CN104844704B - Ub‑Nanoluc、Ub‑Ub‑GS‑Nanoluc报告基因系统及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新的Ub‑Nanoluc报告基因系统和Ub‑Ub‑GS‑Nanoluc报告基因系统，以及其在去泛素化酶活性检测以及通量化筛选去泛素化酶抑制剂中的应用，所述Ub‑Nanoluc报告基因DNA序列如SEQIDNO.1所示，所述Ub‑Ub‑GS‑Nanoluc报告基因DNA序列如SEQIDNO.4所示。本发明利用荧光素酶Nanoluc高灵敏性的特性，提出了利用化学发光报告基因去检测去泛素化酶活性及高通量筛选其抑制剂的方法，为筛选研制新的药物包括抗肿瘤药物提供新的作用靶点和新思路，有广泛应用前景，具有巨大社会经济效益。

Description

Ub-Nanoluc、Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统及其构建和 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Ub-Nanoluc报告基因系统以及Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统，及其在去泛素化酶活性检测中的应用，在通量化筛选去泛素化酶抑制剂或激动剂中的应用。

背景技术

泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway)是细胞内一个重要的蛋白质降解调节系统。通过对底物蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解，可以影响或调节多种细胞活动，包括：基因转录、细胞周期、免疫反应、细胞配体受体功能及肿瘤生长、炎症发生等。

去泛素化酶是一类数量很大的蛋白酶家族，这类去泛素化酶通过水解泛素羧基末端的酯键，肽键或异肽键，将泛素分子特异性地从连接有泛素的蛋白或者前体蛋白上水解下来。去泛素化酶可以分为五类：(1)泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)，属于半胱氨酸蛋白酶，通常是小分子蛋白，已发现UCHL1、3、5等分子。它们作用的底物通常也是一些分子量较小的多肽。UCHs可以通过裂解C末端76位甘氨酸，将泛素分子从小的多肽底物上释放出来，使泛素成熟。UCHs活性位点上的狭窄裂隙和环状结构直径的限制在一定程度上起到了特异性识别底物的功能，阻止了它对一些大分子泛素化蛋白的结合和催化。(2)泛素特异性酶家族(USPs)，该家族是目前已知的去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类，大约有50多种半胱氨酸蛋白酶，包括很重要的癌症调控因子USP4、USP7、USP11、USP15、USP21等。这些酶分子都含有两个短而保守的片段即赖氨酸和组氨酸，能将泛素分子从大的底物蛋白上移除。(3)卵巢肿瘤(OTU)相关蛋白酶，这类去泛素化酶与其他去泛素化酶同源性上有不小差别，但也具有Cys，组成的核心结构域，与USP家族蛋白有很大相似性，并且已证明能起到去泛素化的作用。(4)MJD蛋白酶，这一类去泛素化酶主要被研究的是Ataxin-3含有一个称为Josephin的结构域，内含的氨基酸序列与UCH和USPs有一定的相似性。目前已发现Ataxin-3可以水解Ub-AMC。(5)JAMM(Jab1／MPN域相关金属异肽酶)序列。这一序列含有较为保守的两个组氨酸残基和一个天冬氨酸残基，它们与二价锌离子共同构成催化中心，可以在催化结构域结合泛素分子。

从以上分类来看，去泛素化酶在细胞水平上具有如下功能：UCH家族能够使原始的泛素化分子成熟，使泛素化分子的碳末端暴露出来；USP家族去泛素化底物蛋白分子的泛素化链，调节对底物蛋白的降解，剪切非降解的泛素化链，调节底物蛋白的活性以及功能，使泛素化链成为单泛素化修饰，调节修饰的方式，防止泛素被蛋白酶体途径降解，使泛素分子进入细胞循环，可以被重新利用。

于此同时，去泛素化酶也能够发挥一些生理功能，如：

(1)肿瘤与癌症：许多的转录因子与癌症密切相关，例如重要的转录因子p53，p53的表达已经证明了与癌症的发生息息相关，而这个转录因子能够被泛素连接酶mdm2通过泛素蛋白酶体途径降解促进肿瘤的发生。而已经有报道USP7作为去泛素化酶能够在体内体外去泛素化p53从而保护p53不被蛋白酶体所降解，这就暗示了USP7可能作为一个重要的癌症调控因子。同时，现在已经有文献报道许多去泛素化酶在肿瘤细胞中高表达，如JOSD1、CSN5、UCHL1、USP9X在非小细胞肺癌中显著高表达，而USP10、USP11、USP22、USP48和CSN5则在恶性淋巴瘤细胞中高表达，USP1与结直肠癌的初始形成相关而USP2在卵巢癌和前列腺癌中高表达，USP17在食道癌和宫颈癌中高表达，这些高表达的去泛素化酶可能作为一个很好的抗癌药物靶点。

