信息及泳道设计
根据UTB(AY838799.1)基因启动子信息，设计两条能够与GATA2蛋白相结合的探针并标记(表4、表5)，进行电泳迁移率改变分析。
表4 EMSA探针信息
表5 EMSA泳道设计
3.2.3 EMSA操作步骤
(1)6％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：在15mL试管中，顺序放入ddH2O7.15mL，30％聚丙烯酰胺溶液2mL，5×TBE1mL，甘油175μL，10％APS75μL，TEMED8μL；
(2)4℃，100V电压预电泳约60min；
(3)根据PIERCE公司EMSA试剂盒(货号：20148)要求配制结合反应液，室温放置10min；
(4)加入标记生物素探1μL，室温放置20min；
(5)加入5μLLoadingBuffer到每一个结合反应中，混匀，上样；
(6)4℃，100V电压电泳；至溴芬蓝电泳至2/3凝胶长度时停止电泳；
(7)转膜：将合适大小的尼龙膜浸泡在0.5×TBE中15min，按照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵顺序放好，筛孔板固定，细心去除夹心内所有气泡，凝胶面向阴极插入电泳槽中，倒入0.5×TBE，300mA恒流电转移30min；
(8)紫外线交联；
(9)化学发光法检测生物素标记的DNA：参照PIERCE公司ChemiluminescentEMSAKit说明操作；
(10)50℃水浴温和地将封闭缓冲液(blockingbuffer)和4×漂洗缓冲液(WashBuffer)预热，直至颗粒物全部溶解；
(11)将膜放入洁净的塑料平皿中，加入20ml封闭缓冲液，放在摇床上温和摇动15min；
(12)吸取66.7ul辣根抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶底物到20ml封闭缓冲液，混匀备用；
(13)将封闭缓冲液倒去，加入步骤10所配溶液，放在摇床上温和摇动15min；
(14)取40mL4×漂洗缓冲溶液到120mlddH2O中，得到1×漂洗缓冲溶液；将膜转移到一个新的塑料平皿，加入20mL1×漂洗缓冲溶液漂洗5min，共漂洗4次；
(15)将膜转移至另一新的塑料平皿，加入30mL底物平衡缓冲液，平衡5min；
(16)配置底物工作液(SubstrateWorkingSolution)：将6mLLuminol/EnhancerSolution加入到6mlStablePeroxideSolution中，混匀，避光保存备用；
(17)将膜从底物平衡缓冲液中拿出，正面朝上放到新的洁净平皿中，将底物工作液倒入膜的表面，避光放置5min；
(18)将膜从底物工作液中拿出，用塑封膜封好，避免气泡和皱褶；
(19)在暗房用X-rayfilm曝光3min，显影，定影，洗片，曝光记录结果。
3.3 结果
EMSA试验结果见图7，由图7可知，1、6泳道只有自由探针；2、3、4、5均出现了探针与核蛋白的结合区，因为在凝胶电泳中移动速度较慢，显影呈滞后的条带，表明，本试验中，UTB基因启动子两个结合位点与GATA2转录因子存在特异结合。

Claims (1)

1.转录因子GATA2应用于对奶牛瘤胃UTB基因的转录调节。
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