CN104768615A - 治疗白内障的非手术方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供cc-晶体蛋白聚集的抑制剂和使用cc-晶体蛋白聚集抑制剂以例如在具有白内障或面临发展为白内障的风险的受试者中治疗或预防白内障的方法。本发明还提供筛选用于调节蛋白热稳定性的化合物的高通量方法，该方法包括使蛋白与多个试验化合物的每一个接触；和(b)在多个试验化合物的每一个的存在下，测量蛋白的熔融转变(Tm)，其中降低或增加表观Tm至少2个标准差的化合物被鉴定为药用蛋白伴侣。

Description

治疗白内障的非手术方法
相关申请的交叉参照
本申请要求2012年7月17日提交的美国临时专利申请号61/672,569的优先权，其通过引用以其全文结合到本文中。
政府利益的声明
本发明在政府支持下，在国家卫生研究院授予的资助号RR024986下进行。政府拥有本发明的一定权益。
发明领域
本公开一般涉及α-晶体蛋白聚集的抑制剂，其用途和筛选治疗学上有效的蛋白聚集调节剂的方法。
发明背景
白内障，或混浊的眼晶状体，是影响超过一半的80岁以上的所有成人的病症，在美国有大约2500万患者患有该病症。而且，白内障被认为是世界性失明的主要病因。αA-晶体蛋白(cryAA)和αB-晶体蛋白(cryAB)包含眼晶状体的蛋白含量的30%，其中它们负责维持晶状体的透明性(Haslbeck等, Nat Struct Mol Biol 12, 842 (2005)。cryAA和cryAB属于小热休克蛋白(sHSP)的家族，其包含一个保守的晶体蛋白结构域(Bloemendal等, Prog Biophys Mol Biol 86, 407 (2004)；Haslbeck, 同上)。一旦合成，这些晶状体sHSP决不降解，因此任何损伤终生累积并最终导致年龄相关性白内障(Haslbeck, 同上；Perng等, J Biol Chem 274, 33235 (1999)；Meehan等, J Biol Chem 279, 3413 (2004)；Meehan等, J Mol Biol 372, 470 (2007))。类似地，cryAB中的不稳定突变，例如R120G，导致遗传性早期发病的白内障形式(Vicart等, Nat Genet 20, 92 (1998))。内障中，cryAB倾向于聚集并在体外形成淀粉样蛋白-样原纤维(Andley等, PLoS One 6, e17671 (2011))。
目前，白内障的治疗包括手术切除混浊的晶状体并插入人工置换物。手术可能是昂贵的，并且不适合所有的患者。针对蛋白聚集的潜在机制的疗法将使这些患者获益。因此，本领域仍有对治疗剂和筛选治疗剂的方法的需求，所述治疗剂阻断来自形成病理性聚集体(例如，与白内障有关的聚集体)的聚集-倾向蛋白，例如cryAB。
发明概述
本发明提供一种治疗或预防白内障的方法，该方法包括给予有需要的个体有效量的包含式I化合物或其前药或药学上可接受的盐的组合物：
其中：
两个R1均为H或两个R1均为Me；
R2为H或OH；
5位和6位碳之间的虚线表示任选的双键；
R3为H或Me；
R4为H或Me；
n为0或1；
(a) R6是 和各R5独立地为H或Me或 (b) R6和一个R5结合在一起，形成任选取代的6-元环，而另一个R5是Me；
12位和13位碳之间的虚线是任选的双键，前提是当12位和13位碳之间的双键存在时，R7不存在，而当12位和13位碳之间的双键不存在时，R7为H或Me；
R8为H或OH；
两个R9一起形成氧代(=O)或两个R9为氢；和
R10是CO2H或线性或支链C1-C6烷基。
本发明还提供一种眼科药用组合物，其包含药学上可接受的眼用载体和式I化合物。
在方法和/或组合物的各个方面，式I化合物具有式IA或式IB的结构：
或
其中各R11独立地为烷基、CO2H或CO2烷基。
在方法和/或组合物的更特别的方面，化合物具有式II的结构：
其中R12为H或OH和R13为H或OH。在方法和/或组合物的一个方面，化合物是5-胆甾烯-3b,25-二醇。
在方法的各个方面，组合物经局部、结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内给予。在方法的各个方面，白内障是年龄-相关白内障或糖尿病性白内障。在该方法的某些方面，所述个体具有遗传性早期发病的白内障形式。在该方法的某些特殊方面，所述个体在cryAB中具有R120G突变和/或D109H突变。
在所述组合物的某些方面，药学上可接受的眼用载体是环糊精。在一个特殊方面，环糊精是(2-羟基丙基)-β-环糊精。
此外，本发明包括一种筛选用于调节蛋白热稳定性的化合物的高通量方法，该方法包括：(a) 使蛋白与多个试验化合物的每一个接触；和(b) 在多个试验化合物的每一个的存在下，测量蛋白的熔融转变(Tm)，其中降低或增加表观Tm至少2个标准差的化合物是药用蛋白伴侣。
在方法的各个方面，蛋白是淀粉样蛋白-形成蛋白或造成功能丧失疾病的蛋白。在某些方面，淀粉样蛋白-形成蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉样蛋白、PrP、亨廷顿蛋白、降钙素、心房利尿钠因子、载脂蛋白AI、血清淀粉样蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。在其它方面，造成功能丧失疾病的蛋白选自突变体β-葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜受体、氨基己糖苷酶A、氨基己糖苷酶B、β-半乳糖苷酶和α-葡糖苷酶。
在该方法的某些方面，Tm使用高通量差示扫描荧光计装置测定。
在该方法的一个方面，测量步骤包括：(b1) 在多个试验化合物的每一个的存在下，将蛋白自50℃加热至80℃，(b2) 冷却蛋白至25℃，(b3) 维持蛋白于25℃10秒钟，和(b4) 测量蛋白的荧光性。
在各个方面，该方法还包括重复步骤(b1)-(b4) 2-30次，其中步骤(b1)的各次重复在逐渐增加的较高温度下进行。在特殊的方面，淀粉样蛋白-形成蛋白以1℃的增量自65℃加热至80℃。在其它方面，(b1)还包括，在加热后，平衡淀粉样蛋白-形成蛋白和试验化合物60-180秒钟。在方法的各个方面，平衡步骤是130秒钟。
