CN104661675B - 细胞疫苗和诱导受试者免疫反应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法。本发明进一步包括分离的核酸疫苗、细胞疫苗、融合蛋白、表达载体、疫苗和其中使用的免疫原性组合物。

Description

细胞疫苗和诱导受试者免疫反应的方法
技术领域
本发明涉及诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法。本发明进一步包括分离的核酸疫苗、细胞疫苗、融合蛋白、表达载体、疫苗和其中使用的免疫原性组合物。
背景技术
全世界大概有3300万的个体具有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。许多个体将因为此感染而死亡，据称已经超过2300万例死亡，且每年有270万人被新感染上(InternationalAIDS vaccine initiative(IAVI),AIDS vaccine blueprint,A challenge to thefield,A road map for progress,2008,ISBN#0-9792432-8-9)。超过80％的新HIV-1感染出现在发展中世界中。
澳大利亚每年大概有10,000例新的丙型肝炎病毒(HCV)感染，该国中有220,000名HCV阳性个体(Razali K等人,2007,Drug Alcoho l Depend 91:228-235)，世界上大概有2亿受感染个体且估计每年新增300-400万感染(Bonner,J.E.,Esserman,D.,Evon,D.M.,2012,Reliability and validity of a self-efficacy instrument for hepatitis Cantiviral treatment regimens,J Viral Hep 19:316-26)。在发展中国家，许多感染是由差的医疗实践引起(Hauri,A.M,Armstrong,G.L,Hutin Y.J,2004)。全球的疾病负荷可归因于在保健设置中给出的被污染的注射(Int.J.STD AIDS,15(2004),第7-16页)。
需要有效的疫苗来控制这些病原体的蔓延。然而，现有的许可的疫苗常常取决于诱导保护的中和抗体，但中和抗体可能无法有效地控制HCV和HIV的攻击。这些病毒迅速地突变并产生逃脱中和抗体(NAb)的突变体。因为常规的疫苗引起NAb，所以需要一种设计针对这些病毒的疫苗的替代方法。
需要HIV和HCV的替代疫苗。本发明设法解决或至少改善如上所述的现有技术的一个或多个不足，或为消费者提供有用的或商业的选择。
背景技术的以上讨论仅仅是意图有助于理解本发明。此讨论并非是承认或认可截至申请的优先日期止，任何所提及的材料是或属于常识。
发明概述
根据本发明，提供一种诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法。所述方法包括以下：
使所述免疫原在细胞中表达，以及
向所述受试者施用所述细胞，由此诱导促炎性的免疫反应。
细胞可以是体细胞。
所述方法可以包括在细胞中诱导细胞死亡(坏死)的另一步骤。诱导细胞死亡(坏死)的步骤可以在向受试者施用细胞的步骤前或后进行。诱导细胞死亡的步骤可以在免疫接种后使细胞溶解。细胞溶解可以在施用后在受试者中发生，由此在受试者的免疫系统加工所溶解的细胞时诱导促炎性的免疫反应。典型地，当所述方法包括在细胞中诱导细胞死亡的另一步骤时，细胞作为非抗原呈递细胞、例如体细胞而提供。细胞可以选自同种异体细胞、HEK 293T细胞和重组表达人类白细胞抗原(HLA)I和II类分子和Huh7细胞。优选地，体细胞是同种异体的或者自体的。细胞也可以选自无法表达HLA蛋白质的细胞，例如(但不限于)CIR细胞、K562和LCL721.221细胞。
或者细胞可以是抗原呈递细胞(APC)。
所述方法可以包括使免疫原在细胞中表达的步骤可以进一步包括在细胞表面上呈递所表达的免疫原的步骤的另一步骤。
当细胞是APC时，使免疫原在细胞中表达的步骤可以进一步包括在细胞表面上呈递所表达的免疫原的步骤。在细胞表面上呈递所表达的免疫原的步骤可以通过受试者的免疫系统加工所表达的呈递免疫原的APC，由此在受试者中诱导促炎性的免疫反应。APC可以选自同种异体细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞、郎格罕氏细胞(Langerhans cell)、库柏法细胞(Kupffer cell)。优选地，APC是同种异体的或者自体的。
细胞可以共同表达HLA。细胞表达HLA可以是自然过程的结果或者归因于HLA的重组表达。也就是说，HLA表达可以是细胞通过内源性过程表达HLA的结果。或者，HLA表达可以因重组工程化和蛋白质产生而发生。
免疫原可以来源于HCV。当免疫原来源于HCV时，细胞典型地不共同表达HLA。
免疫原可以来源于HIV。当免疫原来源于HIV时，细胞可能或可能不共同表达HLA。
在一个优选的实施方案中，免疫反应是针对内源性抗原，使得在细胞溶解后，抗原被免疫系统当做外源性抗原处理，导致抗原交叉呈递。在另一个方面，本发明提供一种诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法，其包括以下步骤：
使所述内源性免疫原在体细胞或APC中表达；
在所述细胞中诱导坏死；以及
将所述细胞施用所述受试者，由此诱导促炎性的免疫反应。
本发明的进一步特征提供向受试者施用细胞，由此诱导促炎性的免疫反应的步骤，所述步骤通过受试者的APC经由II类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD4+T细胞检测。
本发明的更进一步特征提供向受试者施用细胞，由此诱导促炎性的免疫反应的步骤，所述步骤通过APC经由I类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD8+T细胞检测。
在另一个方面，本发明提供一种诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的方法，其包括以下步骤：
使所述内源性免疫原在细胞中表达，由此呈递内源性免疫原；以及
向所述受试者施用内源性免疫原呈递细胞，由此诱导促炎性的免疫反应。
在一个实例中，细胞是APC。
本发明的进一步特征提供使免疫原在APC中表达，由此呈递免疫原的步骤，所述步骤通过APC经由II类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD4+T细胞检测。
本发明的更进一步特征提供使免疫原在APC中表达，由此呈递免疫原的步骤，所述步骤通过APC经由I类通路加工免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD8+T细胞检测。
本发明的方法的细胞可以选自同种异体或自体细胞、树突状细胞(DC)、外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞、B细胞、郎格罕氏细胞、库柏法细胞、HEK 293T细胞、重组表达HLAI和II类分子的HEK293T细胞以及Huh7细胞。优选地，APC是同种异体的或者自体的。
免疫原可以是病毒来源。如以上所讨论，免疫原可以是HIV来源。HIV来源的免疫原可以与例如(但不限于)HLA A*0201、HLA B*0702、HLA Cw7、DRB1、DRB3、DRB4和DRB5等人类白细胞抗原(HLA)一起呈递。免疫原在来源于HIV时，可以选自(但不限于)HIV gag和/或env蛋白。或者，免疫原可以来源于SIV，例如SIV gag和/或env蛋白。
在一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)在细胞中表达；
在所述细胞中诱导坏死；以及
向所述受试者施用表达HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)的所述细胞，由此诱导针对HIV蛋白质和HLA蛋白质的促炎性的免疫反应。
优选地，HLA选自HLA-A*0101、HLA-A*0301和HLA-A*2901以及HLA DP、DQ和DR。
HIV抗原可以是任何来源于HIV的蛋白质，例如(但不限于)gp120或gag。
在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HIV蛋白质在细胞中表达；
在所述细胞中诱导坏死；以及
向所述受试者施用表达HIV蛋白质的所述细胞，由此诱导针对HIV蛋白质的促炎性的免疫反应。
本发明的进一步特征提供诱导细胞中的细胞死亡的步骤，所述步骤通过诱导坏死进行。在细胞中诱导坏死的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导条件，例如(但不限于)将免疫原呈递细胞加热到63℃，保持至少30分钟来进行。
或者，诱导细胞中的细胞死亡的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导剂或使坏死剂在细胞中表达(细胞中的内部表达，而非外部暴露于坏死剂)进行。坏死诱导剂的实例可以包括(但不限于)胸苷激酶(TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺病毒五邻体纤维、NSP4、链球菌溶血素O、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。
在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)在细胞中表达；以及
向所述受试者施用表达HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)的APC，由此诱导针对HIV蛋白质的促炎性的免疫反应。
优选地，细胞是APC。
或者，免疫原可以来源于HCV。当来源于HCV时免疫原可以选自(但不限于)以下HCV蛋白质：核心、E1/E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。
在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HCV蛋白质在细胞中表达，由此呈递HCV蛋白质；
在所述细胞中诱导坏死；以及
向受试者施用表达HCV蛋白质的所述细胞，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反应。
本发明的进一步特征提供诱导细胞中的细胞死亡的步骤，所述步骤通过诱导坏死进行。在细胞中诱导坏死的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导条件，例如(但不限于)将免疫原呈递细胞加热到63℃，保持至少30分钟来进行。
或者，诱导细胞中的细胞死亡的步骤可以通过将细胞暴露于坏死诱导剂或使坏死剂在细胞中表达(细胞中的内部表达，而非外部暴露于坏死剂)进行。坏死诱导剂的实例可以包括(但不限于)胸苷激酶(TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺病毒五邻体纤维、NSP4、链球菌溶血素O、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。
在向受试者施用细胞的步骤后细胞可能进行溶解。
在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HCV蛋白质在APC或其它体细胞中表达，由此呈递HCV；以及
向受试者施用表达HCV蛋白质的APC，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反应。
在另一个实施方案中，诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的方法包括以下步骤：
使HCV蛋白质在细胞中表达；以及
向所述受试者施用表达HCV蛋白质的细胞，由此诱导针对HCV的促炎性的免疫反应。
本发明还提供一种核酸疫苗，其包含具有以下序列的核酸序列：
第一核酸序列，其具有编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的第一核酸序列；以及
第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列。
核酸疫苗可以是DNA疫苗。
第一序列和第二序列可以是双顺反子的。
核酸疫苗可以进一步包括一种或多种启动子，例如(但不限于)CMV启动子或SV40启动子。核酸疫苗还可以包括病毒性内部核糖体进入位点(IRES)，例如(但不限于)脑心肌炎病毒(EMCV)IRES。
在一个实施方案中，核酸疫苗包括：
可操作地连接于第一核酸序列的CMV启动子；和
可操作地连接于第二核酸序列的SV40启动子。
