CN104931549A - 一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，包括绝缘基片、工作电极和参考电极；工作电极上喷涂有催化血液同型半胱氨酸反应的生物酶，以及一种能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质和粘合剂。本发明还提供了一种上述电化学试纸的制备方法，将敏感的生物元件生物酶、导电介质和粘合剂等从丝印材料中分离，以非接触的喷涂方式印刷在电极支持物上。该电化学试纸采用酶试剂和印刷电路迭合的结构，试剂稳定性好，电流信号强度高，可使用全血、血清或血浆作为标本，测定人体同型半胱氨酸的含量，且成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，与掌上型电化学检测仪配套使用，更为方便快捷，尤其适于急诊、病床旁和家庭检测。

Description

一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，尤其涉及一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸及其制备方法。

背景技术

同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物。有关其代谢紊乱的报道最早来源于先天性胱硫醚合成酶缺乏导致出现同型半胱氨酸尿患者的观察。此后，又相继发现其他几种参与HCY代谢的酶或辅酶改变所引起的代谢紊乱。近几年来，随着测定技术方法的改进，已经能够对正常人血浆中以各种形式存在的HCY进行测定，并且发现在心、脑及外周血管疾病、慢性肾功能不全、牛皮癣、维生素B12缺乏等疾病的患者中存在HCY的代谢紊乱。对同型半胱氨酸的研究始于20世纪70年代，1969年首次提出高同型半胱氨酸血症可致动脉粥样硬化并可形成血栓后，人们逐渐发现人体血清中同型半胱氨酸的含量与冠心病、脑血管疾病、外周血管疾病和静脉血栓的发生和发展有着密切的关系，而且随着同型半胱氨酸含量的增加发生血管疾病的危险也呈递增趋势。

高同型半胱氨酸通过氧自由基介导引起血管内皮损伤，不同浓度的血清HCY还可通过抑制内皮细胞DNA的合成，影响内皮功能及细胞形态改变，并促使血管平滑肌细胞增殖，导致动脉粥样硬化。血清HCY可使血小板受损，使血小板的黏附性和聚集性增加。血清HCY尚能改变花生四烯酸代谢，使血栓素A2合成增加，血栓素A2具有收缩血管和促血小板聚集的作用。血清HCY还通过抑制凝血酶调节蛋白在内皮细胞表面的表达及活性，进一步抑制蛋白C的激活，影响凝血酶的灭活。血清HCY还能增加组织因子的活性，激活凝血酶，导致血管系统的血栓少形成。

目前越来越多的资料显示HCY与脑血管病有着紧密的联系。甚至有人认为HCY水平升高是脑血管病的一项独立危险因素和重要危险因子。研究分析表明，随着血浆HCY水平的增高，患缺血性脑血管病的相对危险度逐渐增加，与非HCY患者相比，HCY患者患缺血性脑血管病相对危险度增加。此外，研究还发现，不论是缺血性脑血管病患者，还是脑梗死和TIA患者，其血浆HCY水平均高于对照组，提示HCY水平升高可能与缺血性脑血管病的发病密切相关。脑梗死与TIA患者血浆HCY水平相比无显著性差异，表明HCY水平与缺血性脑血管病的类型可能无关。

目前有关HCY测定方法有气相色谱-质谱联用法、氨基酸分析仪、高效液相色谱法、全自动荧光偏振免疫法、高效毛细管电泳法和酶法等。

气相色谱-质谱联用法：所用的仪器为气相色谱-质谱仪，标本的处理过程包括:先加入三种内标:同型胱氨酸，胱氨酸和L-（甲基-²H₃）蛋氨酸，然后加EDTA-Na₂和β-巯基乙醇100℃、15min，再以磺基水杨酸沉淀蛋白，上清液用离子交换柱预处理，氮气吹干后，用水重新溶解，进行衍生处理后上样.气相色谱仪进样温度250℃，毛细血管柱箱温度180℃，以8℃/min速度升温至276℃，柱前端压力为26psi，以保留时间和质谱进行定性和定量。气相色谱-质谱联用法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，现除了在某些专门的实验室进行测定外，普及很困难。

