CN105012959A - 一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶及其制备方法,包括:(1)海藻酸钠和抗肿瘤药物的溶解混合;(2)超声条件下,混合液与交联剂溶液反应并定容;(3)透析纯化冷冻干燥处理,即得絮状海藻酸钠纳米凝胶产品。本发明工艺简单、操作安全、反应条件温和,通过控制反应物浓度可获得表面带有负电荷、粒径范围在170~700nm的凝胶。粒径为170-220nm的凝胶,呈现规则的球形结构,能够负载多种亲水性抗肿瘤药物,具有显著的药物控释效果,能够有效抑制肿瘤的生长,具有在癌症治疗领域应用的潜能和广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶及其制备方法,属于纳米材料及其制备技术领域。
背景技术
纳米凝胶是指尺寸为纳米级(10-1000nm)的、由高分子经化学或物理交联后形成的三维网状结构。纳米凝胶作为药物载体,可显著提高药物的生物利用度和药物在体内的输送与释放性能,是一类安全的、具有潜在生物医学应用价值的体系。
在过去的十年中,多重刺激响应性的药物传输系统已经在癌症诊断和治疗的研究中获得快速发展。众所周知,肿瘤细胞外环境pH值(pH~6.5)比血液pH值(pH~7.4)低,而且内涵体和溶酶体的pH值(pH 5.0~5.5)更低。因此,设计含有pH响应性的纳米凝胶,如结构中含有羧基、氨基等含离子键、酯键、腙键等可水解断裂的化学键,作为pH响应性的药物输送载体已被广泛开发并应用于癌症的治疗中。
化学交联的纳米凝胶通常是由本体或微乳液等聚合合成。传统的制备方法中,大多需要使用有机试剂,如有毒有害的溶剂、催化剂、偶联剂或表面活性剂等。然而,这些化学物质在最终使用前很难除尽,从而影响健康。而且,这种多步制备策略经常会造成环境负荷、高成本、低产量以及质量可靠性差等问题。物理交联的纳米凝胶是通过分子结构中的疏水作用、静电相互作用或氢键以及离子键的吸引力形成三维网状结构的纳米凝胶。此外,作为FDA认可的安全无毒的天然高分子,海藻酸钠由于其良好的生物相容性、生物降解能力和螯合作用,已广泛应用于各种生物医学领域,如组织工程和药物输送等。
pH响应性海藻酸钠纳米凝胶以海藻酸钠为基材,多价金属盐为交联剂,采用超声法一步制得。利用海藻酸钠中存在的羧基与肿瘤药物间的静电相互作用,实现对药物的包载;通过改变制备条件可以有效调控其尺寸大小。本发明以海藻酸钠为基材成功制备了一系列高载药量且粒径在170nm-700nm的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶。本发明不需要使用任何有机试剂,可一步合成绿色纳米载药凝胶,该纳米凝胶在药物控释领域的应用有十分重要的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶及其制备方法,该方法绿色环保、工艺简单,具有广阔的市场前景。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶,其特征在于:所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶包括海藻酸钠和交联剂,所述交联剂为氯化钙、碳酸钙/葡萄糖酸内酯、氯化铝多价盐中的一种或多种混合,其中所述海藻酸钠与所述交联剂的电荷配比为1.0:0.3-2.0。
按上述方案,所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶还包括抗肿瘤药物,所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素含氨基的亲水性药物中的一种或多种混合,所述海藻酸钠中羧基与抗肿瘤药物的摩尔比为10–3:1。
按上述方案,所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶平均粒径为170nm-700nm。
按上述方案,所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶平均粒径为170nm-220nm。
所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)将海藻酸钠溶解在超纯水中;
(2)超声处理同时缓慢滴加交联剂溶液,至海藻酸钠与交联剂的电荷配比为1.0:0.3-2.0时停止滴加,用超纯水定容至海藻酸钠的质量浓度为0.05~0.5mg/mL后继续搅拌2h;
(3)将步骤(2)所得溶液在超纯水中透析,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
按上述方案,步骤(1)所述溶液中还添加有抗肿瘤药物,按海藻酸钠中羧基和抗肿瘤药物10–3:1的摩尔比进行溶液混合。
按上述方案,所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素含氨基的亲水性药物中的一种或多种混合,所述交联剂为氯化钙、碳酸钙/葡萄糖酸内酯、氯化铝多价盐中的一种或多种混合。
按上述方案,超声处理时间为10-60分钟。
所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶作为抗肿瘤药物载体的应用。
本发明的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶制备工艺简单、条件温和、凝胶尺寸可控,反应可选择的交联剂种类多。针对不同病情及部位,本发明所制备的海藻酸钠纳米凝胶可负载不同抗肿瘤药物及负载量以达到更好的治疗目的,在肿瘤治疗领域具有很好的应用前景。
附图说明
附图1为本发明实施例1-5制备的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶粒径和电位分布图;
附图2为本发明实施例6-8制备的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶粒径和电位分布图;
附图3为本发明实施例9-11制备的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶粒径和电位分布图;
附图4为本发明实施例10制备的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶粒径(a)、电位(b)分布图和透射电镜图(c);
附图5为本发明实施例13制备的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶药物释放图;
附图6为本发明实施例14制备的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶的细胞毒性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
在三口烧瓶中,加入0.2mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.225mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图1所示,分别为350-375nm、-31.2mV。
实施例2
在三口烧瓶中,加入0.2mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.225mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为13.3mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图1所示,分别为300-355nm、-34.2mV。
实施例3
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图1所示,分别为170-210nm、-37.2mV。
实施例4
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为8.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图1所示,分别为375-410nm、-39.8mV。
