CN105124137A - 一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌菌液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌菌液的方法，属于动物发酵饲料领域。本发明方法采用饲料原料为主要原料，搅拌均匀以后，灭菌，装入无菌的发酵容器中，按固态基质重量接入5％乳酸菌液和95％的无菌水，混合均匀，35℃培养24h后，用18-20倍体积的含200U/g蛋白类饲料原料的酸性蛋白酶和400U/g淀粉类饲料原料的淀粉酶的0.5％无菌葡萄糖溶液洗涤，将流出液收集至带搅拌的培养罐中，37℃，30r/min培养2-4h，乳酸菌数可以达到10⁹/mL以上。固态发酵基质每16-24h可以洗涤1次，总共可以重复洗涤8次。本发明为发酵饲料行业，如发酵豆粕、发酵花生粕、发酵棉粕和发酵菜籽粕等的乳酸菌种子生产提供了技术基础，适合大面积推广和应用。

Description

一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌菌液的方法

技术领域

本发明涉及一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌菌液的方法，属于动物发酵饲料领域。

背景技术

当前影响我国养殖业发展速度和质量的一个重要因素是饲料原料总量不足。饲料工业的主要原料为谷物原料(约占60％)、蛋白质原料(约占30％)和添加剂等。由于我国人多地少的国情，粮食、经济与饲料作物三元种植结构不平衡矛盾长期以来无法得到有效解决，原料供应成为饲料工业发展的瓶颈，尤其是蛋白质饲料原料不足，现在是、将来也是限制我国饲料工业发展的最重要因素。

目前我国饲料工业使用的蛋白类原料主要包括植物蛋白、动物蛋白和微生物蛋白三大类。植物蛋白类原料主要是各类饼、粕等，占蛋白饲料的70％以上。但植物蛋白饲料中含有多种抗营养因子，如动物免疫系统对植物蛋白中的抗原蛋白特别敏感，可造成对局部体液免疫力的影响，引起过敏反应，导致腹泻、生产性能下降甚至死亡，并能引起肠粘膜损害，造成肠道消化吸收能力下降以及黏膜双糖分解酶的数量及活性降低；植物蛋白中的棉籽糖和水苏糖主要被肠道中的有益微生物发酵，如果含量过高，发酵产气过多可能导致肠胃胀气，同时，发酵产物也影响肠黏膜与血浆间的渗透压，严重时可导致腹泻。这些抗营养因子的存在，严重阻碍了植物蛋白的有效利用。

同时，饲料原料中含有有害或致病微生物，在饲料的运输和保藏过程中，往往会导致有害或致病微生物的大量繁殖，在规模化养殖下，最终导致动物发病、甚至死亡，更有甚者引起疫情。在饲料中添加亚适量抗生素可以减少或消除动物疾病的发生。然而，它在带来巨大经济效益的同时，也愈加凸显潜在的巨大危害，尤其给饲料工业、养殖业的健康发展和人类的健康带来的负面影响更加明显。已引起了世界畜牧业发展各国的高度警惕，美国、日本、欧盟等对动物源性食品中抗生素残留均提出较严格的限量标准，最大残留限量越来越低。欧盟(2006年)、日本(2008年)和韩国(2011年)已经开始禁止所有抗生素在饲料中的使用。重视食品安全，特别是养殖业中滥用抗生素是亟待解决的问题，国内建议立法禁止饲料滥用抗生素的呼声越来越高。

在上述的背景下，发酵蛋白饲料发展迅速，有益微生物及其代谢产物会抑制有害或致病性微生物的生长，提高了饲料的安全性。同时，产品中的有益代谢产物(乳酸、抗菌肽等)进入动物肠道，有利于改善动物肠道的微生态平衡，促进有益微生物的繁殖，抑制有害细菌如大肠杆菌，沙门氏菌等的生长，提高免疫力，降低发病率。这在一定程度上，提高蛋白的利用率，取消抗生素的添加，为市场提供高品质、高安全性的动物源食品，保障人的生命安全和健康。然而，由于发酵饲料生产成本较高，据不完全统计，目前仅有50万吨左右发酵蛋白饲料，和饲料工业约5000万吨的蛋白饲料原料相比，还有很大的差距。

目前用于饲料发酵的乳酸菌菌液是通过三级以上逐级扩培制备的，存在周期长(约72小时)，设备投入大(如发酵饲料每天投料，需配套3套种子扩大培养设备)和培养成本高(合成培养基，多次蒸汽灭菌)等不足。

因此，开发一种可连续制备用于发酵饲料的乳酸菌的方法，为发酵蛋白提供高效、便捷和经济的乳酸菌菌种，降低菌种生产成本，促进发酵蛋白饲料产业发展具有重要的经济效益和社会效应。