核酸疫苗可以包括可操作地连接以例如通过脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(EMCV IRES)进行单顺反子表达的第一核酸序列和第二核酸序列，并在第一核酸序列与第二核酸序列之间任选地包括插入核酸序列，所述插入核酸序列编码FMDV 2A蛋白酶或其它自体蛋白酶序列。
因此，在另一个实施方案中，核酸疫苗包括：
可操作地连接于第一核酸序列的EMCV IRES。
或者，具有编码蛋白酶裂解位点的DNA序列的核酸可以插入第一与第二核酸序列之间，例如(但不限于)口蹄疫病毒2A蛋白酶序列。应了解，载体可以设计成能将口蹄疫病毒2A蛋白酶核酸序列插入编码免疫原的上游第一核酸序列与编码具有坏死诱导活性的多肽的下游第二核酸序列之间。所产生的融合蛋白将预期包括与蛋白酶和具有细胞死亡诱导活性的多肽融合的免疫原。2A蛋白酶具有自我裂解活性，将预期其通过与翻译同时或在翻译后裂解而产生作为独立蛋白质的上游和下游蛋白质。2A蛋白酶的氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO:8，且2A蛋白酶的DNA序列在本文中描述为SEQ ID NO:9。
本发明还提供一种核酸疫苗，其包含：
第一核酸序列，其具有编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；
第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列和
在第一与第二核酸序列之间的插入核酸分子，其具有编码蛋白酶的核酸序列。
本发明的进一步特征提供插入核酸分子具有口蹄疫病毒2A蛋白酶的核酸序列或其功能性片段。
本发明的更进一步特征提供具有坏死诱导活性的多肽，所述多肽选自(但不限于)胸苷激酶(TK)、穿孔素、颗粒酶、胱天蛋白酶、RIP蛋白质1和3、腺病毒五邻体纤维、NSP4、链球菌溶血素O、炭疽杆菌溶血素、PB-F2和其功能性片段。NSP4蛋白质可以来自轮状病毒。或者，诱导细胞死亡的蛋白质可以选自(但不限于)：炭疽杆菌溶血素O；人类或小鼠穿孔素，包括野生型和突变形式(例如(但不限于)SEQ ID NO 7)；腺病毒五邻体纤维；颗粒酶A或B；胱天蛋白酶1；链球菌溶血素O；甲型流感病毒蛋白质PB-F2和霍乱毒素。
本发明进一步提供一种用于本发明的方法的核酸疫苗，其中：
第一核酸序列包含编码具有细胞死亡诱导活性的多肽的核酸序列；以及
第二核酸序列包含编码免疫原性多肽的核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，核酸疫苗进一步包含：
编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；和
编码免疫原性多肽的第二核酸序列；
其中第一核酸序列和第二核酸序列同框可操作地用于将具有坏死诱导活性的多肽和免疫原性肽以融合蛋白形式表达。
在本发明的另一个实施方案中，核酸疫苗进一步包含：
第一核酸序列，其具有编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列；
第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列；和
在第一与第二核酸分子之间的插入核酸序列，其具有编码蛋白酶的核酸分子。
归因于DNA密码的简并性，本领域技术人员非常了解在不改变所编码的多肽的氨基酸序列下可以进行核苷酸取代。因此，本发明包括用于具有坏死诱导活性的多肽的任何核酸序列，其包含编码毒性蛋白质(其能够诱导细胞坏死)的核酸序列和编码根据本发明的免疫原性多肽的核酸序列。此外，本领域应了解，对于给出的蛋白质的氨基酸序列，在对肽的功能无显著影响下可以进行序列中某些氨基酸的取代。此类取代在本领域中称为“保守取代”。本发明涵盖根据本发明的核酸序列，其包含编码具有坏死诱导活性的多肽的第一核酸序列和编码根据本发明的免疫原性多肽的第二核酸序列，其含有保守取代，其中细胞坏死诱导多肽和根据本发明的免疫原性多肽的功能不改变。
本发明延伸到融合蛋白，其包含：
具有细胞坏死诱导活性的多肽；和
免疫原性多肽。
本发明还提供一种融合蛋白，其包含：
具有细胞坏死诱导活性的多肽；
免疫原性多肽和
蛋白酶。
本发明的进一步特征提供蛋白酶，所述蛋白酶为口蹄疫病毒2A蛋白酶或其功能性片段。
本发明还提供一种重组病毒疫苗，其包含
根据本发明的核酸疫苗；和
可操作地连接于用于在宿主细胞中表达具有细胞坏死诱导活性的多肽和免疫原性多肽的核酸疫苗的核酸序列的调控表达元件。
本发明的进一步特征提供重组病毒疫苗，所述重组病毒疫苗选自(但不限于)复制型载体和复制缺陷型载体，其中载体不诱导细胞坏死。
重组病毒疫苗可以选自杆状病毒载体；复制缺陷型病毒，包括选自来源于人类和动物腺病毒、慢病毒、recVV、MVA、AAV、PAV的复制缺陷型病毒的病毒；复制型病毒，其包括选自来源于人类和动物腺病毒、慢病毒、recVV、MVA、AAV、PAV的复制型病毒的病毒；和脂质体/脂质体复合物(lipoplex)和从流感病毒或类似的病毒产生的病毒体。
本发明还提供一种表达载体，其包含
根据本发明的核酸疫苗；和
可操作地连接于用于在宿主细胞中表达具有细胞坏死诱导活性的多肽和免疫原性多肽的核酸疫苗的核酸序列的调控表达元件。
本发明的进一步特征提供表达载体，所述表达载体选自(但不限于)复制型载体和复制缺陷型载体，其中载体不诱导细胞死亡。
表达载体可以选自杆状病毒载体；复制缺陷型病毒，包括选自来源于人类和动物腺病毒、慢病毒、recVV、MVA、AAV、PAV的复制缺陷型病毒的病毒；复制型病毒，其包括选自来源于人类和动物腺病毒、慢病毒、recVV、MVA、AAV、PAV的复制型病毒的病毒；和脂质体/脂质体复合物和从流感病毒或类似的病毒产生的病毒体。
本发明涵盖含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少40％同一性、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的DNA的本发明的表达载体。最优选地，表达载体将与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少99％同一性。
然而，本发明进一步提供一种促炎性的细胞疫苗，其包含细胞；和
本发明的核酸疫苗；
根据本发明的融合蛋白；
本发明的重组病毒疫苗；或
本发明的表达载体；
本发明还提供一种免疫原性组合物，其包含：
编码免疫原性多肽的核酸序列；
编码至少一种人类白细胞抗原(HLA)的核酸序列；
根据本发明的核酸疫苗；
根据本发明的融合蛋白；
根据本发明的重组病毒疫苗；
根据本发明的表达载体；和/或
根据本发明的促炎性的细胞疫苗。
本发明进一步提供一种诱导或增强受试者中针对抗原的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明还提供一种增加受试者中CD4+T细胞水平和/或活性和/或CD8+T细胞水平和/或活性的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明进一步提供一种用免疫原将受试者免疫接种的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明还提供一种在受试者中产生树突状细胞(DC)免疫反应模式(immuneresponse profile)的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明进一步提供一种在受试者中产生CD4+T细胞和/或CD8+T细胞免疫反应模式的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明还提供一种诱导受试者中抗体免疫反应的方法，所述方法包括将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤。
本发明的进一步特征提供将受试者暴露于根据本发明的免疫原性组合物的步骤，其包含以下步骤：
将受试者暴露于根据本发明的疫苗核酸；
将受试者暴露于根据本发明的重组病毒疫苗；以及
将受试者暴露于根据本发明的复制型或复制缺陷型重组病毒疫苗。
本发明的更进一步特征提供一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
使宿主细胞与根据本发明的核酸疫苗接触；
表达免疫原性多肽；以及
在宿主细胞中诱导坏死。
本发明延伸到根据本发明的方法制备的免疫原性组合物。
本发明还提供一种呈递免疫原性多肽到受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
使宿主细胞与根据本发明的核酸疫苗接触；
表达免疫原性多肽；
在宿主细胞中诱导坏死；以及
将受试者暴露于宿主细胞。
本发明进一步提供一种在受试者中产生针对HIV的细胞毒性T细胞反应的方法，所述方法包括：
向受试者施用坏死同种异体细胞或坏死自体细胞；
其中所述坏死细胞包含HIV抗原和人类白细胞抗原(HLA)；
其中所述坏死细胞不包含活的HIV；
其中所述坏死细胞在受试者中进行坏死；
其中坏死将病毒抗原从死的或快死的坏死细胞释放；
其中宿主树突状细胞或其它APC吞噬病毒抗原；
其中宿主树突状细胞或其它APC经由II类通路加工和呈递病毒抗原到首次用于实验的CD4+T细胞以诱导T辅助细胞；
其中宿主树突状细胞或其它APC经由I类交叉呈递通路加工和呈递病毒抗原到首次用于实验的CD8+T细胞以诱导细胞毒性T淋巴细胞；以及
其中所述方法产生针对HIV抗原和HLA的抗体和/或细胞介导的免疫性。
HLA可以包括多种HLA蛋白质和/或在HIV脂质包膜中的其它细胞蛋白质。
本发明还提供一种促炎性的细胞疫苗，其包含含有HIV抗原和人类白细胞抗原(HLA)的同种异体和/或自体细胞，且其中同种异体和/或自体细胞不包含活的HIV。
本发明进一步提供一种在受试者中产生针对HCV的细胞毒性T细胞反应的方法，所述方法包括：
向受试者施用坏死同种异体细胞或坏死自体细胞；
其中所述坏死细胞包含HCV抗原；
其中所述坏死细胞不包含活的HCV；
其中所述坏死细胞在受试者中进行坏死；
其中坏死将免疫原从死的或快死的坏死细胞释放；
其中宿主树突状细胞或其它APC吞噬病毒抗原；
其中宿主树突状细胞或其它APC经由II类通路加工和呈递病毒抗原到首次用于实验的CD4+T细胞以诱导CD4+T辅助细胞；以及
其中宿主树突状细胞或其它APC经由I类交叉呈递通路加工和呈递病毒抗原到首次用于实验的CD8+T细胞以诱导细胞毒性T淋巴细胞。
本发明还提供一种促炎性的细胞疫苗，其包含含有HCV抗原的同种异体和/或自体细胞，且其中细胞不包含活的HCV。
本发明进一步提供一种分离的抗体，其能够结合于如通过以下一者或多者产生的免疫原：
本发明的免疫原性组合物；
编码本发明的免疫原性多肽的核酸序列；
本发明的核酸疫苗；
本发明的融合蛋白；
本发明的重组病毒疫苗；或
本发明的表达载体。
本发明进一步提供一种预防性或治疗性治疗患者感染的方法，所述方法包括向患者施用有效量的根据本发明的免疫原性组合物。优选地，当免疫原性组合物包含细胞时，剂量选自包含以下的清单：每剂1×102到1×109个细胞之间；每剂1×103到1×108个细胞之间；每剂1×104到1×107个细胞之间；以及每剂1×105到1×106个细胞之间；优选地，当免疫原性组合物包含核酸疫苗、融合蛋白、重组病毒疫苗或表达载体时，核酸疫苗、融合蛋白、重组病毒疫苗或表达载体的剂量选自包含以下的清单：每剂10μg到100mg之间；每剂100μg到10mg之间；每剂300μg到5mg之间；每剂300μg到3mg之间；以及每剂500μg到1mg之间；优选地，免疫原性组合物肌肉内、皮内或静脉内施用。优选地，免疫原性组合物依据选自包含以下的清单的惯例施用：每日三次、每日两次、每周两次、每月一次、每月两次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次、每年一次、每年两次、每两年一次以及每五年一次。
本发明进一步提供本发明的免疫原性组合物在制造供预防性或治疗性治疗患者感染的药剂中的用途。
本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的免疫原性组合物以及可接受的稀释剂或载剂。
本发明进一步提供一种治疗性疫苗，其包含本发明的免疫原性组合物。
本发明进一步提供一种预防性疫苗，其包含本发明的免疫原性组合物。
本发明进一步提供一种剂型，其包含本发明的免疫原性组合物。
本发明进一步提供一种试剂盒，其包含被密封在小瓶或容器中的本发明的剂型。优选地，所述密封的小瓶或容器用说明书标明所述试剂盒用于预防性或治疗性治疗患者感染。