(2)干细胞：干细胞的分化过程中涉及到许多基因的时空特异性表达，去泛素化酶通过调控组蛋白的单泛素化调节目的基因的转录。一项基于分化和未分化干细胞蛋白质组学的差异性研究中显示干细胞核心转录因子NANOG和OCT4可能受到多种泛素连接酶和去泛素化酶的调控。

(3)免疫：NF-κB信号通路在免疫反应中起着非常重要的作用，其中非降解泛素化信号调控了该信号通路的活性，细胞中的去泛素化酶CYLD、USP4、USP2a能够通过水解K63泛素化链影响这一信号通路，进而调控免疫反应。

由此可见，去泛素化酶在生物体内通过其去泛素化活性起着非常重要的生理功能，也可以作为非常好的药物靶点，因此，建立通量化筛选去泛素化酶活性的方法对于癌症治疗研究具有重要意义。在现有技术中，目前已知的高通量筛选去泛素化酶活性的方法主要有Ub-AMC，但是由于Ub-AMC并不能很好模拟泛素链的形成，并且AMC读值激发区域位于紫外激发光区域，受到很多小分子本身激发吸收光谱的影响，会导致大约20％假阳性的产生。其他检测去泛素化酶活性的通量化方法有着高成本、不易获得等缺点，而OTULIN作为一种新的水解线性泛素化链的去泛素化酶，对于Ub-AMC没有水解能力，所以至目前尚未见有报道检测OTULIN活性的有效高通量的方法。

发明内容

本发明的目的在于构建新的检测去泛素化酶活性的Ub-Nanoluc报告基因系统以及检测OTULIN去泛素化酶活性的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统。本发明构建检测去泛素化酶活性的高通量筛选系统及筛选方法，筛选去泛素化酶的抑制剂或者激动剂，从而找到新的诊断标志物和去泛素化酶相关的肿瘤药物靶标。本发明首次提出Ub-Nanoluc报告基因系统可以用来检测一些去泛素化酶的活性，本发明首次提出Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统能有效检测 重要免疫调控因子OTULIN活性。本发明为新的去泛素化酶抑制剂的筛选提供了一条新的途径和选择。

本发明提出的Ub-Nanoluc报告基因系统包括泛素蛋白和Nanoluc荧光素酶，所述泛素蛋白与Nanoluc荧光素酶通过肽腱相连。

本发明Ub-Nanoluc报告基因中，在Nanoluc荧光素酶蛋白分子融合泛素蛋白分子之后，通过泛素分子氮末端融合的6X组氨酸标签固定在镍柱固相介质上。

本发明中，泛素蛋白分子与Nanoluc荧光素酶蛋白分子通过肽腱相连接，该肽键能被去泛素化酶分子所水解，而泛素分子依然固定在镍柱上，Nanoluc分子被释放出来，通过加入底物对Nanoluc分子读值定量。

本发明中，所述Ub-Nanoluc报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述泛素蛋白和所述Nanoluc荧光素酶的连接序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明中，构建pET-28a-Ub-Nanoluc分子克隆的图谱如图8所示。

本发明Ub-Nanoluc分子的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1所示，为：

atgcagatcttcgtgaaaacccttaccggcaagaccatcacccttgaggtggagcccagtgacaccatcgaaaatgtgaaggccaagat ccaggataaggaaggcattccccccgaccagcagaggctcatctttgcaggcaagcagctggaagatggccgtactctttctgactacaacatc cagaaggagtcgaccctgcacctggtcctgcgtctgagaggtggtatggaattcatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgaca gacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaagg attgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaa aaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgat cgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatc gacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggc gta(SEQ IDNO.1)

本发明Ub-Nanoluc报告基因的表达蛋白序列，如SEQ ID NO.2所示，为：

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMEFMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCE RILA(SEQ IDNO.2)

本发明Ub-Nanoluc报告基因系统中，泛素分子和Nanoluc荧光素酶通过肽腱相连，连接序列如SEQ ID NO.3所示，为：

LRLRGG-MEFMVF(SEQIDNO.3)。

本发明还提供了Nanoluc的多克隆抗体，其来自于重组蛋白，作为免疫原产生的特异性抗体。

本发明还提供了Ub-Nanoluc报告基因的制备方法，用分子克隆方法将Nanoluc基因融合在泛素分子之后，构建融合表达的泛素报告基因表达质粒。大肠杆菌诱导纯化His-Ub-Nanoluc，、纯化得到Ub-Nanoluc蛋白，步骤详见实施例1。

本发明还提供了Ub-Nanoluc报告基因在检测去泛素化酶活性、通量化筛选去泛素化酶抑制剂中的应用，方法如下：

本发明还提供了利用Ub-Nanoluc检测去泛素化酶活性的方法，将上述纯化好的蛋白固定在镍柱上，通过在反应溶液中加入去泛素化酶，将Nanoluc从镍柱上切除下来，离心转移上清至白色无吸附力96孔板中，通过加入Nanoluc底物furimazine，在报告基因机器上读值，反映切除下来的Nanoluc的量。通过对Nanoluc量的分析反映去泛素化酶的活性。将Ub-Nanoluc报告基因的蛋白分子固定在介质上，洗去非特异性结合，加入去泛素化酶，孵育，离心去除介质，加入Nanoluc底物，读值检测Nanoluc量，从而检测得到去泛素化酶活性。

