CN104379602B - 具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了修饰的抗‑EGFR抗体及编码修饰的抗‑EGFR抗体的核酸分子。本发明还提供了使用抗‑EGFR抗体的治疗方法和应用。

Description

具有条件活性的抗表皮生长因子受体抗体及其使用方法
相关申请
要求美国临时申请序列号61/685,089的优先权，该申请题目为“ConditionallyActive anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies and Methods of UseThereof”，申请日为2012年3月8日。
此申请涉及美国专利申请第13/815,553号，申请日与本文相同，题目为“Conditionally Active anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibodies andMethods of Use Thereof，”其要求美国临时申请序列号61/685,089的优先权。
此申请还涉及Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、GregoryI.Frost、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、Ge Wei和Lei Huang的，题目为“METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVETHERAPEUTIC PROTEINS”的，申请日为2011年9月27日的美国专利申请第13/200,666号，其是Lalitha Kodandapani、Louis Howard Bookbinder、Gregory I.Frost、Philip LeeSheridan、Harold Michael Shepard、Ge Wei和Lei Huang的，题目为“METHODS FORASSESSING AND IDENTIFYING OR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTICPROTEINS”的，申请日为2011年9月27日的国际申请第PCT/US11/50891号的部分连续申请，其要求Lalitha Kodandapani、Philip Lee Sheridan、Harold Michael Shepard、LouisH.Bookbinder和Gregory I.Frost的，题目为“METHODS FOR ASSESSING AND IDENTIFYINGOR EVOLVING CONDITIONALLY ACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS AND CONDITIONALLYACTIVE THERAPEUTIC PROTEINS”的，申请日为2010年9月8日的美国临时申请序列号61/402,979的优先权。
上述各申请的主题通过引用全文并入。
通过引用并入的电子序列表
在此提交电子版的序列表，其内容通过引用全文并入。该电子文件制备于2013年3月8日，大小为1237千字节，题目为3104seqPC1.txt。
发明领域
本文提供了具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体，及编码具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体的核酸分子。本文还提供了使用所述具有条件活性的抗-EGFR抗体的治疗方法。
背景技术
抗-EGFR抗体在临床中用于治疗和诊断人体疾病，例如癌症。例如，示例性的治疗性抗体包括西妥昔单抗。西妥昔单抗被许可用于治疗复发或转移的头颈癌、结肠直肠癌及其它疾病和病症。其也可用于治疗涉及EGFR过表达或者EGFR信号或活化异常的其它疾病或病症。所施用的抗-EGFR抗体在健康细胞和组织中可以结合EGFR。这样限制了可以施用的剂量。因此，当给患者施用时，西妥昔单抗及其它抗-EGFR抗体呈现出受限性。因此，本文的目的是提供改良的抗-EGFR抗体。
发明概述
本文提供了具有条件活性的抗-表皮生长因子受体(EGFR)抗体及其抗原结合片段。所述抗体及其片段是具有条件活性的，因此其在靶组织如具有酸性pH的肿瘤微环境中与在非靶组织如具有大约7-7.2的中性pH的非肿瘤组织环境如在皮肤基底层中相比呈现出更高的活性。通常地，用作抗肿瘤疗法的抗-EGFR抗体结合EGFR受体并抑制基于配体结合发生的EGFR-介导的活性。结果，其可抑制或治疗肿瘤。由于除了肿瘤之外的组织如皮肤中组织也表达EGFR，因此抗-EGFR抗体抑制这些受体的活性，从而导致不希望的副作用。本文提供的抗体是具有条件活性的，其在非肿瘤微环境(例如中性pH)中呈现的活性与非具有条件活性的抗体相比和/或与其在肿瘤微环境中的活性相比降低。凭借对肿瘤微环境的选择性，其呈现出较少或较小的不希望的副作用和/或由于可以使用较高剂量而呈现出改良的效力。
本文提供了抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其在肿瘤微环境条件下是具有条件活性的，其中在肿瘤环境条件下与在非肿瘤环境条件下相比，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出对人表皮生长因子受体(EGFR)或其可溶片段的结合活性至少3.0的比率。在这样的实例中，肿瘤环境条件含有5.6-6.8或大约5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度两者或两者之一，及蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL；非肿瘤环境条件含有7.0-7.8或大约7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度两者或两者之一，及蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL。例如，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出在pH为5.6-6.8或大约5.6-6.8的肿瘤微环境条件下与在pH为7.0-7.8或大约7.0-7.8的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在另一实例中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出在pH为6.0-6.5或大约6.0-6.5的肿瘤微环境条件下与在pH大约7.4的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在一些情况中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出在乳酸盐浓度为5mM-20mM或大约5mM-20mM的肿瘤微环境条件下与在乳酸盐浓度为0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的非肿瘤微环境条件下的活性比率。在本文特别的实例中，权利要求1-4任一项的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出在pH为6.0-6.5及乳酸盐浓度为10mM-20mM的肿瘤微环境条件下与在pH为7.0-7.4及乳酸盐浓度为0.5mM-2mM的非肿瘤微环境条件下的活性比率。
在任何这样的实例中，存在或者在存在蛋白质浓度为10mg/mL-50mg/mL或大约10mg/mL-50mg/mL的条件下存在所述结合活性比率，其中所述蛋白质浓度在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下基本相同或相同。例如，所述蛋白质浓度为至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL。所述蛋白质可以是血清白蛋白，如人血清白蛋白。所述蛋白质是在血清如人血清中提供的。例如，血清的浓度是20％(vol/vol)-90％(vol/vol)、20％(vol/vol)-50％(vol/vol)或者20％(vol/vol)-40％(vol/vol)，例如其低于90％(vol/vol)，大约为或者至少为或者为20％(vol/vol)、25％(vol/vol)、30％(vol/vol)、35％(vol/vol)、40％(vol/vol)、45％(vol/vol)或50％(vol/vol)。在特别的实例中，在含有血清浓度如人血清浓度为低于为大约25％(vol/vol)的条件下存在所述活性比率。
在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何上述实例中，所述结合活性比率是在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比的活性比率，其在能测量或评估与人EGFR或其可溶片段的结合活性的任何测定中确定。例如，结合活性是在固相结合测定中体外确定的。所述固相结合测定可以是免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)。在这样的实例中，所述结合活性是对结合的分光光度测量，所述结合活性比率是浓度抗体相同，在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比的结合的分光光度测量的比率，例如抗体浓度为1ng/mL-100ng/mL或大约1ng/mL-100ng/mL。
在其它实例中，结合活性是使用生物传感器确定的解离常数(KD)，并且如果在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比亲和性高至少3倍，则所述抗体或其抗原结合片段呈现出的比率为至少3。在这样的实例中，抗-EGFR抗体或其抗原结合片段典型地在肿瘤微环境中具有解离常数(KD)低于1x10-8M、5×10-9M、1x10-9M、5×10-10M、1×10-10M、5×10-11M、1×10-11M或更低。在进一步的实例中，结合活性是使用生物传感器确定的解离速率(off-rate)，如果在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比解离速率减慢至少3倍，则所述抗体或其抗原结合片段呈现出的比率为至少3。在任何这样的使用生物传感器的实例中，所述生物传感器可以是Biacore传感器或者Octet传感器，或者本领域技术人员已知的其它相似的生物传感器。
在本文进一步的实例中，结合活性是在表达EGFR的肿瘤微环境中或者在表达EGFR的非肿瘤微环境中在对象中体内评估的。在这样的实例中，所述非肿瘤微环境是表达人EGFR的皮肤基底层。这种体内结合活性可以在非人动物对象中确定，其中所述肿瘤微环境是表达人EGFR的人肿瘤异种移植物，非肿瘤微环境是表达人EGFR的人皮肤异种移植物。例如，所述人肿瘤异种移植物是A431异种移植物。在这样的实例中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可以荧光标记，在这两种条件下的结合活性以荧光信号强度确定，所述荧光信号强度确定可以根据对照IgG标准化。
