CN104523831A - 一种丹参叶提取物的制备方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种丹参叶提取物的制备方法及检测方法，该制备方法是以田间废弃物丹参叶为原料，使用乙醇于10～30℃浸泡提取、喷雾干燥而得的产品，其方法简单，环保安全，有效成分保留完全，含量稳定，成本低廉，适合工业化生产；该检测方法包括性状、成分检测和含量检测项目中的部分或全部，成分检测是以丹参素、丹酚酸A和丹酚酸B为对照品，采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方法进行鉴别，含量测定是用高效液相色谱法对丹酚酸B进行含量测定，所采用的成分检测方法专属性强，含量测定准确度高，保证了所得到的提取物所含有的成分稳定可靠，其主要有效成分丹酚酸B的含量有具体的数据，使制得的丹参叶提取物更有质量保证。

Description

一种丹参叶提取物的制备方法及检测方法

技术领域

本发明涉及一种丹参提取物的制备方法及检测方法，特别涉及一种丹参叶提取物的制备方法及检测方法。

背景技术

丹参始载于《神农本草经》，列为上品，“一味丹参，功同四物”(地黄、当归、白芍、川芎)，传统医药认为：丹参集养血、活血、化瘀、止痛、生新血于一体，功效显著且性味平和，有补有散，无毒副作用，丹参具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神的功效。不少中药处方中均有丹参配伍使用，丹参中的主要有效成分丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，是目前研究较多的丹酚酸之一，对心、脑、肝、肾等器官均具有重要药理作用，丹酚酸B具有很强的抗氧化作用。体内外实验证明，丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，其作用强度高于维生素C、维生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一,对心脑血管疾病也有良好的疗效，另外，其在保健品和化妆品中也有很重要的作用，因其用途越来越多，所以其需求量也越来越大。

丹参一般以其根入药，其叶一般作为牛羊饲料或者直接作为废弃物在田间烧掉，造成巨大的浪费甚至污染环境。但近年来，人们发现丹参叶中也含有不少有效成分，其含有的丹参素、丹酚酸A和丹酚酸B等都是药品、保健品和化妆品行业很有用的物质，所以丹参叶中有效成分的提取越来越受到人们的关注。

但是，丹参叶中的主要有效成分丹酚酸B的热稳定性不高，在高于60℃的温度下10分钟左右即损失80％以上，所以普通的提取方法达不到提取丹参叶中的有效成分来加以利用的目的。目前，丹参叶中有效成分丹酚酸B的提取方法还存在很大的难度，如提取过程中有效成分损失很大、提取后无法制成高浓度干品、提取过程太繁琐、提取过程有易燃易爆危险等。

发明内容

本发明的目的是提供一种丹参叶提取物的制备方法及检测方法，该制备方法能有效利用作为牛羊饲料或者废弃物的丹参叶提取出价值极高的丹酚酸B，变废为宝，避免了浪费，还可降低因大量的燃烧引起的环境污染，并且，该提取方法能够有效的保持主要有效成分丹酚酸B的活性，扩大产量，也减少了成本，而检测方法针对丹参茎叶的提取物进行成分检测和含量检测，以此有效的监测丹参叶提取物的产量及活性。

本发明采用的技术方案如下：

丹参叶提取物的制备方法：

取丹参叶，粉碎成粗粉，置渗滤罐中，取粗粉重量4～6倍的30～70％乙醇，加入渗滤罐至乙醇液面高出丹参叶粗粉1～10厘米，于10～30℃浸泡20～50小时，以每分钟40～100ml的速度放出渗滤液，同时将剩余乙醇从以同样的速度向粗粉中加入，收集渗滤液，滤过，滤液于45～55℃减压回收乙醇，制成相对密度为1.05～1.15的丹参叶清膏，用真空喷雾干燥器于80～90℃喷雾干燥，收集干膏粉，得丹参叶提取物。

其中：所述的乙醇用量优选粗粉重量的5倍。

所述乙醇的浓度优选50％。

所述浸泡的温度优选25℃。

所述浸泡时间优选35小时。

所述减压回收温度优选50℃。

所述真空喷雾干燥温度优选85℃。

本发明所述的丹参叶提取物的检测方法，该检测方法含性状、成分检测、含量检测项目的部分或全部，其中：

性状：应为黄棕色至棕褐色的颗粒；

成分检测：以丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品制成对照品溶液，以梯度洗脱的方法记录色谱图进行高效液相色谱法鉴别；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比＝23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A(％)：0～13，流动相B(％)：100～87