本发明还提供了利用Ub-Nanoluc报告基因检测去泛素化酶抑制剂的方法。将所述Ub-Nanoluc报告基因固定在介质上，洗去非特异性结合，加入去泛素化酶与去泛素酶抑制剂孵育混合物(室温孵育30分钟)，经孵育后，离心去除介质，加入Nanoluc底物，读值检测Nanoluc量，从而测得去泛素化酶抑制剂的抑制活性，高通量筛选时His-Ub-Nanoluc用量为50纳克，介质用量为2ul，反应时间为30分钟，反应温度为30摄氏度。

本发明进一步提供了一种Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统，其是基于本发明Ub-Nanoluc报告基因的改进。本发明Ub-Nanoluc报告基因对于不少去泛素化酶都有较好选择性，但对于线性泛素化酶OTULIN却没有作用。因此，本发明进一步构建了针对线性泛素化酶OTULIN的报告基因系统Ub-Ub-GS-Nanoluc，通过设计搭桥引物引物序列(SEQ ID NO.7SEQID NO.11SEQ ID NO.12SEQ ID NO.13)将两个泛素分子串联起来。Ub-Ub连接能够模拟线性泛素化链，被OTULIN水解，而Ub-GS-Nanoluc能够抵抗OTULIN的水解。本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因有关的其他内容，均可参考本发明Ub-Nanoluc报告基因系统。

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因包括泛素蛋白和Nanoluc荧光素酶，所述泛素蛋白与Nanoluc荧光素酶通过肽腱相连。

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因中，pET-28a Ub-Ub-GS-Nanoluc分子克隆的图谱如图9所示。

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示：

atgcagatcttcgtgaaaacccttaccggcaagaccatcacccttgaggtggagcccagtgacaccatcgaaaatgtgaaggccaagat ccaggataaggaaggcattccccccgaccagcagaggctcatctttgcaggcaagcagctggaagatggccgtactctttctgactacaacatc cagaaggagtcgaccctgcacctggtcctgcgtctgagaggtggtatgcagatcttcgtgaaaacccttaccggcaagaccatcacccttgagg tggagcccagtgacaccatcgaaaatgtgaaggccaagatccaggataaggaaggcattccccccgaccagcagaggctcatctttgcaggcaagcagctggaagatggccgtactctttctgactacaacatccagaaggagtcgaccctgcacctggtcctgcgtctgagaggtagtatggaatt catggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagt ttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgt atgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagat cactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaa cggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcgtaa(SEQ ID NO.4)

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的表达蛋白序列，如SEQ ID NO.5所示，为：

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGSMEFMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA(SEQ ID NO.5)

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因中，泛素分子和Nanoluc荧光素酶连接序列如SEQ ID NO.6所示，为：

LRLRGS-MEFMVF(SEQ ID NO.6)

本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因中，泛素分子和泛素分子连接序列如SEQ IDNO.7所示，为：

LRLRGG-MQIFVK(SEQ ID NO.7)

本发明还提供了Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的制备方法：

PCR扩增Ub-Ub-GS片段引物

反义链：5′tttcacgaagatctgcataccacctctcagacgcag3′(SEQ ID NO.12)；

正义链：5′ctgcgtctgagaggtggtatgcagatcttcgtgaaa3′(SEQ ID NO.13)；

反义链：5′gaattccatggaacctctcagacgcaggaccag3′(SEQ ID NO.14)以泛素分子DNA序列为模板，以SEQ ID NO.8SEQ ID NO.12为引物PCR出Ub-Ub-GS上端段，以SEQ IDNO.13SEQ ID NO.14为引物PCR出Ub-Ub-GS下端段，回收两片段，以回收的片段为模板，以SEQ ID NO.8SEQ IDNO.14为引物PCR出Ub-Ub-GS全长，其PCR体系同上，分子克隆构建与Ub-Nanoluc构建过程相同。

本发明还提供了Ub-Ub-GS-Nanoluc融合表达载体并纯化得到Ub-Ub-GS-Nanoluc蛋白，本发明表明Ub-GS-Nanoluc具有抵抗去泛素化酶水解泛素和Nanoluc报告基因之间肽键的能力。

本发明还提供了Ub-Ub-GS-Nanoluc在检测去泛素化酶活性、通量化筛选去泛素化酶抑制剂或激动剂中的应用。

本发明还提供了利用Ub-Ub-GS-Nanoluc检测去泛素化酶OTULIN活性的方法。方法参照上述利用Ub-Nanoluc检测去泛素化酶活性的方法。去泛素化酶OTULIN作为水解线性泛素化链调控免疫信号通路，目前尚没有方法快速有效检测OTULIN活性。本发明基于前述Ub-Nanoluc方法进一步成功改进的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因，用于有效检测OTULIN活性。本发明将线性泛素分子通过分子克隆手段构建在一起并且在其后融合Nanoluc报告基因，测定其对于线性泛素化分子水解活性。

