CN105198974A

CN105198974A - 一种植物耐逆性Na+(K+)/H+交换蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105198974A
Application number: CN201410269676.0A
Authority: CN
Inventors: 邱丽娟; 关荣霞; 赫卫; 刘林; 夏明月; 常汝镇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性Na⁺(K⁺)/H⁺交换蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的蛋白质。实验证明，GmNcl1转基因拟南芥耐盐，且耐低钾，GmNcl1转基因大豆耐盐。本发明对于培育高度耐盐和耐低钾的作物品种，具有很高的应用价值。

Description

一种植物耐逆性Na+(K+)/H+交换蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物耐逆性Na⁺(K⁺)/H⁺交换蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种与植物耐盐和耐低钾性相关的大豆Na⁺(K⁺)/H⁺交换蛋白GmNcl1及其编码基因与应用。

背景技术

土壤中高浓度的盐分对作物造成渗透胁迫和离子毒害，盐分胁迫影响着植物产量、蛋白质合成和光合作用以及能量代谢，从而影响作物的生长，严重导致作物减产。全世界至少有20％耕地盐渍化，我国各种盐渍土壤资源总面积约达9913万公顷，大部分位于大豆主产区。土壤次生盐碱化日趋严重，次生盐碱地的面积逐渐增加。因此，提高农作物的耐盐能力，对于扩大可耕地面积，增加和稳定作物产量，具有重要的意义。大豆是一种中度耐盐的作物，解析大豆耐盐胁迫反应的机制，不仅对于植物生物学本身的理论研究意义重大，而且对于耐盐育种及提高大豆抗胁迫能力的转基因策略具有重要的指导意义。

离子胁迫和渗透胁迫是高盐毒害的两个主要方面，维持细胞内无机离子的平衡对于提高植物的耐盐能力有着很重要的作用，无机离子也是植物细胞渗透调节的重要物质，能维持细胞的渗透压。造成植物盐害的主要离子是Na⁺，而K⁺是重要的渗透调节组分，在盐碱土地或含盐量较高的土壤中生长的作物往往承受着双毒害作用：Na⁺的毒害和K⁺的亏缺。植物对盐胁迫形成一系列生理机制，主要包括Na⁺的外排、Na⁺的区隔化和限制Na⁺向叶片运输等，这些机制都需要Na⁺(K⁺)/H⁺交换蛋白的参与。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白质及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为GmNcl1，来源于大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种铁丰8号，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将(a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐逆性相关的蛋白质。

为了便于GmNcl1蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述GmNcl1蛋白的基因(命名为GmNcl1)；所述GmNcl1基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述GmNcl1蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由2520个核苷酸组成，第1-2520位为ORF，编码序列表中序列1所示的GmNcl1蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述GmNcl1基因转录的启动子具体为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为如下(I)或(II)：

(I)在pBI121载体的酶切位点中插入所述GmNcl1基因得到的重组质粒。所述酶切位点具体为XbaI和XhoI。

(II)在pCAMBIA3300载体的酶切位点中插入所述GmNcl1基因得到的重组质粒。所述酶切位点具体为XbaI和BamHI。

所述表达盒由能够启动所述GmNcl1基因表达的启动子，所述GmNcl1基因，以及转录终止序列组成。

所述GmNcl1蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)调控植物的耐逆性；

(a2)选育耐逆性增强的植物品种。

在本发明中，所述调控植物的耐逆性具体体现在：在所述植物体内，若所述GmNcl1基因的表达量越高，则所述植物的耐逆性越强。

在本发明中，所述选育耐逆性增强的植物品种的方法，具体可包括将所述GmNcl1基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆性增强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a)向目的植物中导入所述GmNcl1蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，耐逆性增强的转基因植物。

所述GmNcl1蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述GmNcl1蛋白的基因(即GmNcl1基因)是所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述GmNcl1蛋白的DNA分子；

所述GmNcl1基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，也可通过最小化线性转化元件(如：以pCAMBIA3300-GmNcl1载体为模板通过巢式PCR方法扩增得到包括T-DNA右边界序列+35S启动子+序列2+NOS终止子+T-DNA左边界序列的DNA片段)导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述耐逆性为如下中的至少一种：耐盐性、耐低钾。

