CN104650220B - 绿盲蝽温度气味受体蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽温度气味受体蛋白，所述一种绿盲蝽温度气味受体蛋白，(a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；或(c)与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白，本发明同时公开了上述受体蛋白的基因和应用。本发明中的绿盲蝽温度气味受体蛋白在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表现出具有感知环境温度和气味中发挥着重要作用。因此该基因的分离克隆，可以应用于转基因棉花育种，并且可以作为新的有效靶标来设计化合物或者发展物理防治措施来控制绿盲蝽的危害。

Description

绿盲蝽温度气味受体蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种绿盲蝽感受温度和化学气味的受体蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
农作物虫害是严重威胁农业生产的自然灾害之一。虫害严重发生时，会造成农作物大幅减产和农产品品质变劣，进而造成严重的经济损失。为了防治害虫对农作物的为害，人们通常采用以化学农药为主的化学防治。然而随着大范围高剂量化学杀虫药剂的使用，由此产生的弊端也日趋明显，诸如农药对靶标害虫的选择作用使一些农业害虫产生抗药性而降低防治效果；农药对食物链和生态系统的破坏作用带来害虫再猖獗；农药的残留导致环境污染等一系列问题。因此，发展现代植保技术，寻找新的靶标位点来发展高效、安全、环保的害虫防治新方法显得尤为迫切。
昆虫对外界环境因子(例如温度、气味、光照等)的感知是其生存以及完成重要生理过程的基础，包括寄主选择、蜕皮、求偶、交配、躲避不利条件等。经过科学家研究发现细胞膜上有一种重要的非选择性阳离子受体通道蛋白。该受体蛋白能够参与多种生理感觉的感知，如视觉、嗅觉、味觉、听觉、机械感觉、温度感觉、湿度感觉等，在生物体内是一类重要的信号集合器。众所周知，昆虫属于变温动物，温度对于昆虫的新陈代谢、生长发育、生存繁殖、迁移等生理过程及行为反应至关重要。TORC受体蛋白在昆虫中证实参与温度识别过程，例如在按蚊中，该受体蛋白作为温度感受器来感受寄主身上散发的热量，从而寻找寄主。除此之外，在昆虫中TORC受体蛋白还参与化学伤害感知与逃避的过程，例如其在果蝇感受拒食剂马兜铃酸的逃避行为中发挥重要作用，而在蚊子中可以对具有趋避作用的化学气味产生反应进而逃避。由此可见，该蛋白很有可能成为一种新的靶标用来设计研发新的趋避剂，不论是对卫生害虫如蚊子、跳蚤，还是对农业害虫如棉铃虫、蚜虫、盲蝽等，都可能起到很好的效果。
每年因为棉花害虫造成棉花减产损失巨大，例如棉铃虫、棉花盲蝽蟓和棉蚜等。目前尚未发现有关绿盲蝽受体蛋白、功能及基因序列等信息的相关报道。
发明内容
本发明的目的提供一种绿盲蝽温度气味受体蛋白。
所述绿盲蝽温度气味受体蛋白(在本申请中将其命名为TORC-2受体蛋白，所述TORC-2受体蛋白获自半翅目盲蝽科昆虫绿盲蝽(Apolygus lucorum))：
(a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；或
(c)与SEQ ID NO.2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白。
本发明的目的也在于提供编码上述述绿盲蝽温度气味受体蛋白的基因。
其中，所述基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的也在于提供含有上述基因的表达载体。
本发明的目的也在于提供含有上表达载体的宿主。
本发明的目的也在于提供含所述基因的转化植物细胞。
本发明的目的也在于提供所述绿盲蝽温度气味受体蛋白在制备杀虫剂中的应用。
本发明的目的也在于提供绿盲蝽温度气味受体蛋白在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
本发明的目的还在于提供所述基因在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
本发明中的TORC-2受体蛋白或其基因可以通过从半翅目盲蝽科昆虫绿盲蝽(Apolygus lucorum)提取、基因工程或化学方法制备。