本发明还提供了利用Ub-Ub-GS-Nanoluc检测去泛素化酶OTULIN抑制剂或激动剂的方法。方法参照上述利用Ub-Nanoluc检测去泛素化酶抑制剂或激动剂的方法。

本发明基于前述Ub-Nanoluc进一步构建了Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因(Gly75-Ser76)，OTULIN不能切除Ub-Nanoluc，却可以切除Ub-Ub-GS-Nanoluc，将Ub-GS-Nanoluc从泛素分子后切除，而切除后融合了泛素分子的Nanoluc仍然有报告基因的活性。本发明是首次报道了一种通量化筛选OTULIN的方法。

本发明还提出了一种可调控去泛素化酶活性的物质的筛选方法，所述方法包括：检测该候选物质对本发明报告基因检测反应的影响；其中，若所述候选物质能降低报告基因的读值，则表明该候选物质是可有效抑制去泛素化酶活性的潜在物质；若所述候选物质能提高报告基因的读值，则表明该候选物质是可有效激活去泛素化酶活性的潜在物质。

本发明有益效果包括：本发明构建了融合在泛素分子后Nanoluc荧光素酶基因，即Ub-Nanoluc报告基因、Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因，该报告基因融合在泛素分子之后模拟泛素链的活性，具有高效，灵敏，稳定等优点。本发明利用的报告基因相对于其他报告基因有更小，灵敏度更高，读值更稳定(promega公司数据支持)，可以作为检测去泛素化酶的方法，检测结果明确，易于判断。本发明还构建了Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统及其检测方法，检测去线性泛素化分子OTULIN的活性，并构建了新的检测该去泛素化酶活性的通量化方法。

本发明创新提出了将Nanoluc报告基因与泛素分子通过基因克隆的手段相融合；将构建好的克隆在大肠杆菌中表达，纯化；通过优化的实验条件检测去泛素化酶的活性；小分子化 合物可以作为该反应的抑制剂或者激动剂影响去泛素化酶的活性。本发明揭示了去泛素化酶抑制剂的筛选模型的建立与优化；PR619验证活性抑制检测实验；高通量筛选模型的建立与验证；改进报告基因系统在OTULIN活性检测及小分子化合物筛选中的应用。

附图说明

图1表示利用本发明Ub-Nanoluc的高通量筛选方法的示意图。其中：

图1(a)表示去泛素化酶酶切泛素融合的报告基因的示意图，分别为Ub-Nanoluc，Ub-GFP(绿色荧光蛋白)，Ub-GST(谷胱甘肽S转移酶)。

图1(b)表示利用本发明Ub-Nanoluc的高通量筛选流程示意图。

图2表示去泛素化酶酶切泛素报告基因Western blot结果。其中：

图2(a)表明western blot显示USP15切断泛素与Nanoluc或GFP或GST之间的肽腱链接。

图2(b)western blot显示USP15能将Nanoluc或GFP或GST从固定的介质上释放下来并被检测到。

图3表示去泛素化酶USP15水解Ub-Nanoluc条件的优化。其中：

图3(a)显示了不同浓度的底物蛋白His-Ub-Nanoluc对于反应读值的影响。

图3(b)显示了温度对于去泛素化酶USP15水解底物蛋白his-Ub Nanoluc的反应读值的影响。

图3(c)显示了不同浓度去泛素化酶在不同时间点对于反应读值的影响。

图3(d)显示了不同浓度去泛素化酶在一定时间点对于反应读值的影响。

图4表示本发明Ub-Nanoluc报告基因与Ub-AMC报告基因的比较。其中：

图4(a)显示等同摩尔浓度下本发明Ub-Nanoluc和现有技术Ub-AMC的检测比较。

图4(b)显示去泛素化酶USP14对本发明Ub-Nanoluc和Ub-AMC的不同选择性。

图5表示Ub-Nanoluc检测抑制剂PR619对USP15活性的抑制。其中：

图5(a)显示抑制剂PR619在较广泛范围内对Nanoluc报告基因读值没有影响。

图5(b)显示利用Ub-Nanoluc报告基因检测抑制剂PR619对USP15活性的抑制。

图5(c)显示Ub-AMC方法检测抑制剂PR619对USP15活性的抑制。

图6表示高通量筛选稳定性的检测。

图7表示利用本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc检测OTULIN去泛素化酶活性的方法。其中：

图7(a)显示OTULIN能水解Ub-Ub-GS-Nanoluc而不能水解Ub-Nanoluc。

图7(b)显示OTULIN能水解Ub-Ub-GS-Nanoluc将Ub-GS-Nanoluc从固定介质镍柱上分离下来。

图7(c)显示不同浓度OTULIN在一定时间内对于反应读值的影响。

图7(d)显示用本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc有效检测到PR619对OTULIN活性的抑制。