在本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述活性比率为至少3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更高。
在本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段含有可变重链和轻链，所述可变重链与其最接近的人VH基因节段种系序列呈现至少56％的序列相同性，所述轻链与其最接近的人VL基因节段种系序列呈现出至少75％序列相同性。
例如，本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其含有：可变重链(VH)，其具有SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1118、1124-1126、1128-1130、1134-1137或1146-1152所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1118、1124-1126、1128-1130、1134-1137、或1146-1152所示的序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列；及可变轻链(VL)，其具有SEQ ID NO：4、10、1138-1145、1153-1159或1186所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4、10、1138-1145、1153-1159或1186所示的序列具有至少85％序列相同性的氨基酸序列。
例如，本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其含有：
a)SEQ ID NO：495或者与SEQ ID NO：495呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
b)SEQ ID NO：1062或者与SEQ ID NO：1062呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
c)SEQ ID NO：1112或者与SEQ ID NO：1112呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
d)SEQ ID NO：1114或者与SEQ ID NO：1114呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
e)SEQ ID NO：1115或者与SEQ ID NO：1115呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
f)SEQ ID NO：1116或者与SEQ ID NO：1116呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
g)SEQ ID NO：1117或者与SEQ ID NO：1117呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
h)SEQ ID NO：1124或者与SEQ ID NO：1124呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
i)SEQ ID NO：1125或者与SEQ ID NO：1125呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
j)SEQ ID NO：1126或者与SEQ ID NO：1126呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
k)SEQ ID NO：1128或者与SEQ ID NO：1128呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
l)SEQ ID NO：1129或者与SEQ ID NO：1129呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
m)SEQ ID NO：1130或者与SEQ ID NO：1130呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
n)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
o)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1139或者与SEQ ID NO：1139呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
p)SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
q)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1140或者与SEQ ID NO：1140呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
r)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1141或者与SEQ ID NO：1141呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
s)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
t)SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
u)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1143或者与SEQ ID NO：1143呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
v)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
w)SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
x)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
y)SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
z)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
aa)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
bb)SEQ ID NO：1147或者与SEQ ID NO：1147呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
cc)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
dd)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ee)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1155或者与SEQ ID NO：1155呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ff)SEQ ID NO：1151或者与SEQ ID NO：1151呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
gg)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
hh)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ii)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
jj)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
kk)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ll)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
mm)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
nn)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
oo)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
pp)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
qq)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1158或者与SEQ ID NO：1158呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
rr)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ss)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
tt)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
uu)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
vv)SEQ ID NO：1118或者与SEQ ID NO：1118呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：4或10或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链。
33.权利要求31或32的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中序列相同性为至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％或更高。
本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是抗体或其抗原结合片段，其能在哺乳动物细胞中表达，所述细胞含有编码所述抗体的核酸，所述抗体的浓度为至少1mg/mL，例如至少1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL或更高。