此外，本发明包括一种高通量筛选系统，其包含：(a) 淀粉样蛋白-形成蛋白；(b) 能够测量淀粉样蛋白-形成蛋白的熔融转变(Tm)的装置；和(c) 多个试验化合物。
在筛选系统的各个方面，蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉样蛋白、PrP、亨廷顿蛋白、降钙素、心房利尿钠因子、载脂蛋白AI、血清淀粉样蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。
在筛选系统的某些方面，装置是高通量差示扫描荧光计装置。
特别构思了任何一种结构式I、IA、IB或II的化合物在本文公开的任何方法中的用途或在制备依据本文公开的任何方法给予的药物中的用途。在这一点上，本发明提供用于治疗或预防白内障的方法的任何一种结构式I、IA、IB或II的化合物，其中该方法包括给予有需要的个体有效量的所述化合物。
本公开的其它特征和优点从以下的详细描述中将变得显而易见。然而，应该理解，详述和具体的实施例，虽然指出了本公开的具体实施方案，却仅仅是通过举例说明的方式给出，因为在本公开的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员而言，可自该详述中变得显而易见。意欲使整个文件作为一个统一的公开而为相关的，且应该理解，在本文描述的特征的所有组合均应考虑，即使特征的组合没有一起发现在本文件的相同句子或段落或章节中。除了前述之外，本发明还包括，作为另外的方面，本发明的所有实施方案的范围在任何方面比以上具体提及的变化窄。例如，如果本发明的方面被描述为“包括”一个特征，实施方案也期望由该特征“组成”或“基本组成”。
发明详述
本发明提供α-晶体蛋白聚集的抑制剂和使用α-晶体蛋白聚集抑制剂以例如在具有白内障或面临发展为白内障的风险的受试者中治疗或预防白内障的方法。本发明的α-晶体蛋白聚集的抑制剂为，例如，由式I、式IA、式IB和式II表示的甾醇并可配制为包含药学上可接受的眼用载体的眼科药用组合物。由于白内障影响这样一大部分人群(超过80岁年龄的所有成人的一半以上)且主要的治疗是手术干预，因此本文描述的发现代表为治疗白内障可以采用的非手术方法的一个重大进步。而且，目前使用中的许多非手术治疗倾向于进一步抑制α-晶体蛋白的聚集。显著地，本发明的化合物能够逆转α-晶体蛋白的聚集并且还抑制α-晶体蛋白的聚集。
本发明还提供筛选用于调节蛋白热稳定性的化合物的高通量方法，该方法包括使蛋白与多个试验化合物的每一个接触；和在多个试验化合物的每一个的存在下，测量蛋白的熔融转变(Tm)，其中降低或增加表观Tm至少2个标准差的化合物被鉴定为药用蛋白伴侣。
治疗或预防白内障的方法
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗或预防白内障的方法，该方法包括给予有需要的个体有效量的组合物，其包含结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物，或例如，在表1中的化合物。在一些实施方案中，白内障是年龄-相关白内障、糖尿病性白内障、与手术有关的白内障、暴露于辐射所致的白内障、遗传性疾病引起的白内障、感染引起的白内障或药物引起的白内障。在一些实施方案中，所述个体具有遗传性早期发病的白内障形式。例如，遗传形式的白内障包括在cryAB中具有R120G突变和/或D109H突变的个体。
依据本发明的“需要”治疗的个体是患有白内障的个体。例如，所述个体可患有年龄-相关白内障或因患有糖尿病所致的白内障。类似地，依据本发明的“需要”治疗的个体是有发生白内障的风险的个体。面临发生白内障的风险的个体包括，但不限于，具有发生白内障的家族史的个体，具有与早期发病的白内障有联系的突变的个体，例如在cryAB中具有R120G突变和/或D109H突变的个体，暴露于辐射、糖尿病的个体等。例如，在一个方面，所述个体的一只眼被诊断患有白内障，并给予化合物以预防或减慢对侧眼的白内障形成。
“治疗”白内障不需要100%消除白内障。类似地，“预防”不需要100%抑制白内障形成。任何浑浊的减少或白内障进展的减速在受试者中构成有益的生物学效果。在这一点上，与未用本发明方法(例如，在生物学-配对的对照受试者中或未暴露于本发明方法的化合物的样品中)所观察到水平比较，本发明减少白内障，例如，至少约5%，至少约10%或至少约20%。在一些实施方案中，白内障减少至少约30%，至少约40%，至少约50%，或至少约60%，至少约70%，至少约80%，至少约90%，或更多(约100%)。
在一些实施方案中，依据本发明方法“治疗”白内障，与未用本发明方法(例如，在生物学-配对的对照受试者或未暴露于本发明方法的化合物的样品中)所观察到水平比较，抑制白内障形成达，例如，至少约5%，至少约10%或至少约20%。在一些实施方案中，与本发明方法的化合物的不存在下的白内障形成比较，白内障形成被抑制至少约30%，至少约40%，至少约50%，或至少约60%，至少约70%，至少约80%，至少约90%，或更多(约100%)。白内障通常使用大量光学试验中的任一种检测，包括，但不限于，视觉敏度测试、眼底检查、裂隙灯检查、角膜散光计检测、眼压测量法、对比测试、眩光敏感度、波前映射(wavefront mapping)。
包含结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物、或在表1中的化合物的组合物的“有效量”是抑制或减少个体中淀粉样蛋白-形成蛋白例如cryAB聚集的量。抑制聚集不需要聚集的100%抑制。聚集的任何抑制在受试者中构成有益的生物学效果。在这一点上，与未用本发明方法(例如，在生物学-配对的对照受试者或未暴露于本发明方法的化合物的样品中)所观察到水平比较，本发明抑制例如至少约5%、至少约10%或至少约20%的淀粉样蛋白-形成蛋白的聚集。在一些实施方案中，淀粉样蛋白聚集体的形成被抑制至少约30%，至少约40%，至少约50%，或至少约60%。在一些实施方案中，与在本发明方法的化合物的不存在下淀粉样蛋白形成相比，本发明方法抑制淀粉样蛋白形成达至少约70%、至少约80%、至少约90%或更多(约100%)。