如本文所用，术语“免疫原性组合物”包含本发明的物质和任选地一种或多种药学上可接受的载剂。免疫原性组合物宜通过常规用于疫苗施用的任何途径，例如肠胃外或通过吸入来施用。所述物质可以呈通过根据常规程序将免疫原性组合物与标准药物载剂组合所制备的常规剂型施用。在与制剂的其它成分相容并对其接受者无害的意义上，载剂必须是“可接受的”。给药方案将由主治医师和其它临床因素决定；优选地，根据任一上述方法。如医学领域中所众所周知，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、有待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、整体健康和同时施用的其它药物。可以通过周期性评估来监测进展。剂量可以变化并作为一剂或多剂递送。DNA可以作为裸DNA或与脂质、脂质体、脂质体复合物、病毒体、免疫脂质体或其它商业或非市售化合物复合来递送。
在本发明的背景下向患者施用的剂量应足够诱导如通过常规的测量CD4+和/或CD8+反应的分析、常规的测量抗体反应的分析所检测的免疫反应，和/或在受试者中随着时间的推移实现有益的治疗反应，例如(但不限于)病毒负荷下降或其它病毒相关症状减少。
一些上述本发明的疫苗可以用作治疗性疫苗。也就是说，一些本发明的疫苗可以用作注射疗法用于施用给已经感染上HIV或HCV的患者。在这种情况下，使用一些本发明的疫苗可以用于基本上增加对HIV或HCV的免疫反应，并基本上减缓疾病进展。
一些上述本发明的疫苗可以用作预防性疫苗。也就是说，一些本发明的疫苗可以用作预防疗法用于施用给尚未感染上HIV或HCV的患者。在这种情况下，使用一些本发明的疫苗可以用于在先前未受感染的受试者中基本上产生对HIV或HCV的免疫反应。
本文中描述的本发明的疫苗可以通过各种递送途径，例如鼻内、经口、皮下、皮内、肌肉内、鞘内、经肺、直肠内、局部、阴道内、通过划痕、损害内、颊内、粒子轰击、纳米粒子、ID脉冲然后是IN舌下加强或任何其它组合来递送。
附图简述
本发明的进一步特征更彻底地描述在其若干非限制性实施方案的以下描述中。此描述仅仅是为了例示本发明才包括。不应该被理解为是对如以上陈述的本发明的广泛概述、公开或描述的限制。描述将参考附图进行，其中：
图1展示根据实施例1，编码在体外诱导细胞死亡的PRF或DTa的DNA疫苗的设计的示意图。(A)双顺反子DNA疫苗构建体的示意图。所有疫苗都使用具有在CMV启动子控制下编码抗原(HIV-1GAG或荧火虫荧光素酶(LUC))和在SV40启动子控制下编码PRF或DTa的基因的pVAX主链。另一构建体在CMV启动子控制下编码抗原和PRF为在FMDV 2A蛋白酶序列处自我裂解的多聚蛋白。(B)相位显微镜术影像(100x)揭露在用编码DTa或PRF的DNA疫苗转染48小时后圆形的分离HEK293T细胞。(C)转染48小时后，鉴别死细胞的流动式细胞测量术以及鉴别细胞凋亡(膜联蛋白V+)和坏死(膜联蛋白V+PI+)的膜联蛋白V和PI染色。
图2展示‘死细胞’群体门内细胞凋亡和坏死细胞的比例表。细胞凋亡细胞被定义为膜联蛋白V+PI-，继发性坏死细胞被定义为膜联蛋白V+PI+。膜联蛋白V-PI+的第三死细胞群体被鉴别为已经进行非细胞凋亡性细胞死亡、可能是原发性坏死的细胞。
图3展示根据实施例1，用于追踪体内抗原从DNA疫苗表达的荧光素酶的体内成像。(A)用50μg CMV-LUC+/-PRF或DTa进行ID免疫接种后第7、14和28天小鼠真皮中发光的代表性IVIS影像。(B)ID免疫接种后如通过定量免疫接种的小鼠中的发光所确定的LUC的纵向表达。(C)ELISA对LUC特异性抗体的检测。小鼠接受50μg CMV-LUC+/-DTa或PRF的三次免疫接种，并在最终给药后第10天取血清样品。(D)检测用免疫显性LUC肽再刺激的脾细胞中LUC特异性T细胞反应的IFN ELISPOT。在最终免疫接种后第10天收获脾。对5只雌性C57BL/6小鼠的各组进行免疫接种。图展示平均数+/-SEM。
图4展示根据实施例1，检测GAG特异性T细胞反应的IFN ELISPOT。在相隔4周的3个时刻用50μg DNA ID免疫接种小鼠，并在最终免疫接种后第10天收获脾。脾细胞用涵盖完整GAG蛋白质的重叠肽的4个不同池(分别在A-D中展示的池1-4)或C57BL/6MHCI和II限制免疫显性肽的最终池(E)再刺激。对8只雌性C57BL/6小鼠的各组进行免疫接种。图展示每10^6个脾细胞的平均SFU(+/-SEM)。
图5展示根据实施例1，通过流动式细胞测量术检测的多功能T细胞。如图4图例中所描述，DNA免疫接种后针对GAG特异性T细胞反应进行细胞内细胞因子染色。在布雷菲德菌素A存在下将脾细胞用免疫显性GAG肽池再刺激12小时。(A)鉴别IFN、TNF和IL-2阳性CD4和CD8CD44+T细胞的门控策略。(B)响应于GAG肽刺激，分泌IFN和TNF的CD8T细胞的百分比和(C)分泌IFN、TNF和IL-2的CD8T细胞的百分比。(D)响应于GAG肽，分泌IFN和TNF的CD4T细胞的百分比，和(E)分泌IFN、TNF和IL-2的CD4T细胞的百分比。对8只雌性C57BL/6小鼠的各组进行免疫接种。图展示分泌细胞因子的细胞的平均百分比(+/-SEM)。
图6展示活化树突状细胞的检测。根据实施例1，引流淋巴结中的树突状细胞在单次50μg DNA免疫接种后活化。在ID免疫接种后第3、7、10和14天收获耳淋巴结。(A)用于鉴别CD11c+CD8a+Clec9A+/-活化DC的门控策略，展示每一组的代表性曲线。pVAX空和CMV-GAG上中和右图，SV40-DTa和SV40-PRF下中和右图。(B)免疫接种后第14天引流淋巴结中CD11c+CD8a+DC的百分比。(C)引流淋巴结中Clec9A+DC的百分比。(D)如通过MHCII和CD80表达测量的CD11c+CD8+DC的活化状态的直方图。对4只雌性C57BL/6小鼠的各组进行DNA免疫接种。图展示细胞的平均百分比(+/-SEM)。
图7展示根据实施例1，CMV-GAG-SV40-PRF是一种有效的针对EcoHIV攻击的免疫原。在用相隔3周的2剂50μg CMV-GAG、CMV-GAG-SV40-PRF或pVAX空DNA免疫接种后进行EcoHIV攻击。小鼠在10天后用EcoHIV(每只小鼠1.5ug p24)攻击并在7天后测定病毒负荷。(A)腹腔渗出液细胞、(B)脾和(C)血液中的EcoHIV mRNA水平。对8只雌性C57BL/6小鼠的各组进行免疫接种。图展示相对于RPL13a标准化的平均表达(+/-SEM)。
图8展示根据实施例2，准备用于荧光素酶和胸苷激酶(TK)的双顺反子表达的pVAX荧光素酶-TK质粒的质粒图。
图9展示根据实施例2，准备用于荧光素酶和NSP4的双顺反子表达的pVAX荧光素酶-NSP4质粒的质粒图。
图10展示根据实施例2，准备用于荧光素酶和PRF的双顺反子表达的pVAX荧光素酶-PRF质粒的质粒图。
图11展示根据实施例2，用图9的质粒或pVAX(未展示)转染的小鼠中荧光素酶表达的照片，转染小鼠的质粒在照片下面指示。
图12展示根据实施例2，表示在小鼠的皮内DNA免疫接种后随着时间的推移发光表达的图。
图13展示根据实施例2，表示用图8、9或10的质粒免疫接种后在小鼠中检测到的荧光素酶特异性抗体的图。
图14展示根据实施例2，表示用图9的质粒免疫接种后在小鼠中检测到的抗荧光素酶细胞介导的免疫性的图。
图15展示根据实施例2，表示用图8和10的质粒免疫接种后在小鼠中检测到的抗荧光素酶细胞介导的免疫性的图。
图16展示根据实施例3，离体表达HCV/HIV免疫原的细胞的坏死、体内APC吞噬抗原、APC呈递抗原到T细胞以及活化T细胞识别受感染细胞的过程的图示。
图17展示代表与用相同的活细胞系免疫接种相比，从用坏死HCV NS3阳性细胞系免疫接种的小鼠收获的免疫原性不良的HCV NS3蛋白质的肽刺激的脾细胞的ELIspot分析。HCV NS3阳性坏死细胞比活细胞更有效地引起细胞介导的免疫性。DC 2.4细胞用编码HCVNS3蛋白质的RNA转染。使一定比例坏死。C57Bl/6小鼠通过皮下途径如下免疫接种：G1，106未转染，活细胞；G2，106NS3未转染，坏死细胞；G3，106NS#转染，活细胞；G4，106NS3转染，坏死细胞。根据实施例3，在ELIspot分析中脾细胞用NS3肽刺激。
图18展示根据实施例4，如通过ELIspot测定，用pVAXgag、pVAXgag+NSP4或pVAXgag+PRF免疫接种后用免疫显性gag肽离体刺激的鼠类脾细胞的频率。
图19展示根据实施例4，如通过多功能细胞因子染色然后是流动式细胞测量术测定，用pVAXgag、pVAXgag+NSP4或pVAXgag+PRF免疫接种后用免疫显性gag肽离体刺激的鼠类CD44+记忆、CD8+T细胞的频率。
图20展示根据实施例4，如通过多功能细胞因子染色然后是流动式细胞测量术测定，用pVAXgag、pVAXgag+NSP4或pVAXgag+PRF免疫接种后用免疫显性gag肽离体刺激的鼠类CD44+记忆、CD8-T细胞的频率。
图21展示根据实施例5，用于坏死细胞免疫接种的表达密码子优化的NS3g1b的稳定DC2.4细胞系的流动式细胞测量术散布图。
图22展示根据实施例5，用于坏死细胞免疫接种的表达密码子优化的NS3g1b的稳定DC2.4细胞系的单个克隆每一者中GFP阳性细胞的百分比。
图23展示根据实施例5，从免疫接种后免疫接种的小鼠中获得的DLN中的GFP表达。
图24展示根据实施例5，在用NS3阳性、活或坏死DC2.4细胞免疫接种后第2、3、5和7天从免疫接种的小鼠中获得的DLN中GFP阳性细胞的频率。
图25展示根据实施例5，免疫接种后第2、3、5和7天从免疫接种的小鼠中获得的DLN中淋巴细胞的总数。
图26展示根据实施例5，相对于频率和总细胞数，在免疫接种后第2、3、5和7天从免疫接种的小鼠中获得的DLN中的CD11c高DC的频率。
图27展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中CD11c高DC的数目。
图28展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中CD11c高CD8DC的频率。
图29展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中CD11c高CD8DC的细胞数。
图30展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中Clec9A+CD11c高CD8DC的频率。
图31展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中Clec9A+CD11c高CD8DC的细胞数。灰色柱表示用活细胞免疫接种的小鼠，而黑色柱表示用坏死细胞免疫接种的小鼠。
图32展示根据实施例5，在免疫接种后第2、3、5和7天从用活或坏死细胞免疫接种的小鼠中获得的DLN中Clec9A CD11c高CD8DC的频率。
图33展示根据实施例5，初免和加强免疫后用NS3肽池离体刺激的小鼠脾细胞的ELISPOT。
图34展示根据实施例5，初免和加强免疫后来自个别小鼠的脾细胞的ELISPOT数据。
图35展示根据实施例5，从免疫接种后免疫接种的小鼠中获得的DLN中CD8+CD44+DC的频率。
图36展示根据实施例5初免和加强免疫后，体外用HCV NS3肽刺激或无刺激后，分泌IL-2的CD8+CD44+T细胞的频率(上图)和诱导表达IL-2的细胞的平均荧光强度(下图)。
图37展示根据实施例5初免和加强免疫后，体外用HCV NS3肽刺激或无刺激后，分泌TNF的CD8+CD44+T细胞的频率(上图)和诱导表达TNF的细胞的平均荧光强度(下图)。
图38展示根据实施例5初免和加强免疫后，体外用HCV NS3肽刺激或无刺激后，分泌IFNg的CD8+CD44+T细胞的频率(上图)和诱导表达IFNg的细胞的平均荧光强度(下图)。
图39展示根据实施例6的试验的设计。
图40展示根据实施例6，描绘患者1对以下各者的IFN-g ELISPOT反应的图：(A)代表完整HCV多聚蛋白的HCV肽池；和(B)代表疫苗中的蛋白质的肽。
图41展示根据实施例6，描绘患者2对以下各者的IFN-g ELISPOT反应的图：(A)代表完整HCV多聚蛋白的HCV肽池；和(B)代表疫苗中的蛋白质的肽。
图42展示根据实施例6，描绘患者3对以下各者的IFN-g ELISPOT反应的图：(A)代表完整HCV多聚蛋白的HCV肽池；和(B)代表疫苗中的蛋白质的肽。
图43展示根据实施例6，描绘患者4对以下各者的IFN-g ELISPOT反应的图：(A)代表完整HCV多聚蛋白的HCV肽池；和(B)代表疫苗中的蛋白质的肽。
图44展示根据实施例6，描绘患者1到4(A-D)对CEF肽池的IFN-g ELISPOT反应的图。
图45展示根据实施例6的临床试验中免疫接种的患者的原始HCV病毒负荷数据的表。
图46展示根据实施例6的临床试验中免疫接种的患者的HCV病毒负荷作为基线水平的百分比的表。
图47展示根据实施例6的临床试验中免疫接种的患者的病毒负荷变化的图。
图48展示根据实施例6的临床试验中免疫接种的患者的病毒负荷数据百分比的表。
图49展示根据实施例6的临床试验中免疫接种的患者的病毒负荷变化百分比的图。
SEQ ID NO:1是pVAX荧光素酶-TK质粒的DNA序列。
SEQ ID NO:2是pVAX荧光素酶-NSP4的DNA序列。
SEQ ID NO:3是胸苷激酶(TK)的DNA序列。