本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是这样的抗体，其是修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。例如，本文提供的具有条件活性抗-EGFR抗体是这样的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段，其是不呈现出这种具有条件活性或者呈现粗较低程度具有条件活性的抗-EGFR抗体的变体。因此，本文提供的抗体是修饰形式的治疗性抗体，特指西妥昔单抗及西妥昔单抗的其它变体，如其人源化形式及其它形式(见例如公开的国际PCT申请号WO2011059762、WO2005056606A2、WO2006009694、WO2010080463、WO2012020059、WO2008152537、WO9640210及美国专利号7,060,808、7,723,484和7,930,107，这些专利描述了抗-EGFR抗体)。因此，未修饰的抗体可以是西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段和变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR(见例如在任何公开的国际PCT申请号WO2011059762、WO2005056606A2、WO2006009694、WO2010080463、WO2012020059、WO2008152537、WO9640210和美国专利号7,060,808、7,723,484和7,930,107及其它同族申请/专利中描述的那些抗-EGFR抗体)。所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环境中是具有条件活性的。
所述具有条件活性的抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段包括在未修饰的抗体的可变重链、可变轻链或者这二者中或者在其抗原结合片段的这种区域中具有氨基酸置换的那些抗体。在一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。在特定的实例中，在除了pH不同之外相同的条件下测量时，在pH6.0-pH 6.5或大约pH 6.0-pH 6.5与在pH 7.4或大约pH7.4相比，所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段可呈现出与EGFR的结合活性至少2.0的比率。在一些实例中，在相同条件下测量时，所述修饰的抗-EGFR抗体在pH 7.4与未修饰的抗体在pH7.4相比呈现出低于40％的EGFR结合活性，条件是所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段不包括：a)可变重链，其包括选自N31I、N31V、V50L、Y59E和T64N的氨基酸置换；或者b)可变轻链，其包括氨基酸置换L4C。
在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其片段的任何实例中，在相同条件下测量时，所述修饰的抗-EGFR抗体在pH 6.0-pH 6.5或大约pH 6.0-pH6.5与未修饰的抗体在pH 6.0-pH 6.5相比呈现出至少20％的EGFR结合活性。
在所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段的任何实例中，所述可变重链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的氨基酸置换的氨基酸置换：HC-V24E、HC-V24I、HC-V24L、HC-S25C、HC-S25H、HC-S25R、HC-S25A、HC-S25D、HC-S25G、HC-S25M、HC-S25Q、HC-S25V、HC-S25L、HC-S28C、HC-L29H、HC-N31H、HC-G54D、HC-G54S、HC-F63R、HC-F63C、HC-F63M、HC-F63P、HC-F63S、HC-T64V、HC-L67G、HC-D72L、HC-D72P、HC-D72W、HC-N73Q、HC-K75H、HC-K75G、HC-K75P、HC-K75W、HC-S76I、HC-S76V、HC-Q77E、HC-T100P、HC-Y104D、HC-Y104S、HC-Y104V、HC-Q111I、HC-Q111V。对应的氨基酸位置可以通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定。所述其部分可以足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。在一些实例中，所述修饰的可变轻链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的氨基酸置换的氨基酸置换：LC-L4F、LC-L4V、LC-T5P和LC-R24G。对应的氨基酸位置可以通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定，且所述其部分可以是足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段还包括具有未修饰的抗体的可变轻链的互补决定区(CDR)L2中一或多个氨基酸残基的氨基酸置换的那些抗体。在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段中，可变轻链或其部分可包括对应选自如下的对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸残基的氨基酸置换的氨基酸置换：LC-A51T、LC-A51L、LC-S52A、LC-S52C、LC-S52D、LC-S52E、LC-S52G、LC-S52I、LC-S52M、LC-S52Q、LC-S52V、LC-S52W、LC-S52R、LC-S52K、LC-E53G、LC-S54M、LC-I55A、LC-I55F、LC-S56G、LC-S56L、LC-S56A、LC-S56C、LC-S56D、LC-S56E、LC-S56F、LC-S56N、LC-S56P、LC-S56Q、LC-S56V、LC-S56W、LC-S56H、LC-S56R和LC-S56K。所述其部分可以足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。在本文提供的任何修饰的抗-EGFR抗体及其片段的一些实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环境中是具有条件活性的。
所述修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段还包括任何这样的抗体，其包括未修饰的抗体的可变重链(VH)、可变轻链(VL)或者这二者中氨基酸置换。在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。所述VH链中的氨基酸置换残基可以出现在对应选自参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的例如26、36、66、69、75、93、94、109、110、111和112位置的氨基酸残基的氨基酸位置，对应的氨基酸位置通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定。在一些实例中，所述VL链中氨基酸置换可出现在对应选自参照SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的29、48、51、52、53、55、56、86和98位置的氨基酸残基的氨基酸位置，对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定。在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其片段的一些实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段在肿瘤微环境中是具有条件活性的。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是任何这样的抗体，其中可变重链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸残基的氨基酸置换的氨基酸置换：G26H、G026R、G026D、G026F、G026M、G026N、G026P、G026Q、G026S、G026Y、G026L、W036K、W036A、W036I、W036V、W036Y、R066L、R066A、R066C、R066E、R066F、R066N、R066P、R066Q、R066S、R066T、R066V、R066G、I069A、I069C、I069G、I069Y、K075H、K075R、K075L、K075A、K075C、K075E、K075F、K75G、K075M、K75P、K075Q、K075T、K075V、K075W、K075Y、Y093H、Y093V、Y093W、Y094R、Y094L、W109I、W109M、W109Y、G110R、G110A、G110M、G110P、G110T、Q111K、Q111H、Q111R、Q111L、Q111D、Q111E、Q111G、Q111I、Q111M、Q111P、Q111S、Q111T、Q111V、Q111W、Q111Y、G112A、G112N、G112P、G112S、G112T和HC-G112Y，且所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换；和/或所述可变轻链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO：4所示的残基的氨基酸置换的氨基酸置换：I029A、I029E、I029F、I029S、I029T、I029R、I048M、I048S、I048L、I048K、A051T、A051L、S052A、S052C、S052D、S052E、S052G、S052I、S052M、S052Q、S052V、S052W、S052R、S052K、E53G、I055A、I055F、S056G、S056L、S056A、S056C、S056D、S056E、S056F、S056N、S056P、S056Q、S056V、S056W、S056H、S056R、S056K、Y086F、Y086M、Y086H、F098A、F098M、F098S、F098V和F098Y，且所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
在本文的任何实例中，修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段在pH 6.0或pH 6.5与在pH 7.4或大约pH 7.4相比的结合活性比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.0或更高。在本文的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段在pH 6.0-pH 6.5或大约pH 6.0-pH 6.5与在pH 7.4或大约pH7.4相比当在除了pH不同之外的相同条件下测量时呈现出至少2.0倍的更高的EGFR结合活性。
