CN104865235B - 一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，属于荧光银纳米簇应用技术领域。在O2存在下，葡萄糖氧化酶(GOx)催化氧化葡萄糖可以生成H2O2，H2O2与Fe2+发生“芬顿反应”产生的自由基用于引发甲基丙烯酸(MAA)聚合，聚合产物聚甲基丙烯酸(PMAA)作为稳定剂可以通过紫外光还原法制备荧光银纳米簇(Ag NCs)，利用获得的纳米簇荧光发射强度与葡萄糖浓度建立定量关系，从而实现对葡萄糖浓度的检测。这种方法制备的Ag NCs粒径均匀且尺寸小于2nm，并且具有很好的橙色荧光发射。该种方法对葡萄糖的检测是一个荧光“turn‑on”的过程，通过优化制备条件，可以获得最优的葡萄糖检测条件。
Description
技术领域
本发明属于荧光银纳米簇应用技术领域，具体涉及一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法。
背景技术
金属纳米簇是尺寸接近电子的费米波长、介于金属原子和纳米粒子之间的一类新型材料，由于纳米簇具有超小的尺寸，使其具有较强的荧光发射、良好的稳定性以及较好的生物相容性等优点，因此在生物小分子检测领域具有很高的应用价值。
葡萄糖是生物体内一种重要的碳水化合物，它是人体新陈代谢必需的一种营养物质，是细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物。葡萄糖浓度的异常通常可以引起严重的疾病，如糖尿病等，因此，在生命科学和临床医学中葡萄糖检测是十分重要的。目前，尽管已有报道利用荧光金属纳米簇能够实现对葡萄糖的检测(Nano Lett.,2013,13,309-314；Biosens.Bioelectron.,2011,26,1965-1969；Anal.Chim.Acta.,2012,749,56-62)，但这些方法均是利用葡萄糖催化氧化的产物双氧水对纳米簇的荧光淬灭作用实现的，这种荧光“turn-off”的方法可能会难以避免检测时假阳性信号的干扰。因此，需要一种利用荧光金属纳米簇实现对葡萄糖检测的荧光“turn-on”方法。
发明内容
本发明提供了一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的荧光“turn-on”方法。在O2存在下，葡萄糖氧化酶(GOx)催化氧化葡萄糖可以生成H2O2，H2O2与Fe2+发生“芬顿反应”产生的自由基用于引发甲基丙烯酸(MAA)聚合，聚合产物聚甲基丙烯酸(PMAA)作为稳定剂可以通过紫外光还原法制备荧光银纳米簇(Ag NCs)，利用获得的纳米簇荧光发射强度与葡萄糖浓度建立定量关系，从而实现对葡萄糖浓度的检测。
这种方法制备的Ag NCs粒径均匀且尺寸小于2nm(图1)，并且具有很好的橙色荧光发射(图2)。通过优化制备条件，可以获得最优的葡萄糖检测条件。
本发明所述的一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，具体步骤如下：
(1)将不同终浓度(225～1200μM)的D-葡萄糖水溶液混合于终浓度为5μg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)和pH值为5～6、终浓度为5mM的柠檬酸缓冲溶液中，加入去离子水使总体积为400μL，然后置于30～40℃水浴锅中温育2～3h；
(2)在上述步骤(1)的溶液中加入终浓度为100～500mM(优选为400mM)的甲基丙烯酸(MAA)、终浓度为1mM的FeSO4和pH值为2.5～3.5、终浓度为10mM的柠檬酸缓冲溶液以及适量的去离子水使混合后的总体积为500μL，室温放置20～60min，用分子量为500～1500Da的透析袋透析12～24h；
(3)取200μL步骤(2)制得的溶液加入终浓度为20mM的AgNO3，pH值为4.0～5.0、终浓度为10mM的HAc-NaAc缓冲溶液以及适量的去离子水使混合后的总体积为400μL，将样品置于波长为302nm的紫外光下辐照2～8分钟(优选为4分钟)，然后在波长为480nm的激发光下测试495～800nm的荧光发射光谱；取荧光发射光谱中荧光发射最强处荧光强度的数值对葡萄糖浓度的对数值作图，建立荧光发射强度与葡萄糖浓度的定量关系曲线；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量未知浓度的D-葡萄糖水溶液的荧光发射光谱，将所得荧光发射光谱中荧光发射最强处荧光强度的数值代入步骤(3)的定量关系曲线，从而得到D-葡萄糖水溶液的浓度。
本发明检测葡萄糖浓度具有以下特点：在检测葡萄糖的过程中原位制备荧光银纳米簇，而非使用事先制备好的荧光金属纳米簇；获得的银纳米簇具有优良的荧光性质；葡萄糖的检测是一个荧光“turn-on”的过程，可以有效避免检测过程中假阳性信号可能带来的干扰。