SEQ ID NO:4是NSP4的DNA序列。
SEQ ID NO:5是荧光素酶的DNA序列。
SEQ ID NO:6是NS3的RNA序列。
SEQ ID NO:7是小鼠突变穿孔素(PRF)的DNA序列。
SEQ ID NO:8是2A蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是2A蛋白酶的DNA序列。
遍及本说明书，除非上下文另外要求，否则应了解词语“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等变化形式暗示包括所陈述的整数或整数群，但不排斥任何其它整数或整数群。发明详述
引言
DNA疫苗
DNA疫苗诱导细胞介导(CMI)和体液免疫反应，并引起模拟病毒蛋白质产生的抗原表达和加工。DNA疫苗还具有实用的优点，因为它们高度稳定且比蛋白质或重组病毒疫苗更容易快速地制造。
提高DNA疫苗免疫原性的尝试主要是集中在例如细胞因子、共同刺激分子CD80和CD86以及Toll样受体配体等免疫刺激蛋白质的共同表达。先前，提高对疫苗的免疫反应已经涉及抗原直接靶向树突状细胞(DC)。蛋白质疫苗已经缀合于结合例如DEC205和Clec9A等DC表面受体的抗体。此策略在传统上诱导主要体液反应的蛋白质免疫接种后增加DC抗原呈递和T细胞反应。然而，此类方法需要额外的佐剂，例如聚I:C，以确保DC活化。
实施例1中，本发明者已经发展一种用于抗原靶向DC和经由诱导坏死为活化提供辅助信号的DNA免疫接种策略。坏死经由释放充当‘损伤相关分子模式’(DAMP)的细胞内因子提供危险信号到免疫系统。例如尿酸和HMGB-1等DAMP能够经由各种受体发信号给DC。近年来，受体Clec9A和其配体F-肌动蛋白已经被鉴别为DC感知坏死并靶向抗原用于交叉呈递的机制。此外，坏死还引起细胞内NLRP3发炎体活化和促炎性的细胞因子的释放。另外，引起双链DNA释放到细胞间隙中的组织损伤已经被鉴别为明矾佐剂的根本机制之一。本文中描述的DNA疫苗编码引起抗原阳性细胞靶向性坏死的抗原和细胞溶解基因。因而，此DNA疫苗基本上模拟溶解病毒的作用，且已知例如牛痘等溶解病毒是高度免疫原性的。
已经提议一般诱导标靶细胞的细胞凋亡的自杀基因用作癌症疗法。本发明者已经意外地发现诱导坏死的自杀基因或细胞溶解基因可以用作预防性疫苗的佐剂。
本发明者相信为了实现最佳保护，除了中和抗体(NAb)或具有例如ADCC活性等其它特征的抗体外，针对HIV和HCV的疫苗需要诱导细胞介导的免疫性(CMI)。CMI最容易通过自然感染、活或重组病毒疫苗或DNA疫苗产生，引起免疫原的表达。
先天免疫活化适应性免疫反应
作为适应性免疫反应的前奏，先天免疫通过病原体相关分子模式(PAMP)或DAMP活化。最常见的PAMP是LPS和dsRNA，其结合于被识别的模式识别受体(PRR)，包括toll样受体(TLR)，但这些PAMP在用裸DNA或重组的复制缺陷型疫苗载体(例如RecAd)免疫接种后未表达。因此，虽然这些疫苗产生供DC吸收的病毒抗原，但此不会产生成熟DC，因为需要额外的刺激信号或DAMP“许可”成熟的负荷抗原的DC具有迁移到引流淋巴结并活化首次用于实验的T细胞的能力。坏死细胞尤其是DAMP的丰富来源，包括热休克蛋白(HSP)、尿酸、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1protein；HMGB1)和细胞外ATP、染色质、核小体、DNA、半乳凝集素、硫氧还蛋白、S100蛋白质、金环蛇抗菌肽(cathelicidin)和防御素，并充当天然的佐剂。细胞凋亡细胞虽然实际上一般不发炎，但可能形成继发性坏死。HSP70和HMGB1已经成功地用于增加病毒蛋白质的免疫原性。一项研究使用编码HIV gag和HMGB1的质粒的混合物，而本文中描述的结果使用在单一载体中编码两种蛋白质的DNA疫苗。
细胞死亡和启动免疫反应
B淋巴细胞在其细胞表面上表达免疫球蛋白和II类MHC分子，并能够产生识别与其免疫球蛋白受体B细胞受体相同的抗原的抗体。B细胞也可以充当APC。抗原由免疫球蛋白受体识别、吞噬、加工，并以MHC II类限制方式呈递抗原决定基到T辅助细胞。此引起T细胞活化并产生细胞因子，细胞因子反过来诱导B细胞分裂并分泌特异性抗体。在这方面，B细胞充当可以吞噬抗原的APC，类似于II类APC。
然而，按类似于上文针对DC所述的方式，需要PAMP或DAMPS提供的额外刺激来活化B细胞。因此，为引起有效的抗体反应，许多抗原都依赖于T细胞的帮助。
虽然CD8+T细胞被识别为消除病毒感染细胞或分泌抑制病毒复制的细胞因子的效应细胞，但还需要CD4+T细胞的帮助来启动和扩展CD8+T细胞。通过模拟病毒相关的细胞死亡，本文中描述的本发明促进免疫原的交叉呈递和CD8T细胞反应的诱导，且还通过由细胞溶解产生的外源性免疫原的吸收促进CD4T细胞反应的诱导。
树突状细胞(DC)是能够启动首次用于实验的T细胞(免疫接种的主要目标)的主要APC。DC吞噬病毒抗原(从感染或疫苗靶向的坏死细胞释放)，加工，并将这些经由II类通路呈递到首次用于实验的CD4+T细胞(以产生Th)和经由I类通路(交叉呈递)呈递到首次用于实验的CD8+T细胞以产生CTL。提出交叉呈递是对病毒的CD8T细胞免疫性所需的，因为免疫性将仅仅在病毒或疫苗感染DC而表达抗原的情况下另外出现。如果疫苗递送媒介物是成功的，那么它们必须靶向DC或以其它方式引导免疫原到DC。有可能，甚至很可能交叉呈递是诱导细胞介导的免疫反应的主要机制。
死细胞因释放DAMP(促炎性的“死亡信号”)而为高度免疫原性的。DC和其它APC吸收病毒抗原阳性的死的或快死的细胞代表了一种引起针对病原体的免疫性或天生不感染DC的疫苗递送媒介物的有效负荷的基本机制。
自杀基因疗法
自杀基因疗法已经通过诱导细胞死亡而用于治疗各种肿瘤。原型自杀基因是胸苷激酶(TK)，通常来源于单纯疱疹病毒(HSV)。第一步，递送该基因以在标靶细胞中表达蛋白质。第二步是施用前药更昔洛韦(ganciclovir，GCV)，其被所表达的蛋白质活化。与GCV组合使用的HSV TK基因是杀死细胞的若干方法之一并可以诱导坏死，取决于细胞类型。常用于治疗疱疹病毒感染患者的GCV是一种核苷类似物，其通过HSV TK转变成单磷酸盐形式，接着通过细胞激酶转变成三磷酸盐形式，随后并入DNA中。此引起DNA链终止和细胞死亡。非细胞凋亡性细胞死亡(坏死)引起HSP70的表达，且DC表达HSP受体。因此，TK/GCV诱导的细胞死亡很可能引起DC中蛋白质免疫原的交叉呈递和巨噬细胞的吞噬。坏死后对肿瘤细胞的免疫反应比细胞凋亡后更有效，特征为增加的HSP70水平，不过细胞凋亡的细胞还诱导抗肿瘤免疫性。在该研究中，不同的细胞系中TK/GCV治疗诱导细胞凋亡或坏死，且在用HSP70cDNA共转染肿瘤细胞后免疫原性增加。
重要的是，此领域中的工作已经局限于使用自杀基因疗法治疗癌症来直接破坏癌细胞。本发明涉及复制活减毒病毒的作用的方法，这些活减毒病毒引起内源性免疫原的产生，由此在病毒抗原表达期间，细胞将溶解，产生将被抗原呈递细胞(包括树突状细胞)吞噬的外源性蛋白质，随后抗原呈递细胞将交叉呈递被吞噬的抗原。
其它前药/活化剂组合可以用于将无毒的前药转变成毒性代谢物，例如被5-氟胞嘧啶活化的胞嘧啶脱氨酶和被氟达拉滨(fludarabine)活化的嘌呤核苷磷酸化酶。近年来，报道了使用直接是细胞毒性的且不需要活化的自杀蛋白质。在此研究中，来自传染性造血组织坏死病毒I(IHNV)的蛋白质免疫原和细胞毒性蛋白质M在鱼免疫接种后从DNA共同表达。蛋白质M表达由可诱导的启动子，即金属硫蛋白启动子，通过添加锌到养鱼的水中来控制。这消除了DNA免疫接种后残余的DNA，但未增加针对IHNV攻击的保护水平。虽然这些方法一般在体外有效，并可以在体内具有一些作用，但它们依赖于免疫接种后活化或诱导试剂的施用。这给免疫接种过程增添一定复杂度，且如果此程序是使人类疫苗有效所必需的，那么显著比例的人类疫苗将是非顺应性的。
实施例1
材料与方法
DNA疫苗
所有的DNA疫苗构建体都是基于pVAX质粒主链(Invitrogen)。将萤火虫荧光素酶2(Promega)或密码子优化的HIV-1gag(进化枝B)的基因插入CMV启动子的下游。将额外的启动子SV40启动子和聚腺苷酸化序列插入pVAX主链中，且所有细胞溶解/自杀基因候选物插入此第二启动子的下游。所有的DNA疫苗都使用Qiagen无内毒素的大规模试剂盒纯化。
细胞培养
HEK293T细胞(人类胚肾细胞系)在补充有10％FCS和1％青霉素/链霉素的DMEM中生长，并使用Fugene 6试剂(Promega)用DNA转染。通过锥虫蓝染色测定细胞活力。通过荧光素酶分析，使用萤火虫荧光素酶作为报道分子和D-荧光素(Perkin Elmer)底物，随着时间的推移追踪细胞死亡。细胞凋亡和继发性坏死的标记物通过流动式细胞测量术，使用膜联蛋白-V(Invitrogen)和PI(BDBiosciences)染色来分析。
小鼠
所有的实验都经阿德莱德大学(the University of Adelaide)和妇幼健康网络动物伦理委员会(the Women’s and Children’s Health Network animal ethicscommittees)批准。来自阿德莱德大学实验动物中心(the University of AdelaideLaboratory Animal Services)的C57BL/6小鼠被供养在无特定病原体的条件下并在6-8周免疫接种。所有的介入都是在腹膜内注射的多咪静(Domitor)/氯胺酮(Ketamine)麻醉剂下进行。经腹膜内用咹啶醒(Antisedan)逆转麻醉剂。血液样品通过用分血管后进行眼窝抽血来获得。使用IVIS活体成像器(PerkinElmer)，在注射D-荧光素K+3mg/20g小鼠后，对异氟烷镇静的动物进行活体成像。
免疫接种
C57BL/6小鼠接受50L剂量的DNA疫苗(50g于生理食盐水中)，其注射到耳朵的外胚层中(每只耳朵25l)。除非另有说明，否则小鼠以4周的时间间隔接受总共3剂疫苗，并在每次免疫接种之前取外周血样品。最终免疫接种10天后，将小鼠麻醉并杀死，且收集脾、外周血和引流淋巴结。
ELISPOT
对红血球耗尽的脾细胞进行IFN ELISPOT，这些脾细胞用2ug/mL 15聚体的11氨基酸重叠gag肽池(NIH AIDS试剂银行#8117)或MHC I和II限制免疫显性肽(HIV分子免疫学数据库，http://www.hiv.lanl.gov/中列出)再刺激。Multiscreen-IP HTS板(Millipore)用抗小鼠IFN(克隆AN18，MabTech)涂布并用抗小鼠IFN-生物素(克隆R4-6A2，MabTech)、抗生蛋白链菌素-AP(Sigma)和SigmaFast BCIP/NBT检测分泌的IFN。用于荧光素酶ELISPOT的细胞用2ug/mL免疫显性肽LMYRFEEEL再刺激。
流动式细胞测量术
在布雷菲德菌素A存在下对用免疫显性gag肽再刺激的脾细胞进行多色细胞内细胞因子染色12小时。用BD FACS Cytofix/Cytope rm和BD抗小鼠抗体(CD3-PercP-Cy5.5、CD8-APC-Cy7、CD44-APC、IL-2-FITC、IFN-Pecy7、TNF-PE，Bdbiosciences)进行染色。使用BD抗体(CD8a-APC-Cy7、CD11c-PeCy7、CD80-APC、CD86-PE、MH CII-FITC，BDbiosciences)对从耳引流淋巴结中获得的细胞悬浮液进行树突状细胞染色。在BD FACS Canto上分析细胞并用FlowJo软件分析结果。
ELISA
Corning 96孔EIA/RIA板用每孔500ng重组荧光素酶(Promega)涂布。血清样品在37℃下孵育2小时并用抗小鼠IgG-HRP(GE healthcare)和SigmaFast OPD(Sigma)检测。
EcoHIV攻击
如先前所述，进行EcoHIV/NL4-3攻击和qRT PCR监测(Potash MJ等人.(2005)ProcNatl Acad Sci U S A 102(10):3760-3765；Ro shorm Y等人,(2009)Eur J Immunol 39(7):1831-1840；Suhrbier A等人,(2013)PLoS One出版中)。简单地说，通过pEcoHIV转染到HEK293T细胞中来制备EcoHIV原液。纯化的病毒上清液(或条件培养基对照)以1.5ug p24(Zeptometrix p24抗原ELISA)浓度经由腹膜内注射来施用给小鼠。EcoHIV攻击七天，挑选小鼠并收集脾、腹腔渗出液细胞(PEC)和外周血样品。RNA使用Trizol方法分离并用于产生cDNA(Qiagen Quantitect RT-PCR试剂盒)。50ng cDNA用作使用Quantifast Sybr Green试剂盒(Qiagen)的定量实时PCR的模板从而测定MLV mRNA(5’-GAGGTCGGGTGGAAGTACCA-3’5’-TGCA TC TTGGCCTTTTCCTT-3’)的水平。在验证引物扩增功效后，使用定量的CT法，结果相对于RPL13a表达(5’-TAGGGCCAAACCCCGTTCTG-3’5’-GCCGGTGGAAGTTGGGTAGG-3’)标准化。