图8表示本发明中的pET-28a-Ub-Nanoluc分子克隆的图谱。

图9表示本发明中的pET-28a-Ub-Ub-GS-Nanoluc分子克隆的图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公众常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

实验材料：

PR619(Lifesensors美国)、Ub-AMC(Boston Biochem美国)、Furimazine底物PNL1.1质粒(Promega美国)、Nanoluc抗血清(使用GST-Nanoluc蛋白免疫实验兔获得)、96孔无吸附力自／黑板(Greiner Bio-One德国)、Ni-NTA磁珠(QIAGEN，德国)、考马斯亮蓝R-250、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(Amersco美国)、基因克隆所需酶类(TAKARA中国)、LUMIstar报告基因读值机器(BMG Labtech德国)、常用生化试剂(鼎国生物中国)

本发明中Nanoluc荧光素酶属现有技术内容，可参考PROMEGA公司网页内容，如：http：／／cn.promega.com／products／pm／nanoluc／

实施例1获得本发明Ub-Nanoluc报告基因及蛋白

分子克隆

分子克隆构建pET-28a、pCDNA3.1Ub由本实验室保存，PNL1.1质粒从Promega公司获得。

PCR扩增全长Ub基因引物：

正义链：5′ggatccatgcagatcttcgtgaaaac3′(SEQ ID NO.8)；酶切位点BamHI

反义链：5′ctgcgtctgagaggtggtatggaattc3′(SEQ ID NO.9)；酶切位点EcoRIPCR扩增全长Nanoluc基因引物：

正义链：5′gaattcatggtcttcacactcgaagatt3′(SEQ ID NO.10)；酶切位点EcoRI

反义链：5′gtgcgaacgcattctggcgtactcgag3′(SEQ ID NO.11)；酶切位点XhoIPCR反应体系

PCR反应条件

PCR反应完成后利用天根凝胶回收试剂盒回收PCR片段

Takara限制性内切酶酶切消化37°2小时s

利用天根凝胶试剂盒回收获得大约30-40ul回收后的片段和载体获得酶切后的片段利用碧云天T4快速连接酶连接转化

10ul体系连接，室温连接30分钟后转化，转化以及抽取质粒具体步骤如下：

(1)加入10ul连接子体系至100ul大肠杆菌DH5a感受态中，冰上静置30分钟

(2)42°热激90秒

(3)冰上静置5分钟

(4)加入600ul无抗LB培养基37°震荡复苏45分钟

(5)4500rpm离心去除上清

(6)将感受态细胞悬浮起来涂布卡纳抗性平板上

(7)37℃倒置培养16小时

(8)调取单克隆在卡纳培养基中37℃200rpm摇床震荡培养14小时

(9)碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定克隆

(10)将鉴定的克隆重新酶切

利用EcoRI和XhoI将Nanoluc片段以同样的方法构建入上述Ub融合载体中，酶切鉴定并测序。

蛋白诱导表达及纯化BL21(DE3)pLysS菌株检测融合蛋白的表达：

(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)

(2)2ml离心管中，加入25μl BL21+3μl质粒(300-500纳克)，混匀(质粒≤感受态1／10)

(3)冰上放置30分钟

(4)42℃，90s

(5)冰上放置5分钟

(6)加入600μl LB(无抗生素)，37℃，250rpm，1h

(7)4000rpm，2分钟，弃上清，其余混匀以后涂平板(kana)，37℃，过夜(16h)

(8)挑单克隆菌落，5ml LB(kana)，37℃，250rpm，过夜(16h)

(9)取500μl菌液加入5ml LB(kana)(10倍稀释)(其余菌液4℃保存)，测OD600

(10)37℃，220rpm，2h(OD600：0.6-0.8)，测OD600

(11)取100μl作为诱导前对照，冰上放置

(12)菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1mM

(13)30℃，250rpm，2-4h(可做时间梯度)，测OD600

(14)取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2分钟，加入50μl1×SDS上样缓冲液

(15)取4ml菌液，12000rpm，离心2分钟，收集到2ml离心管中

(16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体

(17)超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度120瓦特(冰浴)

(18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4℃，12000rpm，离心5分钟

(19)超声后上清：取25μl上清，加入25μl2×SDS上样缓冲液

(20)超声后沉淀：沉淀加入1ml裂解缓冲液重悬，取25μl，加入25μl2×SDS上样缓冲液

(21)将四个样品煮沸3分钟，12000rpm，离心5分钟

(22)8-10％SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀

(23)考马斯亮蓝染色液染色，脱色液脱色后拍照记录

蛋白纯化

(1)已经转化的菌液，或者重新转化BL21(DE3)pLysS

(2)活化：取20μl菌液加入10ml LB(Ampr)(500倍稀释)，37℃，250rpm，过夜(16h)

(3)取10ml菌液加入100ml LB(Kana)(10倍稀释)(剩余菌液4℃保存)