20～35分钟，流动相A(％)：13～21，流动相B(％)：87～79

35～60分钟：流动相A(％)：21～32，流动相B(％)：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，应分别呈现与参照物色谱保留时间相应的色谱峰；

含量检测：以丹酚酸B为对照品，用高效液相色谱法进行测定；

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:乙腈:甲酸:水的体积比＝3O:10:1:59为流动相，检测波长为286nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液,；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含丹酚酸B(C₃₆H₃₀O₁₆)不得少于10％。

为了确保本发明的制备方法和检测方法科学、合理、可行，本申请人对方法中成分检测、含量检测进行了研究，具体实验资料如下：

(一)提取工艺的研究：

为了考察提取工艺的条件，申请人设计了正交试验，乙醇浓度分别为30％、50％、70％，提取时间(浸泡、渗滤的时间)分别为20小时、35小时、50小时，提取溶剂量(乙醇)分别为丹参茎叶粗粉的4倍、5倍、6倍，共进行了9次试验，分别考察收得的总干膏粉和含丹酚酸B的总量。

表1           正交试验计划表

表2            总干膏粉的正交试验分析表

	A	B	C
				Ⅰ	717	718	664
Ⅱ	777	785	851
				Ⅲ	726	717	705
K1	239	239	221
				K2	259	262	284
K3	242	239	235
				R	20	23	65

结论：据表2分析，C因素提取溶剂量(乙醇)对总干膏粉收率的影响最大，其次是提取时间，第三是乙醇浓度，从试验结果得出，较好的因素水平组合为：乙醇浓度50％、提取时间为35小时，提取溶剂量5倍。

表3          含丹酚酸B的总量的正交试验分析表

	A	B	C
				Ⅰ	23921	22802	23700
Ⅱ	23422	23455	24288
				Ⅲ	24594	25680	23949
K1	7974	7601	7900
				K2	7807	7818	8096
K3	8198	8560	7983
				R	391	959	196

结论：据表3分析，提取时间对丹酚酸B的提取量的影响最大，其次是乙醇浓度，第三是提取溶剂量(乙醇)，从试验结果得出，较好的因素水平组合为：乙醇浓度70％、提取时间为50小时，提取溶剂量为5倍。

综合分析：

乙醇浓度：乙醇浓度分别为30％、50％、70％，乙醇浓度对总干膏粉的收率影响不大，但是含丹酚酸B的总量以乙醇浓度为70％最高，从消防安全和节约溶剂的角度出发，再考虑到乙醇浓度高一些便于降低浓缩温度和缩短浓缩时间，以乙醇浓度为50％为最佳。

提取时间：考察时间分别为20小时、35小时、50小时，对总干膏粉的提取量影响不大，但是时间太长或者太短对丹酚酸B的提取量有影响，所以，以提取时间35小时为最佳。

提取溶剂量(乙醇)：考察的提取溶剂量分别为4倍、5倍、6倍，因为丹参茎叶干粉比较松泡，为了让溶剂能全部浸泡丹参茎叶干粉和节约能源和溶剂，以提取溶剂量(乙醇)5倍为最佳。

(二)成分检测：

成分检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比＝23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A(％)：0～13，流动相B(％)：100～87

20～35分钟，流动相A(％)：13～21，流动相B(％)：87～79

35～60分钟：流动相A(％)：21～32，流动相B(％)：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率59KHZ)15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，分别呈现有与参照物色谱保留时间相应的色谱峰。

(三)含量检测：

照高效液相色谱法测定：

指标成分的选择：参照丹参的成分分析，因丹酚酸B是其主要有效成分之一，所以我们选定丹酚酸B为指标成分之一，采用高效液相色谱法对丹酚酸B进行含量测定。

1.仪器与试药

SHIMADZU SPD-10AVP型高效液相色谱仪，UV762型双光束紫外分光光度计，FA2004电子分析天平，甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂为分析纯，对照品为中检所提供。