统计分析
数据以平均数+/-SEM呈现。使用Graphpad Prism 5.0b和SAS9.3版分析数据和产生图。非参数的克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wa llis test)用于比较多个疫苗组(pVAXGAG标准疫苗、pVAX GAG D Ta(A)、pVAX GAG PRF(B)和pVAX GAG 2A PRF(C))之间的差异。如果全局测试展示组之间的显著差异，那么进行威尔科克森检验(Wil coxon test)以分开比较标准疫苗组与A、标准疫苗组与B和标准疫苗组与C之间的事后差异。
结果
DTa和PRF体外引起细胞死亡
使用质粒pVAX(Invitrogen)构建DNA疫苗，所述质粒pVAX含有组成性CMV启动子控制下荧光素酶(LUC)报道基因或者HIV-1GAG基因。为了研究在DNA免疫接种后细胞死亡的作用，双顺反子构建体被设计成还编码(i)穿孔素(PRF)，一种破坏细胞膜并引起细胞溶解的内源性介体；或者(ii)白喉毒素亚单元A(DTa)，其抑制蛋白质合成并引起细胞凋亡。这些基因在较弱的SV40启动子控制下插入(图1A)。与CMV启动子相比，SV40启动子引起的荧光素酶表达低10倍，使得相对于从CMV启动子表达的抗原，PRF或DTa表达水平较低。另一个构建体在CMV启动子控制下编码LUC-PRF或GAG-PRF多聚蛋白；此两种蛋白质被FMDV 2A蛋白酶分离以使多聚蛋白自动裂解。当以高10倍的水平从CMV启动子表达时，此后一构建体允许研究细胞溶解基因PRF的作用。
首先测试DNA疫苗体外诱导细胞死亡的能力。用双顺反子质粒转染后，HEK293T细胞展示48小时后细胞死亡的明显征象，且通过流动式细胞测量术，使用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色证实细胞死亡(图1B-C)。用CMV-LUC-SV40-PRF或CMV-LUC-SV40-DTa转染48小时后，如通过前向和侧向散射特征(分别38.2％和43.2％)所确定，与用单独CMV-LUC DNA转染的细胞(15.4％)相比，显著比例的细胞展示死亡。当在更强的CMV启动子(CMV-LUC-2A-PRF)控制下编码PRF时，与CMV-LUC-SV40-PRF比较，细胞死亡更迅速，到48小时48.9％的细胞死亡。因为转染功效一般为约70％，所以此表明表达PRF或DTa的大多数细胞都被杀死。在这些死细胞群体内，细胞凋亡(膜联蛋白V+PI-)和坏死性(膜联蛋白V+PI+)细胞的比例变化，如图2中所概述，反映了DTa和PRF诱导细胞死亡的不同机制。用CMV-LUC-SV40-DTa转染引起主要是细胞凋亡或继发性坏死的细胞，而CMV-LUC-SV40-PRF转染引起较高比例的原发性和继发性坏死细胞。用CMV-LUC-2A PRF转染的细胞展示最高比例的原发性坏死细胞。
荧光素酶的活体成像允许在皮内免疫接种后追踪抗原表达
为了研究体内DNA免疫接种后细胞死亡的作用，荧光素酶用作模型抗原。这允许小鼠活体成像并在免疫接种后追踪抗原表达。雌性C57BL/6小鼠用单剂50μg DNA经由皮内(ID)途径(耳廓真皮)免疫接种并针对发光来定期成像。包括PRF或DTa基因改变了免疫接种后荧光素酶表达的动力学(图3A-B)。接受CMV-LUC DNA的小鼠证明到免疫接种35天后可检测到发光，不过在此期间发光水平下降约100倍。相比之下，接受CMV-LUC-SV40-PRF DNA的小鼠展示发光更迅速地下降，在第35天不可检测。CMV-LUC-SV40-DTa和CMV-LUC-2A-PRF群组展示发光下降最迅速，且在第14天后在这些小鼠中未看到可检测的发光，表明荧光素酶阳性细胞清除(图3B)。另外，CMV-LUC-SV40-DTa和CMV-LUC-2A-PRF免疫接种的群组证明免疫接种1天后发光降低10倍，表明即使在最早时间点，真皮中抗原表达也降低。因此，活体成像证明DTa或PRF与荧光素酶从DNA疫苗共同表达促进荧光素酶阳性细胞的去除。在DTa与PRF之间以及CMV或SV40启动子控制的不同水平的PRF表达之间，细胞死亡的时间不同。这表明DTa和PRF的内在性质以及通过启动子控制的表达的总水平影响细胞死亡的时间。
所有接受ID免疫接种的小鼠都在注射部位周围展示一些刺激(红色和肿胀)，然而，即使接受生理食盐水注射的小鼠也会观测到此，并在免疫接种2-3天后迅速消退。在任何免疫接种的群组中，未在宏观上，或在显微镜下通过组织分析观测到组织损伤。因此，DTa或PRF的共同表达导致荧光素酶阳性细胞被特异性杀死，且无过度的发炎或组织损伤。
皮内DNA免疫接种后荧光素酶特异性免疫反应
为了检验对荧光素酶的免疫反应，免疫接种的小鼠在第35天(在发光表达是比CMV-LUC对照小鼠中的低100倍的点(图3B))接受50μg DNA的加强免疫接种。为了评估体液免疫反应，通过ELISA检验血清样品以检测荧光素酶特异性IgG。用CMV-LUC、CMV-LUC-SV40-PRF或CMV-LUC-2A-PRF免疫接种的小鼠都展示抗荧光素酶IgG 1/10,000的终点滴度(图3C)。因此，疫苗中包括PRF未显著地增强荧光素酶特异性抗体反应。有趣地，CMV-LUC-SV40-DTa免疫接种诱导与CMV-LUC对照相比，较低水平的荧光素酶特异性IgG(大概100倍)，表明其对免疫反应具有抑制作用，而非增强免疫性，这可能归因于由DTa抑制重新蛋白质合成的能力所引起的抗原水平减少。
使用单一免疫显性荧光素酶肽再刺激脾细胞，来进行IFN ELISPOT(图3D)。ELISPOT分析揭露低水平的IFN对此肽的反应。CMV-LUC-SV40-PRF免疫接种展示与CMV-LUC相比，对此免疫显性肽的反应增加的明显倾向，而CMV-LUC-SV40-DTa降低反应。
PRF增强T细胞介导的对HIV-1GAG DNA疫苗的免疫反应
为了研究PRF和DTa对针对含有多种T细胞抗原决定基的病毒抗原的免疫反应的作用，荧光素酶报道基因被密码子优化的进化枝B HIV-1GAG基因替换。如上所指出，小鼠接受3剂50μg CMV-GAG、CMV-GAG-SV40-PRF、CMV-GAG-SV40-DTA或CMV-GAG-2A-PRF DNA，且在最终免疫接种10天后分析免疫反应。使用代表完整GAG序列的四个重叠肽池(每池30种15聚体肽)和仅仅含有免疫显性肽(另外存在于池2和3中)的最终池进行IFN ELISPOT。用CMV-GAGDNA免疫接种的小鼠展示对所有肽池在50-1200平均SFU范围内的反应(图4A-D)。用CMV-GAG-SV40-PRF DNA免疫接种的小鼠展示对池1-3与对照CMV-GAG小鼠中类似范围的反应，但与CMV-GAG小鼠相比呈现对肽池4高2.5倍的反应(平均SFU 155对比62，p＝0.03)(图4D)。因为此池不含有免疫显性GAG肽，所以此表示免疫反应拓宽到非显性抗原决定基。相比之下，CMV-GAG-SV40-DTa DNA免疫接种的小鼠展示与CMV-GAG小鼠相比对肽池3(平均SFU 142对比696，p＝0.003)和对池5中的免疫显性肽(平均SFU 272对比1270，p＝0.001)的IFN反应降低5倍(图4C和E)。这些结果与图3中所示的CMV-LUC-SV40-DTa免疫接种的结果一致，并证实DTa与抗原共同表达实际上降低随后免疫反应。意外地，用CMV-GAG-2A-PRF DNA疫苗免疫接种的小鼠展示与用CMV-GAG DNA免疫接种的小鼠相比IFN反应无显著变化。
细胞内细胞因子染色证明个别CD4和CD8T细胞通过产生IFN、TNF和IL-2对免疫接种起反应(图5)。用CMV-GAG-SV40-PRF DN A免疫接种的小鼠展示与用CMV-GAG DNA免疫接种的小鼠(平均百分比0.21对比0.1，p＝0.03)相比分泌TNF和IFN的CD8T细胞的水平高2倍(图5B)。有趋势展示与CMV-GAG相比，用CMV-GA G-SV40-PRF免疫接种的小鼠中同时分泌TNF、IFN和IL-2的稀少的多功能CD8T细胞增加(平均百分比0.078对比0.04)(图5C)。所有免疫接种的群组(除非模拟免疫接种的)都响应于GAG免疫显性肽而产生分泌多种细胞因子的CD4T细胞，各群组之间无差异(图5D-E)。类似地，与CMV-GAG DNA相比，CMV-GAG-2A-PRF DNA疫苗诱导的CD8和/或CD4T细胞的细胞因子产生无显著变化。
因此，仅仅PRF增加对GAG肽池的免疫反应，并只有在其从较弱的SV40启动子表达(CMV-GAG-SV40-PRF)时。PRF从CMV启动子(CMV-GAG-2A-PRF)表达的水平增加对免疫反应没有影响，且当与对照CMV-GAG DNA相比时，CMV-GAG-SV40-DTa DNA积极地降低免疫反应。因此，与28-35天期间较慢的杀死相比，7-14天期间GAG抗原阳性细胞更迅速地杀死不提高免疫反应。
PRF增加交叉呈递CD8a+和感知坏死的Clec9A+DC的频率
以上呈现的数据展示细胞溶解蛋白质PRF和细胞凋亡蛋白质DT a的表达对针对GAG的免疫反应起到相反的作用。为了确定PRF和DTa诱导的细胞死亡是否会活化树突状细胞(DC)，在免疫接种后不同的时间点收集耳引流淋巴结。DC亚群被鉴别为CD3e-、CD11c+和CD8a+/-或Clec9A+/-(图6)。用CMV-GAG、CMV-GAG-SV40-PRF或C MV-GAG-SV40-DTa免疫接种的小鼠展示与仅仅用pVAX免疫接种的对照组比较，淋巴结中CD11c+DC的频率增加以及DC活化的标记物表达增加。免疫接种14天后，与用CMV-GAG免疫接种的小鼠(平均百分比1.3对比1.0，p＝0.02)相比，在用CMV-GAG-SV40-PRF免疫接种的小鼠的引流淋巴结中检测到交叉呈递CD11c+CD8a+DC的频率显著增加(图6B)。
重要的是，在此时间点，与用CMV-GAG免疫接种的小鼠(平均百分比2.6对比2.2，p＝0.008)相比，在用CMV-GAG-SV40-PRF免疫接种的小鼠中Clec9A+DC的频率也增加(图6C)。此DC子集能够感知坏死细胞并靶向抗原用于交叉呈递。有趣地，与CMV-GAG(平均百分比1.8对比2.2，p＝0.002)相比，在用CMV-GAG-SV40-DTa免疫接种的小鼠中Clec9A+DC的频率下降，这表明虽然DTa导致抗原阳性细胞死亡，但机制不影响CD8a+DC，且降低Clec9A+DC的频率。
如通过MHCII和CD80表达所测量，还测定来自引流淋巴结的DC的活化状态(图6D)。用CMV-GAG-SV40-PRF而非CMV-GAG-S V40-DTa免疫接种诱导CD11c+CD8a+DC上MHCII与CD80的上调，超过在用CMV-GAG免疫接种后所观测到的(90.5％对比84％，p＝0.002，和24.4％对比13.4％，p＝0.002)。Clec9A+DC在所有群组(包括模拟免疫接种对照)中都已经高度活化，因为MHCII和CD80分别在90-100％和60-70％细胞上表达，且在免疫接种后未检测到活化进一步增加。因此，在免疫接种后DTa和PRF诱导对DC亚群的不同作用，且仅仅PRF引起交叉呈递和感知坏死的DC的频率增加以及活化标记物增加，与坏死增强的抗原交叉呈递一致。
攻击后PRF DNA免疫接种降低EcoHIV病毒负荷
在用编码HIV-1GAG和细胞溶解蛋白质PRF的DNA免疫接种后观测到T细胞的细胞因子产生显著变化和DC活化增加。为了确定这些变化是否表示对病毒感染的免疫性增强，用EcoHIV攻击免疫接种的小鼠，EcoHIV是一种嵌合HIV，其中HIV gp120已经被来自亲嗜性鼠类白血病病毒的gp80替换。EcoHIV编码所有其它HIV蛋白质，包括来自HIV-1进化枝B NL4-3株系的GAG。小鼠通过ID途径接受2剂50μg CMV-GAG DNA或CMV-GAG-SV40-PRF DNA并接着在10天后通过IP途径，如先前描述，在1.5μg p24剂量下用EcoHIV攻击。攻击7天后挑选小鼠并收集组织以确定病毒负荷(图7)。用CMV-GAG DNA免疫接种将腹腔渗出液细胞(PEC)中的病毒负荷降低到低于在假免疫接种小鼠中检测到的病毒负荷(标准化mRNA水平减少2倍，p＝0.02)，而用CMV-GAG-SV40-PRF DNA免疫接种引起进一步降低(降低5倍，p＝0.001)(图7A)。脾中，与在模拟免疫接种小鼠中观测到的病毒负荷相比，CMV-GAG-SV40-PRF DNA而非CMV-GAG DNA免疫接种降低病毒负荷(2.5倍，p＝0.02)(图7B)。同样地，在外周血中，病毒负荷被CMV-GAG-SV40-PRF(2.5倍，p＝0.01)而不是被CMV-GAG DNA免疫接种显著降低(图7C)。因此，含有细胞溶解基因PRF的DNA免疫接种诱导的免疫反应引起EcoHIV攻击的小鼠中感染部位和全身病毒复制的控制提高。
