CN104726508A - 多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents
多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104726508A CN104726508A CN201510055312.7A CN201510055312A CN104726508A CN 104726508 A CN104726508 A CN 104726508A CN 201510055312 A CN201510055312 A CN 201510055312A CN 104726508 A CN104726508 A CN 104726508A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- heterotrophic
- dha
- bnoa
- thanomin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N docosahexaenoic acid Natural products CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 title claims abstract description 69
- DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title abstract description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 claims abstract description 27
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 claims abstract description 24
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims abstract description 9
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N Ethanolamine Oleate Chemical compound NCCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O KGWDUNBJIMUFAP-KVVVOXFISA-N 0.000 claims description 22
- CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N benzoic acid;2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1.OC(=O)C1=CC=CC=C1O CUBCNYWQJHBXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 4
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 abstract 4
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 abstract 4
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 abstract 2
- RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 2-naphthyloxyacetic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(OCC(=O)O)=CC=C21 RZCJYMOBWVJQGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 abstract 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 abstract 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 3
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- DSQNMNVLWGRUSL-UHFFFAOYSA-N P(=O)(=O)C(C(C)=O)(O)O Chemical compound P(=O)(=O)C(C(C)=O)(O)O DSQNMNVLWGRUSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-L aldehydo-D-ribose 5-phosphate(2-) Chemical compound [O-]P(=O)([O-])OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-L 0.000 description 3
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 3
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940025237 fructose 1,6-diphosphate Drugs 0.000 description 3
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024732 dysthymic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产二十二碳六烯酸（DHA）的方法，以寇氏隐甲藻的异养培养基为基础，在其中添加任一种化学促进剂；所说异养培养基的组成为：葡萄糖9 g/L,酵母浸粉2g/L,海盐25g/L；所说化学促进剂也可称为植物生长调节剂，包括吲哚乙酸（IAA）、萘氧乙酸（BNOA）、氯苯甲酸、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、乙醇胺，这些化学促进剂，在所说异养培养基中的浓度为：吲哚乙酸（IAA）2.5mg/L，萘氧乙酸（BNOA）4mg/L，氯苯甲酸4mg/L，水杨酸（SA）1 mg/L，脱落酸（ABA）20 mg/L，乙醇胺2.5 mM；25oC下培养72小时后，提取油脂，使用气质联用仪测定培养物DHA含量，同时从平行培养物中提取细胞代谢物，利用代谢组学方法检测分析胞内代谢物的含量变化情况。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产DHA的方法。
背景技术
DHA即二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid, DHA）是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15%以上的速度增长。
截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。
利用隐甲藻 ( Crypthecodinium cohnii ) 发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比，具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前景。