类似地，减少聚集的“有效量”不需要100%消除聚集。聚集的任何减少在受试者中构成有益的生物学效果。在这一点上，与未用本发明方法(例如，在生物学-配对的对照受试者或未暴露于本发明方法的化合物的样品中)所观察到水平比较，本发明减少例如至少约5%、至少约10%或至少约20%的淀粉样蛋白-形成蛋白的聚集。在一些实施方案中，淀粉样蛋白聚集体减少至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%。在一些实施方案中，与本发明方法的化合物的不存在下的淀粉样蛋白聚集体比较，本发明方法减少淀粉样蛋白聚集体至少约70%、至少约80%、至少约90%或更多(约100%)。
给药途径
如将为本领域技术人员所理解的，给予化合物至受试者的最适宜的方法取决于多种因素。在各个实施方案中，依据本发明的化合物经局部给予眼，例如，局部、结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内。例如，在各个实施方案中，组合物通过注射局部传递给眼。可以用细针将注射溶液直接注入角膜、晶体蛋白晶状体和玻璃体或其邻近组织。所述组合物也可作为眼内灌注液给药。
给药的另外的期望途径包括，但不限于，以下的一种或多种：口服(例如，作为片剂、胶囊，或作为可摄取的溶液)、粘膜(例如，作为鼻腔喷雾剂或气雾剂吸入)、鼻、胃肠外(例如，通过注射形式)、胃肠道、脊柱内、腹膜内、肌内、静脉内、子宫内、皮内、颅内、气管内、阴道内、侧脑室内、脑内、皮下、透皮、直肠、颊下、硬膜外和舌下。
在一些实施方案中，将本发明的组合物传递给眼的方式是经由接触镜片。可提供用所需化合物预处理的镜片。或者，镜片在具有用于制备涂布镜片的成分的药剂盒中提供，其被作为用于重新溶解的冻干粉末或作为浓缩液或即用的溶液提供。所述组合物可作为供单次或多次使用的药剂盒提供。
在一些实施方案中，本发明的组合物传递给眼的方式是经由眼杆状体(ophthalmic rod) (Gwon等, Ophthalmology. 1986 Sep；93(9 Suppl):82-5)。在一些实施方案中，本发明的组合物传递给眼的方式是经由眼内晶状体-水凝胶装配(assembly) (Garty等, Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011 Aug 3；52(9):6109-16)。
剂量
包含所述化合物的组合物以在医学上-可接受的毒性水平下获得所需生物学效果的治疗有效量提供。所述组合物的剂量可根据给药途径和疾病的严重性而变化。剂量也可根据要治疗的各患者的体重、年龄、性别和/或症状的程度进行调整。精确的剂量和给药途径将最终由现场医师或兽医决定。应该意识到，根据患者的年龄和体重以及待治疗的病症的严重性，有必要对剂量进行常规变更。给药频率取决于制剂和上述参数。例如，可能需要施用滴眼液，每天至少一次，包括每天2、3、4或5次。
经由眼睛途径给予人(约70 kg体重)的化合物的示例性剂量是0.1 mg-1 g，例如，1 mg-500 mg化合物每单位剂量。在各个实施方案中，剂量为约1μg/kg体重- 15 mg/kg体重。例如，剂量可以是1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、160μg/kg、180μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg或15 mg/kg。通过系统途径给予人(约70 kg体重)的化合物的示例性剂量是0.1 mg-5 g、例如，1 mg-2.5g化合物每单位剂量。
式I、IA、IB或II的化合物，或在表1中所列的化合物的优选浓度范围自约1μg/ml-500μg/ml，例如，约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约20μg/ml、约30μg/ml、约40μg/ml、约50μg/ml、约60μg/ml、约70μg/ml、约80μg/ml、约90μg/ml、约100μg/ml、约120μg/ml、约140μg/ml、约160μg/ml、约180μg/ml、约200μg/ml、约250μg/ml、约300μg/ml、约350μg/ml、约400μg/ml、约450μg/ml或约500μg/ml。所述抑制剂可与其它药用活性剂组合提供。
依据本发明的组合物以容器提供，作为在使用前用适宜的稀释剂稀释的浓缩液，或者以即用的浓度提供。优选地，单一剂量在无菌小瓶中提供。
有效治疗或预防白内障的化合物
在各个实施方案中，本发明方法或组合物的化合物是式I化合物：
其中：
两个R1为H或两个R1为Me；
R2为H或OH；
5位和6位碳之间的虚线表示任选的双键；
R3为H或Me；
R4为H或Me；
n为0或1；
(a) R6是和各R5独立地为H或Me或(b) R6和一个R5结合在一起，形成任选取代的6-元环，而另一个R5是Me；
12位和13位碳之间的虚线是任选的双键，前提是当12位和13位碳之间的双键存在时，R7不存在，而当12位和13位碳之间的双键不存在时，R7为H或Me；
R8为H或OH；
两个R9一起形成氧代(=O)或两个R9为氢；和
R10是CO2H或线性或支链C1-C6烷基。
例如，本发明方法或组合物的化合物是式IA或式IB的化合物：
或
其中各R11独立地为烷基、CO2H或CO2烷基。
在各个实施方案中，化合物具有式II的结构：
其中R12为H或OH和R13为H或OH。在一些实施方案中，化合物是5-胆甾烯-3b,25-二醇。
或者，化合物是在表1中所列的化合物。
以上化合物的任何前药或药学上可接受的盐均涵盖在本发明的范围内。
药用组合物