本发明中利用生物信息学技术，分析了绿盲蝽触角转录组，并获得了TORC-2受体蛋白的基因片段，以此片段设计正向和反向引物，分别进行3’-RACE和5’-RACE，获得了该基因的5’端和3’端基因PCR片段。根据基因测序拼接获得DNA序列，在5’端和3’端非编码区重新设计一对引物TORC-2-F与TORC-2-R，提取绿盲蝽RNA并反转录成cDNA，以此cDNA为模板并进一步设计巢式引物来扩增TORC-2基因的全长序列进行测序验证。在此基因内重新设计一对引物，提取绿盲蝽不同组织RNA并反转录成cDNA，以这些cDNA为模板进行RT-PCR反应，获得该基因在绿盲蝽不同组织中表达谱，分析证明该基因在触角中高水平表达。构建表达载体，对该基因利用爪蟾卵母细胞异源表达系统进行体外表达，结合双电极电压钳技术，对该受体蛋白功能进行验证。并通过绿盲蝽行为学研究证明TORC-2基因在绿盲蝽感知环境温度和气味中发挥着重要作用。
本发明中的绿盲蝽温度气味受体蛋白(TORC-2受体蛋白)在爪蟾卵母细胞异源表达系统中表现出具有感知环境温度和气味中发挥着重要作用。因此可以利用此基因和RNAi转基因植物的工作原理，用于转基因棉花育种。绿盲蝽取食此转基因棉花后，其编码的蛋白即此气味受体蛋白功能受到影响，进而影响绿盲蝽感知气味和温度，导致其生存能力下降，对棉花的抗绿盲蝽育种将起到重要的促进作用。本发明中的基因或蛋白作为靶标控制绿盲蝽提供了理论基础，可以作为新的有效靶标来设计高效、安全、环保的化合物或者发展新颖的物理防治措施来控制绿盲蝽的危害。无论把该基因做成转基因作物或者杀虫药剂，利用RNAi干扰原理，当绿盲蝽取食该转基因作物或药剂后，其体内该基因受到干扰，是基因功能丧失，因此蛋白表达受到影响。
附图说明
图1为TORC-2基因蛋白序列及结构示意图；阴影部分序列为预测的锚蛋白重复序列(Ank1-Ank16)；下划线序列为预测的跨膜结构(TM1-TM6)。
图2为绿盲蝽TORC-2基因的组织表达谱分析；(a)为绿盲蝽TORC-2基因的组织表达谱分析柱状图；(b)为绿盲蝽TORC-2基因在雌、雄虫中的表达，图中M代表D2000 marker；1代表雌虫触角；2代表雄虫触角；3代表清水的阴性对照。
图3为表达TORC-2基因的爪蟾卵母细胞对于温度刺激的反应检测图；A为对照组的爪蟾卵母细胞对热刺激的反应轨迹；B为表达TORC-2的爪蟾卵母细胞对热刺激的反应轨迹图，C为对照组和表达TORC-2的爪蟾卵母细胞对热刺激的电流反应值，1、2分别为两次刺激，其中a、b同一字母表示差异不显著，不同字母差异显著；D为表达TORC-2的爪蟾卵母细胞对不同温度梯度热刺激的反应轨迹图；E为表达TORC-2的爪蟾卵母细胞对不同温度梯度热刺激的电流反应值。
图4为注射TORC-2基因cRNA的爪蟾卵母细胞对化学刺激的反应；A为注射TORC-2基因cRNA的爪蟾卵母细胞对化学刺激的反应轨迹图；B为注射TORC-2基因cRNA的爪蟾卵母细胞对化学刺激的反应的电流图。
图5绿盲蝽对AITC、CA和Citronellal的行为反应检测图；与对照DMSO相比，*表示差异显著，**表示差异极显著。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1 TORC-1蛋白及其编码基因的发现、获得和分离
1.TORC-2基因的生物信息学分析
利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽触角转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲蝽TORC-2基因的部分片段。
2.供试昆虫及组织收集
绿盲蝽为中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(ZeamaysL)及四季豆(Phaseolus vulgaris L.)饲养，饲养温度为25-28℃，相对湿度为60％-70％，光照为16:8(L:D)。取雌、雄成虫的触角、头、喙、足、腹、翅等组织，至于-70℃冰箱等待使用。
3.RNA的提取
昆虫总RNA提取的全部过程在无RNase条件下进行。整个提取步骤如下所示：
1)取-70℃保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，暂时至于冰上。
2)4℃，12000g离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
3)将上清在室温下放置5min后，向离心管中加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡15s，再室温静置2-3min。
4)4℃，12000g离心15min，混合物在此后分层，下层为有机相，上层为水相(RNA就在水相中)，用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，注意尽量不要吸到中间层，以免造成蛋白质或DNA污染。