附图说明
图1为实施例1葡萄糖浓度为600μM所制备的荧光Ag NCs的透射电镜照片，表明制备的Ag NCs粒径小于2nm；
图2为实施例1中葡萄糖浓度为600μM所制备的荧光Ag NCs的荧光光谱(Ex为荧光激发光谱，Em为荧光发射光谱)；其中插图为在自然光下和紫外光下Ag NCs水溶液的照片，表明Ag NCs具有橙色荧光；
图3为实施例1不同葡萄糖浓度下所制备的Ag NCs荧光发射光谱；箭头所示方向为葡萄糖浓度增加的方向；
图4为实施例1拟合的荧光发射强度与葡萄糖浓度的定量关系曲线；
表1为不同浓度的葡萄糖制备的Ag NCs对应的荧光发射强度最大值。
表1：不同浓度葡萄糖制备的Ag NCs荧光发射强度最大值
具体实施方式
实施例1
将不同浓度(分别为225、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100和1200μM)的D-葡萄糖分别混合于终浓度为5μg/mL的GOx和pH值为5.5、终浓度为5mM的柠檬酸缓冲溶液中，加入一定体积的水使总体积为400μL，将样品置于37℃水浴锅中温育2h。加入终浓度为400mM的MAA、终浓度为1mM的FeSO4和pH值为3.0、终浓度为10mM的柠檬酸缓冲溶液以及适量的去离子水，使混合后总体积为500μL，室温放置30min，用分子量为1000Da的透析袋透析12h。取出上述200μL溶液加入终浓度为20mM的AgNO3，pH值为4.5、终浓度为10mM的HAc-NaAc缓冲溶液以及适量的水，使混合后样品体积为400μL，将样品置于波长为302nm的紫外光下辐照4分钟，然后分别测试在波长为480nm的激发光下495～800nm的荧光发射光谱(图3)。取葡萄糖浓度在225～1100μM范围内对应的荧光发射最强处荧光强度的数值对葡萄糖浓度的对数值作图，建立荧光发射强度与葡萄糖浓度的定量关系曲线，不同浓度葡萄糖制备的纳米簇对应的荧光发射强度最大值如表1所示，拟合后标准曲线的经验公式为y＝412.7x-917.4(y为荧光光谱中荧光强度最大值，x为葡萄糖浓度的对数值)。
实施例2
配置浓度为550μM的葡萄糖溶液作为未知浓度葡萄糖样品来检验检测方法的准确度，步骤与实施例1相同，我们测试四组数据，其荧光发射强度分别200.5、219.1、205.4、201.9，而由标准曲线计算得出的荧光发射强度标准值为212.1，与标准值相比每次检测葡萄糖浓度的相对误差分别为5.5％、3.3％、3.2％、4.8％，平均误差为4.2％。
Claims (3)
1.一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，具体步骤如下：
(1)将D-葡萄糖水溶液混合于葡萄糖氧化酶GOx和柠檬酸缓冲溶液中，加入去离子水使总体积为400μL，使得D-葡萄糖的终浓度为225～1200μM，葡萄糖氧化酶GOx的终浓度为5μg/mL，柠檬酸缓冲溶液终浓度为5mM，溶液的pH值为5～6，然后置于30～40℃水浴锅中温育2～3h；
(2)在上述步骤(1)的溶液中加入甲基丙烯酸MAA、FeSO4水溶液和柠檬酸缓冲溶液，加入去离子水使混合后的总体积为500μL，使得甲基丙烯酸MAA的终浓度为100～500mM，FeSO4的终浓度为1mM，柠檬酸缓冲溶液的终浓度为10mM，溶液的pH值为2.5～3.5，室温放置20～60min，用分子量为500～1500Da的透析袋透析12～24h；
(3)取200μL步骤(2)制得的溶液加入AgNO3水溶液，HAc-NaAc缓冲溶液，加入去离子水使混合后的总体积为400μL，使得AgNO3的终浓度为20mM，HAc-NaAc缓冲溶液的终浓度为10mM，溶液的pH值为4.0～5.0，将样品置于波长为302nm的紫外光下辐照2～8分钟，然后在波长为480nm的激发光下测试495～800nm的荧光发射光谱；取荧光发射光谱中荧光发射最强处荧光强度的数值对葡萄糖浓度的对数值作图，建立荧光发射强度与葡萄糖浓度的定量关系曲线；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量未知浓度的D-葡萄糖水溶液的荧光发射光谱，将所得荧光发射光谱中荧光发射最强处荧光强度的数值代入步骤(3)的定量关系曲线，从而得到D-葡萄糖水溶液的浓度。
2.如权利要求1所述的一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的甲基丙烯酸MAA的终浓度为400mM。
3.如权利要求1所述的一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的紫外光下的辐照时间为4分钟。
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