进一步，所述盐可为100-200mMNaCl，如100-125mMNaCl、125-175mMNaCl或200mMNaCl。所述低钾可为0.1-1mMK⁺。

在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物。如：大豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

在本发明中，所述植物为拟南芥或大豆。进一步，所述拟南芥为拟南芥Columbia生态型；所述大豆为大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄35或大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄57。

实验证明，GmNcl1转基因拟南芥耐盐，且耐低钾，GmNcl1转基因大豆耐盐。GmNcl1转基因拟南芥于苗期在含有100-125mMNaCl的MS培养基中生长7天，其根长和莲座直径均显著大于未转基因的对照植株；GmNcl1转基因拟南芥于营养生长期和生殖生长期用125-175mMNaCl水溶液处理，其莲座直径和花序长度均显著大于未转基因的对照植株；GmNcl1转基因拟南芥经0.1-1mMK⁺处理，其根长和莲座直径均显著大于未转基因的对照植株。GmNcl1转基因大豆经200mM的NaCl水溶液处理，其存活率显著高于未转基因的对照植株。可见，本发明对于培育高度耐盐和耐低钾的作物品种，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为GmNcl1转基因拟南芥的RT-PCR鉴定结果。M,Maker；1，野生型；2-6，转化GmNcl1基因拟南芥株系。

图2为GmNcl1转基因拟南芥幼苗期耐盐性鉴定结果。A：5天龄GmNcl1转基因纯合体株系(L57和L43)和野生型拟南芥的幼苗从正常的MS培养基上转移至含有0、100或125mMNaCl的MS培养基上生长7d；B和C：野生型对照和GmNcl1转基因植株在含有0、100或125mMNaCl的MS培养基上处理7d的根长和莲座直径。*表示与相应对照相比，差异显著(P<0.05)；**表示与相应对照相比，差异显著(P<0.01)。

图3为GmNcl1转基因拟南芥营养生长期和生殖生长期的耐盐性鉴定结果。A：三周龄GmNcl1转基因纯合体株系(L57、L55和L43)和野生型拟南芥的幼苗浇含有0、125或175mMNaCl水溶液后生长二周；B：野生型对照和GmNcl1转基因植株在含有0、125或175mMNaCl的土壤上处理二周的莲座直径；C：野生型对照和GmNcl1转基因植株在含有0、125或175mMNaCl的土壤上处理四周的花序长；D：三周龄GmNcl1转基因纯合体株系(L57、L55和L43)和野生型拟南芥的幼苗浇含有0、125或175mMNaCl的水溶液后生长四周。**表示与相应对照相比，差异显著(P<0.01)。

图4为GmNcl1转基因拟南芥耐低钾鉴定结果。A：5天龄GmNcl1转基因纯合体株系(L57、L55和L43)和野生型拟南芥的幼苗从正常的MS培养基上转移至含有20、1或0.1mMK⁺的MS培养基上生长7d；B和C：野生型对照和GmNcl1转基因植株在含有20mM、1mM或0.1mMK⁺的MS培养基上处理7d的根长和莲座直径。*表示与相应对照相比，差异显著(P<0.05)；**表示与相应对照相比，差异显著(P<0.01)。

图5为GmNcl1转基因大豆的PCR鉴定结果。M,Maker；1-6，过表达GmNcl1基因株系；7，野生型；8，阳性对照：质粒pCAMBIA3300-GmNcl1。

图6为GmNcl1转基因大豆的Southern鉴定结果。1-7，过表达GmNcl1基因株系；8，野生型中黄35；9，野生型中黄57；10，质粒pCAMBIA3300-GmNcl1经内切酶HindⅢ酶切。