5)加入0.5mL异丙醇，混匀后，室温静置10min来沉淀RNA。
6)4℃，12000g离心10min后，观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净)，加入1mL75％的乙醇(用DEPC水配置，现用现配)，轻轻震荡离心管悬浮沉淀，洗涤沉淀。
7)4℃，7500g离心10min后，弃上清(尽量吸净)，超净台中干燥沉淀5-10min。
8)加入10-20μL RNA-free水(根据RNA量而定)，轻弹离心，使沉淀充分溶解。
9)55-60℃温育后，取1μL样品稀释至5μL，其中2.5μL进行电泳检测，2.5μL用NanoDrop仪器检测；剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。
4.5’/3’-RACE cDNA模板的制备
整个过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit进行，具体如下：
1)准备Buffer Mix:将2μL的5×First-Strand Buffer；1μL的DTT(20mM)；1μL的dNTP Mix(10mM)依次加入到一个无RNA酶的PCR管中，置于室温等待下步反应。
2)另备一无RNA酶的PCR管，对于合成5’-RACE cDNA模板，依次加入1-2.75μL的总RNA；1μL的5’-CDS Primer A，补水至3.75μL；对于合成3’-RACE cDNA模板，依次加入1-3.75μL的总RNA；1μL的5’-CDS Primer A，补水至4.75μL。
3)72℃温育3min后42℃温育2min(PCR仪控温)，冷却后，14000g简单离心10s。对于合成5’-RACE cDNA模板，在步骤2后需再加入1μL的SMARTer IIA oligo，合成3’-RACE cDNA模板则不需要。
4)准备Master Mix:将步骤1中准备好的4μL的Buffer Mix中依次加入0.25μL的RNase Inhibitor(40U/μL)；1μL的SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)。
5)将5.25μL Master Mix加入到步骤3中的PCR管中,轻柔混匀，简单离心。
6)42℃温育90min后70℃加热10min。
7)根据总RNA的量，用Tricine-EDTA Buffer稀释产物，-20℃冰箱保存。
5.第一链cDNA的合成
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行，操作步骤按Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，具体如下：
1)在无RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根据NanoDrop定量的结果计算应该加入RNA的体积数)，DNaseⅠ1μL，1μLRibolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Bufferwith MgCl2，用RNA-free水将体系补足到10μL；轻微震荡后离心；
2)37℃温育30min后，向体系内加入1μL 50mM EDTA，震荡后离心，然后65℃温育10min,以去除DNA酶I；
3)加入1μLoligo-dT，用RNA-free水补至12μL；
4)65℃温育5min后，立即置于冰上；
5)依次加入下列试剂，使体系达到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTPMix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNaseInhibitor；简单混匀离心；
6)42℃温育1h，然后再70℃温育5min；
7)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情况稀释若干倍。
6.TORC-2基因的扩增、测序
