CN105232541B

CN105232541B - 可皆霉素在制备治疗糖尿病药物中的应用

Info

Publication number: CN105232541B
Application number: CN201510714809.5A
Authority: CN
Inventors: 陈林; 马经纬; 郭庆丰; 张勇; 尹震花; 康文艺
Original assignee: Huanghe Science and Technology College
Current assignee: Huanghe Science and Technology College
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105232541A

Abstract

本发明提供一种可皆霉素在治疗糖尿病中的应用，可皆霉素具有良好的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，能显著的降低餐后血糖和空腹血糖，且作用强于或相当于糖尿病一线核心治疗药物阿卡波糖和二甲双胍。可皆霉素可以降低糖尿病的血糖水平，并能通过降低血清中TCH（总胆固醇）和TG（甘油三脂）的含量，从而改善高血脂这种糖尿病并发症，且其作用强于或相当于阿卡波糖和二甲双胍。此外，可皆霉素能通过降低血清中MDA（丙二醛）的含量，升高SOD（超氧化物岐化酶）水平，增强机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害，且其作用强于或相当于阿卡波糖和二甲双胍。

Description

可皆霉素在制备治疗糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明属于微生物次生代谢产物应用技术领域，具体涉及狭旋毛壳次生代谢产物可皆霉素在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

狭旋毛壳（Chaetomium angustispirale）属于子囊菌门毛壳属真菌，世界性分布，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够在防治植物病害方面发挥积极作用，且多数具有降解纤维素的能力，此外毛壳菌还具有重要的医学价值。从美登木植物中分离出的内生毛壳菌的代谢过程中，可产生具有显著抗癌作用的毛壳甲素。可皆霉素（Cochliodinol）为狭旋毛壳的次生代谢产物，分子式为C₃₂H₃₀N₂O₄；分子量：506.22；CAS登录号：11051-88-0，结构式为

。

糖尿病作为我国目前仅次于肿瘤和心脑血管的常见病，其中Ⅱ型糖尿病占糖尿病总人数的90%以上。患者胰岛素分泌不足，或者胰岛素降低而引起的代谢综合症。目前主要治疗策略是控制患者的餐后高血糖症状，抑制碳水化合物水解α-葡萄糖苷酶的活性能够推迟葡萄糖的释放，从而实现餐后高血糖的控制。α-葡萄糖苷酶又称α-D-葡萄糖苷水解酶，能够水解非还原末端的α-葡萄糖苷键。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂作为一线药物在我国早期的糖尿病防治中发挥重要作用。

葡萄糖苷酶抑制剂的研究众多，按照来源可将其分为天然产物中提取、化学合成以及从微生物的代谢产物中得到三大类。然而，天然产物分离原料稀少，纯度低，很少能够进入工业化生产；以天然产物为母体通过化学合成的方法进行修饰，可加强对酶的亲和特异性，但是对人体的毒副作用大。微生物代谢提取药物是利用菌株自身的天然产物合成途径产生比较复杂的大分子产物，生产可达工业化，人体副作用很少，且具有可持续发展性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可皆霉素在制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明的目的之一是提供一种可皆霉素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗糖尿病药物的应用。

本发明的目的之一是提供一种可皆霉素在制备升高肝糖元值药物中的应用。

本发明的目的之一是提供一种可皆霉素在制备升高超氧化物歧化酶水平药物中的应用。

本发明的目的之一是提供一种可皆霉素在制备降低血清中甘油三脂、丙二醛和总胆固醇含量药物中的应用。

可皆霉素具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可皆霉素对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀（半抑制浓度）为0.36±0.04 µg/mL，抑制作用显著强于阿卡波糖（IC₅₀为136.41 ±150.26 µg/mL）。可皆霉素高低剂量均能显著的降低餐后血糖和空腹血糖，且作用强于或相当于糖尿病一线核心治疗药物阿卡波糖和二甲双胍。可皆霉素可以降低糖尿病的血糖水平，并能通过降低血清中TCH（总胆固醇）和TG（甘油三脂）的含量，从而改善高血脂这种糖尿病并发症，且其作用强于或相当于阿卡波糖和二甲双胍。此外，可皆霉素能通过降低血清中MDA（丙二醛）的含量，升高SOD（超氧化物岐化酶）水平，增强机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害，且其作用强于或相当于阿卡波糖和二甲双胍。

具体实施方式

实施例1

微孔板法测可皆霉素对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

1.1 原理：

α-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），产生硝基苯酚（PNP，黄色物质，在405 nm有最大吸收），α-糖苷酶抑制剂可抑制α-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量，以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。