在本文的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在pH7.4与包括如SEQ ID NO：3所示的可变重链及如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的可变轻链的西妥昔单抗抗体对应的形式在pH 7.4相比可以呈现出降低的EGFR结合活性，结合活性是在相同条件下测量的。例如，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可呈现出低于西妥昔单抗抗体对应的形式的结合活性的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或更低的结合活性。
在本文的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在pH6.0-6.5或大约pH 6.0-6.5与包括如SEQ ID NO：3所示的可变重链及如SEQ ID NO：4或SEQID NO：10所示的可变轻链的西妥昔单抗抗体对应的形式在pH 7.4相比可呈现出增加的EGFR结合活性，结合活性是在相同条件下测量的。例如，修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可呈现出高于西妥昔单抗抗体对应的形式的结合活性的110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、500％或更高的结合活性。
本文提供的抗-EGFR抗体还包括修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包括在未修饰的抗体的可变重链(VH)、可变轻链(VL)或者这二者中的氨基酸置换。在一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或者其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。所述VH链或者其部分可包括对应选自如下参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的氨基酸置换的一或多个氨基酸置换：T023H、T023R、T023C、T023E、T023G、T023I、T023M、T023N、T023P、T023S、T023V、T023W、T023L、V024R、V024F、V024G、V024I、V024M、V024P、V024S、V024T、V024L、S025H、S025R、S025A、S025D、S025E、S025F、S025G、S025I、S025M、S025P、S025Q、S025T、S025V、S025L、G026H、G026R、G026D、G026F、G026M、G026N、G026P、G026Q、G026S、G026Y、G026L、F027H、F027R、F027A、F027D、F027E、F027M、F027P、F027Q、F027S、F027T、F027V、F027W、F027Y、F027L、S028K、S028H、S028R、S028A、S028D、S028I、S028M、S028P、S028Q、S028V、S028W、S028L、L029K、L029H、L029A、L029D、L029G、L029M、L029N、L029S、L029V、T030H、T030R、T030D、T030G、T030I、T030M、T030N、T030P、T030V、T030W、T030Y、N031K、N031H、N031E、N031G、N031L、Y032H、Y032C、Y032M、Y032N、Y032T、Y032V、Y032L、G033M、G033S、G033T、V034A、V034C、V034I、V034M、V034P、H035I、H035Q、W036K、W036A、W036I、W036V、W036Y、V050K、V050H、V050A、V050D、V050G、V050T、I051K、I051H、I051E、I051N、I051Y、I051L、W052I、W052N、S053H、S053R、S053A、S053C、S053G、S053I、S053M、S053P、S053L、S053V、S053Y、G054H、G054R、G054A、G054C、G054D、G054P、G054S、G055R、G055M、G055S、G055Y、N056K、N056P、N056V、T057H、T057R、T057L、T057C、T057F、T057M、T057N、T057Q、T057W、T057Y、D058L、D058G、D058M、D058Q、Y059R、Y059D、Y059I、Y059T、Y059V、N060K、N060C、N060F、N060G、N060P、N060Q、N060S、N060T、N060Y、T061N、T061Q、P062G、F063H、F063R、F063A、F063C、F063D、F063G、F063M、F063N、F063Q、F063S、T064R、T064L、T064C、T064F、T064G、T064Q、T064V、S065H、S065R、S065L、S065C、S065E、S065F、S065I、S065M、S065N、S065P、S065Q、S065T、S065W、S065Y、R066L、R066A、R066C、R066E、R066F、R066N、R066P、R066Q、R066S、R066T、R066V、R066G、L067A、L067C、L067D、L067E、L067I、L067M、L067Q、L067S、L067T、L067Y、S068K、S068H、S068R、S068L、S068C、S068D、S068E、S068F、S068G、S068I、S068N、S068Q、S068V、I069A、I069C、I069G、I069Y、N070H、N070R、N070L、N070D、N070E、N070F、N070G、N070I、N070P、N070Q、N070V、N070Y、K071H、K071R、K071L、K071C、K071F、K071G、K071Q、K071S、K071T、K071W、K071Y、D072K、D072H、D072R、D072L、D072A、D072G、D072I、D072M、D072N、D072Q、D072S、D072V、D072W、D072Y、N073H、N073R、N073L、N073A、N073C、N073G、N073I、N073M、N073P、N073Q、N073S、N073V、N073W、N073Y、S074K、S074H、S074R、S074L、S074C、S074D、S074E、S074G、S074I、S074M、S074P、S074T、S074V、S074Y、K075H、K075R、K075L、K075A、K075C、K075E、K075F、K075M、K075Q、K075T、K075V、K075W、K075Y、S076H、S076R、S076L、S076A、S076C、S076D、S076E、S076F、S076M、S076P、S076Q、S076T、S076Y、Q077H、Q077R、Q077L、Q077A、Q077E、Q077G、Q077I、Q077M、Q077N、Q077V、Q077W、Q077Y、Y093H、Y093V、Y093W、Y094R、Y094L、R097H、R097W、A098P、L099N、L099W、T100H、T100L、T100I、T100N、T100P、T100Q、T100S、T100V、T100Y、Y101H、Y101E、Y101F、Y101M、Y102R、Y102D、Y102I、Y102N、Y102W、D103R、D103L、D103A、D103I、D103Q、D103Y、D103P、Y104H、Y104L、Y104D、Y104F、Y104I、Y104M、Y104S、Y104V、E105H、E105T、F106L、F106V、F106W、A107K、A107H、A107R、A107L、A107E、A107G、A107N、A107S、A107T、A107Y、A107D、Y108K、Y108H、Y108R、Y108L、Y108I、Y108N、Y108S、Y108T、Y108V、Y108W、W109I、W109M、W109Y、G110R、G110A、G110M、G110P、G110T、Q111K、Q111H、Q111R、Q111L、Q111D、Q111E、Q111G、Q111M、Q111P、Q111S、Q111T、Q111W、Q111Y、G112A、G112N、G112P、G112S、G112T、G112Y、V24E、S28C、F63P、L67G、D72P、K75G、K75P、S76I、S76V、Q111I和Q111V，对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定的，且所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。在一些实例中，所述VL链或其部分包括对应选自如下参照SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的氨基酸置换的氨基酸置换：D001W、I002V、I002W、L003D、L003F、L003G、L003S、L003W、L003Y、L003R、L004E、L004F、L004I、L004P、L004S、L004T、L004V、L004W、L004K、L004H、L004R、T005A、T005D、T005E、T005F、T005G、T005N、T005S、T005W、T005L、T005K、T005H、T005R、R024A、R024C、R024F、R024L、R024M、R024S、R024W、R024Y、A025G、S026A、S026C、S026I、S026M、S026N、S026V、S026W、S026L、S026G、S026H、S026R、Q027A、Q027D、Q027I、Q027M、Q027N、Q027P、S028A、S028D、S028N、S028Q、S028L、S028K、S028H、I029A、I029E、I029F、I029S、I029T、I029R、G030E、G030I、G030P、G030V、G030L、T031A、T031F、T031G、T031M、T031S、T031W、T031L、T031K、T031H、N032G、I033F、I033G、I033M、I033T、I033V、I033H、I048M、I048S、I048L、I048K、K049A、K049E、K049G、K049N、K049Q、K049S、K049T、K049V、K049L、K049H、K049R、A051T、A051L、S052A、S052C、S052D、S052E、S052G、S052I、S052M、S052Q、S052V、S052W、S052R、S052K、E053G、S054M、I055A、I055F、S056G、S056L、S056A、S056C、S056D、S056E、S056F、S056N、S056P、S056Q、S056V、S056W、S056H、S056R、S056K、Y086F、Y086M、Y086H、Y087L、Y087C、Y087D、Y087F、Y087G、Y087I、Y087