本发明还包括组合物，其包含结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物，或在表1中所列的化合物，和药学上可接受的眼用载体，例如，药学上可接受的赋形剂、载体、粘合剂和/或稀释剂。任选地，组合物包括结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物或在表1中所列的化合物的游离酸、游离碱、盐(例如，酸或碱加成盐)、水合物或前药。前药是包含共价连接于载体部分的结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物或在表1中所列的化合物的物质。载体部分可在体外或体内自结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物或在表1中所列的化合物释出，以得到结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物，或在表1中所列的化合物。前药形式是本领域熟知的，如在Sloan, K. B., Prodrugs, M. Dekker, New York, 1992；和Testa, B.和Mayer, J. M., Hydrolysis in drug and prodrug metabolism: chemistry, biochemistry, and enzymology, Wiley-VCH, Zurich, 2003中举例说明的。
在各个实施方案中，组合物包含配制为滴眼液、注射液或眼膏剂的结构式I、IA、IB或II的任何一种的化合物或在表1中所列的化合物。这些药用组合物可根据常规方法通过使化合物，任选地与适宜的药用添加剂例如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和溶解助剂混合、稀释或溶解于其中来配制并根据剂型以常规方式配制。例如，滴眼液可通过使化合物溶解于无菌水中配制，其中表面活性剂被溶解并任选地加入适宜的药用添加剂例如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和粘度改进剂。在一些实施方案中，组合物包含环糊精。在特定的实施方案中，环糊精是(2-羟基丙基)-β-环糊精。
生理学上可接受的缓冲剂包括，但不限于，磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液(包含三(羟基甲基)氨基甲烷和HCl)。例如，具有pH 7.4的Tris-HCl缓冲液包含3 g/l三(羟基甲基)氨基甲烷和0.76 g/l HCl。在还一个方面，缓冲液是10x磷酸盐缓冲盐水("PBS")或5x PBS溶液。
其它缓冲剂包括，但不限于，基于HEPES (N-{2-羟基乙基}哌嗪-N'-{2-乙烷磺酸})的缓冲剂，其具有于25℃时7.5的pKa和在约6.8-8.2范围内的pH；BES (N,N-双{2-羟基乙基}2-氨基乙烷磺酸)，其具有于25℃时7.1的pKa和在约6.4-7.8范围内的pH；MOPS (3-{N-吗啉代}丙烷磺酸)，其具有于25℃时7.2的pKa和在约6.7-7.9范围内的pH；TES (N-三{羟基甲基}-甲基-2-氨基乙烷磺酸)，其具有于25℃时7.4的pKa和在约6.8-8.2范围内的pH；MOBS (4-{N-吗啉代}丁烷磺酸)，其具有于25℃时7.6的pKa和在约6.9-8.3范围内的pH；DIPSO (3-(N,N-双{2-羟基乙基}氨基)-2-羟基丙烷))，其具有于25℃时7.52的pKa和在约7-8.2范围内的pH；TAPSO (2-羟基-3{三(羟基甲基)甲基氨基}-1-丙烷磺酸))，其具有于25℃时7.61的pKa和在约7-8.2范围内的pH；TAPS ({(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基}-1-丙烷磺酸))，其具有于25℃时8.4的pKa和在约7.7-9.1范围内的pH；TABS (N-三(羟基甲基)甲基-4-氨基丁烷磺酸)，其具有于25℃时8.9的pKa和在约8.2-9.6范围内的pH；AMPSO (N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸))，其具有于25℃时9.0的pKa和在约8.3-9.7范围内的pH；CHES (2-环己基氨基)乙烷磺酸)，其具有于25℃时9.5的pKa和在约8.6-10.0范围内的pH；CAPSO (3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙烷磺酸)，其具有于25℃时9.6的pKa和在约8.9-10.3范围内的pH；和CAPS (3-(环己基氨基)-1-丙烷磺酸)，其具有于25℃时10.4的pKa和在约9.7-11.1范围内的pH。
大量用于控制释放活性剂的有效方法是可获得的。参见，例如，Wagh V. D., Inamdar B., Samanta M. K., 用于眼科剂型的聚合物和药物传递系统(Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems). Asian J Pharm 2, 2008, 12-17和其中引用的参考文献，其内容通过引用结合到本文中。特别构思了聚合物(例如，纤维素衍生物例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羟丙基纤维素(HPC)、聚(丙烯酸) (PAA)、聚丙烯酸酯、环糊精和天然树胶、聚原酸酯(POE)和粘膜粘附性聚合物)；半固体例如凝胶、薄膜和其它插入物；树脂例如离子交换树脂；电离子透入递送；和胶体粒子例如微球和纳米粒子的用途。
也可提供与其它治疗剂组合的本发明的化合物。在一些实施方案中，本发明的化合物可与止痛药、麻醉剂、人工眼泪、酶抑制剂、细胞因子抑制剂、抗炎药或抗生素共同配制。在一些实施方案中，抗生素是抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原虫剂或其组合。