(4)37℃，250rpm，1小时10分钟-1小时20分钟，OD6000.6-0.8(OD600小于1.0即可)

(5)取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置

(6)加入IPTG，终浓度0.1mM

(7)30℃，250rpm，诱导适当时间(预实验确定)

(8)取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2分钟，收集菌体，加入100ul1×SDS上样缓冲液

(9)其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20分钟，收集细胞

(10)每管加入8-10ml裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中(无气泡)

(11)超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度120W(冰浴)

(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中，4℃，13000rpm，离心20-30分钟

(13)将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl2×SDS上样缓冲液(其余上清-80℃保存)

(14)将沉淀加入16-20ml HIS裂解缓冲液(或PBS)重悬，取出50μl，加入50μl2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80℃保存)

(15)将四个样品煮沸3分钟，12000rpm，离心5分钟

(16)10％SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀

(17)考马斯亮蓝染色

(18)混匀镍柱，取200μl加入15ml离心管中(2份)

(19)加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3分钟，弃上清

(20)加入超声后上清液，4℃轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)

(21)4℃，3000rpm，离心3分钟

(22)10ml清洗液洗涤2次(冰上)

(23)10ml TBS(含20mM咪唑)洗涤2次(冰上)

(24)弃上清，加入1倍柱床体积的冲洗缓冲液(含5mM MgCl2、1mM DTT、50％甘油)，混匀(25)Elution buffer洗脱蛋白一共洗过5次，透析蛋白

(26)取悬液测定蛋白浓度和SDS-PAGE跑胶定量

(27)-20℃保存

以上获得的本发明Ub-Nanoluc报告基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

实施例2构建多克隆抗体

构建原核Nanoluc表达克隆并纯化GST-Nanoluc蛋白(实验方法参考实施例1)

多克隆抗体制备

免疫动物：两只新西兰兔

佐剂：首先用完全弗氏佐剂，后用不完全弗氏佐剂。

免疫原：GST-Nanoluc。每次免疫500微克免疫原。

免疫：用磷酸缓冲液稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1∶1混合，抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射，每个区域大约用1／4的免疫原，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，4°静置过夜取血清。

第0星期采血2ml(获得0.5-1ml免疫前血清)

完全弗氏佐剂混合的500微克抗原免疫兔。

第2星期

完全弗氏佐剂混合的500微克抗原免疫兔。

第4星期

不完全弗氏佐剂混合的500微克抗原免疫兔。

第5星期

取检测血清2-3ml取适当的细胞水平过表达Nanoluc WB检测，

检测效果良好进行心肌取血，四度静置，离心取血清。

实施例3去泛素化酶USP15水解泛素与Nanoluc荧光素酶之间的异肽腱以及Western Blot检测蛋白水平

(1)去泛素化酶USP15水解泛素与Nanoluc荧光素酶之间的异肽腱：

将去泛素化酶USP15蛋白与Ub-Nanoluc蛋白分子在30℃反应体系里共同孵育半小时

(2)Western Blot检测蛋白水平：

Western Blot基本原理为抗原抗体反应。蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到固相支持物上(本实验采用硝酸纤维素膜)。与特异的一抗反应，再与荧光二抗反应显色，可以得到特异蛋白分子的免疫印迹图。该方法具有从混杂抗原中检测出特定的抗原的特点。

将待测样品水解反应完成的泛素-报告基因的蛋白加入SDS Loading buffer，100°煮样5分钟，流程如下：A、制胶(8％浓缩胶，12％分离胶)；B、蛋白样品加入上样缓冲液，煮沸，上样；C、电泳，浓缩胶80V电压，分离胶120V电压：D、转膜，200V，1h；E、5％脱脂牛奶，封闭1h；F、一抗反应，4℃，过夜；G、PBST洗膜，三次，每次5分钟；H、二抗反应，避光1h；I、PBST洗膜，三次，每次5分钟；J、Odyssey系统(LI-COR Biosciences)扫描。

实验结果如图1所示，表明去泛素化酶USP15能水解泛素和Nanoluc或GFP或GST之间的肽腱，即无论Nanoluc或GFP或GST，均能被去泛素化酶USP15切除，并且Nanoluc或GFP或GST均能被释放到溶液中。图2(a)表明western blot显示USP15切断了泛素与Nanoluc或GFP或GST之间的异肽腱链接。图2(b)表明western blot显示USP15能将Nanoluc或GFP或GST从固定的介质上释放下来，并能检测到溶液中含有的Nanoluc或GFP或GST。实施例4本发明Ub-Nanoluc报告基因系统检测去泛素化酶活性的方法

利用本发明Ub-Nanoluc报告基因检测去泛素化酶活性：将50纳克His-Ub Nanoluc固定 在2ul固体介质上，洗去非特异性结合；将去泛素化酶和固定好的beads在100ul反应缓冲液中孵育；37℃孵育0.5小时离心去除固体介质；吸取上清至无吸附力白色96孔板；加入报告基因底物Furimazine(1：50稀释)，震荡混匀读值。