2.检测波长的选择

检测波长为286nm，用紫外检测器检测，并通过如下实验确认：取丹酚酸B对照品的甲醇溶液，在200～600nm波长处进行扫描测定，最大吸收波长与中国药典丹酚酸B的测定波长(286nm)是一致的。

3.流动相的选择

选择甲醇：乙腈：甲酸：水的体积比＝3O:10:1:59为流动相；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流速：1.0ml/min；

柱温：26℃。

4.供试溶液的制备

4.1对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

4.2样品溶液的制备

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率59KHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

4.3提取溶剂的考察

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇、75％甲醇、甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率59KHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，测定，计算，结果见表4。

表4             提取溶剂考察结果

提取溶剂	50％甲醇	75％甲醇	甲醇
				丹酚酸B含量(mg/ml)	0.511	0.518	0.492

由表4可知，以75％甲醇为提取溶剂，提取效率优于50％甲醇、甲醇，因此提取溶剂以75％甲醇为最佳。

4.4提取方法的研究

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，一份超声处理(功率120W，频率59KHZ)20分钟，另一份置水浴中加热回流20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算，结果见表5。

表5                  提取方法的考察

提取方法	回流提取	超声提取
			丹酚酸B含量(mg/ml)	0.516	0.517

由表5分析，两种方法提取含量几无差异，因此选用功率120W，频率59KHZ的超声处理进行提取，方法简单。

4.5提取时间的考察

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率59KHZ)10分钟、20分钟、30分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算，结果见表6。

表6                提取时间的考察

提取时间(分钟)	10	20	30
				丹酚酸B含量(mg/ml)	0.502	0.518	0.518

由表6分析，选择提取时间为20分钟为最佳。

5.耐用性试验

5.1稳定性试验

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率120W，频率59KHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，室温下保存，取对照品溶液及供试品溶液分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，按含量测定方法测定，结果见表7。

表7                 稳定性试验结果

放置时间(H)	0	2	4	6	8
						含量(mg/ml)	0.517	0.516	0.518	0.518	0.516

由表7可知，对照品溶液与供试品溶液在配制后8小时内测定，结果稳定。

5.2不同比例的流动相

实验曾以甲醇：乙腈：甲酸：水(体积比)＝3O:10:2:58、甲醇：乙腈：甲酸：水(体积比)＝25:15:1:59、甲醇：乙腈：甲酸：水(体积比)＝3O:10:1:59为流动相，流速：1.0ml/min，以SHIMADZUC₁₈柱(5μm，4.6×250mm)为分析柱，柱温26℃，进行试验研究，均能达到满意的分离，测定结果分别为0.519、0.517、0.516，RSD为0.29％。

5.3不同的色谱分析柱

实验曾用SHIMADZU C₁₈柱(5μm，4.6×250mm)、ZIVCHROMI柱(5μ，4.6×150mm)与KromsilC₁₈柱(5μm，4.6×150mm)为分析柱，以甲醇：乙腈：甲酸：水(体积比)＝3O:10:1:59为流动相，测定结果分别为0.506、0.514、0.519，RSD为1.28％。

综上，该方法的耐用性较好。

流动相的比例略作变化，丹酚酸B与其他组分均能达到基线分离，系统适应性好，分别用SHIMADZU、ZIVCHROMI和Kromsil三种品牌的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，丹酚酸B与其他组分均能达到基线分离，系统适应性好。

6.含量测定方法学研究

6.1标准曲线与线性范围

精密称取丹酚酸B对照品28.3147mg，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；分别精密量取该溶液1ml、3ml、5ml、7ml、9ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。丹酚酸B分别为11.32588ug、33.97764ug、56.6294ug、79.28116ug、101.93292ug，作为供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液各10μl，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，结果见表8。

表8                丹酚酸B对照品线性范围考察

对照品浓度C(μg/ml)	11.32588	33.97764	56.6294	79.28116	101.93292
						峰面积A	535949	1607917	2679786	3751541	4823517

丹酚酸B浓度在11.32588～101.93292μg/ml范围内与峰面积呈很好的线性关系，回归方程及相关系数：A＝473.213C－144.0953,γ＝0.9998(C为丹酚酸B浓度，单位μg/ml，A为峰面积)；