图7为GmNcl1转基因大豆的耐盐性鉴定结果。A：10d龄GmNcl1转基因株系G62和野生型受体亲本大豆(中黄57)的幼苗含200mMNaCl的土壤上约生长10d；B：10d龄GmNcl1转基因株系G12和野生型受体亲本大豆(中黄35)的幼苗含200mMNaCl的土壤上生长15d；C：野生型对照(中黄57)和GmNcl1转基因株系G62在含有200mMNaCl的土壤上约处理10d的存活率；D：野生型对照(中黄35)和GmNcl1转基因株系G12在含有200mMNaCl的土壤上15d的存活率。其中，ZH35表示大豆品种中黄35；ZH57表示大豆品种中黄57。**表示与相应对照相比，差异显著(P<0.01)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种铁丰8号：统一编号：ZDD00738，中国国家种质资源库提供。记载于“中国大豆品种志，吉林省农业科学院主编，1985年新华书店发行”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄35：统一编号：ZDD24636，中国国家种质资源库提供。记载于“王晓光,赵念力,魏建军,董钻.中黄35大豆超高产实例分析.大豆科学,2011年06期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄57：统一编号：ZDD24656，中国国家种质资源库提供。记载于“刘章雄,孙石,李卫东,陈立军,常汝镇,邱丽娟.1983-2010年北京市大豆育成品种的亲缘关系分析.作物学报,2013年09期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

拟南芥Columbia生态型：记载于“孙晶,杨今朝,于涛.拟南芥莲座叶芥子油苷对聚乙二醇模拟干旱的响应.安徽农业科学,2010年13期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pBI121载体：记载于“王华新,曹家树,向珣,余小林,叶纨芝.pBI121表达载体及其转化植株的快速鉴定.浙江大学学报(农业与生命科学版),2008年02期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCAMBIA3300载体：记载于“杨俊杰.植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建.齐鲁师范学院学报，2012年05期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

农杆菌菌株GV3101：记载于“肖卫民,赵名琛,邹敏,苏承刚,杜小兵,谭远德,张兴国.拟南芥受伤和接种根癌农杆菌GV3101对转录的影响.农业生物技术学报,2013年05期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、大豆GmNcl1基因的获得

从大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种铁丰8号的幼苗叶片提取RNA并反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。

F1：5'-GCCTCTAGAATGCATATGGCGTTGAACATAA-3'(斜体下划线部分为序列2的第1-22位)；

R1：5'-GTTGGATCCTTACACTACGTTGTCGTTTGATATTG-3'(斜体下划线部分为序列2的第2495-2520位的反向互补序列)。

PCR反应体系：10×Buffer2μl，dNTP0.25mM，引物F10.1μM，引物R10.1μM，cDNA20ng，Taq酶0.5U，加去离子水至20μl。各浓度为相应组分在反应体系中的终浓度。

PCR反应程序：先94℃5min；然后94℃30S，60℃30S，72℃1min30S，扩增36个循环；最后72℃延伸8min。

反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，所得PCR产物大小约为2538bp。进一步对其进行序列测定，其核苷酸序列为“GCCTCTAGA+序列2+GGATCCAAC”。将序列2所示基因命名为GmNcl1，整个序列2即为其开放阅读框，编码序列表中序列1所示的蛋白质(命名为GmNcl1)。

实施例2、GmNcl1转基因拟南芥的获得及耐逆性检测

一、GmNcl1转基因拟南芥的获得及鉴定

1、重组表达载体pBI121-GmNcl1的构建

将GmNcl1基因的ORF(序列2)构建与pBI121载体中，并置于35S启动子控制下，具体方法为：

根据上述GmNcl1cDNA序列设计引物F2和R2，序列如下所示：

F2：5'-GCTCTAGAATGCATATGGCGTTGAACATAAC-3'(下划线标注的是XbaI酶识别位点，其后的序列为序列2的第1-23位)；

R2：5'-CCCTCGAGTTACACTACGTTGTCGTTTGATA-3'(下划线标注的是XhoI酶识别位点，其后的序列为序列2的第2498-2520位的反向互补序列)。

从大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种铁丰8号的幼苗叶片提取RNA，并反转录得到第一链cDNA，以该cDNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增。

反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，所得PCR产物大小为2536bp。将扩增得到的片段用XbaI和XhoI双酶切，将得到的酶切片段插入到pBI121载体的XbaI和XhoI酶识别位点之间，得到重组载体。将经XbaI和XhoI双酶切初步鉴定正确(得到大小约为13700bp和2536bp两个目的条带)的重组载体送样测序，经过测序表明将pBI121载体的酶切位点XbaI和XhoI之间的小片段替换为“序列2”所示DNA片段的重组载体命名为pBI121-GmNcl1。