分析绿盲蝽转录组未得到TORC-2基因的全长序列，仅有部分序列，需要设计多对特异性引物多次通过RACE技术来获得TORC-2的5’及3’端的序列，从而分析出全长序列。首先根据已知序列片段设计了两条5’-RACE特异引物AlucTORC-2-5RACE外-201及AlucTORC-2-5RACE内-67，通过巢氏PCR得到部分序列。之后又根据第一次5’-RACE得到的序列设计5’-RACE特异引物AlucTORC-2-5’RACE-500及AlucTORC-2-5’RACE-290做巢氏PCR，经过这两次5’-RACE扩增得到TORC-2基因的5’端部分非编码区序列。为了得到TORC-2基因的3’端序列，根据3’端的已知序列片段设计3’-RACE特异引物AlucTORC-2-3RACE外-39及AlucTORC-2-3RACE内-378，并扩增得到3’端部分非编码区序列。通过5’及3’–RACE扩增，成功找到TORC-2基因的起始密码子与终止密码子。进一步设计巢式引物来扩增TORC-2基因的全长序列，首先根据5’及3’端非编码区序列，设计外侧引物AlucTORC-2-_F0与AlucTORC-2_R0进行第一轮PCR扩增，随后以第一轮PCR产物为模板，设计内侧引物AlucTORC-2_F与AlucTORC-2_R来进行第二轮全长扩增。
上述试验中详细的引物序列如下：
AlucTORC-2-5RACE外-201：CCTCGGGCTGAAGGCTGAACAT
AlucTORC-2-5RACE内-67：TTGAAGTCGCCGCTGTGAACTG
AlucTORC-2-5’RACE-500：TGGCTTCCAGTGAATCGTGCTC
AlucTORC-2-5’RACE-290：CGCCACAGCATCCACAGGCTTGAAG
AlucTORC-2-3RACE外-39：ACTGATCATCGCTTTTGGACTGTCG
AlucTORC-2-3RACE内-378：CGTGCTGCACACTGAGCTAGAGAGG
AlucTORC-2_F0：TCATACTGTGACCTCCGCTCCA
AlucTORC-2_R0：CAATCGTCATTCCACCTTCTCA
AlucTORC-2_F：ATGGGTCTACTAAGTCTACCGTGG
AlucTORC-2_R：CTACCTCGGAGGCGTATTTTTC
上述试验具体的PCR反应体系为：31.5μL ddH2O，5μL的10×LA PCR Buffer II(Mg2 +Plus)，8μL的dNTPs(2.5mM)，2μL的cDNA，2μL的F引物(10mM)，2μL的R引物(10mM)和0.5μL的LA Taq酶。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸4min，35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶溶解在1×TAE buffer的缓冲液中进行检测。在长波紫外灯下切下含所需目的DNA片段大小相符的凝胶，置于1.5mL的离心管中，用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段连接到ProgemapGEM-T载体上，连接体系如下：5μL的2×Rapid Ligation Buffer；1μL的pGEM-TVecto；3μL的PCR产物；1μL的T4DNA Ligase，4℃连接过夜。连接体系转化天根Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行)，培养过夜后，挑取16个白色单克隆进行PCR验证，阳性克隆用含有浓度为100μg/mL的氨苄的液体LB培养基震荡培养过夜，保种后送测序。测序结果使用DNAMAN软件进行拼接、比对，选择具有正确开放阅读框的克隆进行下一步的实验。
克隆得到TORC-2基因的全长为3672bp，编码的1223个氨基酸，详细的氨基酸和核酸序列序列如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
实施例2、TORC-2受体蛋白基因表达谱分析和氨基酸序列结构分析
1.TORC-2基因的表达谱分析
首先在TORC-2基因上设计一对引物，再以GADPH基因为对照，使用荧光定量PCR分析TORC-2基因在雌成虫触角、头(除去触角)、喙、足、腹、翅六种组织中的表达情况，结果见图2。TORC-2基因在触角中的表达量最高，其次是翅和足，头、喙、腹中的表达量相差不大。RT-PCR分析TORC-2基因在雌雄触角中的表达量，结果显示雌、雄虫触角的表达量相同。上述试验中详细的引物序列如下：
AlucGADPH-QF:CGAGTTCCTGTCCCTAATGTTTC
AlucGADPH-QR:GCCTCCTTCACCTTCTGCTT
AlucTORC-2-QF:CGTGGTTATGTTCCTCGAGATT
AlucTORC-2-QR:CGCGTAAGACAGCAGGATATAA
2.TORC-2受体蛋白氨基酸序列结构分析
使用在线软件工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测TORC-2受体蛋白的氨基酸结构，如图1所示。其中ANK代表锚蛋白重复序列，TM代表跨膜结构域，预测结果结果表明这3个TORC-2通道蛋白在N端均有16个锚蛋白重复序列(ankyrin repeat)和6次跨膜结构域(transmembrane domain)。