本文中描述的本发明的实施方案包括一种靶向抗原以通过利用与细胞坏死相关的通路被DC吸收以增加抗原交叉呈递水平的方法。所描述的编码感兴趣的抗原和细胞溶解蛋白质PRF的DNA疫苗诱导抗原阳性细胞坏死，增强DC活化和抗病毒的T细胞介导的免疫性，并提供了增加的对病毒攻击的保护水平。此方法优于例如使用明矾佐剂或电穿孔等在免疫接种部位诱导细胞死亡的更一般的机制，因为其限制组织损伤并更接近地模拟包括活减毒病毒疫苗在内的溶解病毒的作用。
描述两种候选基因，DTa和PRF，其展示对抗原表达的动力学和随后免疫反应不同的作用。此研究中突出显示了抗原表达必需的阈值水平和最小周期，因为由穿孔素(CMV-GAG-2A-PRF)表达的水平增加产生的降低的抗原表达和更迅速的细胞死亡无法增强抗原特异性免疫反应(图3和4)。此事实只能通过使用活体成像技术追踪抗原表达来确定。其它细胞溶解蛋白质也可以适用于此系统中，特别是在实现免疫原性抗原表达的阈值后的时间点其表达引起溶解细胞死亡的情况下。
此方法诱导的组织损伤不会比从标准ID注射方案预期多，因为细胞死亡被限制于先前被DNA疫苗转染的细胞。然而，此方法引起引流淋巴结中活化CD11c+CD8a+DC(一种被认为是抗原交叉呈递到首次用于实验的CD8T细胞中不可或缺的细胞群体)的频率增加(图6)。如通过记忆T细胞响应于GAG肽刺激分泌的IFN数目增加所确定，穿孔素的共同表达也增强免疫接种后T细胞介导的免疫反应(图4)。当经由ID途径施用时，CMV-GAG疫苗诱导强烈的免疫反应，但添加穿孔素通过增强对非显性抗原决定基的T细胞反应而拓宽免疫反应。穿孔素还增加能够分泌多种细胞因子的CD8T细胞(一种被证明在控制HIV-1感染中重要的T细胞子集)的频率(图5)。
相反地，DTa未能活化DC或增强免疫反应，反而是降低对一些GAG抗原决定基的免疫反应。此突出显示了细胞死亡在此模型中的机制的重要性。DTa抑制蛋白质合成并引起细胞凋亡，已知细胞凋亡比坏死性细胞死亡发炎少。变成细胞凋亡并在其进行继发性坏死前清除的病毒抗原阳性细胞预计基本上限制DC活化和交叉呈递。这些结果指示人类背景下坏死性细胞死亡在免疫活化中如果不比细胞凋亡细胞死亡更有益的话，那么可能与其同等有益。
本文中描述一种编码抗原和细胞溶解蛋白质的DNA疫苗，如通过病毒攻击所确定，其不仅在腹腔中的感染部位，而且也在脾和外周血中全身性地引起比仅仅编码抗原的DNA疫苗高的保护性免疫水平。
这些结果证实诱导病毒抗原阳性细胞的坏死引起树突状细胞活化增加，而无过度发炎，并增强对控制感染说来是重要的免疫反应类型。
实施例2
材料与方法
简单地说，编码荧光素酶的DNA用作原则证明。TK/GCV用以确定荧光素酶和TK的共同表达、接着施用更昔洛韦是否会增加小鼠中DNA免疫接种的功效。进行荧光素酶和毒性蛋白质的组成性共同表达以检测针对荧光素酶的免疫反应水平的任何增加。为确保毒性蛋白质的表达不早熟且引起疫苗所靶向的细胞早期死亡，将毒素的表达置于比用于推动荧光素酶(或其它免疫原性蛋白质)表达的CMV立即早期启动子(在此文献中称为CMV启动子)弱的SV40启动子的控制下。
荧光素酶/TK DNA疫苗的构建
经修饰的荧光素酶基因从质粒扩增，并插入pVAX主链(Invitrogen)中在CMV启动子控制下和BGH聚腺苷酸化序列的上游。pVAX质粒用NheI和EcoR1限制酶消化且经修饰的荧光素酶2基因用T4DNA接合酶(NEB)接合到消化的pVAX中。DNA转化到电感受态DH5α大肠杆菌中并在卡那霉素(kannamycin)琼脂板上选择阳性克隆。插入物的存在由再消化和DNA测序来确认。
SV40启动子、胸苷激酶(TK)基因和聚腺苷酸化序列从质粒扩增。此质粒含有单纯疱疹病毒TK基因。SV40启动子、TK基因和SV40聚(A)+位点通过用限制酶PmlI消化来插入pVAX-荧光素酶主链中，用T4DNA接合酶(NEB)接合到pVAX中，并如上所述选择和测试阳性克隆(图8)。
荧光素酶/NSP4DNA疫苗的构建
经修饰的荧光素酶基因从质粒扩增，并插入pVAX主链(Invitrogen)中在CMV启动子控制下和BGH聚腺苷酸化序列的上游。pVAX质粒用NheI和EcoR1限制酶消化且经修饰的荧光素酶2基因用T4DNA接合酶(NEB)接合到消化的pVAX中。DNA转化到电感受态DH5α大肠杆菌中并在卡那霉素琼脂板上选择阳性克隆。插入物的存在由再消化和DNA测序来确认。
SV40启动子和聚腺苷酸化序列从质粒扩增。此质粒基于pcDNA3。SV40启动子和SV40聚(A)+位点通过用限制酶PmlI消化来插入pVAX-荧光素酶主链中，用T4DNA接合酶(NEB)接合，并如上所述选择和测试阳性克隆。
NSP4基因通过PCR从表达构建体扩增，并通过用SmaI限制酶消化，插入pVAX-荧光素酶质粒中在SV40启动子控制下和SV40聚腺苷酸化序列的上游，片段如上所述来接合并选择(图9)。
荧光素酶/PRF DNA疫苗的构建
经修饰的荧光素酶基因从质粒扩增，并插入pVAX主链(Invitrogen)中在CMV启动子控制下和BGH聚腺苷酸化序列的上游。pVAX质粒用NheI和EcoR1限制酶消化且经修饰的荧光素酶2基因用T4DNA接合酶(NEB)接合到消化的pVAX中。DNA转化到电感受态DH5α大肠杆菌中并在卡那霉素琼脂板上选择阳性克隆。插入物的存在由再消化和DNA测序来确认。
SV40启动子和聚腺苷酸化序列从质粒扩增。此质粒基于pcDNA3。SV40启动子和SV40聚(A)+位点通过用限制酶PmlI消化来插入pVAX-荧光素酶主链中，用T4DNA接合酶(NEB)接合，并如上所述选择和测试阳性克隆。
PRF基因通过PCR从表达构建体扩增，并通过用SmaI限制酶消化，插入pVAX-荧光素酶质粒中在SV40启动子控制下和SV40聚腺苷酸化序列的上游，片段如上所述来接合并选择(图10)。
免疫接种时程
八周龄的C57Bl/6小鼠预抽血并在相隔5周的2个时刻，通过皮内途径(耳朵)，用50μg DNA，用单独pVAXLUC、pVAXLUC-TK+/-GCV或pVAXLUC-NSP4免疫接种。每7天通过发光来测量荧光素酶表达，直到发光降低。四周以后，挑选小鼠并收集血液以检验体液对荧光素酶的免疫反应。在分析抗体反应的进一步实验中，小鼠经由皮内途径，在第0天、第28天和第56天用50μg pVAXLUC、pVAXLUC-TK+/-GCV、pVAXLUC-NSP4或LUC-PRF免疫接种，并在10天后测量抗体滴度。在分析细胞介导的免疫反应的实验中，pVAXLUC、pVAXLUC-NSP4、pVAXLUC-TK+/-GCV或pVAXLUC-PRF以及pVAX、pVAXGagNSP4或pVAXGagPRF免疫接种的小鼠经由皮内途径以4周时间间隔接受3×50μg DNA，且10天后还通过ELIspot或细胞内细胞因子染色检验免疫反应。
荧光素酶的暂时表达
从第1天起，使用Xenogen IVIS活体成像器检测发光。使小鼠镇静，接着通过腹膜内途径注射150μL D-荧光素。进行10分钟孵育以允许表达DNA疫苗的荧光素酶与荧光素反应后，小鼠置于Xenogen IVIS中并拍照。通过活体成像软件检测发光，以每秒的光子数计(图11)。发光是当前荧光素酶表达的直接量度，因为荧光素酶仅仅具有3小时的半衰期。因此，荧光素酶表达(图12)继续至少4周，且缓慢降低，直到第35天，其比第3天低1-2log倍。
初始DNA疫苗初免(第0天)后，在荧光素酶对照(pVAXluc、pVAXluc+GCV、pVAXluc+TK)或具有佐剂的荧光素酶(pVAXluc+TK+GCV或+NSP4或+PRF)组之间未发现发光水平的差异。所有群组都展示在第3天与第21天之间高水平的荧光素酶表达，且在第21天与第35天之间表达缓慢减少，在此时间点其比第3天低1-2log倍。
DNA疫苗加强免疫后，pVAXluc+NSP4和pVAXluc+PRF群组展示与其它群组相比，荧光素酶表达随着时间的推移更迅速地减少(图12)。额外的实验展示发光在第35天与第49天之间完全消失，取决于最初的表达水平。
免疫接种的小鼠中的抗荧光素酶抗体滴度
重组萤火虫荧光素酶蛋白质用以涂布ELISA板，并在37℃下孵育小鼠血清的连续稀释液一小时。接着用与辣根过氧化酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG检测抗荧光素酶IgG。与邻苯二胺(OPD)底物一起孵育后，通过分光光度计测量底物中的变色。在2个时刻用50μg DNA免疫接种小鼠的初始实验展示通过Elisa检测的抗LUC的滴度对于LUC是1/256，且对于LUC+NSP4DNA是1/4096。用TK/GCV处理产生类似的抗LUC抗体滴度，但无后一GCV施用的TK的共同表达对抗LUC滴度没有影响。接着在用pVAXLUC、pVAXLUC(后面施用GCV，作为对照)或pVAXLUC+TK(后面未施用GCV)免疫接种的小鼠中测量抗荧光素酶抗体滴度并且大概是1/10,000。在用pVAXLUC+TK(加后面施用GCV)或用pVAXLUC+NSP4免疫接种的小鼠中，抗荧光素酶抗体滴度大概是1/20,000，而用pVAXLUC+PRF免疫接种产生大概1/40,000的抗荧光素酶抗体滴度(图13)。重要的是，抗体滴度在pVAXLUC+NSP4和pVAXLUC+PRF免疫接种的小鼠中更加迅速地升高(图13)。
免疫接种的小鼠中细胞介导的对荧光素酶的反应
通过ELIspot测量细胞介导的对荧光素酶的反应。最终免疫接种7天后，从小鼠收获脾细胞，并用来源于荧光素酶的肽刺激。此实验的结果展示pVAXLuc+NSP4免疫接种使表达IFN的细胞的频率增加3倍。类似地，用pVAXLuc+PRF免疫接种使IFN阳性细胞的频率比用单独pVAXLuc免疫接种增加2倍，且多功能T细胞的频率增加2倍(图14、15、18-20)。
本文中陈述的结果展示使用自杀基因疗法可以增加针对由DNA疫苗编码的特定免疫原的免疫反应。此策略可以同等地应用于由复制缺陷型重组疫苗载体编码的免疫原乃至复制型疫苗载体，两者通常都可以是非细胞溶解的。
本文中陈述的结果还展示毒性蛋白质同时与免疫原组成性表达很可能由于交叉呈递增加而使免疫性的水平增加。因此，不需要随后施用例如可以活化可诱导启动子的前药或化合物等试剂，使得不再需要例如向患者施用更昔洛韦。虽然使用锌活化金属硫蛋白启动子在动物中可能有效，但在人类中不可能同等有效，在人类中锌是一直存在的关键元素。
有效疫苗将必然地需要诱导不可能通过诱导细胞凋亡的自杀基因实现的发炎反应。
实施例3
以下数据说明本发明的另一实施方案，其中小鼠细胞系DC 2.4用编码HCV NS3蛋白质的RNA转染。通过在63℃下热处理30分钟，使转染细胞坏死，从而产生本发明的同基因疫苗。
坏死的病毒抗原阳性细胞是高度免疫原性的
进行坏死全细胞疫苗的临床前研究。所述策略的示意图展示于图16中。小鼠细胞系DC2.4用编码HCV NS3蛋白质的RNA(此RNA序列由R Trowbridge和EJ Gowans(TrowbridgeR及Gowans EJ(1998).Molecular cloning of an Australian isolate of hepatitis Cvirus.Arch.Virol 143:501-511)和寄存在Genebank寄存编号AJ000009下的序列)转染，且48小时后，通过将细胞加热到63℃，保持30分钟来诱导这些细胞坏死。与用相同的活细胞系免疫接种相比，在6只小鼠的群组中用这些细胞皮下免疫接种诱导更高的CMI反应(如通过代表免疫原性差的HCV NS3蛋白质的肽刺激的脾细胞的ELIspot分析确定，在不同的实验中80-100倍)(图17)。在这些实验中，通过比较在蛋白质印迹法(Western blot)中检测到的亮带的强度与市售纯化NS3的亮带强度，小鼠接受大概100ng NS3蛋白质。
此外，坏死细胞引起的反应比用例如DNA免疫接种等其它(规范)免疫接种方案检测高得多，所述免疫接种方案典型地产生约100个点形成单位/106个细胞。
实施例4
按图3和4中描述的类似方式，来自HIV基因组的gag序列分别插入pVAX中NSP4和PRF顺反子的上游，产生DNA疫苗pVAXgag+NSP4和pVAXgag+PRF。C57Bl/6小鼠用50μg这些DNA疫苗通过上述皮内途径，在相隔4周的3个时刻免疫接种。这些结果展示在ELIspot分析中当脾细胞用所识别的gag免疫显性肽刺激时，与单独pVAXgag相比，pVAXgag+NSP4诱导分泌IFN的T脾细胞增加大概1.5倍，而pVAXgag+PRF诱导增加1.3倍(图18)。
为了更详细地分析这些反应，CD8+和CD8-记忆细胞(CD44+)用免疫显性gag肽离体刺激并先后通过细胞内细胞因子染色与流动式细胞测量术检验IFN、TNF和IL-2的表达。提出个别细胞中多种细胞因子的表达代表了能够防止攻击的成功疫苗的一种先决条件(RSeder,PA Darrah及M Roederer(2008)T-cell quality in memory and protection:implications for vaccine design.Nat Rev 8:247-258)。这些实验的结果展示pVAXgag+NSP4使能够在个别细胞中合成所有三种细胞因子的CD8+记忆细胞的频率增加1.7倍，而pVAXgag+PRF使其增加2.7倍(图19)。