6.2重复性试验

按本发明的含量测定方法，取样品共6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表9。

表9               重复性试验结果

由表9可知，RSD＝1.71％，表明重复性良好。

6.3精密度

从同批本品样品中，同时取样5份，按本发明的含量测定方法，分别制备样品供试液测定。统计各样的含量和平均含量、RSD，见表10。

表10              精密度考察结果

从表10分析可知，精密度较好。

6.4样品测定

按照拟定的测定方法对三批样品(批号为091001、091002、091003)的丹酚酸B含量进行了测定，每批平行测定2次，结果表11。

表11                丹酚酸B含量测定结果

本发明的有益效果：

一、针对丹参叶中的主要有效成分丹酚酸B的热稳定性不高，在高于60℃的温度下很容易损失的特点，用沸点较低、溶解度好的30～70％乙醇为提取溶剂，在10～30℃浸泡提取，减压回收乙醇的浓缩方法，然后进行喷雾干燥，最大限度地减少了丹酚酸B受热损失，制成的丹参叶提取物有效成分保留完全且产品含量较高，使丹参叶提取物中丹酚酸B的含量达到12％以上，几乎是常规方法的3倍，并且很好地保留了丹酚酸A、丹参素等其它有效成分，满足了医药卫生方面的需求。

二、本发明方法简单，成本低廉，提取过程没有大型设备，只需要在常温下浸泡提取即可，整个过程不需加热，没有能耗，低碳环保，安全方便，所用乙醇浓度较低，安全可靠，完全适合工业化生产，克服了丹酚酸B在提取和浓缩过程中被大量破坏、提取过程加热能耗大、提取过程太繁琐、成本较高等缺限。

三、丹参叶不再作为牛羊饲料或者废弃物在田间被烧掉，而是被充分利用起来，变废为宝，不仅保护了环境，也增加了农民的收入。

四、本发明对使用该提取方法制备的丹参叶中的有效成分丹参素、丹酚酸A和丹酚酸B采用高效液相色谱法以梯度洗脱的方法记录其特征色谱图进行鉴别检测，保证合格产品中有效成分丹参素、丹酚酸A和丹酚酸B能保留完全，能保证因为工艺不稳定或者其它原因导致成分不全的产品被发现，另外，还用高效液相色谱法测定其主要有效成份丹酚酸B的含量，使用该分成检测和含量检测方法，保证了所得到的提取物所含有的成分稳定可靠，其主要有效成分丹酚酸B的含量有具体的数据，使制得的丹参茎叶提取物更有质量保证。

具体实施方式

实施例1：

丹参叶提取物的制备方法：

取丹参叶300kg，粉碎成粗粉，置渗滤罐中，取30％乙醇1200kg，加入渗滤罐至乙醇液面高出丹参叶粗粉1～10厘米，于10℃浸泡20小时，以每分钟40～100ml的速度放出渗滤液，同时将剩余乙醇从以同样的速度向粗粉中加入，收集渗滤液，滤过，滤液于45℃减压回收乙醇，制成相对密度为1.05～1.15的丹参叶清膏，用真空喷雾干燥器于80℃喷雾干燥，收集干膏粉，得丹参叶提取物60.4kg。

检测方法：

性状：应为黄棕色至棕褐色的颗粒或粉末；

成分检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比＝23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A(％)：0～13，流动相B(％)：100～87

20～35分钟，流动相A(％)：13～21，流动相B(％)：87～79

35～60分钟：流动相A(％)：21～32，流动相B(％)：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，分别呈现与参照物色谱保留时间相应的色谱峰；

(2)含量检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:乙腈:甲酸:水的体积比＝3O:10:1:59为流动相，检测波长为286nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液,；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

丹酚酸B的含量为12.2％。

实施例2：

丹参叶提取物的制备方法：

取丹参叶300kg，粉碎成粗粉，置渗滤罐中，取70％乙醇1800kg，加入渗滤罐至乙醇液面高出丹参叶粗粉1～10厘米，于30℃浸泡50小时，以每分钟40～100ml的速度放出渗滤液，同时将剩余乙醇从以同样的速度向粗粉中加入，收集渗滤液，滤过，滤液于55℃减压回收乙醇，制成相对密度为1.05～1.15的丹参叶清膏，用真空喷雾干燥器于90℃喷雾干燥，收集干膏粉，得丹参叶提取物65.9kg。