氨基酸分析仪法和高效液相色谱法：氨基酸分析仪和高效液相色谱法(HPLC)这两种方法都属色谱分离技术，HPLC由于其分离的高效率和检测方式灵敏而更常用一些。HPLC根据所用的色谱柱(反相柱或离子交换柱)、衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方式(紫外或荧光)又分为多种测定方法。其中以Fiskerstrand等报道的方法较有代表性。血液标本以EDTA-Na₂抗凝，0℃-4℃，2000g离心5min，磺基水杨酸沉淀蛋白质，上清液再与NaBH₄溶液反应，还原二硫键，衍生化试剂为0.025mol/L的Monobromobimane，反应3min后以冰醋酸终止反应。20ul衍生化后的样本进入一根150mm X4.6mm ODS柱。色谱柱预先以pH3.5的硝酸铵缓冲液平衡，用含有乙腈的流动相进行梯度洗脱，用荧光检测器激发波长365nm，发射波长475nm检测。这两种方法耗时长且不适宜大规模自动化的测定。全自动荧光偏振免疫法和高效毛细管电泳法等方法也都存在类似的缺点。

酶法测定血清同型半胱氨酸反应原理：基于小分了捕获技术SMT的S-腺苷同型半胱氨酸的方法，这种方法测定迅速、准确，适合医院内大规模测定样本。该方法不适合于基层医院检验场所应用，尤其不适合于家庭方式检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种同型半胱氨酸电化学试纸及其制作方法，使该试纸一旦接触人体体液后，可在相应的配套测试仪器上方便直观的读出测试结果，其制作方法简单，方便后期加工和封装，有利于规模化生产。

本发明的第一个方面是提供一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，包括一绝缘基片、设置在绝缘基片上的工作电极和参考电极；所述绝缘基片上设有电回路，在绝缘基片的一端设有与读出仪表相连的导线，所述工作电极上喷涂有催化血液同型半胱氨酸反应的生物酶，以及一种能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质和粘合剂。

优选地，所述生物酶为同型半胱氨酸甲基转移酶或D-蛋氨酸氧化酶。

优选地，所述工作电极和参考电极均为双层导电薄膜，包括碳涂层和设置在碳涂层与绝缘基片之间的导电银层。

优选地，所述碳涂层中含有1.2-2.5wt%的粘合剂、10-20wt%的导电介质、以及余量的导电碳材料。

优选地，所述导电介质为苯醌、铁氰化钾或二茂铁甲酸。

优选地，所述粘合剂为羟乙基纤维素、羟甲基纤维素和聚乙二醇中的一种或多种。

优选地，所述绝缘基片一种韧性好、绝缘度高的聚合材料，如聚氯乙烯、聚酯或聚碳酸酯。

工作电极与参考电极靠近，两个电极构成一个有效反应区域，在同测试仪连接后，组成有效体液成分测试系统。

本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸的制备方法。采用生物传感及电化学原理，通过丝网和喷涂印刷相结合的方法制作上述试纸，丝网印刷局限于印制导电线路，仅作为导通，将比较敏感的生物元件从丝印材料中分离，采用非接触的喷涂方式印刷在电极支持物上，喷涂材料的喷涂量和喷涂面积完全由电脑精确控制。

所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，导电碳材料的制备：导电碳墨中加入1.2-2.5wt%的粘合剂，加入10-20wt%的能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质，混匀备用；

生物酶液的制备：将生物酶加入到50-120mmol/L的磷酸缓冲液中，同时添加在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质，其中，生物酶的浓度为20-100国际单位/L，导电介质的浓度为200-800mg/L；