在各个实施方案中，本发明的化合物也可与选自以下眼腈治疗剂组合来提供：安贺拉(酮咯酸氨丁三醇滴眼液) 0.5%、Acuvail (酮咯酸氨丁三醇)、AK-Con-A (眼用萘甲唑啉)、Akten (盐酸利多卡因)、Alamast、阿法根(溴莫尼定)、Alrex、Astepro (盐酸氮卓斯汀鼻喷剂)、AzaSite (阿奇霉素)、Bepreve (贝他斯汀苯磺酸盐滴眼液)、Besivance (贝西沙星(besifloxacin)眼用混悬液)、Betaxon、BSS无菌灌洗液、Cosopt、Durezol (二氟泼尼酯)、Eylea (阿柏西普(aflibercept))、Lotemax、Lucentis (雷珠单抗)、Lumigan (比马前列素滴眼液)、Macugen (培加他尼)、Ocuflox (氧氟沙星滴眼液) 0.3%、OcuHist、Ozurdex (地塞米松)、Quixin (左氧氟沙星)、Rescula (异丙基乌诺前列酮滴眼液) 0.15%、Restasis (环孢菌素眼用乳剂)、舒乐津片剂、苏为坦(曲伏前列素滴眼液)、万赛维(缬更昔洛韦HCl)、Viroptic、Vistide (西多福韦)、维速达尔(注射用维替泊芬)、Vitrasert Implant、Vitravene Injection、ZADITOR、Zioptan (他氟前列素滴眼液)、Zirgan (更昔洛韦眼用凝胶剂)、Zymaxid (加替沙星滴眼液)、阿托品、氟比洛芬、毒扁豆碱(Physostimine)、Azopt、庆大霉素、匹罗卡品、杆菌肽、羟丙甲纤维素眼液、多粘菌素B、聚维酮碘、短杆菌肽、泼尼松龙、倍他洛尔、Humorsol、丙美卡因、贝特舒、Hylartin、普罗品、布林唑胺、高渗NaCl、Puralube、BSS、吲哚箐绿、玫瑰红、卡巴胆碱、伊曲康唑、透明质酸钠、头孢唑啉、拉坦前列素、舒洛芬、潇莱威、甘露醇、土霉素、氯霉素、醋甲唑胺、噻吗洛尔、盐酸环丙沙星溶液、咪康唑、妥布霉素、环丙沙星、Miostat、曲安西龙、Cosopt、Muro 128、曲氟尿苷、Demecarium、新霉素、托吡卡胺、地塞米松、尼布他松、舒净露、地匹福林、氧氟沙星眼液、阿糖腺苷、多佐胺、氧氟沙星、Vira-A、肾上腺素、土霉素、Viroptic、荧光素、苯福林和适利达。
筛选方法和系统
在各个实施方案中，本发明包括一种筛选用于调节蛋白热稳定性的化合物的高通量方法。该方法包括(a) 使蛋白与多个试验化合物的每一个接触；和(b) 在多个试验化合物的每一个的存在下，测量蛋白的熔融转变(Tm)，其中降低或增加表观Tm至少2个标准差的化合物是药用蛋白伴侣。在各个实施方案中，降低或增加表观Tm至少3个标准差的化合物是药用蛋白伴侣。
调节蛋白热稳定性的药剂可使用差示扫描荧光计(DSF)鉴定。在DSF中，蛋白靶标的熔融转变(Tm)在有效的配体的存在下测量。DSF通过内在色氨酸荧光，或染料，例如1,8-苯胺基萘磺酸(双-ANS)或Sypro Orange测量目标蛋白的热去折叠。配体的结合增加了折叠状态或关键中间体的自由能，这限制了去折叠并转移了表观Tm。因此，在一些实施方案中，熔融转变使用高通量差示扫描荧光计装置，例如ThermoFluor® 384-孔DSF平台，或实时PCT热循环仪测定。
在筛选方法的各个实施方案中，其中测量熔融转变的步骤包括以下步骤：(b1) 在多个试验化合物的每一个的存在下，将蛋白自50℃加热至80℃，(b2) 冷却蛋白至25℃，(b3) 维持蛋白于25℃ 10秒钟，和(b4) 测量蛋白的荧光性。在更特别的实施方案中，所述方法还包括重复步骤(b1)-(b4) 2-30次，其中步骤(b1)的各次重复在逐渐增加的较高温度下进行。例如，在第一次重复期间，在试验化合物的存在下，将蛋白加热至65℃并冷却至25℃，在此维持约10秒钟，然后测量蛋白的荧光。在第二次重复期间，在试验化合物的存在下，将蛋白加热至66℃并冷却至25℃，在此维持约10秒钟，然后测量蛋白的荧光。该过程重复(例如，2-30次)，同时例如以1℃增量，增加蛋白加热所至的峰值温度。在一些实施方案中，在步骤(b1)期间，将蛋白在峰值温度平衡60-180秒钟。在该方法的具体实施方案中，平衡步骤为130秒钟。
在筛选方法的各个实施方案中，其中测量熔融转变的步骤包括在多个试验化合物的每一个的存在下，将蛋白逐渐地加热至80℃，同时连续地测量蛋白的荧光性。
在筛选方法的各个方面，蛋白是淀粉样蛋白-形成蛋白。一般地，当蛋白是淀粉样蛋白-形成蛋白时，所需的调节剂降低蛋白的熔融转变。这样一种调节剂稳定蛋白的非-淀粉样蛋白形式。在一些实施方案中，淀粉样蛋白-形成蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白(白内障)、αB-晶体蛋白(白内障)、βB2-晶体蛋白(白内障)、βB1-晶体蛋白(白内障)、γD-晶体蛋白(白内障)、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白(帕金森氏病)、IAPP (2型糖尿病)、β-淀粉样蛋白(阿尔茨海默氏病)、PrP (传染性海绵状脑病)、亨廷顿蛋白(亨廷顿氏病)、降钙素(甲状腺管道样癌)、心房利尿钠因子(孤立性心房淀粉样蛋白变性)、载脂蛋白AI (动脉粥样硬化)、血清淀粉样蛋白A (类风湿性关节炎)、Medin (主动脉内淀粉样蛋白)、催乳素(泌乳素瘤)、运甲状腺素蛋白(家族性淀粉样蛋白多神经病)、溶菌酶(遗传性非神经病性系统性淀粉样蛋白变性)、β2微球蛋白(透析相关淀粉样蛋白变性)、凝溶胶蛋白(Finnish淀粉样蛋白变性)、角膜上皮蛋白(格子状角膜营养不良)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(脑淀粉样血管病：冰岛型)、免疫球蛋白轻链AL (系统AL淀粉样蛋白变性)、肌纤蛋白(青光眼)和S-IBM (散发性包涵体肌炎)。
在筛选方法的一些实施方案中，蛋白是造成功能丧失疾病的蛋白。一般地，当蛋白是造成功能丧失疾病的蛋白时，所需调节剂增加蛋白的熔融转变。这样一种调节剂稳定蛋白的突变体形式，以致它保持活性(即，蛋白的降解减少)。造成功能丧失疾病的蛋白可以是，例如，突变体β-葡糖苷酶、突变体葡糖神经酰胺酶(Gaucher’s病)、突变体囊性纤维化跨膜受体(囊性纤维化)、突变体氨基己糖苷酶A (Tay-Sachs病)、突变体氨基己糖苷酶B (Sandhoff病)、突变体β-半乳糖苷酶(Morquio综合征)和突变体α-葡糖苷酶(即，Pompe病)。