检测方法：

性状：应为黄棕色至棕褐色的颗粒或粉末；

(1)成分检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比＝23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A(％)：0～13，流动相B(％)：100～87

20～35分钟，流动相A(％)：13～21，流动相B(％)：87～79

35～60分钟：流动相A(％)：21～32，流动相B(％)：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，分别呈现与参照物色谱保留时间相应的色谱峰；

(2)含量检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:乙腈:甲酸:水的体积比＝3O:10:1:59为流动相，检测波长为286nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液,；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

丹酚酸B的含量为12.3％。

实施例3：

丹参叶提取物的制备方法：

取丹参叶300kg，粉碎成粗粉，置渗滤罐中，取50％乙醇1500kg，加入渗滤罐至乙醇液面高出丹参叶粗粉1～10厘米，25℃浸泡35小时，以每分钟40～100ml的速度放出渗滤液，同时将剩余乙醇从以同样的速度向粗粉中加入，收集渗滤液，滤过，滤液于50℃减压回收乙醇，制成相对密度为1.05～1.15的丹参叶清膏，用真空喷雾干燥器于85℃喷雾干燥，收集干膏粉，得丹参叶提取物80.7kg。

检测方法：

性状：应为黄棕色至棕褐色的颗粒或粉末；

(1)成分检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比＝23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A(％)：0～13，流动相B(％)：100～87

20～35分钟，流动相A(％)：13～21，流动相B(％)：87～79

35～60分钟：流动相A(％)：21～32，流动相B(％)：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，分别呈现与参照物色谱保留时间相应的色谱峰；

(2)含量检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:乙腈:甲酸:水的体积比＝3O:10:1:59为流动相，检测波长为286nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液,；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

丹酚酸B的含量为12.8％。

Claims (8)

1. 一种丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：

取丹参叶，粉碎成粗粉，置渗滤罐中，取粗粉重量4～6倍的30～70%乙醇，加入渗滤罐至乙醇液面高出丹参叶粗粉1～10厘米，于10～30℃浸泡20～50小时，以每分钟40～100ml的速度放出渗滤液，同时将剩余乙醇从以同样的速度向粗粉中加入，收集渗滤液，滤过，滤液于45～55℃减压回收乙醇，制成相对密度为1.05～1.15的丹参叶清膏，用真空喷雾干燥器于80～90℃喷雾干燥，收集干膏粉，得丹参叶提取物。

2. 根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述的乙醇用量为粗粉重量的5倍。

3.根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述乙醇的浓度为50%。

4.根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述浸泡的温度为25℃。

5. 根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述浸泡时间为35小时。

6. 根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述减压回收温度为50℃。

7.根据权利要求1所述的丹参叶提取物的制备方法，其特征在于：所述真空喷雾干燥温度为85℃。

8.一种权利要求1至7任意一项所述的丹参叶提取物的检测方法，该检测方法包括性状、检查、成分检测和含量检测项目中的部分或全部，其特征在于：

（1）成分检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以甲醇:水:甲酸的体积比=23:57:1为流动相B，按照下述方式进行梯度洗脱，流动相A与流动相B之比以体积百分比计，流速为每分钟1ml，柱温为30℃，检测波长为280nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000；

0～20分钟，流动相A（%）： 0～13，流动相B（%）：100～87

20～35分钟，流动相A（%）：13～21，流动相B（%）：87～79

35～60分钟：流动相A（%）：21～32，流动相B（%）：79～68

取本品0.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理15分钟，放冷，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取丹参素对照品、丹酚酸A对照品、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素20μg、丹酚酸A10μg、丹酚酸B100μg的溶液，即得对照品溶液；

分别精密吸取供试品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60分钟色谱图，即得；

供试品色谱图中，应分别呈现与参照物色谱保留时间相应的色谱峰；

（2）含量检测：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇:乙腈:甲酸:水的体积比=3O:10:1:59为流动相，检测波长为286nm，理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000；

取丹酚酸B对照品，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得对照品溶液；

取本品0.4g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，在功率为120W，频率为59KHZ的条件下超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液,；

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。