N、Y087P、Y087T、Y087V、Y087W、Y087K、Y087H、Y087R、Q089E、N091A、N091I、N091M、N091S、、N091T、N091V、N091H、N091R、N092D、N092S、N092T、N092V、N092W、N092R、N093T、T096M、T096V、T097V、F098A、F098M、F098S、F098V、F098Y、G099L、G099D、G099E、G099F、G099I、G099M、G099N、G099S、G099T、G099V、G099K、G099H、Q100C、Q100D、Q100E、Q100F、Q100I、Q100M、Q100N、Q100P、Q100T、Q100V、Q100W、Q100Y、Q100K、Q100H和Q100R，对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定的，且所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，可变重链或其部分可包括选自如下的氨基酸置换：V024I、V024E、V024L、S025C、S025G、S025I、S025Q、S025T、S025L、S025V、F027R、T030F、Y032T、S053G、G054R、G054C、G054P、D058M、F063R、F063C、F063G、F063M、D072K、D072M、D072W、D072L、S074H、S074R、S074D、S074G、S074Y、K075H、K075W、Q077R、N091V、R097H、T100I、Y104D、Y104F、F027R、L029S、R097H和Q111P；和/或所述可变轻链或其部分可包括氨基酸置换L4V或I29S。
在本文特别的实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段中，所述可变重链或其部分可包括选自如下的氨基酸置换：V24E、V24I、V24L、S25C、S25H、S25R、S25A、S25D、S25G、S25M、S25Q、S25V、S25L、S28C、L29H、N31H、G54D、G54S、F63R、F63C、F63M、F63P、F63S、T64V、L67G、D72L、D72P、D72W、N73Q、K75H、K75G、K75P、K75W、S76I、S76V、Q77E、T100P、Y104D、Y104S、Y104V、Q111I、Q111V，且可以进一步包括氨基酸置换V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D和Q111P。所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在可变重链、可变轻链或者这二者中可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸置换。例如，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段含有至少两个在不包含所述氨基酸置换并特异性结合EGFR西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体中的氨基酸置换，其中所述VH链中氨基酸置换对应选自参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的氨基酸置换V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D和Q111P，其中对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定的；所述VL链中氨基酸置换对应参照SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的氨基酸置换I29S，其中对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定的。例如，抗-EGFR抗体或其抗原结合片段含有氨基酸置换HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Y104D、HC-Y104D/LC-I29S、HC-Y104D/HC-Q111P/LC-I29S、HC-S53G/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-Y104D、HC-S25V/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-Y104D、HC-T30F/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-D72L/HC-Y104D、HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D、HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Q111P、HC-V24E/HC-F27R/HC-R97H/HC-Q111P、HC-S25C/LC-I29S或者HC-Q111P/LC-I29S。在任何这样的实例中，修饰的抗-EGFR抗体或其片段呈现出在大约pH 6.0-pH 6.5与在大约pH 7.4的EGFR结合活性比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.0或更高。
在特定的实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体或其片段呈现出的在或大约在pH 6.0-pH 6.5与在或大约在pH 7.4的EGFR结合活性比率为至少2.0，通常为至少3.0或更高。在这种实例中，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包括氨基酸置换Y104D。例如，所述氨基酸置换是HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-Y104D、HC-S25V/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-Y104D、HC-T30F/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-D72L/HC-Y104D、HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D或者HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P。
在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体包含：a)重链，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列，及轻链，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列；或者b)重链，其具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列，及轻链，其具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。
在本文提供的任何实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包括其中未修饰的西妥昔单抗是人源化变体的那些抗体。例如，在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述未修饰的西妥昔单抗包括SEQ ID NO：28所示的可变重链及SEQ ID NO：29所示的可变轻链。
在本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。例如，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。
在本文提供的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述未修饰的西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体是其抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。例如，所述未修饰的西妥昔单抗可以是Fab片段，其包含具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：5呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列的轻链。
本文提供了修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包括：a)可变重链(VH)，其如SEQ ID NO：31-32、35-57、59-85、87-112、114-125、127-131、133-134、138-139、141-149、148-168、170、174、176-177、180、182、186-189、191-198、200、202-205、207-210、212-216、218、220-224、226、228-236、238-240、243、246、250-251、253、255、257-268、270-277、279-283、285-292、294-322、324-336、338-352、355-359、361-366、368-394、396-402、404-448、450-465、467-477、479、481-483、485-487、489-505、507-510、512-523、525-557、1062、1063、1093、1098-1107和1112-1113中任一或者与SEQ ID NO：31-32、35-57、59-85、87-112、114-125、127-131、133-134、138-139、141-149、148-168、170、174、176-177、180、182、186-189、191-198、200、202-205、207-210、212-216、218、220-224、226、228-236、238-240、243、246、250-251、253、255、257-268、270-277、279-283、285-292、294-322、324-336、338-352、355-359、361-366、368-394、396-402、404-448、450-465、467-477、479、481-483、485-487、489-505、507-510、512-523、525-557、1062、1063、1093、1098-1107和1112-1113中任一呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示，且包括所述氨基酸置换；和/或b)可变轻链(VL)，其如SEQ ID NO：558、560-565、568-570、572-583、585-603、605、608-609、611-621、624-627、629-641、643、645、647、649-650、652、656-660、662-678、680-685、687-733、735-741、743、745-751、753、756-759、764-768、775、778-809、810、812-817、820-822、824-835、837-855、857、860-861、863-873、876-879、881-893、895、897、899、901-902、904、908-912、914-930、932-937、939-985、987-993、995、997-1003、1005、1008-1011、1016-1020、1027、1030-1061任何序列或者与SEQ ID NO：558、560-565、568-570、572-583、585-603、605、608-609、611-621、624-627、629-641、643、645、647、649-650、652、656-660、662-678、680-685、687-733、735-741、743、745-751、753、756-759、764-768、775、778-809、810、812-817、820-822、824-835、837-855、857、860-861、863-873、876-879、881-893、895、897、899、901-902、904、908-912、914-930、932-937、939-985、987-993、995、997-1003、1005、1008-1011、1016-1020、1027、1030-1061呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示，且包括所述氨基酸置换。