在一些实施方案中，本发明包括一种高通量筛选系统，其包括：(a) 淀粉样蛋白-形成蛋白；(b) 能够测量淀粉样蛋白-形成蛋白的熔融转变(Tm)的装置；和(c) 多个试验化合物。能够测量淀粉样蛋白-形成蛋白的Tm的装置可以是本领域已知的任何装置。如上所指出的，在一些实施方案中，装置是差示扫描荧光计装置，例如ThermoFluor® 384-孔DSF平台。在筛选系统的各个方面，蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉样蛋白、PrP、亨廷顿蛋白、降钙素、心房利尿钠因子、载脂蛋白AI、血清淀粉样蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。
实施例
下面是本文描述方法的各个方面的非限制性实施例。给出实施例仅仅是为了举例说明的目的并不视为限制本公开，因为其许多变化都是可能的。
实施例 1
该实施例描述筛选稳定示例性聚集倾向的蛋白Hsp27的化合物的高通量方法。
采用差示扫描荧光计(DSF)以鉴定稳定cryAB的化合物。在DSF实验中，蛋白靶标的熔融转变(Tm)在有效配体的存在下测量(Cummings等, J Biomol Screen 11, 854 (2006)。DSF通过内在色氨酸荧光，或(更常见)染料，例如1,8-苯胺基萘磺酸(双-ANS)或Sypro Orange测量目标蛋白的热去折叠。配体的结合增加了折叠状态或关键中间体的自由能，这限制了去折叠并转移了表观Tm。这些值被用于计算去折叠转变。当化合物在加热前结合于靶标时，它们稳定针对去折叠，转移△Tm。对于cryAB和cryAB R120G突变体的情况，寻找减少表观Tm的化合物，因为淀粉样蛋白通常在这个平台具有较高的表观稳定性。例如，野生型cryAB的Tm是64.1 ± 0.5℃，而更具淀粉样蛋白倾向的R120G cryAB突变体具有68.3 ± 0.2℃的表观Tm （ 3 ）。这种差别与R120G的增加的淀粉样蛋白倾向有关。因此，有理由认为，筛选减少表观Tm的“击中”可能抑制聚集。
使用小型384-孔DSF平台(ThermoFluor®)，筛选2,446个化合物阻断sHSP聚集的能力。作为一个模型，人Hsp27被用于HTS，因为其容易地形成淀粉样蛋白且其保留了在所有sHSP中发现的高度保守的晶体蛋白结构域。Hsp27在室温下是可溶的，但其是热展开的并在加热时迅速形成稳定的淀粉样蛋白。
筛选在Abgene黑色384-孔PCR板中，在含50 mM NaPO4中的10 µM Hsp27 (pH 7.4)、700 mM NaCl、50 mM LiCl和100 μM 双-ANS的7 µL体积中进行。反应物被硅油覆盖以限制蒸发。对照试验提示分析耐受至多4% DMSO，但是1%被用作最终浓度。用上/下模式(up/down mode)测量板，其凭经验确定以提供比连续渐变模式(continuous ramp mode)更好的信噪比。将板以1℃增量自65℃加热至80℃，在各高温下平衡130秒钟，冷却至25℃，并于25℃保持10秒钟，然后对于每个温度读数用单一的10秒曝光成像。板均匀性试验测定在72.3 ± 0.16℃的Hsp27的Tm。经计算Z因子在~0.59和0.71之间变化和CV是8%。大多数变化似乎由某些“边际效应”产生。
对于各孔，获得一系列荧光对比温度点，作图并拟合以确定Tm。在MatLab中开发自动方法，所述MatLab进行各个拟合，然后基于如何使3个独立的拟合方法(Savitzky-Golay导数、S形曲线和平行基线Hill)密切地相符对每个试验孔排序。
从初次筛选，鉴定了降低表观Tm超过3个标准差(-3SD；~0.6℃)的45个化合物和增加Tm达+3SD的45个化合物。所有这90个化合物都进行剂量依赖性实验研究以证实它们的活性和，从这些研究得知，64个化合物的活性低于50 µM。经鉴定降低表观Tm超过3个标准差的45个化合物以12-点剂量依赖性分析进行了测试，提供在浓度低于20 µM下证实和转移△Tm的28个化合物。有趣的是，这28个中的12个化合物是相关甾醇的单一结构类型的一部分。选择该骨架进一步研究。
总之，这些研究证实HTS方法为鉴定淀粉样蛋白-形成蛋白，例如cryAB的药物伴侣的强有力的手段。事实上，研究证实HTS方法可用于发现调节其中需要增加的稳定性(例如，丧失功能蛋白例如负责Pompe病的α-葡糖苷酶的突变体形式)或降低的稳定性(聚集倾向蛋白例如亨廷顿蛋白)的任何蛋白的Tm的药剂。
实施例 2
该实施例描述在实施例1的初步筛选中鉴定的甾醇骨架的构效关系(SAR)研究。如进一步在下文中所述的，SAR揭示了减少淀粉样蛋白-形成蛋白，R120G cryAB的Tm至少2℃的化合物的通用化学结构(式I)。
32个具有与17-a-羟基-孕酮相关的化学结构的甾醇被收集并经受进一步的测试(见表2)。使用R120G cryAB进行关于这种集中收集的DSF实验，鉴定了两种减少Tm至少2℃的化合物：5a-胆甾烷-3b-醇-6-酮和5-胆甾烯-3b,25-二醇。许多其它的密切相关的甾醇，包括胆固醇，为无活性的和得到的SAR支持相当特异的分子相互作用。
表 2
名称 活性 ( 在 100μM 的热稳定性的转移 )
5-胆甾烯-3b,25-二醇 -2.0℃
5a-胆甾烷-3b-醇-6-酮 -3.0℃
5-胆甾烯-3b-醇 -1.1℃
本胆烷-17b-醇-3-酮 +1.7℃
17-a-羟基-孕酮 +1℃和-1℃之间
5a-雄甾烷-3b,17b-二醇 +1℃和-1℃之间
17a-羟基-孕烯醇酮 +1℃和-1℃之间
5-a-雄甾烷-3,17-二酮 +1℃和-1℃之间
表雄甾酮 +1℃和-1℃之间
孕酮 +1℃和-1℃之间
脱氢异雄甾酮 +1℃和-1℃之间
D4-雄甾烯-3,17-二酮 +1℃和-1℃之间
b-雌二醇 +1℃和-1℃之间
睾酮 +1℃和-1℃之间
皮质酮 +1℃和-1℃之间
可的松 +1℃和-1℃之间
雌激素三醇 +1℃和-1℃之间
4-胆甾烯-3-酮 +1℃和-1℃之间
胆固醇 +1℃和-1℃之间
氢化可的松 +1℃和-1℃之间
雌激素酮 +1℃和-1℃之间
D5-孕烯-3b-醇-20-酮 +1℃和-1℃之间
睾酮乙酸酯 +1℃和-1℃之间
脱氧皮质酮 +1℃和-1℃之间