发明内容

针对现有发酵蛋白饲料生产成本较高，产业发展意愿不足的情况下，本发明提供了一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌的方法，该法工艺简单，可重复使用多次，生产周期短，由该法制备的乳酸菌可广泛应用于目前发酵豆粕、发酵棉粕和发酵花生粕等发酵饲料的生产中。

所述方法是以饲料原料为主要原料，搅拌均匀、灭菌得固态基质，接入乳酸菌液和无菌水，混合均匀后装入底部带有筛孔的发酵容器中进行固态发酵，于35℃培养24h后，用含蛋白酶和淀粉酶的无菌葡萄糖溶液洗涤，将流出液收集后于37℃、震荡或搅拌培养2-4h，即得乳酸菌菌液；固态发酵基质每16-24h洗涤1次，流出液培养2-4h得乳酸菌菌液。

在本发明的一种实施方式中，所述饲料原料包括蛋白类饲料原料和淀粉类饲料原料。

在本发明的一种实施方式中，所述原料，按质量分数计，含有豆粕或花生粕或菜籽粕或棉粕30％、麸皮40％和玉米粉30％。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌菌液为固态基质的5％v/w，无菌水加入量为固态基质的95％v/w。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是采用厌氧发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述洗涤用的葡萄糖溶液的体积为固态发酵基质体积的18-20倍。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖溶液中蛋白酶添加量为200U/g蛋白类饲料原料。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶为酸性蛋白酶。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖溶液中淀粉酶添加量为400U/g淀粉类饲料原料，葡萄糖的浓度为0.5％m/v。

在本发明的一种实施方式中，所述洗涤是总共洗涤2-8次。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

采用豆粕(30％)、麸皮(40％)和玉米粉(30％)为主要原料，搅拌均匀以后，121℃灭菌30分钟，加入5％(v/w)乳酸菌液和95％(v/w)的无菌水，混合均匀，装入底部带有筛孔的无菌发酵容器中，35℃培养24h后，用18-20倍体积的0.5％(m/v)无菌葡萄糖溶液洗涤(洗涤溶液中含有200U/g蛋白类饲料原料的酸性蛋白酶和400U/g淀粉类饲料原料的淀粉酶)，将流出液收集，37℃，30r/min培养2-4h以内，固态发酵基质继续培养，每16-24h洗涤1次，流出液再培养2-4h得乳酸菌菌液。

本发明的有益效果：

(1)按本发明的方法，可以实现乳酸菌菌液的连续化培养，而且培养周期短，流出液培养2-4h即可达到10⁹个/mL以上，适合用于发酵饲料工业，克服了常规发酵饲料工业需要3级以上扩大培养制备乳酸菌而导致的发酵周期长(大于72小时)、效率低、成本高(每吨发酵饲料的种子培养成本约50元)的问题；

(2)本发明方法具有普遍适用性，申请人随机选择了多株乳酸菌进行试验，重复洗涤8次后培养4h内都能使乳酸菌数达到10⁹个/mL以上；

(3)加入的蛋白酶和淀粉酶部分残留在固态基质上，可以进一步降解固态基质中的蛋白质和淀粉，为固态培养乳酸菌提供丰富的营养，另一部分蛋白酶和淀粉酶随着洗涤液进入种子液中，为液体种子的增殖提供更多的营养物质；

(4)按本发明的方法制备得到的乳酸菌菌液，用于发酵饲料，相对于常规培养的乳酸菌，能够更快地适应环境进行生长，如在发酵豆粕和棉子粕中，采用本方法培养的菌种可以诱导产生α-半乳糖苷酶，降解豆粕和棉子粕中的棉籽糖和水苏糖，从而迅速生长，发酵周期从原来的72小时减少到60小时。

具体实施方式

实施例1：按以下方法制备乳酸菌菌液

采用豆粕(30％)、麸皮(40％)和玉米粉(30％)为主要原料，搅拌均匀以后，121℃灭菌30分钟，按固态基质重量接入5％(v/w)戊糖片球菌CGMCCNo.9182的菌液和95％(v/w)的无菌水，混合均匀，装入无菌的高径比为5：1的发酵容器中(底部筛板，高纯度的超高分子量聚乙烯)，35℃培养24h后，用20倍体积的含200U/g蛋白类饲料原料的酸性蛋白酶，400U/g淀粉类饲料原料的淀粉酶的0.5％无菌葡萄糖溶液洗涤，将流出液收集至带搅拌的培养罐中，37℃，30r/min培养4h，乳酸菌数达到5.2×10⁹个/mL以上。固态发酵基质每24h洗涤1次，重复洗涤8次，37℃，30r/min培养4h，乳酸菌数分别达到5.2×10⁹个/mL，4.2×10⁹个/mL，4.4×10⁹个/mL，3.6×10⁹个/mL，3.2×10⁹个/mL，3.2×10⁹个/mL，2.8×10⁹个/mL和2.2×10⁹个/mL。