隐甲藻是一种原始的真核单细胞微生物，营异养生活，在甲藻门中处于较低等的地位。隐甲藻的细胞周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累DHA的主要阶段。目前工程培养隐甲藻细胞过程中，油脂产量较低。在不抑制隐甲藻自身生长的前提下，在培养基中添加各类刺激隐甲藻油脂积累的物质成为改善发酵培养的重要方向，但是对其代谢机理是不清楚的，这限制了对其的开发应用。
植物生长调节剂是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质，具有调控植物生长和发育的功能。作为外源的非营养性化学物质，植物生长调节剂通常可在植物体内传导至作用部位，以很低的浓度就能促进或抑制其生命过程的某些环节，使之向符合人类的需要发展。它不仅适用于种植业中几乎所有的高等和低等植物，还可用于食用菌及藻类的生长，且具有用量少、残毒小的特点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产DHA的方法。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：利用代谢组学分析在一种或两种化学促进剂刺激下二十二碳六烯酸累积明显的寇氏隐甲藻细胞内代谢物丰度的变化情况。
本发明多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产二十二碳六烯酸（DHA）的方法的特征是，以寇氏隐甲藻的异养培养基为基础，在其中添加任一种化学促进剂；所说的异养培养基的组成为：葡萄糖9 g/L, 酵母浸粉2 g/L, 海盐25 g/L；所说的化学促进剂也可称为植物生长调节剂，包括吲哚乙酸（IAA）、萘氧乙酸（BNOA）、氯苯甲酸、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、乙醇胺，这些化学促进剂在所说的异养培养基中的浓度为：吲哚乙酸（IAA）2.5 mg/L，萘氧乙酸（BNOA）4 mg/L，氯苯甲酸4 mg/L，水杨酸（SA）1 mg/L，脱落酸（ABA）20 mg/L，乙醇胺2.5 mM; 25 oC下培养72小时后，提取油脂，使用气质联用仪测定培养物DHA含量，使用t检验分析添加化学促进剂的样品与对照之间的显著性差异，同时从平行培养物中提取细胞代谢物，利用代谢组学方法检测分析胞内代谢物的变化情况。
在所说的异养培养基中还可添加两种组合的植物生长调节剂，即萘氧乙酸（BNOA）与乙醇胺和水杨酸（SA）与乙醇胺两种组合；所说的两种组合的植物生长调节剂在异养培养基中的浓度为：萘氧乙酸（BNOA）4 mg/L，水杨酸（SA）1 mg/L，乙醇胺2.5 mM。
通过基于液质联用仪（LC-MS）的代谢组分析，糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径中代谢物含量与通过在异样培养基中添加化学促进剂来提高异养微生物胞内DHA含量有密切联系，在不同种化学促进剂的刺激下，异养微生物胞内DHA含量明显提高的同时，糖酵解途径和三羧酸循环中的主要代谢物含量均上调，而磷酸戊糖途径中的代谢物含量则下调；同时，与DHA累积相关的一系列生物标志物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸二羟丙酮、 乙酰-辅酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸 。
本发明的有益效果是：使用t检验分析，表明添加化学促进剂的样品与对照之间存在显著性差异，化学促进剂的添加能有效提高寇氏隐甲藻细胞二十二碳六烯酸（DHA）累积量，同时，发现了糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径与通过在异样培养基中添加化学促进剂来提高异养微生物胞内DHA含量有密切联系，并且公开了与DHA积累密切相关的生物标志物。
附图说明
图1为分别添加水杨酸（SA）、乙醇胺以及水杨酸（SA）&乙醇胺混合物培养后，使用油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS）的方法测定的寇氏隐甲藻二十二碳六烯酸（DHA）相对含量对比图（* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001）。p值小于0.05表明添加化学促进剂的样品与对照间存在显著性差异，p值越小，差异越大。
图2为分别添加萘氧乙酸（BNOA）、乙醇胺以及萘氧乙酸（BNOA）&乙醇胺混合物培养后，使用油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS）的方法测定的寇氏隐甲藻二十二碳六烯酸（DHA）相对含量对比图（* p <0.05; ** p <0.01）。p值小于0.05表明添加化学促进剂的样品与对照间存在显著性差异，p值越小，差异越大。
图3为添加水杨酸（SA）&乙醇胺混合物培养后，使用LC-MS的方法分析寇氏隐甲藻胞内代谢物的变化情况，图中加大加粗字体为上调代谢物，加大斜体字体为下调代谢物。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种寇氏隐甲藻的异养培养基的组成为：葡萄糖9 g/L, 酵母浸粉2 g/L, 海盐25 g/L。在所说的异养培养基中，加入植物生长调节剂为吲哚乙酸（IAA），浓度为 2.5 mg/L。25 oC下培养72小时后，提取油脂，使用气质联用仪测定培养物DHA含量，同时从平行培养物中提取细胞代谢物，利用LC-MS方法检测分析胞内代谢物的变化情况。
实施例2
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为萘氧乙酸（BNOA），浓度为4 mg/L。
实施例3
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为氯苯甲酸，浓度为4 mg/L。
实施例4
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为水杨酸（SA），浓度为1 mg/L。
实施例5
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为脱落酸（ABA），浓度为20 mg/L。
实施例6
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为乙醇胺，浓度为2.5 mM。
实施例7
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为水杨酸（SA）与乙醇胺，浓度为水杨酸（SA）1 mg/L，乙醇胺2.5 mM。
实施例8
和实施例1的情况基本上相同，只是其中加入的植物生长调节剂为萘氧乙酸（BNOA）与乙醇胺，浓度为萘氧乙酸（BNOA）4 mg/L，乙醇胺2.5 mM。
具体实验步骤：分别将0.2克吲哚乙酸（IAA）、0.2克萘氧乙酸（BNOA）、0.2克氯苯甲酸加入到10mL 二甲基亚砜中充分溶解，配成20 mg/mL的储液，将0.1克水杨酸（SA）加入到10 mL水中充分溶解，配成10 mg/mL的储液，将0.025克脱落酸（ABA）加入到10 mL水中充分溶解，配成2.5 mg/mL的储液，将0.006克乙醇胺加入到10 mL水中充分溶解，配成10 mM的储液，将所有储液过滤除菌，即得到各种植物生长调节剂储液。按照报导的培养基方案，即葡萄糖9 g/L, 酵母浸粉2 g/L, 海盐25 g/L，配制基础培养液，加入油脂积累促进剂，得到含有不同植物生长调节剂的促进隐甲藻中DHA积累的培养基。分别接种处于旺盛对数生长期的寇氏隐甲藻( Crypthecodinium cohnii)株系（藻株来自美国菌种保藏中心ATCC30772）。将藻株分别接种到上述培养基后摇匀，进行摇瓶实验。在250 mL摇瓶中装入100 mL上述培养基，以OD460nm=0.1为初始接种量，同时设计只加相同体积的溶剂以及不做任何处理的菌株作为对照试验，每个处理3个重复。然后利用天津市欧诺仪器仪表有限公司HNY-202B摇床进行单因子实验，培养温度为25 ℃，随机排放各瓶在摇床内的位置，减少处理误差。