在一些实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包含：a)可变重链(VH)，其如SEQ ID NO：31-32、35-57、59-85、87-112、114-125、127-131、133-134、138-139、141-149、148-168、170、174、176-177、180、182、186-189、191-198、200、202-205、207-210、212-216、218、220-224、226、228-236、238-240、243、246、250-251、253、255、257-268、270-277、279-283、285-292、294-322、324-336、338-352、355-359、361-366、368-394、396-402、404-448、450-465、467-477、479、481-483、485-487、489-505、507-510、512-523、525-557、1062、1063、1093、1098-1107和1112-1113中任一或者与SEQ ID NO：31-32、35-57、59-85、87-112、114-125、127-131、133-134、138-139、141-149、148-168、170、174、176-177、180、182、186-189、191-198、200、202-205、207-210、212-216、218、220-224、226、228-236、238-240、243、246、250-251、253、255、257-268、270-277、279-283、285-292、294-322、324-336、338-352、355-359、361-366、368-394、396-402、404-448、450-465、467-477、479、481-483、485-487、489-505、507-510、512-523、525-557、1062、1063、1093、1098-1107和1112-1113中任一呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示；及b)可变轻链(VL)，其如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10或者与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示。
在一些实例中，修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包含：a)可变重链(VH)，其如SEQ ID NO：3或者与SEQ ID NO：3呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示；及b)可变轻链(VL)，如SEQ ID NO：558、560-565、568-570、572-583、585-603、605、608-609、611-621、624-627、629-641、643、645、647、649-650、652、656-660、662-678、680-685、687-733、735-741、743、745-751、753、756-759、764-768、775、778-809、810、812-817、820-822、824-835、837-855、857、860-861、863-873、876-879、881-893、895、897、899、901-902、904、908-912、914-930、932-937、939-985、987-993、995、997-1003、1005、1008-1011、1016-1020、1027、1030-1061中任一或者与SEQ ID NO：558、560-565、568-570、572-583、585-603、605、608-609、611-621、624-627、629-641、643、645、647、649-650、652、656-660、662-678、680-685、687-733、735-741、743、745-751、753、756-759、764-768、775、778-809、810、812-817、820-822、824-835、837-855、857、860-861、863-873、876-879、881-893、895、897、899、901-902、904、908-912、914-930、932-937、939-985、987-993、995、997-1003、1005、1008-1011、1016-1020、1027、1030-1061中任一呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示，且包括所述氨基酸置换。
在具有条件活性的抗-EGFR抗体(包括修饰的抗-EGFR抗体，如本文所述其含有对应重链中Y104D的氨基酸置换并且呈现出结合活性至少2.0的比率)的特别实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段含有：可变重链(VH)，其具有SEQ ID NO：495、1062、1112、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130或1131所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：495、1062、1112、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130或1131呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列；及可变轻链(VL)，其包含SEQ ID NO：4或10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列。例如，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段含有可变重链(VH)，其含有SEQ ID NO：1062或1125所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：1062或1125呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列；及可变轻链(VL)，其包含SEQ ID NO：4或10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4或10呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列。
在本文的任何实例中，所述抗-EGFR或其抗原结合片段是人源化的。典型地，在这种实例中，所述抗-EGFR或其抗原结合片段保留条件活性及在肿瘤微环境与非肿瘤微环境相比呈现的活性比率为至少2.0，通常为至少3.0或更高。在本文提供的人源化抗体的一些情况中，所述可变重链与SEQ ID NO：3所示的可变重链相比呈现低于85％序列相同性及高于65％序列相同性；及所述可变轻链与SEQ ID NO：4所示的可变轻链呈现出低于85％序列相同性及高于65％序列相同性。示例性的这种抗体是含有如下氨基酸序列的任何抗体：
a)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
b)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1139或者与SEQ ID NO：1139呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
c)SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
d)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1140或者与SEQ ID NO：1140呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
e)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1141或者与SEQ ID NO：1141呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
f)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
g)SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
h)SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1143或者与SEQ ID NO：1143呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
i)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
j)SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
k)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
l)SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
m)SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