如图3所示的去泛素化酶USP15水解Ub-Nanoluc。USP15水解底物蛋白His-Ub-Nanoluc，将Nanoluc从固定介质镍柱上释放到反应缓冲液中，通过去除介质，加入Nanoluc底物，读值检测Nanoluc量，从而反映去泛素化酶的活性。其中，图3(a)表示了底物蛋白His-Ub-Nanoluc的不同浓度对于反应读值的影响。图3(b)表示了不同温度对于去泛素化酶USP15水解底物蛋白his-Ub Nanoluc的反应读值的影响。图3(c)表示了不同浓度去泛素化酶在不同时间点对于反应读值的影响。图3(d)表示了不同浓度去泛素化酶在一定时间点对于反应读值的影响。

实施例5本发明Ub-Nanoluc报告基因应用于检测去泛素化酶抑制剂抑制能力的方法

现有技术中Ub-AMC方法是检测去泛素化酶活性的常用方法，去泛素化酶通过水解Ub和AMC，使AMC形成单体能在350nm下被激发，从而获得460nm吸收光。

将小分子化合物PR619和去泛素化酶在室温孵育，参考实施例3检测去泛素化酶活性的方法，利用Ub-Nanoluc报告基因检测抑制剂抑制效率。本实施例采用PR619抑制实验进行分析，将不同摩尔浓度的去泛素化酶抑制剂PR619(0-50uM)与10umol USP15室温孵育0.5小时，使用不同的去泛素化酶活性检测系统检测PR619对于USP15去泛素化酶活性的抑制，使用Graphpad prism5.0软件计算PR619IC50，如图5所示。图5(a)显示去泛素化酶抑制剂PR619在较广泛范围内对Nanoluc报告基因读值没有影响。图5(b)显示利用本发明Ub-Nanoluc报告基因有效检测到抑制剂PR619对USP15活性的抑制。图5(c)显示利用现有技术Ub-AMC检测抑制剂PR619对USP15活性的抑制效率。由此可见，与现有技术Ub-AMC方法比较，利用本发明Ub-Nanoluc报告基因检测去泛素化酶抑制剂，半数抑制效率上基本相似。因此，本发明Ub-Nanoluc可作为一个有效检测去泛素化酶抑制剂抑制效率的方法。

实施例6利用Ub-Nanoluc报告基因系统进行通量化筛选

利用本发明Ub-Nanoluc报告基因检测去泛素化酶活性可作为一个新型检测去泛素化酶活性的方法，也可进行高通量筛选其抑制剂或激活剂的方法，利用本发明Ub-Nanoluc报告基因进行高通量筛选流程，如图1(b)所示。本发明目的之一是将其通量化，而高通量筛选方法有一个很好的检测指标：Z因子。对于一个典型的HTS实验，未知化合物的活性确定与所选定的阳性与阴性对照密切相关，Z因子值是以检测信号平均值的3倍标准差，即约99.73％可信区间作为活性化合物的“命中区间”而计算的。Z因子不仅考虑了活性化合物的“命中”数，而且涉及到了假阴性与假阳性数，因此Z因子非常适合于评价所有HTS实验，Z值介于1和-1之间，Z值越大，则实验越适合于HTS方法。Z因子主要用来评价实验方法本身的“质量”， 可以作为实验方法优化的判断因子。高通量筛选稳定性试验，使用等摩尔量的GST与USP15作为对照检测通量化试验的稳定性，计算Z因子的值，其中报告基因操作方法如上所述。如图6所示，经过计算，在96孔板实验中Z因子为0.65，大于通量化的标准0.5，可以认为本发明Ub-Nanoluc报告基因系统是一个可信、严谨的高通量筛选方法。

实施中，His-Ub-Nanoluc用量为50纳克，介质用量为2ul，反应时间为30分钟，反应温度为30℃。Z因子具体计算方法参考如下文献

A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validationof High Throughput Screening Assays，文献链接网址http：／／jbx.sagepub.com／ content／4／2／67.lon。

实施例7构建获得Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因及其蛋白

以Ub分子DNA序列为模板，以SEQ ID NO.8SEQ ID NO.12为引物PCR出Ub-Ub-GS上端段，以SEQ ID NO.13SEQ ID NO.14为引物PCR出Ub-Ub-GS下端段，回收两片段，以回收的片段为模板，以SEQ ID NO.8SEQ ID NO.14为引物PCR出Ub-Ub-GS全长，其基本PCR体系同上，分子克隆构建与Ub-Nanoluc构建过程相同，其他纯化步骤及条件均参照实施例1。

通过分子克隆方法构建得到如SEQ ID NO.4所示的Ub-Ub-GS-Nanoluc基因，并纯化该蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