同样地，虽然CD8+T细胞常常被识别成杀死病毒感染细胞的细胞，但表达多种细胞因子的CD4+细胞是T细胞帮助所必需的。因此，还通过多色流动式细胞测量术检验来自免疫接种小鼠的CD8-、CD44+记忆T细胞以分析个别细胞中IFN、TNF和IL-2的合成。结果展示，虽然pVAX+NSP4展示在肽刺激后这些多功能T细胞的频率没有增加，但来自用pVAXgag+PRF免疫接种的小鼠的T细胞展示此细胞群体增加3倍(图20)。
实施例5
材料与方法
表达密码子优化的NS3g1B的稳定的DC2.4细胞系的制备
所有实验都使用含有人类乙型肝炎病毒转译后调控元件(PRE)和HIV中央聚嘌呤区(cPPT)元件的第三代慢病毒载体(Barry等人2001和Brown等人2010中描述)。为使NS3g1b过度表达，主链经重新工程化以含有延伸因子(EF)-1启动子(plvEIG)、Gateway克隆位点(att，CAT ccdB att)和内部核糖体进入位点(IRES)，以推动编码绿色荧光蛋白质的标记物基因(GFP)。为了产生HCV NS3递送载体，此主链经工程化，以在其中NS3盒进行重组的Rev反应元件的上游含有Gate way盒(att，CAT ccdB att)。HCV NS3g1b插入在EF-1α启动子的控制下，且从IRES表达标记物基因(GFP)。为了产生NS3慢病毒原液，HEK293T细胞以6×106个细胞的密度接种于75cm2组织培养瓶中的18ml培养基中。根据标准方案，使用Lipofectamine LTX试剂(Invitrogen)和Opti-MEM(Invitrogen)减血清培养基，细胞用12.5g NS3转移载体(plvEIG)、7.5g Gag/Pol(8.2)、6.25g Rev(pRSV-Rev)和3.75g Env(pCMV-VSV-G)转染。第二天，培养基换成10ml新鲜RPMI，且48小时后，收集上清液，过滤(孔径，0.45m)，且立刻使用或冷冻储存(-70℃)。
为转导鼠类DC2.4细胞系，细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在6孔板中。培养基换成3ml含有8g/ml的最终浓度的聚凝胺的病毒上清液(未浓缩)。NS3-GFP阳性细胞通过流动式细胞测量术(FACSAria；BD Biosciences,San Jose,CA)分选，直到纯度到达96％。
表达密码子优化的NS3g1B的坏死稳定的DC2.4细胞系的刺激
NS3DC2.4细胞在PBS中再悬浮。细胞加热到63℃，保持30分钟，以诱导坏死。通过锥虫蓝染色和流动式细胞测量术确认坏死。
坏死细胞的流动式细胞测量术检测
坏死NS3DC 2.4细胞通过流动式细胞测量术(FACSCanto,BD Biosciences,SanJose,CA)分析。通过检查DC2.4的FFC和SSC特征确认坏死。
结果
坏死细胞的流动式细胞测量术检测
制备稳定的DC2.4细胞系，其表达密码子优化的NS3g1b。收集表达密码子优化的NS3g1B的稳定DC2.4细胞的97.56％样品(图21A)。在转导7-8天后，使用标准流动式细胞测量术分选技术，收集GFP阳性转导细胞的此群体。第四次分选后，GFP阳性细胞的纯度提高到93-95％(图21B-F)。
制备七个稳定的DC2.4细胞系克隆。如使用上述流动式细胞测量技术检测，每一克隆细胞系的GFP阳性细胞的百分比在52.1％到82.8％之间变化(图22A-G)，门控参数在图22H中说明。
单剂坏死或活免疫接种后的细胞活化动力学
代表所制备的表达NS3g1b的稳定DC2.4细胞系的活或坏死细胞的单剂106个细胞施用小鼠，并在第0、2、3、5和7天取样。从引流LN(局部)和脾(全身性)取样，并针对以下进行分析：i)T细胞活化(CD3/CD4/CD8/CD25/CD69)；ii)DC活化(CD11c/CD8/MHCII/CD80/CD86)；iii)Clec9A DCs(Clec9A/CD11c/CD8/MHCII/CD4)；iv)免疫接种后引流LN中GFP表达；和v)引流LN中细胞数。
图23展示在免疫接种后第2、3、5和7天GFP阳性细胞的频率。图24A-D展示第2、3、5和7天DLN中的GFP表达。发现2、3和5天后DLN中坏死GFP阳性细胞的频率显著增加。7天后，活GFP阳性细胞的频率显著增加。
单剂坏死或活疫苗后DLN中CD11c高细胞
如图25中所示，免疫接种5天后，LN中坏死细胞的数目相对于活细胞的数目显著增加。然而，DLN中坏死CD11c高细胞的数目在免疫接种7天后最高(图26)。关于频率和总细胞数，坏死CD11c高细胞相对于活细胞的频率在免疫接种5天后显著增加(图27)。
DLN中坏死CD11c高CD8细胞的频率不随时间显著变化(图28)。然而，DLN中坏死CD11c高CD8细胞的数目在免疫接种7天后最高(图29)。
DLN中坏死CD11c高CD8+Clec9A+细胞的频率不随时间显著变化(图30)。然而，免疫接种5天和7天后，DLN中坏死CD11c高CD8+Clec9A+细胞的数目比活细胞显著高(图31)。
免疫接种2天后，DLN中坏死CD11c高CD8+MHCII+Clec9A+细胞的频率比活细胞显著高(图32)。
加强剂量的坏死或活疫苗后DLN中NS3细胞
小鼠用106个细胞初始剂量免疫接种，接着7天后类似地施用加强剂量。施用加强剂量14天后取样并收集3池的NS3细胞。
如图33A-D和图34中所示，所有三个池中，与用活NS3细胞免疫接种的小鼠比较，在用坏死NS3细胞免疫接种的小鼠中分泌干扰素-γ的细胞的数目显著更大，表明在用坏死细胞免疫接种的小鼠中所有池的IFNg反应更大。
与NS3阳性活细胞比较，在用NS3阳性坏死细胞免疫接种的小鼠中NS3刺激的细胞分泌的IL-2、TNF和IFNg的量显著增加(图36-38)。
实施例6
材料与方法
为了检验用HCV抗原阳性的坏死树突状细胞免疫接种对HCV感染结果的潜能，对许多先前用常规的基于干扰素的疗法失败的HCV阳性人类个体免疫接种。获取基线血液样品。在用HCV抗原阳性的坏死树突状细胞免疫接种前四周，每个患者用干扰素-处理总共4周。在用细胞免疫接种前一周，从患者获取血液样品并从每个患者制备单核细胞衍生的树突状细胞(Mo-DC)，如先前所述(Gowans EJ,Roberts S,Jones K,Dinatale I,Latour PA,Chua B,Eriksson EMY,Chin R,Li S,Wall DM,Sparrow RL,Moloney J,Loudovaris M,Ffrench R,Prince HM,Hart D,Zeng W,Torresi J,Brown LE,Jackson DC(2010).A phase Iclinical trial of dendritic cell immunotherapy in HCV-infected individuals.JHepatology.53(4):599-607)，此过程耗费5天。基本上，外周血标本收集在9ml肝素锂vacutainer管(Becton Dickinson)中。对于每15ml血液，等体积的RPMI(R-)(Invitrogen)通过在50ml Falcon离心管中旋动来混合。接着使用注射器和套管将Ficoll-paque溶液铺在30ml稀血液下面。管置于气溶胶密封的离心机中，并在22℃下在400g下离心30分钟。
使用注射器/套管吸出浑浊的单核细胞界面。接着将细胞转移到另一个新制的无菌50ml管(Falcon)中并使用RPMI洗涤细胞来补足到45ml体积。接着细胞在室温下在400g下离心8分钟。弃去上清液并将来自每个管的细胞汇集到50ml离心管中，并再悬浮于MACS缓冲液(PBS、2mM EDTA、1％BSA)中，浓度为2.5×108个细胞/毫升。接着CD14微珠粒(MiltenyiBiotec)以每1×107个细胞20ul添加到细胞中。此混合物在4℃下孵育15分钟，并接着用MACS缓冲液洗涤。接着细胞施加于由MACS磁铁供应的磁场中的LS+MACS柱(Miltenyi)。使CD14阴性细胞通过柱以废弃。接着从磁铁去除柱，且通过使用试剂盒中供应的柱塞，施加10ml MACS缓冲液，从柱洗脱CD14阳性细胞。接着CD14阳性单核细胞用MACS缓冲液洗涤，并在具有1000U/ml GM-CSF(Berlex)和IL-4(R&D Systems)的Aim-V培养基(Invitrogen)中再悬浮，浓度为每毫升1×106个细胞。接着细胞在37℃下孵育5天以获得不成熟的单核细胞衍生的DC(Mo-DC)。接着MO-DC用来自基因型1b病毒(Trowbridge和Gowans,1998)的编码HCV蛋白质E1、E2和NS3的重组人类腺病毒感染并在37℃下孵育48小时，确保HCV抗原表达。接着细胞在63℃下孵育30分钟以诱导坏死。对于接受多剂HCV抗原阳性Mo-DC的患者，活抗原阳性细胞在液氮中冷冻，在免疫接种当天解冻，并接着如上所述使其坏死。
因为此为一项剂量扩大试验，所以所有连续的患者在1、2或3个时刻通过皮内途径接受磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中递增剂量的坏死细胞，在1×104到1×107个细胞范围内。在免疫接种后定期取血液样品，并通过对用肽池离体刺激的PBMC进行ELIspot分析来测量HCV特异性细胞介导的免疫反应，这些肽池总体上代表了疫苗中含有的完整的HCV多聚蛋白或蛋白质。病毒负荷还通过定量的RT-PCR测量。试验的设计以及剂量和给药时程的细节在图39中示意性展示。
结果
虽然此I期试验主要设计成测试安全性，但进行ELIspot和qRT-PCR来检验作为功效量度的HCV细胞介导的免疫性和病毒负荷的任何变化。没有患者展示任何有害的事件。因为患者#1和#2分别仅仅接受1×104和2×104个细胞，所以这些患者未能展示HCV细胞介导的免疫性的任何增加(分别图40和41，上图和下图)，不过提出患者#2中的NS3特定反应。此外，虽然患者#3和#4展示对广泛肽的一些反应，但对疫苗中含有的肽的HCV细胞介导的免疫性明显增加(图42和43)。因为临床试验仍然进行中，所以没有获得额外的ELIspot数据。为了证实ELIspot方案是可再生的，对CEF肽(CMV、EBV和流感病毒的肽)的ELIspot反应展示最少波动，不过在患者#4中从基线到第2周大幅度增加，其可以反映出对免疫接种的非特定反应(展示于图44中)。病毒负荷数据由局部病理学提供者产生且在临床试验的此阶段仍然不完整。大部分的患者对干扰素诱导起反应，且原始资料展示于图45和46中，而数据的解释以各种图展示(图46-48)。数据展示在免疫接种后，患者#6和#3展示病毒负荷为基线的57％和64％，而患者#2和#4展示病毒负荷为基线的75％和77％。患者#1和#5展示对免疫接种无反应，且实际上患者#5展示回弹超过基线(图49)。
本发明的范围不受本文中描述的任何特定实施方案限制。这些实施方案仅仅意图是为了示例。功能同等的产物、制剂和方法清楚地在如本文中描述的本发明范围内。
本文中描述的本发明可以包括一个或多个数值范围(例如尺寸、位移和场强等等)。将了解值的范围包括在所述范围内的所有值，包括界定所述范围的值和接近所述范围，产生与紧接着界定所述范围边界的值的值相同或基本上相同的结果的值。
本文中所用的所选择术语的其它定义可以在发明详述内找到并全文适用。除非另外定义，否则本文中使用的所有其它科学和技术术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常了解的含义相同的含义。术语“活性剂”可以意指一种活性剂，或可以涵盖两种或两种以上活性剂。
本领域技术人员将了解本文中描述的本发明可以进行除特别描述内容以外的变化和修改。本发明包括所有这类的变化和修改。本发明还包括所有在本说明书中个别或统一提及或指示的步骤、特征、制剂和化合物，以及步骤或特征的任何和所有组合或其任两者或两者以上。
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Claims (47)

1.细胞在制备用于诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的药物中的用途，其中：
a).具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽在所述细胞中表达，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).所述免疫原在细胞中表达，其中所述免疫原的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子；以及
c).所述细胞诱导促炎性的免疫反应，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和所述免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在所述细胞中被诱导。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述细胞是体细胞。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述细胞是APC。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述表达的免疫原在所述细胞的表面上被呈递。