1.2 仪器：

Multiskan MK3酶标仪（Thermo Electron）；LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；DELTA 320型pH计（Mettler-Toledo）；电子天平（Mettler-Toledo）；旋转蒸发仪（Heidolph）。

1.3 试剂：

α-葡萄糖苷酶（Sigma，EC 3.2.1.20），PNPG（Sigma，026K1516），磷酸钾缓冲液，阿卡波糖（杭州中美华东制药有限公司，110704），其他试剂均为分析纯。

1.4 检测方法及数据处理

样品溶液的配置：

称取一定质量的阿卡波糖加入一定体积的DMSO，配成阿卡波糖浓度为30 mg/mL溶液；称取一定质量的可皆霉素，加入一定体积的DMSO，配成可皆霉素浓度为2 mg/mL溶液。

实验分组：

空白组（8μL DMSO+152μL磷酸钾缓冲液）；阴性对照组（8μL DMSO+20μL α-葡萄糖苷酶+112μL磷酸钾缓冲液+20μL PNPG）；样品对照组（8μL样品溶液+152μL磷酸钾缓冲液）；样品组（8μL样品溶液+20μL α-葡萄糖苷酶+112μL磷酸钾缓冲液+20μL PNPG）。

实验步骤：

112μL磷酸钾缓冲液 (pH 6.8)，加入20μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶、8μL样品溶液，37℃恒温15 min，加入20μL 2.5 mmol/L PNPG，37℃恒温反应15 min。再加入80μL 0.2mol/L的终止剂Na₂CO₃溶液，于405 nm波长下测OD值。同时做相同体系下的阴性对照组、空白组、样品组和样品对照组，按下面方法计算抑制率，并用Origin6.0软件求出相应IC₅₀值。

1.5 实验结果

表1 可皆霉素对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

从表1可以看出，可皆霉素对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为0.36±0.04 µg/mL，阳性对照药阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为1136.41 ±150.26 µg/mL，这表明可皆霉素对α-葡萄糖苷酶抑制活性强于阿卡波糖，具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

实施例2

可皆霉素对糖尿病小鼠血糖的影响

2.1 实验动物材料：

昆明小鼠雄性，体重22 ± 2 g。

2.2 实验方法：

购回的小鼠适应7 d后，随机分成组，空白组10只，另一组为糖尿病模型组。糖尿病模型组于禁食不禁水12-16 h小时后按80 mg/kg一次性尾静脉注射四氧嘧啶致糖尿病。正常喂养72 h后，禁食不禁水12 h，眼眶取血，测空腹血糖水平，依据血糖均衡原则将血糖水平在11.1 mmol/L以上的小鼠分成4组，每组10只：可皆霉素高低剂量组（可皆霉素高、低剂量组用量分别为200、100mg/kg体重）、阿卡波糖阳性对照组、二甲双胍阳性对照组、糖尿病模型组，正常对照组作为空白组。除糖尿病模型组和空白组外，其他组分别灌胃相应的药物，1次/ d，连续给药7 d，于末次给药后2 h眼眶取血测餐后血糖水平，并于当晚禁食12 h，第8 d摘取眼球取血，分离血清，放置于冰箱0-3℃保存，用于测定给药后空腹血糖、TG、TCH、MDA和SOD。处死动物，取肝脏并称重，用于测定肝糖元含量。

2.3 仪器：

UV-2000型紫外可见分光光度计 (上海尤尼科仪器有限公司)；Multiskan MK3酶标仪 (美国Thermo Electron公司)；LRH-150恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；电子天平 (美国Mettler-Toledo公司)；旋转蒸发仪 (德国Heidolph公司)；CS-H1型混合器 (北京博励阳科技公司)。

2.4 试剂：

葡萄糖测定试剂盒 (上海荣盛生物药业有限公司，20150101147)；甘油三酯 (TG)测定试剂盒 (浙江东瓯诊断产品有限公司，Lot：2014120018)；总胆固醇 (TCH) 测定试剂盒 (浙江东瓯诊断产品有限公司，Lot：2015010013)；肝/肌糖元测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，20150421)、丙二醛(MDA)试剂盒 (南京建成生物工程研究所，20150421)；SOD试剂盒 (测总) (南京建成生物工程研究所，20150319)；四氧嘧啶 (Allxan monohydrate，Lot：10150059，Alfa Aesar)；无水乙醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司)；浓硫酸(AR，开封市方晶化学试剂有限公司，09080634)；冰醋酸(AR，开封化学试剂总厂，961005)。

2.5 实验结果如表2所示

表2 可皆霉素对糖尿病小鼠血糖的影响 (`x±s，n=10)