n)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
o)SEQ ID NO：1147或者与SEQ ID NO：1147呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
p)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
q)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
r)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1155或者与SEQ ID NO：1155呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
s)SEQ ID NO：1151或者与SEQ ID NO：1151呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
t)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
u)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
v)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
w)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
x)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
y)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
z)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
aa)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
bb)SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
cc)SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
dd)SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1158或者与SEQ ID NO：1158呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ee)SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
ff)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
gg)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链；
hh)SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的序列所示的可变重链，及SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示的可变轻链。
在本文提供的任何实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体，是全长IgG抗体。例如，具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体，可包括重链恒定区及轻链恒定区，所述重链恒定区如SEQ ID NO：22-25、1069和1070中任一或者与其呈现至少75％序列相同性的变体所示，所述轻链恒定区如SEQ ID NO：1072-1073中任一或者与其呈现至少75％序列相同性的变体所示。
在本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体机器抗原结合片段，的任何实例中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。在一些实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是Fab或scFv。
在本文的任何实例中，本文与参考序列或SEQ ID NO(例如修饰的抗-EGFR抗体或未修饰的西妥昔单抗的氨基酸序列)呈现序列相同性的本文提供的氨基酸序列与其呈现出至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性。序列相同性可以使用具有或不具有缺口的整体比对而确定。
在本文提供的具有条件活性抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的任何实例中，所述抗体或抗原结合片段还可包括选自如下的氨基酸置换：a)可变重链中的氨基酸置换，其对应选自如下的参照SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸位置的氨基酸置换：在位置1的谷氨酰胺(Q)由谷氨酸(E)置换、Q1C、V2C、Q3T、Q3C、L4C、K5Q、K5V、K5L、K5C、Q6E、Q6C、S7C、G8C、P9A、P9G、P9C、G10V、G10C、L11C、V12C、Q13K、Q13R、Q13C、P14C、S15G、S15T、S15C、Q16G、Q16R、Q16E、Q16C、S17T、S17C、L18C、S19K、S19R、S19T、S19C、I20L、I20C、T21S、T21C、T23A、T23K、T23C、V24A、V24C、S25C、F27G、S28N、S28T、L29I、T30S、T30K、N31V、N31D、N31I、N31T、N32S、Y32R、Y32W、G33A、G33D、G33E、G33Y、V34L、V34N、V34E、V34Q、V34S、V34W、H35S、V37I、S40A、S40P、P41T、G44A、L48V、L48I、G49S、G49A、V50L、V50Q、V50E、V50I、V50Y、V50N、I51G、I51M、I51S、I51Q、I51A、I51C、I51V、W52F、W52Y、W52G、W52T、S53Q、S53T、S53N、S53Y、G54A、G54V、G54L、G54I、G54S、G55D、G55A、G55E、G55H、G55F、N56A、N56G、N56S、N56T、T57A、T57D、T57G、T57S、T57E、T57P、D58Y、D58N、Y59A、Y59C、Y59E、Y59F、Y59G、Y59S、Y59W、T59H、Y59P、Y59Q、N60D、N60A、T61E、T61P、P62S、F63L、F63V、T64K、T64E、T64A、T64N、T64D、S65G、L67F、L67V、S68T、N70S、N70T、K71V、D72E、N73T、S74A、S76N、Q77T、Q77S、V78L、V78F、V78A、F79Y、F79S、F79V、F80L、F80M、K81Q、K81T、K81E、K81Q、M82L、N83T、N83S、S84N、L85M、L85V、Q86R、Q86D、Q86T、S87A、S87P、N88E、N88V、N88G、N88A、N88D、I92T、I92V、A96C、R97C、A98C、L99C、L99E、T100D、T100C、T100A、Y101C、Y101W、Y101A、Y102C、Y102F、Y102A、Y102W、D103E、D103P、D103C、Y104C、E105C、E105N、E105D、E105Y、F106C、F106D、F106Y、A107C、A107D、Y108C和Y108F，对应的氨基酸位置通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定；和/或b)可变轻链中的氨基酸置换，其对应选自如下的参照SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸位置的氨基酸置换：在位置1的天冬氨酸(D)由谷氨酸(E)置换、D1C、I2T、I2C、L3V、L3T、L3C、L4C、T5C、Q6C、S7C、P8C、V9C、V9A、V9D、V9G、V9P、V9S、I10T、I10S、I10F、I10C、L11Q、L11C、S12A、S12C、V13L、V13M、V13S、V13A、V13C、S14T、S14C、P15V、P15L、P15C、G16K、G16C、E17D、E17K、E17C、R18V、R18K、R18C、V19A、V19T、V19C、S20T、S20C、S20A、F21I、F21L、F21C、S22T、S22C、R24P、A25V、A25S、A25I、A25P、A25T、A25Y、A25C、A25F、A25M、A25L、A25W、S26D、Q27W、Q27E、Q27F、Q27Y、Q27T、Q27H、S28R、S28F、G30Y、G30C、G30H、G30K、G30Q、G30R、G30W、G30F、G30T、G30M、G30S、G30A、T31E、T31V、T31D、T31R、N32H、I33L、H34C、Q38K、R39K、T40P、T40S、N41G、N41D、G42Q、G42K、G42E、S43A、S43P、R45K、K49Y、K49F、Y50G、S53V、S60D、S60A、G64S、G64A、D70E、D70V、F71Y、S74T、N76S、N76T、S77R、S77G、V78L、E79Q、S80P、S80A、E81A、I83F、I83S、I83V、I83A、D85V、D85T、D85I、D85M、Y87S、Q89C、Q89H、Q90C、N91C、N91Q、N91L、N92C、N92L、N92R