5.如权利要求1到4中任一项所述的用途，其中所述细胞共同表达人类白细胞抗原(HLA)。
6.如权利要求1到4中任一项所述的用途，其中所述免疫原来源于HIV。
7.如权利要求1到4中任一项所述的用途，其中所述免疫原来源于HCV。
8.细胞在制备用于诱导或增强受试者中针对免疫原的免疫反应的药物中的用途，其中：
a).具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽在体细胞或APC中表达，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).所述免疫原在体细胞或APC中表达，其中所述免疫原的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子；
c).细胞死亡在所述细胞中被诱导；以及
d).所述体细胞或APC诱导促炎性的免疫反应，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和所述免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在所述细胞中被诱导。
9.如权利要求8所述的用途，其中向所述受试者施用所述细胞由此诱导促炎性的免疫反应的步骤是通过所述受试者的APC经由II类通路加工所述免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD4+T细胞检测。
10.如权利要求8所述的用途，其中向所述受试者施用所述细胞由此诱导促炎性的免疫反应的步骤通过所述APC经由I类通路加工所述免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD8+T细胞检测。
11.细胞在制备用于诱导或增强受试者中针对内源性免疫原的免疫反应的药物中的用途，其中：
a).具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽在所述细胞中表达，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).所述内源性免疫原在细胞中表达，其中所述免疫原的表达受第二启动子的控制，由此呈递所述内源性免疫原，所述第二启动子是CMV启动子；以及
c).所述内源性免疫原呈递细胞诱导促炎性的免疫反应，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和所述免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在所述细胞中被诱导。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述细胞是APC。
13.如权利要求11或12所述的用途，其中使免疫原在细胞中表达由此呈递所述免疫原的步骤通过所述细胞经由II类通路加工所述免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD4+T细胞检测。
14.如权利要求11或12所述的用途，其中使免疫原在细胞中表达由此呈递所述免疫原的步骤通过所述细胞经由I类通路加工所述免疫原来进行，所呈递的免疫原可被首次用于实验的CD8+T细胞检测。
15.细胞在制备用于诱导或增强受试者中针对HIV蛋白质的免疫反应的药物中的用途，其中：
a).具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽在所述细胞中表达，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)在细胞中表达，并且其中所述HIV蛋白和人类白细胞抗原(HLA)的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子；以及
c).表达HIV蛋白质和人类白细胞抗原(HLA)的所述细胞诱导针对所述HIV蛋白质的促炎性的免疫反应，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在所述细胞中被诱导。
16.如权利要求15所述的用途，其中在所述细胞中诱导坏死的步骤通过将所述细胞暴露于坏死诱导条件来进行。
17.如权利要求15所述的用途，其中在所述细胞中诱导坏死的步骤通过将所述细胞暴露于坏死诱导剂或使所述坏死剂在所述细胞中表达来进行。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述细胞是APC。
19.细胞在制备用于诱导或增强受试者中针对HCV蛋白质的免疫反应的药物中的用途，其中：
a).具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽在所述细胞中表达，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).HCV蛋白质在细胞中表达，由此呈递所述HCV蛋白质，其中所述HCV蛋白质的表达受第二启动子控制，所述第二启动子是CMV启动子；以及
c).表达HCV蛋白质的所述细胞诱导针对HCV的促炎性的免疫反应，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在所述细胞中被诱导。
20.如权利要求19所述的用途，其中在所述细胞中诱导坏死的步骤通过将所述细胞暴露于坏死诱导条件来进行。
21.如权利要求19所述的用途，其中在所述细胞中诱导坏死的步骤通过将所述细胞暴露于坏死诱导剂或使所述坏死剂在所述细胞中表达来进行。
22.如权利要求19所述的用途，其中所述细胞是APC。
23.一种核酸疫苗，其包含：
a).第一核酸序列，其具有编码具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽的第一核酸序列，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述第一核酸序列的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；以及
b).第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在细胞中被诱导。
24.如权利要求23所述的核酸疫苗，其中所述疫苗是DNA疫苗。
25.如权利要求23所述的核酸疫苗，其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列之间包括插入核酸序列，所述插入核酸序列编码FMDV 2A蛋白酶。
26.一种用于如权利要求1到22中任一项所述的用途的核酸疫苗，其包含一对分离的核酸分子，其中：
a).第一核酸序列包含编码具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽的核酸序列，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；以及
b).第二核酸序列包含编码免疫原性多肽的核酸序列，其中免疫原的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和所述免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在细胞中被诱导。
27.一种核酸疫苗，其包含：
a).第一核酸序列，其具有编码具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽的第一核酸序列，其中所述多肽是突变穿孔素，其中所述突变穿孔素的表达受第一启动子的控制，所述第一启动子是SV40启动子，并且其中所述突变穿孔素的DNA序列是SEQ ID NO:7；
b).第二核酸序列，其具有编码免疫原性多肽的第二核酸序列，其中免疫原的表达受第二启动子的控制，所述第二启动子是CMV启动子；和
c).在所述第一与第二核酸分子之间的插入核酸序列，其具有编码蛋白酶的核酸序列，
其中，所述第二启动子比所述第一启动子具有更大的相对功效；
其中，通过使用双顺反子载体实现所述具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和所述免疫原的差异表达；并且
其中，坏死在细胞中被诱导。
28.一种重组病毒疫苗，其包含：
a).根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗；和
b).调控表达元件，其可操作地连接于所述核酸疫苗的核酸序列以在宿主细胞中表达具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和免疫原性多肽。
29.如权利要求28所述的重组病毒疫苗，其中所述重组病毒疫苗包含载体，所述载体选自复制型载体和复制缺陷型载体，且其中所述载体不诱导坏死。
30.一种表达载体，其包含：
a).根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗；和
b).调控表达元件，其可操作地连接于所述核酸疫苗的核酸序列以在宿主细胞中表达具有非凋亡细胞死亡诱导活性的多肽和免疫原性多肽。
31.一种促炎性的细胞疫苗，其包含细胞；和
a).根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗；
b).根据权利要求28到29中任一项所述的重组病毒疫苗；或
c).根据权利要求30所述的表达载体。
32.一种免疫原性组合物，其包含：
a).根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗；
b).根据权利要求28到29中任一项所述的重组病毒疫苗；
c).根据权利要求30所述的表达载体；或
d).根据权利要求31所述的促炎性的细胞疫苗。
33.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于诱导或增强受试者中针对抗原的抗原特异性免疫反应的药物中的用途。
34.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于增加受试者中CD4+T细胞水平和/或活性和/或CD8+T细胞水平和/或活性的药物中的用途。
35.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于针对免疫原来免疫接种受试者的药物中的用途。
36.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于在受试者中产生树突状细胞(DC)免疫反应模式的药物中的用途。
37.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于在受试者中产生CD4+T细胞和/或CD8+T细胞免疫反应模式的药物中的用途。
38.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于诱导受试者中抗体免疫反应的药物中的用途。
39.如权利要求33到38中任一项所述的用途，其中所述药物是：
a).根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗；或
b).根据权利要求28到29中任一项所述的重组病毒疫苗。
40.如权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗在制备用于诱导或增强免疫反应的免疫原性组合物中的用途，其中：
a).使宿主细胞与根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗接触；
b).使所述免疫原性多肽表达；以及
c).在所述宿主细胞中诱导坏死。
41.宿主细胞在制备用于呈递免疫原性多肽到受试者的药物中的用途，其中：
a).使所述宿主细胞与根据权利要求23到27中任一项所述的核酸疫苗接触；
b).所述免疫原性多肽被表达；以及
c).坏死在所述宿主细胞中被诱导。
42.如权利要求32所述的免疫原性组合物在制备用于预防性或治疗性治疗患者感染的药物中的用途。
43.一种药物组合物，其包含根据权利要求32所述的免疫原性组合物以及可接受的稀释剂或载剂。
44.一种治疗性或预防性疫苗，其包含根据权利要求32所述的免疫原性组合物。
45.一种剂型，其包含根据权利要求32所述的免疫原性组合物。
46.一种试剂盒，其包含被密封在容器中的如权利要求45所述的剂型。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中密封的所述容器用说明书标明所述试剂盒用于预防性或治疗性治疗患者感染。
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