步骤2，参考电极的制备：通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上，得到参考电极；

工作电极的制备：通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上，然后喷涂印刷生物酶液，得到工作电极。

优选地，通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上的具体操作为：

1）将100-300目数的金属或尼龙聚酯材料丝网固定在方型轻质金属框加上，在暗室内涂上感光胶，干燥备用；

2）将计算机绘制的工作电极和参考电极负片置于感光胶上，于10-30瓦紫外灯下曝光10-20分钟，用高压水枪冲洗去被电极负片覆盖的未硬化感光胶，干燥后形成丝印模板；

3）将带有工作电极和参考电极图形的丝印模板安装于自动丝印机上备用；

4）将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上。

优选地，磷酸缓冲液中生物酶为同型半胱氨酸甲基转移酶，其活性浓度为50-100国际单位/L，或者所述生物酶为D-蛋氨酸氧化酶，其活性浓度为20-50国际单位/L。

本发明提供的制备方法将丝网印刷局限于印制导电线路，仅起导通作用，从而降低了工艺制作要求；丝印材料和丝印设备不必特殊加工，通过市售渠道即可获得，成本很低；将比较敏感的生物元件如酶、导电介质和粘合剂等从丝印材料中分离，以非接触的喷涂方式印刷在电极支持物（工作电极）上，消除了复合丝印方式因反复接触式印刷对生物敏感材料带来的不利影响；由于喷涂印刷技术已臻于完善，所要喷涂的材料完全可由电脑精确控制其喷涂量和面积，使最终产品的精度和重复性得到充分保障。本发明试纸一旦接触人体体液后，可在相应的配套测试仪器上方便直观的读出测试结果，制作方法简单，精度高，成本低，方便后期加工和封装，有利于规模化生产。

本发明提供的定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸采用酶试剂和印刷电路迭合的结构，试剂稳定性好，电流信号强度高，可使用全血、血清或血浆作为标本，测定人体同型半胱氨酸的含量。试纸成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，与一台掌上型电化学检测仪配套使用，使用更为方便快捷，尤其适合于急诊、病床旁和家庭检测。

附图说明

图1为本发明提供的定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸的结构示意图。

具体实施方式

参照图1，本发明提供的定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，包括一绝缘基片1，在绝缘基片1上印有工作电极2和参考电极3；绝缘基片1上印有电回路，在绝缘基片1的一端设有与读出仪表相连的导线4。

工作电极2上喷涂有催化血液同型半胱氨酸反应的生物酶，以及一种能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质和粘合剂。如此构成一个电路回路，反应时根据血液中同型半胱氨酸浓度的高低，产生相应大小的电流信号，并被测试仪检测读出。被测试的物质为同型半胱氨酸，使用的生物酶可以为同型半胱氨酸甲基转移酶或D-蛋氨酸氧化酶。

工作电极和参考电极均为双层导电薄膜5，包括碳涂层和设置在碳涂层与绝缘基片之间的导电银层。碳涂层中含有1.2-2.5wt%的粘合剂、10-20wt%的导电介质、以及余量的导电碳材料。

所述导电介质可以为苯醌、铁氰化钾或二茂铁甲酸。

所述绝缘基片一种韧性好、绝缘度高的聚合材料，如聚氯乙烯、聚酯或聚碳酸酯。

下面参照具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

实施例1

本实施例提供了一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，按照下述方法制备而成。

材料准备：

1）聚氯乙烯（PVC）板材，预先切成150×150公分基板备用。

2）在1克丝印导电碳墨中加入1.2wt%的羟乙基纤维素，加入10wt%的导电介质苯醌，混匀制得导电碳材料备用。

3）将200目数的金属丝网固定在方型轻质金属框加上，在暗室内涂上柯达感光胶，干燥备用。

4）将计算机绘制的工作电极和参考电极负片置于3）中干燥后的感光胶上，于20瓦紫外灯下曝光10分钟，用高压水枪冲洗去被电极负片覆盖的未硬化感光胶。干燥后形成丝印模板。