雄甾酮 +1℃和-1℃之间
皮质酮-21-乙酸酯 +1℃和-1℃之间
洋地黄皂苷 +1℃和-1℃之间
5-胆甾烯-3b-醇-7-酮 +1℃和-1℃之间
熊去氧胆酸 +1℃和-1℃之间
6-酮胆甾烷醇 +1℃和-1℃之间
18-a-甘草次酸 +1℃和-1℃之间
用5a-胆甾烷-3b-醇-6-酮、5-胆甾烯-3b,25-二醇和胆固醇进行的进一步的剂量依赖性研究显示5a-胆甾烷-3b-醇-6-酮和5-胆甾烯-3b,25-二醇二者均能够部分地恢复野生型Tm，表明它们作为药物伴侣的用途。为证实在独特的实验平台中与cryAB的直接相互作用，采用生物层干涉技术(biolayer interferometry) (在实施例1中所述)以确定5-胆甾烯-3b,25-二醇结合于具有10.1 ± 4.4 µM的KD的R120G cryAB。通过生物层干涉技术(Octet Red)测量试验蛋白的亲和力允许假阳性的鉴定。简言之，生物素化cryAB固定于链霉抗生物素包被的针(pins)并分析在一百倍浓度范围内的平衡关联数据以生成表观KD。为控制非特异性结合，生物素封闭的针的反应从每个传感图减去。
总之，以上结果证明式I化合物作为R120G cryAB的药物伴侣在体外起作用并以高的亲和力结合。此外，所述结果指明公开的DSF方法代表一个强效的高通量筛选系统，供鉴定新的用于非酶的药物伴侣。
实施例 3
该实施例证实在实施例1中鉴定的化合物抑制淀粉样蛋白形成。值得注意的是，所述化合物还能逆转淀粉样蛋白形成。
DSF研究提示甾醇抑制R120G cryAB淀粉样蛋白形成。为测试这种概念，R120G cryAB (15 µM)用5-胆甾烯-3b,25-二醇或胆固醇(100 µM)处理，而其聚集的能力通过电子显微镜测量。这些研究证实5-胆甾烯-3b,25-二醇，而不是胆固醇或溶剂对照品，极大地抑制淀粉样蛋白形成。溶液的视觉检查支持这一结论，因为只有5-胆甾烯-3b,25-二醇减少R120G cryAB混合物的不透明度。而且，5-胆甾烯-3b,25-二醇还逆转预形成的R120G cryAB淀粉样蛋白的聚集，提示其将平衡向非-淀粉样蛋白结构转移。
为了探究5-胆甾烯-3b,25-二醇的作用机理，R120G cryAB的结合位点通过15N HSQC NMR探测，产生的化学位移的分析提示其结合保守的晶体蛋白结构域的暴露表面。特别地，5-胆甾烯-3b,25-二醇结合跨越cryAB二聚体界面的沟并与R120和D109附近的残基接触。
以上结果支持一种模型，其中甾醇稳定sHSP并减少淀粉样蛋白形成。
实施例 4
该实施例证实本文鉴定的化合物在体内逆转白内障显型。
R120G cryAB基因敲入小鼠是年龄相关性和遗传性白内障的临床上-可接受的模型。动物模型在20周内产生严重的白内障(Andley等, PLoS One 6, e17671 (2011))。自这些小鼠摘下的眼睛用5-胆甾烯-3b,25-二醇(100 µM)或盐水对照品处理。5-胆甾烯-3b,25-二醇治疗显著地减少cryAB的聚集并改善cryAB溶解性。
然后5-胆甾烯-3b,25-二醇在盐水-环糊精溶液(5 mM环糊精；5 mM 5-胆甾烯-3b,25-二醇)中配制并经滴眼液递送至活体动物(n = 15)，一周3次，持续2周。cryAB溶解性和晶状体透明度通过在活体动物中测量狭缝晶状体照明和通过凝胶渗透色谱/自晶状体匀浆的光散射测定。这种治疗显著提高cryAB的溶解性，改进晶状体透明度并挽救10/15只处理的R120G cryAB基因敲入小鼠的白内障表型。因此，5-胆甾烯-3b,25-二醇，和更通常地，式I化合物，是治疗白内障的有前景的治疗剂。更广义地说，这些研究提示基于DSF的HTS的活动可以用来识别非酶的药物伴侣，例如cryAB。
实施例 5
该实施例证实本文鉴定的化合物增加眼睛中的可溶性α-晶体蛋白的水平。
在盐水-环糊精溶液(5 mM环糊精；5 mM 5-胆甾烯-3b,25-二醇)中配制的5-胆甾烯-3b,25-二醇经滴眼液递送至活体小鼠(n = 15)，一周3次，持续2周。α-晶体蛋白溶解性的凝胶过滤分析通过如前由Andley等 (PLoS ONE, 6:3, 1-13 (2011))中所述处理样品来进行。简言之，α-晶体蛋白的聚集程度使用带有光散射和折射率(RI)测量的凝胶渗透色谱(GPC)来确定。所有数据使用SAS版本9.3 (SAS Institute；Cary, NC)分析。为了控制在动物中分析敏感性的差异，将在药物处理的眼睛中α-晶体蛋白的曲线下面积与从相同动物的未经处理的眼睛产生的曲线下面积进行比较并表示为使用未经处理的眼作为分母的面积“百分比”差异。使用用于无差异的零假设的Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)，比较处理和未处理的眼之间的百分比差异。使用Spearman秩相关系数，计算年龄和百分比差异之间的关系。采用非参数统计模型以防止偏离正常。
发现在药物处理的眼中α-晶体蛋白的曲线下面积在统计学上显著高于相同动物的未经处理的眼睛(n=17，平均百分比差异 = 381.2 ± 974.6，中位数 = 63.3, Wilcoxon符号秩p-值 = 0.001)。年龄大的小鼠在处理的眼中的α-晶体蛋白相对于未经处理的眼睛表现出较高的增长百分率(Spearman秩相关= 0.44, p=0.075)。表1中的数据显示，当年龄大于200天时，中位数百分比差异显著地增加。
所述数据揭示式I化合物，5-胆甾烯-3b,25-二醇，在体内显著地增加α-晶体蛋白的溶解性，特别是在年龄较大的受试者中，从而针对白内障形成的潜在机制。
本文引用的每篇文献，包括任何交叉参考的或相关的专利或申请，通过引用以其全文结合到本文中，除非专门排除或另外限制。任何文献的引用并未承认它是关于本文公开的或要求的任何发明的现有技术或承认它单独或与任何其它参考文献的任何组合而教导、提示或公开任何这样的发明。此外，在这个文件中术语的任何意义或定义与通过引用结合的文件中的相同术语的任何意义或定义相抵触时，将以这个文件中的该术语的意义或定义为准。
虽然公开的主题的具体实施方案已被举例说明和描述，但本领域技术人员显而易见，可进行各种其它的变化和修饰而不背离要求保护的主题的精神和范围。因此，其意欲覆盖所附权利要求书中所有这样的变化和修饰。