实施例3、TORC-2基因表达载体的构建
为了将测序正确的TORC-2基因序列连入表达载体，需要根据序列设计带合适酶切位点的引物，通过PCR扩增将酶切位点连入序列中，带酶切位点的F引物需要在酶切位点后加入Kozak序列(GCCACC)来增强真核基因的表达效果。详细的引物序列如下：
AlucTORC-2-F-SpeI：GACTAGTgccaccATGGGTCTACTAAGTCTACCG
AlucTORC-2-R-NotI：GCGGCCGCCTACCTCGGAGGCGTATTTTTC
具体的PCR反应体系为：15.75μL的ddH2O；5μL的5×PrimeSTAR buffer(Mg2+plus)；2μL的dNTP Mixture(各2.5mM)；0.5μL的F引物(10mM)；0.5μL的R引物(10mM)；1μL的菌液，0.25μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)。PCR产物用1％琼脂糖凝胶溶解在1×TAE buffer的缓冲液中进行检测。在长波紫外灯下切下含所需目的DNA片段大小相符的凝胶，置于1.5mL的离心管中，用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行)，回收的片段及表达载体pT7Ts由引物上带的酶位双酶切后，由T4连接酶进行连接，具体的反应体系为：6μ双酶切过的基因片段、2μL的10×T4Ligase Buffer，1μL双酶切过的pT7Ts载体和1μL的T4 Ligase，22℃连接2小时，连接体系转化天根Top10感受态细胞，平板37℃培养过夜后，挑取8个克隆进行PCR验证。阳性克隆用含有氨苄的液体LB(含100μg/mL的抗生素Amp)培养基培养过夜，第二天保种后送测序检验。
测序正确后提取重组质粒进行单酶切线性化并进行cRNA的合成，实验步骤如下：利用SmaI将连到表达载体上的质粒进行单酶切，酶切体系为：45μL重组质粒、8μL的10×TBuffer、4μL的Sma Ⅰ、4μL的BSA，用水补足80μL体系；30℃温育3小时，之后取1μL的酶切产物，电泳检测是否完全切开。
确定切开后进行酚-氯仿抽提，实验步骤如下：
1)在线性化质粒体系中加入120μL ddH2O，再加入200μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)；充分震荡后，10000rpm，常温离心10min；
2)使用无RNA酶的枪头转移上清液160μL于RNA-free的离心管中，加入0.5μLGenElute LPA，20μL 3M NaAc(pH＝5.2)、400μL100％乙醇，轻轻混合后，-20℃沉淀2小时；
3)4℃，14000rpm，离心30min；
4)弃上清，加1mL 80％乙醇洗沉淀，离心5min，弃乙醇，风干沉淀；
5)加7μL DEPC水溶解沉淀，取0.5μL电泳检测。理想的结果应该是单一的非常亮的带。
在检测正确的基础上，利用mMESSAGE MmachineT7进行cRNA的合成，实验步骤如下：
1)在另取的无RNA酶的1.5mL离心管中分别加入下列试剂，使体系达到20μL：10μL的T72×NTP/CAP，2μL的T710×Reaction Buffer，6μL的线性化质粒模板和2μL的Enzymemix；充分混匀后，37℃温育2h；
2)向体系中分别加入30μL的RNA-free水和30μL的氯化锂溶液；充分混匀后，4℃静置过夜；
3)4℃，12000rpm，离心30min；
4)弃上清，加1mL 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心5min，弃乙醇，风干沉淀；
5)加8μL DEPC水溶解沉淀，取1μL稀释五倍，一半用来电泳检测，一半用来测定含量。
实施例4、TORC-2基因感知温度和气味的功能研究
将合成好的TORC-2基因cRNA稀释到2μg/μL，以50nL的量注射到健康且成熟的爪蟾卵母细胞中，注射好的细胞存放于18℃恒温培养箱中培养。培养2-3天后，利用双电极电压钳进行记录温度及气味刺激卵母细胞产生的反应，记录在OC-725C oocyte clamp，具体数据的获取和分析则是利用仪器Digidata 1440A和软件pCLAMP 10.2。