5）将带有工作电极和参考电极图形的丝印模板安装于自动丝印机上备用。

6）将活性为65国际单位的同型半胱氨酸甲基转移酶，配入60毫摩尔每升的磷酸缓冲液中，同时添加苯醌或铁氰化钾每升300毫克，充分溶解后搁置4℃冰箱备用。

在上述自动丝网印刷机上添加导电银材料进行导电线路的印刷；干燥后在自动丝网印刷机上加入2）中得到的导电碳材料，将先前印制的银墨线路覆盖，分别制成工作电极和参考电极。印制完的电极需搁置于60℃烘箱内固化30分钟，在每一片PVC基片上形成50对工作和参考电极，然后取出备用。制作可测试同型半胱氨酸的酶试纸时，取出已制成的基础工作电极和参考电极，将上述6）制得的生物酶液加入到自动精密喷涂仪的存储瓶中，通过计算机设置间距和液滴大小，然后均匀喷涂在制成的工作电极和参考电极的设定部位。该部位位于工作电极和参考电极的工作反应端约5×5mm的区间内。

上述电极制成干燥后，将一约10mm宽的聚酯网膜覆盖在反应区上，然后用绝缘丝印油墨印制在工作和参考电极的非反应部位，露出反应区间。喷涂印刷完的电极片在干燥条件下室温干燥3小时。用剪切机将干燥的测试片切成35mm长，0.8mm宽的测试条成品。

将已制成的测试条，置于测试仪中并在工作电极和参考电极两段施加220mV工作电压，测定不同浓度的同型半胱氨酸，结果表明反应发生10秒后，显示制作电极良好的测试重复性和相关性。经同生化分析仪比较，分别取50份同型半胱氨酸质控液和50份脑中风病人血样同型半胱氨酸对照测试，其相关性γ达到0.9567，测试条的相对标准误差为CV≤6.5%。

实施例2

本实施例提供了一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，按照下述方法制备而成。

材料准备：

1）聚酯（PE）板材，预先切成150×150公分基板备用。

2）在丝印导电碳墨中加入1.2wt%的羟乙基纤维素，加入10wt%的导电介质苯醌，混匀制得导电碳材料备用。

3）将300目数的尼龙聚酯材料丝网固定在方型轻质金属框加上，在暗室内涂上柯达感光胶，干燥备用。

4）将计算机绘制的工作电极和参考电极负片置于3）中干燥后的感光胶上，于20瓦紫外灯下曝光15分钟，用高压水枪冲洗去被电极负片覆盖的未硬化感光胶。干燥后形成丝印模板。

5）将带有工作电极和参考电极图形的丝印模板安装于自动丝印机上备用。

6）将活性为50国际单位的D-蛋氨酸氧化酶，配入80毫摩尔每升的磷酸缓冲液中，同时添加苯醌或铁氰化钾每升500毫克，充分溶解后搁置4℃冰箱备用。

喷涂等后续制作方法同实施例1,。

将已制成的测试条，置于测试仪中并在工作电极和参考电极两段施加300mV工作电压，测定不同浓度的同型半胱氨酸，结果表明反应发生15秒后，显示制作电极良好的测试重复性和相关性。经同生化分析仪比较，分别取30份同型半胱氨酸质控液和20份脑中风病人血样同型半胱氨酸对照测试，其相关性γ达到0.967，测试条的相对标准误差为CV≤5.7%。

实施例3

本实施例提供了一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，按照下述方法制备而成。

材料准备：

1）聚酚酯（PP）板材，预先切成150×150公分基板备用。

2）在丝印导电碳墨中加入2.5wt%的羟乙基纤维素，加入20wt%的导电介质苯醌，混匀制得导电碳材料备用。

3）将250目数的金属丝网固定在方型轻质金属框加上，在暗室内涂上柯达感光胶，干燥备用。

4）将计算机绘制的工作电极和参考电极负片置于3）中干燥后的感光胶上，于30瓦紫外灯下曝光15分钟，用高压水枪冲洗去被电极负片覆盖的未硬化感光胶。干燥后形成丝印模板。