在细胞生长到72 h时，收集一定量细胞，根据文献叙述的油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS）的方法测定样品中二十二碳六烯酸（DHA）的含量。在实验过程中，不同种类的植物生长调节剂对异养微生物的作用存在一定差异，但在一定浓度下能促进细胞的二十二碳六烯酸（DHA）的积累。
同时，收集一定量细胞，根据文献叙述的代谢物提取方法以及LC-MS的方法测定各样品中代谢物的含量。
最后通过论证，与空白对照组相比，添加不同种类的植物生长调节剂对细胞的二十二碳六烯酸（DHA）含量有明显提高，DHA积累情况比没有使用植物生长调节剂的对照提高5%-19%，促DHA积累效果明显（表1）；通过对细胞代谢物的分析，与对照组相比，DHA积累增加的细胞内糖酵解途径和三羧酸循环均上调，磷酸戊糖途径下调，并发现与DHA积累相关的生物标志物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸二羟丙酮、 乙酰-辅酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸。
表1 相对于对照，添加不同植物生长调节剂后，隐甲藻DHA积累情况
两种植物生长调节剂组合的实验步骤：将上述储液中的萘氧乙酸（BNOA）储液、水杨酸（SA）储液以及乙醇胺储液配比成两种混合物组合，即萘氧乙酸（BNOA）&乙醇胺和水杨酸（SA）&乙醇胺，并将这两种混合物分别加到上述的异养培养基中，使萘氧乙酸（BNOA）、水杨酸（SA）以及乙醇胺在培养基中的终浓度分别为4 mg/L、1 mg/L、2.5 mM，得到两种含有植物生长调节剂混合物的促进二十二碳六烯酸（DHA）积累的培养基。分别接种处于旺盛对数生长期的寇氏隐甲藻( Crypthecodinium cohnii )株系（藻株来自美国菌种保藏中心ATCC30772）。将藻株分别接种到上述培养基后摇匀，进行摇瓶实验。在250 mL摇瓶中装入100 mL上述培养基，以OD460nm=0.1为初始接种量，同时设计只加相同体积的溶剂以及不做任何处理的菌株作为对照试验，每个处理3个重复。然后利用天津市欧诺仪器仪表有限公司HNY-202B摇床进行单因子实验，培养温度为25 ℃，随机排放各瓶在摇床内的位置，减少处理误差。在细胞生长到72 h时，收集一定量细胞，根据文献叙述的油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS）的方法测定样品中二十二碳六烯酸（DHA）的含量。同时，收集一定量细胞，根据文献叙述的代谢物提取方法以及LC-MS的方法测定各样品中代谢物的含量。
在实验过程中，两种含有植物生长调节剂混合物的上述培养基对隐甲藻的二十二碳六烯酸（DHA）积累均有明显的促进作用，并相对于单加这三种植物生长调节剂中的任一种所起到的二十二碳六烯酸（DHA）积累作用有明显的提高（图1、2）；通过对细胞代谢物的分析，与对照组相比，也同样能发现DHA积累增加的细胞内糖酵解途径和三羧酸循环均上调，磷酸戊糖途径下调，与DHA积累相关的生物标志物也包含了葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸二羟丙酮、 乙酰-辅酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸（图3）。
本发明提供的培养基有明显的促进DHA积累的作用，同时有助于更清楚的了解异养微生物生产二十二碳六烯酸(DHA)的机制，从而加速相关微生物资源的开发。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (2)
1.多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产二十二碳六烯酸（DHA）的方法，其特征是，以寇氏隐甲藻的异养培养基为基础，在其中添加任一种化学促进剂；所说的异养培养基的组成为：葡萄糖9 g/L, 酵母浸粉2 g/L, 海盐25 g/L；所说的化学促进剂也可称为植物生长调节剂，包括吲哚乙酸（IAA）、萘氧乙酸（BNOA）、氯苯甲酸、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、乙醇胺，这些化学促进剂在所说的异养培养基中的浓度为：吲哚乙酸（IAA）2.5 mg/L，萘氧乙酸（BNOA）4 mg/L，氯苯甲酸4 mg/L，水杨酸（SA）1 mg/L，脱落酸（ABA）20 mg/L，乙醇胺2.5 mM；25 oC下培养72小时后，提取油脂，使用气质联用仪测定培养物DHA含量，同时从平行培养物中提取细胞代谢物，利用代谢组学方法检测分析胞内代谢物的含量变化情况。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在所说的异养培养基中还可添加两种组合的植物生长调节剂，即萘氧乙酸（BNOA）与乙醇胺和水杨酸（SA）与乙醇胺两种组合；所说的两种组合的植物生长调节剂在异养培养基中的浓度为：萘氧乙酸（BNOA）4 mg/L，水杨酸（SA）1 mg/L，乙醇胺2.5 mM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510055312.7A CN104726508B (zh) | 2015-02-03 | 2015-02-03 | 多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510055312.7A CN104726508B (zh) | 2015-02-03 | 2015-02-03 | 多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104726508A true CN104726508A (zh) | 2015-06-24 |
| CN104726508B CN104726508B (zh) | 2018-04-06 |
Family
ID=53450920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510055312.7A Expired - Fee Related CN104726508B (zh) | 2015-02-03 | 2015-02-03 | 多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104726508B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055448A (zh) * | 2018-09-25 | 2018-12-21 | 杭州园泰生物科技有限公司 | 富含dha藻油的生产、提取以及纯化工艺 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304479A (zh) * | 2011-08-31 | 2012-01-04 | 中国海洋大学 | 添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用 |
-
2015
- 2015-02-03 CN CN201510055312.7A patent/CN104726508B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102304479A (zh) * | 2011-08-31 | 2012-01-04 | 中国海洋大学 | 添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 梅志刚: "隐甲藻生产DHA的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055448A (zh) * | 2018-09-25 | 2018-12-21 | 杭州园泰生物科技有限公司 | 富含dha藻油的生产、提取以及纯化工艺 |