卵母细胞培养基、洗液、灌流缓冲液的制备：蒸馏水、抽滤瓶等提前灭菌，称取NaCl：56.1g、KCl：1.5g、MgCl2·6H2O：10.2g、HEPES：11.9g，灭菌水定容至1L，即10×Ringer，NaOH调节PH至7.6，抽滤备用。四环素、链霉素、庆大霉素及丙酮酸钠用灭菌水分别配成50mg/ml、100mg/ml、10mg/ml、275mg/ml的贮备液，CaCl2·2H2O配成60mm的100×CaCl2贮备液。爪蟾卵母细胞洗液由10×Ringer 100ml、1ml庆大霉素贮备液定容到1L后抽滤待用。爪蟾卵母细胞培养基由10×Ringer 100ml、100×CaCl210ml、马血清50ml、四环素贮备液1ml、链霉素贮备液1ml及丙酮酸钠贮备液2ml灭菌水定容到1L后抽滤待用。灌流缓冲液(1×Ringer)组分与洗液基本相同，但灌流液中每升加入10ml 100×CaCl2贮备液。
卵母细胞对各待测气味不同浓度及温度的反应利用GraphPadPrism 5.0进行作图分析。待测气味包括异硫氰酸烯丙酯(Allylisothiocyanate，AITC)、肉桂醛(cinnamaldehyde，CA)、香矛醛(Citronellal)，原液先用DMSO溶解成1M的储备液，在使用前再根据具体使用浓度进行稀释。
对于热刺激，当温度从20℃升到所需最高热刺激温度时，立即停止热刺激，使用20℃的缓冲液灌流，直到细胞状态回到基线的位置再进行下一次的刺激。注射TORC-2基因cRNA的爪蟾卵母细胞对温度刺激的反应如图3所示，对照爪蟾卵母细胞对20-40℃的热刺激仅产生<100nA的电流(图3A)，而表达TORC-2的卵母细胞能够被20-40℃逐渐增高的热刺激激活，产生的平均电流为600nA左右(图3B-C)。此外给予表达TORC-2卵母细胞两次连续的热刺激时，产生的电流强度不存在差异，即TORC-2对于热刺激没有钝化现象。在研究反应强度与温度梯度的关系中，我们发现在卵母细胞中表达的TORC-2对热刺激的反应强度是随着温度的增高而增强，反应在45℃时反应达到最大，20-25℃的热刺激能够明显激活TORC-2(图3D-E)。数据用mean±SEM表示(n≧8)，数据的统计用单因素方差分析。
对于化学刺激，每种化合物灌流1min，灌流结束后用缓冲液冲洗，直到细胞状态回到基线的位置再进行下一次的刺激。对于ATTC、CA和Citronellal这三种化合物从低到高连续9个浓度的剂量反应分析。注射TORC-2基因cRNA的爪蟾卵母细胞对化学刺激的反应如图4所示，TORC-2对高浓度10-3的三种气味化合物均产生反应，电流值较小。
实施例5、AITC、CA和Citronellal三种气味挥发物对绿盲蝽的行为分析
绿盲蝽对AITC(异硫氰酸烯丙酯)、CA(肉桂醛)和Citronellal(香茅醛)三种化合物的行为反应通过下述试验方法进行。取绿盲蝽的成虫(♀:♂＝1:1)作为试验材料。实验在有机玻璃盒(35cm×22cm×4.5cm)中进行，有机玻璃盒每隔5cm有一透明隔板，实验过程中只留中间两块隔板，绿盲蝽置于中间5cm长，
22cm宽的两块隔板中间区域。有机玻璃盒两端各均匀放置三张滤纸片(～1cm×1cm)，将10uL气味滴加到滤纸片上，并各覆上面积稍大的滤纸片。实验开始后拔掉中间的隔板，并盖上盖子。15min后统计有效范围的虫数，有效范围为靠近两端10cm长、22cm宽的区域。对照组两端滴加DMSO，处理组一端滴加DMSO，另一端滴加气味(处理组需要对调气味及DMSO的放置位置)。每次投放10头虫子，有效虫数≧30头为一次重复，至少做3次生物学重复。三种化合物溶于DMSO，稀释为1％、10％两个浓度。利用AI(Avoid Index)进行统
计，AI＝(对照-处理)/(对照+处理)，利用T-test进行显著性分析。
AITC、CA和Citronellal三种气味挥发物对绿盲蝽行为的分析如图5所示，DMSO对照组中绿盲蝽的AI值趋近于0，然而使用不同浓度的不同气味处理的实验组中，1％CA、10％CA及1％Citronellal对绿盲蝽有显著的趋避作用，10％Citronellal则对绿盲蝽有极显著的趋避作用。因此，CA及Citronellal两种化合物可能成为绿盲蝽的候选趋避剂。

Claims (9)

1.一种绿盲蝽温度气味受体蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述绿盲蝽温度气味受体蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求4所述表达载体的不可再生宿主。
6.含有权利要求2或3所述基因的不可再生转化植物细胞。
7.权利要求1所述绿盲蝽温度气味受体蛋白在制备杀虫剂中的应用。
8.权利要求1所述绿盲蝽温度气味受体蛋白在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
9.权利要求2或3所述基因在杀虫剂制备中作为靶标的应用。
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