实施例8利用本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc检测去泛素化酶OTULIN活性

OTULIN作为水解线性泛素化链调控免疫信号通路，现有技术中尚无方法检测OTULIN活性，本实施例基于前述Ub-Nanoluc方法，参照实施例4，利用本发明构建的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因来检测OTULIN活性。将50纳克HIS-Ub-Ub-GS-Nanoluc固定在固体介质上，洗去非特异性结合；将去泛素化酶和固定好的beads在100ul反应buffer中孵育；30℃孵育0.5小时离心去除固体介质；吸取上清至无吸附力白色96孔板中；加入报告基因底物Furimazine(1∶50稀释)，震荡混匀读值。

实验结果如图7所示：图7(a)显示OTULIN能水解Ub-Ub-GS-Nanoluc而不能水解Ub-Nanoluc。图7(b)显示OTULIN能水解Ub-Ub-GS-Nanoluc，并将Ub-GS-Nanoluc从固定介质镍柱上分离下来。图7(c)显示不同浓度OTULIN在相同时间中对于反应读值的影响。

实施例9利用本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc检测抑制剂PR619对OTULIN活性的抑制

除使用的底物为50纳克His-Ub-Ub-GS-Nanoluc，其他步骤及条件均参照实施例5，利用本发明Ub-Ub-GS-Nanoluc检测抑制剂PR619对OTULIN活性的抑制，实验结果如图7(d)所示。

实施例10本发明Ub-Nanoluc报告基因与Ub-AMC报告基因的比较

比较实验过程：Ub-Nanoluc报告基因检测活性方法如实施例6，Ub-AMC检测去泛素化酶活性方法需要USP15蛋白与Ub-AMC在缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10μg／ml BSAand2mMdithiothreitol(DTT))中反应，反应的条件同实施例6，反应后使用具有激发／光吸收读值机器读值，通过标准化读值数据，利用激活倍数反应去泛素化酶的活性，从而进行比较。

实验结果如图4所示，图4(a)显示等同摩尔浓度下，本发明Ub-Nanoluc报告基因和现有技术Ub-AMC报告基因的活性检测的比较。图4(b)显示某些去泛素化酶(例如USP14)对本发明Ub-Nanoluc具有较好的选择性。

Claims (10)

1.一种Ub-Nanoluc报告基因，其特征在于，所述Ub-Nanoluc报告基因包括泛素蛋白和Nanoluc荧光素酶，所述泛素蛋白与Nanoluc荧光素酶通过肽腱相连。

2.如权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因，其特征在于，所述Ub-Nanoluc报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述泛素蛋白和所述Nanoluc荧光素酶的连接序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因，其特征在于，所述Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因包括泛素蛋白和Nanoluc荧光素酶，所述泛素蛋白与Nanoluc荧光素酶通过肽腱相连；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述泛素蛋白和所述Nanoluc荧光素酶的连接序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求1所述Ub-Nanoluc报告基因或权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的构建方法，其特征在于，利用分子克隆的方法通过搭桥聚合酶链式反应，将两个泛素分子的DNA序列串联起来，并且将第二个泛素分子的76位甘氨酸序列替换为丝氨酸序列，再在其后融合Nanoluc的DNA序列。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，

PCR扩增全长Ub基因引物：

正义链：5'ggatccatgcagatcttcgtgaaaac 3'(SEQ ID NO.8)；

反义链：5'ctgcgtctgagaggtggtatggaattc 3'(SEQ ID NO.9)；

PCR扩增全长Nanoluc基因引物：

正义链：5'gaattcatggtcttcacactcgaagatt 3'(SEQ ID NO.10)；

反义链：5'gtgcgaacgcattctggcgtactcgag 3'(SEQ ID NO.11)。

6.如权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因在检测去泛素化酶活性、通量化筛选去泛素化酶抑制剂或激动剂中非诊断目的的应用。

7.利用权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因检测去泛素化酶活性非诊断目的的方法，其特征在于，将所述Ub-Nanoluc报告基因或所述Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因固定在固相介质上，洗去非特异性结合，加入去泛素化酶，孵育，离心去除固相介质，加入Nanoluc底物，读值检测Nanoluc量，从而检测分析得到去泛素化酶活性。

8.利用权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因进行通量化筛选去泛素化酶抑制剂的方法，其特征在于，将所述Ub-Nanoluc报告基因或所述Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因固定在固相介质上，洗去非特异性结合，加入去泛素化酶、去泛素酶抑制剂，经孵育后，离心去除介质，加入Nanoluc底物，读值检测Nanoluc量，从而测得去泛素化酶抑制剂的抑制效率。

9.如权利要求7、8之任一项所述的方法，其特征在于，当所述方法中采用所述Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因时，则所述去泛素化酶为去泛素化酶OTULIN。

10.一种可调控去泛素化酶活性的物质的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：检测候选物质对如权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或如权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因检测反应的影响；其中，若所述候选物质能降低如权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或如权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的读值，则表明该候选物质是可有效抑制去泛素化酶活性的潜在物质；若所述候选物质能提高如权利要求1所述的Ub-Nanoluc报告基因或如权利要求3所述的Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因的读值，则表明该候选物质是可有效激活去泛素化酶活性的潜在物质。