| CN109055448B (zh) * | 2018-09-25 | 2020-08-04 | 广西小藻农业科技有限公司 | 富含dha藻油的生产、提取以及纯化工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104726508B (zh) | 2018-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | A flexible culture process for production of the green microalga Scenedesmus dimorphus rich in protein, carbohydrate or lipid | |
| Kong et al. | Effect of glycerol and glucose on the enhancement of biomass, lipid and soluble carbohydrate production by Chlorella vulgaris in mixotrophic culture | |
| Dos Santos et al. | Cultivation of Spirulina maxima in medium supplemented with sugarcane vinasse | |
| Crolla et al. | Optimization of citric acid production from Candida lipolytica Y-1095 using n-paraffin | |
| Doucha et al. | Production of Chlorella biomass enriched by selenium and its use in animal nutrition: a review | |
| Rocha et al. | Combination of trace elements and salt stress in different cultivation modes improves the lipid productivity of Scenedesmus spp. | |
| Dhup et al. | Effect of nitrogen concentration on lipid productivity and fatty acid composition of Monoraphidium sp. | |
| Oostlander et al. | Optimization of Rhodomonas sp. under continuous cultivation for industrial applications in aquaculture | |
| Schwenk et al. | Lipid content in 19 brackish and marine microalgae: influence of growth phase, salinity and temperature | |
| Li et al. | The potential productivity of the microalga, Nannochloropsis oceanica SCS-1981, in a solar powered outdoor open pond as an aquaculture feed | |
| Running et al. | Extracellular production of L-ascorbic acid by Chlorella protothecoides, Prototheca species, and mutants of P. moriformis during aerobic culturing at low pH | |
| Nygård et al. | Single cell and in vivo analyses elucidate the effect of xylC lactonase during production of D-xylonate in Saccharomyces cerevisiae | |
| Dashti et al. | Batch culture and repeated-batch culture of Cunninghamella bainieri 2A1 for lipid production as a comparative study | |
| Traugott et al. | Aeration and nitrogen modulated growth rate and chemical composition of green macroalgae Ulva sp. cultured in a photobioreactor | |
| Huang et al. | Metabolomic analysis and pathway profiling of paramylon production in Euglena gracilis grown on different carbon sources | |
| CN112481348A (zh) | 一种高产dha裂殖壶菌突变菌株的筛选方法 | |
| CN109463744A (zh) | 一种冠突散囊菌固态发酵白果粉的方法及其制备的产品和应用 | |
| Wu et al. | Enhancement in lipid productivity of the marine microalga Nannochloropsis sp. SCSIO-45217 through phosphate adjustment strategies | |
| CN104726508A (zh) | 多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法 | |
| Meng et al. | Establishment of a high-throughput screening platform to screen Schizochytrium sp. with a high yield of DHA | |
| Huang et al. | Identification of six novel microalgal strains and characterization of their potential for development of high-value compounds | |
| CN103710402A (zh) | 一种促进微藻油脂积累的培养基 | |
| US9605289B2 (en) | Process of production and extra-cellular secretion of lipids | |
| CN103468575B (zh) | 一株高产dha的寇氏隐甲藻突变株及发酵方法和应用 | |
| US20240164418A1 (en) | Organic selenium enriched edible marine microalgal biomass |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180406 |