5）将带有工作电极和参考电极图形的丝印模板安装于自动丝印机上备用。

6）将活性为100国际单位的同型半胱氨酸甲基转移酶，配入100毫摩尔每升的磷酸缓冲液中，同时添加苯醌或铁氰化钾每升800毫克，充分溶解后搁置4℃冰箱备用。

喷涂等后续制作方法同实施例1,。

将已制成的测试条，置于测试仪中并在工作电极和参考电极两段施加400mV工作电压，测定不同浓度的同型半胱氨酸，结果表明反应发生20秒后，显示制作电极良好的测试重复性和相关性。经同生化分析仪比较，分别取50份同型半胱氨酸质控液和50份脑中风病人血样同型半胱氨酸对照测试，其相关性γ达到0.97，测试条的相对标准误差为CV≤8.1%。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸，包括一绝缘基片、设置在绝缘基片上的工作电极和参考电极；所述绝缘基片上设有电回路，在绝缘基片的一端设有与读出仪表相连的导线，其特征在于，所述工作电极上喷涂有催化血液同型半胱氨酸反应的生物酶，以及一种能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质和粘合剂。

2.根据权利要求1所述的电化学试纸，其特征在于，所述生物酶为同型半胱氨酸甲基转移酶或D-蛋氨酸氧化酶。

3.根据权利要求1所述的电化学试纸，其特征在于，所述工作电极和参考电极均为双层导电薄膜，包括碳涂层和设置在碳涂层与绝缘基片之间的导电银层。

4.根据权利要求1所述的电化学试纸，其特征在于，所述碳涂层中含有1.2-2.5wt%的粘合剂、10-20wt%的导电介质、以及余量的导电碳材料。

5.根据权利要求1或4所述的电化学试纸，其特征在于，所述导电介质为苯醌、铁氰化钾或二茂铁甲酸。

6.根据权利要求1或4所述的电化学试纸，其特征在于，所述粘合剂为羟乙基纤维素、羟甲基纤维素和聚乙二醇中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的电化学试纸，其特征在于，所述绝缘基片为聚氯乙烯、聚酯或聚碳酸酯。

8.一种权利要求1所述的定量测定同型半胱氨酸的电化学试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，导电碳材料的制备：导电碳墨中加入1.2-2.5wt%的粘合剂，加入10-20wt%的能在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质，混匀备用；

生物酶液的制备：将生物酶加入到50-120mmol/L的磷酸缓冲液中，同时添加在酶催化反应中心和电极之间进行电子传递的导电介质，其中，磷酸缓冲液中生物酶的活性浓度为20-100国际单位/L，导电介质的浓度为200-800mg/L；

步骤2，参考电极的制备：通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上，得到参考电极；

工作电极的制备：通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上，然后喷涂印刷生物酶液，得到工作电极。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，通过丝网印刷技术将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上的具体操作为：

1）将100-300目数的金属或尼龙聚酯材料丝网固定在方型轻质金属框加上，在暗室内涂上感光胶，干燥备用；

2）将计算机绘制的工作电极和参考电极负片置于感光胶上，于10-30瓦紫外灯下曝光10-20分钟，用高压水枪冲洗去被电极负片覆盖的未硬化感光胶，干燥后形成丝印模板；

3）将带有工作电极和参考电极图形的丝印模板安装于自动丝印机上备用；

4）将导电银材料和导电碳材料印在绝缘基片上。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，磷酸缓冲液中生物酶为同型半胱氨酸甲基转移酶，其活性浓度为50-100国际单位/L，或者所述生物酶为D-蛋氨酸氧化酶，其活性浓度为20-50国际单位/L。