实施例5
在三口烧瓶中,加入0.8mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.90mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为8.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图1所示,分别为600-700nm、-42.5mV。
实施例6
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.225mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图2所示,分别为390-435nm、-38.5mV。
实施例7
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图2所示,分别为185-212nm、-35.8mV。
实施例8
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.90mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
所得纳米凝胶的平均粒径和电位如图2所示,分别为265-334nm、-33.7mV。
实施例9
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液和0.05mL 4mg/mL的盐酸阿霉素(DOX)溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠载药纳米凝胶。
所得载药纳米凝胶的平均粒径和电位如图3所示,分别为325-425nm、-37.5mV。
实施例10
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液和0.10mL 4mg/mL的盐酸阿霉素(DOX)溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠载药纳米凝胶。
所得载药纳米凝胶的平均粒径和电位如图3所示,分别为170-225nm、-34.5mV。
实施例11
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液和0.25mL 4mg/mL的盐酸阿霉素(DOX)溶液,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.45mL 0.01mol/L氯化钙溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠载药纳米凝胶。
所得载药纳米凝胶的平均粒径和电位如图3所示,分别为390-410nm、-33.5mV。
实施例12
在三口烧瓶中,加入0.4mL 5mg/mL海藻酸钠水溶液,0.10mL 4mg/mL的盐酸阿霉素(DOX)溶液和0.46mg碳酸钙,并用超纯水进行稀释,搅拌0.5h;然后在超声条件下,将0.90mL 0.01mol/L葡萄糖酸内酯溶液缓慢滴加到上述反应液中,用超纯水定容至最终体积为20.0mL,搅拌2h。所得粗产品溶液在超纯水中透析四次,所用透析袋的截留分子量为10KDa,得到纳米凝胶的水溶液,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠载药纳米凝胶。
所得载药纳米凝胶的平均粒径和电位分别为325-360nm、-30.5mV。
上述实施例中,选择实施例10中海藻酸钠的单元节羧基与钙离子的电荷配比为1.0:1.0、海藻酸钠和盐酸阿霉素(DOX)的质量比为5.0:1.0的条件,作为最后制备pH响应型海藻酸钠纳米凝胶的优化条件。
上述实施例10所得的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶的平均粒径和电位如图4a和4b所示,分别为170-225nm,电位为-34.5mV,与透射电镜(TEM)相符合(图4c)。
实施例13
以实施例10来研究本发明制备的海藻酸钠载药纳米凝胶的pH响应性,其药物释放曲线如图5所示。50h时,在pH 5.0的环境下DOX的释放量达到98%以上,而在pH 7.4的环境下仅有38%。
实施例14
以实施例10来研究本发明制备的pH响应性海藻酸钠载药纳米凝胶的细胞毒性,结果如图6所示。以宫颈癌HeLa细胞和小鼠成纤维3T3细胞为模型,考察纳米凝胶的毒性及其对细胞的生长抑制能力。结果表明,纳米凝胶本身基本无毒,共培育48h后,HeLa细胞和3T3细胞的相对存活率仍高达95%以上(图6a)。同时,载药纳米凝胶可以有效抑制HeLa细胞的生长,其IC50为0.26μg/mL,达到与DOX(IC50为0.18μg/mL)相当的水平。需要强调的是,该载药纳米凝胶可有效降低药物对正常细胞的毒副作用。在相同的DOX剂量下(如1.09μg/mL),载药纳米凝胶对3T3细胞的相对存活率仍高于70%,而游离的DOX对该细胞的相对存活率仅有10%(图6b)。
Claims (9)
1.一种pH响应性海藻酸钠纳米凝胶,其特征在于:所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶包括海藻酸钠和交联剂,所述交联剂为氯化钙、碳酸钙/葡萄糖酸内酯、氯化铝多价盐中的一种或多种混合,其中所述海藻酸钠与所述交联剂的电荷配比为1.0:0.3-2.0。
2.根据权利要求1所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶,其特征在于:所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶还包括抗肿瘤药物,所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素含氨基的亲水性药物中的一种或多种混合,所述海藻酸钠中羧基与抗肿瘤药物的摩尔比为10–3:1。
3.根据权利要求1所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶,其特征在于:所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶平均粒径为170nm-700nm。
4.根据权利要求3所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶,其特征在于:所述pH响应性海藻酸钠纳米凝胶平均粒径为170nm-220nm。
5.权利要求1所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)将海藻酸钠溶解在超纯水中;
(2)超声处理同时缓慢滴加交联剂溶液,至海藻酸钠与交联剂的电荷配比为1.0:0.3-2.0时停止滴加,用超纯水定容至海藻酸钠的质量浓度为0.05~0.5mg/mL后继续搅拌2h;
(3)将步骤(2)所得溶液在超纯水中透析,经冷冻干燥,得到絮状的海藻酸钠纳米凝胶。
6.根据权利要求5所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述溶液中还添加有抗肿瘤药物,按海藻酸钠中羧基和抗肿瘤药物10–3:1的摩尔比进行溶液混合。
7.根据权利要求6所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶的制备方法,其特征在于:所述抗肿瘤药物为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素含氨基的亲水性药物中的一种或多种混合,所述交联剂为氯化钙、碳酸钙/葡萄糖酸内酯、氯化铝多价盐中的一种或多种混合。
8.根据权利要求5所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶的制备方法,其特征在于:超声处理时间为10-60分钟。
9.权利要求1所述的pH响应性海藻酸钠纳米凝胶作为抗肿瘤药物载体的应用。
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