实施例2：按以下方法制备乳酸菌菌液

采用棉粕30份、麸皮40份和玉米粉30份为主要原料，搅拌均匀以后，121℃灭菌30分钟，按固态基质重量接入5％(v/w)植物乳杆菌CGMCCNO.7184的菌液和95％(v/w)的无菌水，混合均匀，装入无菌的高径比为5：1的发酵容器中(底部筛板，高纯度的超高分子量聚乙烯)，35℃培养24h后，用18倍体积的0.5％无菌葡萄糖溶液(含200U/g蛋白类饲料原料的酸性蛋白酶、400U/g淀粉类饲料原料的淀粉酶)洗涤，将流出液收集至带搅拌的培养罐中，37℃，30r/min培养2h，乳酸菌数达到3.2×10⁹个/mL以上。固态发酵基质每16h洗涤1次，重复洗涤8次，37℃，30r/min培养4h，乳酸菌数分别达到3.2×10⁹个/mL，3.2×10⁹个/mL，2.4×10⁹个/mL，2.6×10⁹个/mL，2.2×10⁹个/mL，1.5×10⁹个/mL，1.8×10⁹个/mL和1.2×10⁹个/mL。

实施例3：本发明的乳酸菌菌液在发酵饲料方面的应用

常规乳酸菌种子液的制备方法：戊糖片球菌经活化斜面接入MRS培养基37℃培养36h，而后以5％接种量进行逐级扩培24h，直至足够的固态发酵用量，如0.2L至4L至80L至1600L，用于30吨的发酵饲料；MRS培养基(g·L^-1)：葡萄糖20，牛肉膏10，胰蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄2，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，MgSO₄0.1，MnSO₄·H₂O0.05，吐温-801，pH自然，121℃灭菌20min。

将本方法和常规方法制备的种子液5％(v/m)和无菌水95％(v/m)混合均匀后，加入至无菌的豆粕中，37±5℃分别发酵60和72小时后烘干。

采用本方法制备的菌液发酵速度快(发酵8小时就开始产生大量的代谢产物，pH降低至5.4，棉籽糖和水苏糖含量开始降低，而常规方法则延迟至16小时，pH才降至5.4)、发酵周期明显缩短(发酵60小时总酸含量达到3.8％，而常规方法发酵72小时总酸含量才达到3.8％)。

实施例4：制备工艺对乳酸菌菌液的影响

(1)洗涤溶液体积对菌液质量的影响：

将洗涤液改为8倍固态发酵基质的体积，其他步骤与实施例2一致，结果发现菌液体积过少时，达不到发酵要求；

将洗涤液改为30倍固态发酵基质的体积，结果发现洗涤、扩培4小时后得到的菌液中菌体浓度仅为2.5×10⁸个/mL，需要培养10小时后才达到1.2×10⁹个/mL，导致培养周期过程，而且重复洗涤次数只能保持4次。

(2)酸性蛋白酶添加量：

发明人发现，每次洗涤的时候添加酸性蛋白酶(50U/g蛋白类饲料原料)过少，会影响乳酸菌浓度，除了第一次和第二次达到要求外，其余的都低于10⁹个/mL，洗涤前4次的结果分别为2.2×10⁹个/mL，1.6×10⁹个/mL，3.4×10⁸个/mL，3.6×10⁸个/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种连续制备用于发酵饲料的乳酸菌的方法，其特征在于，所述方法是以饲料原料为主要原料，搅拌均匀、灭菌得固态基质，接入乳酸菌液和无菌水，混合均匀后装入底部带有筛板的发酵容器中进行固态发酵，于35℃培养24h后，用含蛋白酶和淀粉酶的无菌葡萄糖溶液洗涤，将流出液收集后于37℃、震荡或搅拌培养2-4h，即得乳酸菌菌液；固态发酵基质每16-24h洗涤1次，流出液培养2-4h得乳酸菌菌液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤是总共洗涤2-8次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤用的葡萄糖溶液的体积为固态发酵基质体积的18-20倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液中蛋白酶添加量为200U/g蛋白类饲料原料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为酸性蛋白酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌菌液为固态基质的5％v/w，无菌水加入量为固态基质的95％v/w。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶的含量为400U/g淀粉类饲料原料，葡萄糖的浓度为0.5％(m/v)。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料按质量份数计，含有豆粕或花生粕或菜籽粕或棉粕30份、麸皮40份和玉米粉30份。

9.根据权利要求1-8任一所述方法得到的乳酸菌菌液。

10.权利要求9所述乳酸菌菌液在发酵饲料方面的应用。