在重组表达载体pBI121-GmNcl1中，启动所述GmNcl1基因(序列2)转录的启动子为35S启动子。

2、GmNcl1转基因拟南芥的获得

用农杆菌介导法获得GmNcl1转基因拟南芥，具体如下：

(1)重组农杆菌的获得

将重组载体pBI121-GmNcl1通过冻融法(参考文献：HolstersM,deWaeleD,DepickerA,MessensE,vanMontaguM,SchellJ.TransfectionandtransformationofAgrobacteriumtumefaciens[J].MolecularandGeneralGenetics,1978,183:181-187.)转入农杆菌菌株GV3101，获得重组菌，将该重组菌利用PCR方法验证。将经引物F2和R2(序列同上)进行PCR扩增鉴定表明含有GmNcl1基因(PCR目的条带大小约为2536bp)的重组农杆菌命名为GV3101/pBI121-GmNcl1。

同时设置向农杆菌菌株GV3101中转入pBI121空载体的对照。将转入pBI121空载体的重组农杆菌命名为GV3101/pBI121。

(2)农杆菌转化拟南芥

将步骤(1)获得的重组农杆菌GV3101/pBI121-GmNcl1通过蘸花法(参考文献：CloughSJBentAF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal,1998,16:735-743.)转化拟南芥Columbia生态型，获得T₀代GmNcl1转基因拟南芥。

将获得的T₀代GmNcl1转基因拟南芥种子种植在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，获得阳性植株，将获得的阳性植株逐代在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选获得转基因纯合体株系。

采用同样的方法，将步骤(1)获得的重组农杆菌GV3101/pBI121转化拟南芥Columbia生态型，获得转入pBI121空载体的拟南芥株系。

(3)GmNcl1转基因拟南芥的鉴定

以步骤(2)筛选获得的GmNcl1转基因拟南芥株系、转入pBI121空载体的拟南芥株系，及未转基因的拟南芥Columbia生态型为实验材料。

根据上述GmNcl1cDNA序列设计引物F3和R3，序列如下所示：

F3：5'-GCCTAACTCGGCGTGCTCT-3'(序列2的第2316-2334位的反向互补序列)；

R3：5'-TGCTTGTGGACCGTGGATG-3'(序列2的第1844-1862位)。

提取各拟南芥株系的RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用引物F3和R3进行PCR扩增，经鉴定得到一个大小约为491bp目的条带的阳性株系，即为GmNcl1转基因阳性植株，结果如图1。

从鉴定阳性的GmNcl1转基因拟南芥纯合体株系中随机选择三个，分别记作L57、L55和L43，作为耐盐性和耐低钾鉴定的材料。

二、GmNcl1转基因拟南芥的耐逆性检测

1、GmNcl1转基因拟南芥幼苗期耐盐性鉴定

将未转基因的拟南芥Columbia生态型(简称野生型)、步骤一获得的GmNcl1转基因拟南芥纯合体株系L57和L43，以及转入pBI121空载体的拟南芥株系的种子(每个株系的种子粒数均在150以上)均匀的点播于MS培养基上，于4℃放置3天后，转移至培养室于22℃，16h光照/8h黑暗条件下生长5天后，移栽至含0mM或100mM或125mMNaCl的MS培养基中，7天后观察植株生长情况。

结果如图2所示，GmNcl1转基因拟南芥株系L57和L43的生长情况明显优于野生型(WT)，具体表现为：GmNcl1转基因株系的根长显著大于野生型(P<0.01)，莲座直径显著大于野生型(P<0.05)，表现出很高的耐盐性。而转入pBI121空载体的拟南芥株系其表型与野生型相比基本一致，无统计学差异。

2、GmNcl1转基因拟南芥营养生长期和生殖生长期的耐盐性鉴定

将野生型(Columbia生态型)、步骤一获得的GmNcl1转基因拟南芥3个纯合体株系(L57、L55和L43)，以及转入pBI121空载体的拟南芥株系的种子(每个株系的种子粒数均在150以上)均匀的播种于MS培养基上，于4℃放置3天后，转移至培养室于22℃，16h光照/8h黑暗条件下生长1周后，移栽至土壤中生长2周后，用含0mM或125mM或175mM的NaCl盐水处理，并使土壤完全吸透盐水，2周后统计莲座直径，4周后统计花序长。