注：阿卡波糖、二甲基双胍为阳性对照；

与空白组比较：^△△△ p< 0.001，^△△ p< 0.01，^△ p< 0.05；

与模型组比较：^*** p< 0.001，^** p< 0.01，^* p< 0.05；

与阿卡波糖比较：^### p< 0.001，^## p< 0.01，^# p< 0.05；

与二甲双胍比较：^%%% p< 0.001，^%% p< 0.01，^% p< 0.05；（表3、4、5同）。

从表2可以看出，给药前，与空白组相比，糖尿病组 (可皆霉素高低剂量组、阿卡波糖和二甲双胍阳性对照组及模型组) 空腹血糖均呈极显著性升高（P<0.001），说明四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠造模成功，并且各糖尿病组之间无显著性差异。

灌胃给药7 d后，与空白组相比，模型组餐后血糖呈极显著性升高（P<0.001），可见糖尿病可引起餐后血糖值升高；与模型组相比，可皆霉素高低剂量组、阿卡波糖和二甲双胍阳性对照组分别能显著性降低餐后血糖（P<0.001，P<0.05，P<0.05，P<0.05）；与阳性对照组相比，可皆霉素高剂量组能显著性的降低餐后血糖（P<0.05，P<0.05），可皆霉素低剂量组无显著性差异（P>0.05）。与模型组相比，可皆霉素高低剂量组分别能显著性降低空腹血糖（P<0.001，P<0.001）；与阳性对照组相比，可皆霉素高低剂量组能显著性的降低餐后血糖（P<0.001，P<0.001；P<0.001，P<0.001）。从给药后餐后血糖和空腹血糖综合分析，可皆霉素高低剂量均能显著的降低餐后血糖和空腹血糖，且作用强于或相当于阳性对照阿卡波糖和二甲双胍。

为了进一步研究血糖与肝糖元的关系，测定了糖尿病小鼠中肝糖元的含量，结果见表3。

表3 可皆霉素对糖尿病小鼠肝糖元的影响 (`x±s，n=10)

。

从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠肝糖元含量极显著性的降低（P<0.001），可见糖尿病可引起肝糖元值降低；给药治疗7 d后，与模型组相比，可皆霉素高低剂量组、阿卡波糖和二甲双胍阳性对照组分别能显著性升高肝糖元（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；与阿卡波糖阳性对照组相比，可皆霉素低剂量组能显著性升高肝糖元（P<0.05），可皆霉素高剂量组无显著性差异。可见，可皆霉素可以通过促进肝糖元的合成，降低肝糖元的分解等途径，降低糖尿病的血糖水平。

可皆霉素对糖尿病小鼠血清中TCH和TG的影响结果如表4所示。从表4可以看出，与空白组相比，模型组小鼠TCH含量显著性的升高 (P<0.05)；给药治疗7 d后，与模型组相比，可皆霉素高低剂量组均能显著性的降低TCH和TG的含量（P<0.001，P<0.001；P<0.05，P<0.05）；与阿卡波糖阳性对照组相比，可皆霉素高低剂量组能显著性的降低TCH的含量（P<0.001，P<0.001），降低TG含量无显著性差异（P>0.05）。可见，可皆霉素能通过降低血清中总胆固醇（TCH）和TG的含量，来改善高血脂这种糖尿病并发症，纠正糖尿病小鼠的脂质代谢紊乱，且其作用强于或相当于阳性对照阿卡波糖、二甲双胍。

表4 可皆霉素对糖尿病小鼠血清中TCH和TG的影响 (`x±s，n=10)

可皆霉素对糖尿病小鼠血清MDA和SOD的影响如表5所示：

表5 可皆霉素对糖尿病小鼠血清MDA和SOD的影响 (`x±s，，n=10 )

由表5可以看出，与空白组相比，模型组小鼠血清中MDA含量极显著性升高（P<0.001），SOD水平极显著性降低（P<0.001）。给药治疗7 d后，与模型组相比，可皆霉素高低剂量组均能显著性的降低MDA含量（P<0.001）和升高SOD水平（P<0.001）；与阳性对照组相比，可皆霉素高低剂量组均能显著性的升高SOD水平（P<0.001，P<0.001；P<0.05，P<0.05），降低MDA含量无显著性差异（P>0.05）。可见，可皆霉素能通过降低血清中MDA的含量，升高SOD水平，增强糖尿病小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基的进一步伤害，且其作用强于或相当于阳性对照阿卡波糖、二甲双胍。

Claims

1.可皆霉素作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗糖尿病药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，可皆霉素在制备升高肝糖元药物中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，可皆霉素在制备升高超氧化物歧化酶水平药物中的应用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，可皆霉素在制备降低血清中甘油三脂、丙二醛和总胆固醇中任一种或几种含量药物中的应用。