Claims (27)

1. 一种治疗或预防白内障的方法，该方法包括给予有需要的个体有效量的包含式I化合物或其前药或药学上可接受的盐的组合物：
其中：
两个R1为H或两个R1为Me；
R2为H或OH；
5位和6位碳之间的虚线表示任选的双键；
R3为H或Me；
R4为H或Me；
n为0或1；
(a) R6是和各R5独立地为H或Me或(b) R6和一个R5结合在一起，形成任选取代的6-元环，而另一个R5是Me；
12位和13位碳之间的虚线是任选的双键，前提是当12位和13位碳之间的双键存在时，R7不存在，而当12位和13位碳之间的双键不存在时，R7为H或Me；
R8为H或OH；
两个R9一起形成氧代(=O)或两个R9为氢；和
R10是CO2H或线性或支链的C1-C6烷基。
2. 权利要求1的方法，其中式I化合物具有式IA或式IB的结构：
或
其中各R11独立地为烷基、CO2H或CO2烷基。
3. 权利要求1或2的方法，其中化合物具有式II的结构：
其中R12为H或OH和R13为H或OH。
4. 权利要求3的方法，其中化合物是5-胆甾烯-3b,25-二醇。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述组合物经局部、结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内给药。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述白内障是年龄-相关白内障或糖尿病性白内障。
7. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述个体具有遗传性早期发病的白内障形式。
8. 权利要求7的方法，其中所述个体具有在cryAB中的R120G突变和/或D109H突变。
9. 一种眼科药用组合物，其包含药学上可接受的眼用载体和式I化合物或其前药或药学上可接受的盐：
其中：
两个R1均为H或两个R1均为Me；
R2为H或OH；
5位和6位碳之间的虚线表示任选的双键；
R3为H或Me；
R4为H或Me；
n为0或1；
(a) R6是和各R5独立地为H或Me或(b) R6和一个R5结合在一起，形成任选取代的6-元环，而另一个R5是Me；
12位和13位碳之间的虚线是任选的双键，前提是当12位和13位碳之间的双键存在时，R7不存在，而当12位和13位碳之间的双键不存在时，R7为H或Me；
R8为H或OH；
两个R9一起形成氧代(=O)或两个R9为氢；和
R10为CO2H或线性或支链C1-C6烷基。
10. 权利要求1的组合物，其中式I化合物具有式IA或式IB的结构：
或
其中各R11独立地为烷基、CO2H或CO2烷基。
11. 权利要求9或权利要求10的组合物，其中化合物具有式II的结构：
其中R12为H或OH和R13为H或OH。
12. 权利要求11的组合物，其中化合物是5-胆甾烯-3b,25-二醇。
13. 权利要求9-12中任一项的组合物，其中药学上可接受的眼用载体是环糊精。
14. 权利要求13的组合物，其中所述环糊精是(2-羟基丙基)-β-环糊精。
15. 一种筛选用于调节蛋白热稳定性的化合物的高通量方法，该方法包括：
(a) 使蛋白与多个试验化合物的每一个接触；和
(b) 在多个试验化合物的每一个的存在下，测量蛋白的熔融转变(Tm)，其中降低或增加表观Tm至少2个标准差的化合物是药用蛋白伴侣。
16. 权利要求15的方法，其中所述蛋白是淀粉样蛋白-形成蛋白或造成功能丧失疾病的蛋白。
17. 权利要求16的方法，其中所述淀粉样蛋白-形成蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉样蛋白、PrP、亨廷顿蛋白、降钙素、心房利尿钠因子、载脂蛋白AI、血清淀粉样蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。
18. 权利要求16的方法，其中造成功能丧失疾病的蛋白选自突变体β-葡糖苷酶、囊性纤维化跨膜受体、氨基己糖苷酶A、氨基己糖苷酶B、β-半乳糖苷酶和α-葡糖苷酶。
19. 权利要求15-18中任一项的方法，其中Tm使用高通量差示扫描荧光计装置测定。
20. 权利要求15-19中任一项的方法，其中所述测量步骤包括：
(b1) 在多个试验化合物的每一个的存在下，将蛋白自50℃加热至80℃，
(b2) 冷却蛋白至25℃，
(b3) 维持蛋白于25℃ 10秒钟，和
(b4) 测量蛋白的荧光性。
21. 权利要求20的方法，该方法还包括重复步骤(b1)-(b4) 2-30次，其中步骤(b1)的每次重复在逐渐增加的较高温度下进行。
22. 权利要求21的方法，其中淀粉样蛋白-形成蛋白以1℃增量自65℃加热至80℃。
23. 权利要求20-22中任一项的方法，其中(b1)还包括，在加热后，平衡淀粉样蛋白-形成蛋白和试验化合物60-180秒。
24. 权利要求23的方法，其中平衡步骤为130秒钟。
25. 一种高通量筛选系统，其包含
(a) 淀粉样蛋白-形成蛋白；
(b) 能够测量淀粉样蛋白-形成蛋白的熔融转变(Tm)的装置；
(c) 多个试验化合物。
26. 权利要求25的筛选系统，其中蛋白选自Hsp27、αA-晶体蛋白、αB-晶体蛋白、βB2-晶体蛋白、βB1-晶体蛋白、γD-晶体蛋白、Hsp22、Hsp20、τ、α-突触核蛋白、IAPP、β-淀粉样蛋白、PrP、亨廷顿蛋白、降钙素、心房利尿钠因子、载脂蛋白AI、血清淀粉样蛋白A、Medin、催乳素、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、β2微球蛋白、凝溶胶蛋白、角膜上皮蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、免疫球蛋白轻链AL和S-IBM。
27. 权利要求25或权利要求26的筛选系统，其中所述装置是高通量差示扫描荧光计装置。
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