结果如图3所示，GmNcl1转基因拟南芥株系L57、L55和L43的生长情况明显优于野生型(WT)，具体表现为：GmNcl1转基因株系的花序长长显著长于野生型(P<0.01)，莲座直径显著大于野生型(P<0.01)，表现出很高的耐盐性。而转入pBI121空载体的拟南芥株系其表型与野生型相比基本一致，无统计学差异。

3、GmNcl1转基因拟南芥耐低钾鉴定

将野生型(Columbia生态型)和步骤一获得的GmNcl1转基因拟南芥3个纯合体株系(L57、L55和L43)，以及转入pBI121空载体的拟南芥株系的种子(每个株系的种子粒数均在150以上)均匀的点播于MS培养基上，于4℃放置3天后，转移至培养室于22℃，16h光照/8h黑暗条件下生长5天后，移栽至含20mM(正常)或低钾0.1mM或1mMK⁺的MS培养基中，7天后观察植株生长情况。

结果如图4所示，GmNcl1转基因拟南芥株系L57、L55和L43的生长情况明显优于野生型(WT)，具体表现为：GmNcl1转基因株系的根长显著大于野生型(P<0.05)，莲座直径显著大于野生型(P<0.05)，表现出很强的耐低钾性。而转入pBI121空载体的拟南芥株系其表型与野生型相比基本一致，无统计学差异。

实施例3、GmNcl1转基因大豆的获得及耐逆性检测

一、GmNcl1转基因大豆的获得及鉴定

1、重组表达载体pCAMBIA3300-GmNcl1的构建和最小化线性转化元件的获得

将GmNcl1基因的ORF(序列2)构建至pCAMBIA3300载体中，并置于35S启动子控制下，具体方法为：

根据上述GmNcl1cDNA序列设计引物F4和R4，序列如下所示：

F4：5'-GCCTCTAGAATGCATATGGCGTTGAACATAA-3'(下划线标注的是XbaI酶识别位点，其后的序列为序列2的第1-22位)；

R4：5'-GTTGGATCCTTACACTACGTTGTCGTTTGATATTG-3'(下划线标注的是BamHI酶识别位点，其后的序列为序列2的第2495-2520位的反向互补序列)。

从大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种铁丰8号的幼苗叶片提取RNA，并反转录得到第一链cDNA，以该cDNA为模板，以F4和R4(序列同上)为引物进行PCR扩增。

反应结束后，将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，所得PCR产物大小约为2538bp。将扩增得到的片段用XbaI和BamHI进行不完全双酶切，将得到的酶切片段插入到pCAMBIA3300载体的XbaI和BamHI酶识别位点之间，得到重组载体。将经XbaI和BamHI双酶切初步鉴定正确(因序列2中有一BamHI酶切位点，得到大小约为9538bp、1197bp和619bp三个目的条带)的重组载体送样测序，将经过测序表明将pCAMBIA3300载体的酶切位点XbaI和BamHI之间的小片段替换为“序列2”所示DNA片段的重组载体命名为pCAMBIA3300-GmNcl1。

在重组表达载体pCAMBIA3300-GmNcl1中，启动所述GmNcl1基因(序列2)转录的启动子为35S启动子。

获得最小化线性转化元件的具体方法为：以pCAMBIA3300-GmNcl1载体为模板通过巢式PCR方法扩增得到包括T-DNA右边界序列+35S启动子+序列2+NOS终止子+T-DNA左边界序列的DNA片段。

根据上述载体pCAMBIA3300-GmNcl1序列设计引物槽式PCR引物序列如下所示：

第一轮引物F:5'-TAGTAACATAGATGACACCGC-3'(NOS终止子)

第一轮引物R:5'-GTCCCCAGATTAGCCTTT-3'(35S启动子)

第二轮引物

TF:5'-GTTTACACCACAATATATCCTGCCATAGTAACATAGATGACACCGC-3'(下划线标注的是T-DNA左边界序列，其后是NOS终止子)

第二轮引物

TR:5'-TGTCGCGTAACTTAGGACTTGTGCGAGTCCCCAGATTAGCCTTT-3'(下划线标注的是T-DNA右边界序列，其后是35S启动子)

2、GmNcl1转基因大豆的获得

(1)GmNcl1转基因大豆的获得

受体亲本：大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄35，大豆(Glycinemax(L.)Merr.)品种中黄57。

用子房原位转化法(参考文献：刘明.大豆子房原位转化法的建立与应用,大连理工大学,2011,博士论文.)将步骤1获得的重组表达载体pCAMBIA3300-GmNcl1和最小化线性转化元件分别单独转入受体大豆植株中黄57和受体大豆植株中黄35，获得两个不同受体亲本的T₀代GmNcl1转基因大豆。

(2)GmNcl1转基因大豆的鉴定

将步骤(1)获得的T₀代GmNcl1转基因大豆经PCR和Southern筛选，获得阳性植株。其中，PCR以T₀代GmNcl1转基因大豆的基因组DNA为模板，采用的引物为F5和R5，经鉴定得到一个大小约为1154bp目的条带为阳性株系；Southern筛选用内切酶BglⅡ进行，经鉴定得到大于3714bp条带为阳性株系。

F5：5'-CAGACCCACAAGGAAGAGG-3'(序列2的第306-324位的反向互补序列)；

R5：5'-TTCAGAAAGAATGCTAACCCAC-3’(35S启动子处的序列)。

实验同时设置了步骤(1)获得的转入pCAMBIA3300空载体的大豆株系，以及未转基因的受体亲本大豆(大豆品种中黄35和中黄57)作为对照。另外，还设置了质粒pCAMBIA3300-GmNcl1经内切酶HindⅢ酶切的阳性对照。

PCR扩增结果如图5所示，步骤(1)获得的T₀代GmNcl1转基因大豆得到大小约为1154bp(序列2的第324位-35S启动子)目的条带的植株为阳性，而所有的转入pCAMBIA3300空载体的大豆株系和未转基因的受体亲本大豆均未扩增出目的条带。Southern筛选结果如图6所示，泳道1、3、5和6所示的T₀代GmNcl1转基因大豆得到大于3714bp条带为阳性株系，泳道2、4和7所得条带片段太小，没有完整的表达盒。而未转基因的受体亲本大豆(泳道8和9)株系无转基因特异性条带。转入pCAMBIA3300空载体的大豆株系也无转基因特异性条带。

从经过以上PCR和Southern筛选鉴定均为阳性的两个受体亲本的T₀代GmNcl1转基因大豆中各随机选择一个株系，其中从大豆品种中黄35作为亲本的T₀代GmNcl1转基因大豆中选取的株系记为G12，从大豆品种中黄57作为亲本的T₀代GmNcl1转基因大豆中选取的株系记为G62，作为其耐盐性鉴定的材料。

二、GmNcl1转基因大豆的耐逆性检测

将未转基因的大豆品种中黄35、未转基因的大豆品种中黄57、步骤一获得的GmNcl1转基因大豆株系G12(受体亲本为大豆品种中黄35、转化步骤1中的最小化线性转化元件)、GmNcl1转基因大豆株系G62(受体亲本为大豆品种中黄57、转化步骤1中的重组表达载体pCAMBIA3300-GmNcl1)，以及转入pCAMBIA3300空载体的大豆品种中黄35和转入pCAMBIA3300空载体的大豆品种中黄57的种子(每个株系的种子粒数均在100以上)均匀的点播于营养土中，于25℃，16h光照/8h条件下生长10天后，用含200mM的NaCl盐水处理，并使土壤完全吸透盐水，约10-15左右观察植株生长情况。叶片没有萎蔫的植株计为存活，存活率为存活的植株数占处理的总植株数的百分数。

结果如图7所示，步骤一获得的GmNcl1转基因大豆株系G62的存活率为87.13％，而未转基因的大豆品种中黄57只有50.30％存活。当未转基因的大豆品种中黄35无存活时，步骤一获得的GmNcl1转基因大豆株系G12仍有59.38％存活率，表明GmNcl1基因有助于提高转基因大豆植株的耐盐性。而转入pCAMBIA3300空载体的大豆品种中黄35和转入pCAMBIA3300空载体的大豆品种中黄57，与相应的野生型亲本受体相比其存活率基本一致，无统计学差异。

Claims

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中，启动所述基因的转录的启动子为35S启动子。

7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4-6中任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：

(a1)调控植物的耐逆性；

(a2)选育耐逆性增强的植物品种。

8.培育耐逆性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为如下中的至少一种：耐盐性、耐低钾。

10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。