N92K、N92M、N92Y、N92H、N92E、N92F、N93A、N93D、N93E、N93V、N93K、N93C、W94F、W94Y、P95C、T96C、T96L、T96E、T97C、T97A、T97D、T97E、T97P、T97K、T97N、T97Q、T97I、T97G、T97L、T97H、T97R、T97S、G99A、A100G、A100Q、K103T、L104V和L106I，对应的氨基酸位置通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定；和/或c)重链恒定区中的氨基酸置换，选自如下根据EU索引编号的氨基酸置换：在位置230的脯氨酸(P)由丙氨酸(A)置换、E233D、L234D、L234E、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243LF243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、S267T、S267H、S267D、S267N、E269H、E269Y、E269F、E269R、E269T、E269L、E269N、D270Q、D270T、D270H、E272S、E272K、E272I、E272Y、V273I、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276S、N276E、N276R、N276L、N276Y、Y278T、Y278E、Y278K、Y278W、E283R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、S298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、V302I、W313F、E318R、K320T、K320D、K320I、K322T、K322H、V323I、S324T、S324D、S324R、S324I、S324V、S324L、S324Y、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、K326L、K326I、K326T、A327N、A327L、A327D、A327T、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、A330S、A330W、A330M、P331V、P331H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y、I332A、E333T、E333H、E333I、E333Y、K334I、K334T、K334F、T335D、T335R、T335Y、D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225E、T225K、T225W、P227E、P227K、P227Y、P227G、P228E、P228K、P228Y、P228G、P230E、P230Y、P230G、A231E、A231K、A231Y、A231P、A231G、P232E、P232K、P232Y、P232G、E233N、E233Q、E233K、E233R、E233S、E233T、E233H、E233A、E233V、E233L、E233I、E233F、E233M、E233Y、E233W、E233G、L234K、L234R、L234S、L234A、L234M、L234W、L234P、L234G、L235E、L235K、L235R、L235A、L235M、L235W、L235P、L235G、G236D、G236E、G236N、G236Q、G236K、G236R、G236S、G236T、G236H、G236A、G236V、G236L、G236I、G236F、G236M、G236Y、G236W、G236P、G237D、G237E、G237N、G237Q、G237K、G237R、G237S、G237T、G237H、G237V、G237L、G237I、G237F、G237M、G237Y、G237W、G237P、P238D、P238E、P238N、P238Q、P238K、P238R、P238S、P238T、P238H、P238V、P238L、P238I、P238F、P238M、P238Y、P238W、P238G、S239Q、S239K、S239R、S239V、S239L、S239I、S239M、S239W、S239P、S239G、F241D、F241E、F241Y、F243E、K246D、K246E、K246H、K246Y、D249Q、D249H、D249Y、R255E、R255Y、E258S、E258H、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262E、V262F、V264D、V264E、V264N、V264Q、V264K、V264R、V264S、V264H、V264W、V264P、V264G、D265Q、D265K、D265R、D265S、D265T、D265H、D265V、D265L、D265I、D265F、D265M、D265Y、D265W、D265P、S267E、S267Q、S267K、S267R、S267V、S267L、S267I、S267F、S267M、S267Y、S267W、S267P、H268D、H268E、H268Q、H268K、H268R、H268T、H268V、H268L、H268I、H268F、H268M、H268W、H268P、H268G、E269K、E269S、E269V、E269I、E269M、E269W、E269P、E269G、D270R、D270S、D270L、D270I、D270F、D270M、D270Y、D270W、D270P、D270G、P271D、P271E、P271N、P271Q、P271K、P271R、P271S、P271T、P271H、P271A、P271V、P271L、P271I、P271F、P271M、P271Y、P271W、P271G、E272D、E272R、E272T、E272H、E272V、E272L、E272F、E272M、E272W、E272P、E272G、K274D、K274N、K274S、K274H、K274V、K274I、K274F、K274M、K274W、K274P、K274G、F275L、N276D、N276T、N276H、N276V、N276I、N276F、N276M、N276W、N276P、N276G、Y278D、Y278N、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278H、Y278V、Y278L、Y278I、Y278M、Y278P、Y278G、D280K、D280L、D280W、D280P、D280G、G281D、G281K、G281Y、G281P、V282E、V282K、V282Y、V282P、V282G、E283K、E283H、E283L、E283Y、E283P、E283G、V284E、V284N、V284T、V284L、V284Y、H285D、H285E、H285Q、H285K、H285Y、H285W、N286E、N286Y、N286P、N286G、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290N、K290H、K290L、K290W、P291D、P291E、P291Q、P291T、P291H、P291I、P291G、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293N、E293R、E293S、E293T、E293H、E293V、E293L、E293I、E293F、E293M、E293Y、E293W、E293P、E293G、E294K、E294R、E294S、E294T、E294H、E294V、E294L、E294I、E294F、E294M、E294Y、E294W、E294P、E294G、Q295D、Q295E、Q295N、Q295R、Q295S、Q295T、Q295H、Q295V、Q295I、Q295F、Q295M、Q295Y、Q295W、Q295P、Q295G、Y296K、Y296R、Y296A、Y296V、Y296M、Y296G、N297Q、N297K、N297R、N297T、N297H、N297V、N297L、N297I、N297F、N297M、N297Y、N297W、N297P、N297G、S298D、S298E、S298Q、S298K、S298R、S298I、S298F、S298M、S298Y、S298W、T299D、T299E、T299N、T299Q、T299K、T299R、T299L、T299F、T299M、T299Y、T299W、T299P、T299G、Y300D、Y300E、Y300N、Y300Q、Y300K、Y300R、Y300S、Y300T、Y300H、Y300A、Y300V、Y300M、Y300W、Y300P、Y300G、R301D、R301E、R301H、R301Y、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304N、S304T、S304H、S304L、V305E、V305T、V305Y、K317E、K317Q、E318Q、E318H、E318L、E318Y、K320N、K320S、K320H、K320V、K320L、K320F、K320Y、K320W、K320P、K320G、K322D、K322S、K322V、K322I、K322F、K322Y、K322W、K322P、K322G、S324H、S324F、S324M、S324W、S324P、S324G、N325K、N325R、N325S、N325F、N325M、N325Y、N325W、N325P、N325G、K326P、A327E、A327K、A327R、A327H、A327V、A327I、A327F、A327M、A327Y、A327W、A327P、L328D、L328Q、L328K、L328R、L328S、L328T、L328V、L328I、L328Y、L328W、L328P、L328G、P329D、P329E、P329N、P329Q、P329K、P329R、P329S、P329T、P329H、P329V、P329L、P329I、P329M、P329Y、P329W、P329G、A330E、A330N、A330T、A330P、A330G、P331D、P331Q、P331R、P331T、P331L、P331I、P331F、P331M、P331Y、P331W、I332K、I332R、I332S、I332V、I332F、I332M、I332W、I332P、I332G、E333L、E333F、E333M、E333P、K334P、T335N、T335S、T335H、T335V、T335L、T335I、T335F、T335M、T335W、T335P、T335G、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337N、S337H、S298A、K326A、K326S、K326N、K326Q、K326D、K326E、K326W、K326Y、E333A、E333S、K334A、K334E、Y300I、Y300L、Q295K、E294N、S298N、S298V、S298D、D280H、K290S、D280Q、D280Y、K290G、K290T、K290Y、T250Q、T250E、M428L、M428F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、V264I、V264T、V264Y、E272Y、K274E、Y278T、N297D、T299A、T299V、T299I、T299H、K326T、L328A、L328H、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N和I332Q。
本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可以免疫特异性结合EGFR。
本文还提供了缀合物，其含有与靶向剂直接或间接连接的本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。所述缀合物可含有如下成分：(Ab)、(L)q和(靶向剂)m，其中：
Ab是结合EGFR的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，
L是连接Ab与靶向剂的接头，
m是至少为1，如至少1-8，
q是0或更大，如0-8，只要所得缀合物结合EGFR即可，及
所得缀合物结合EGFR。
在本文提供的任何缀合物的实例中，所述靶向剂可以是蛋白质、肽、核酸或者小分子。例如，所述靶向剂是治疗性部分。所述治疗性部分可以是细胞毒性部分、放射性同位素、化疗剂、细胞裂解肽或者细胞因子。本文缀合物中治疗性部分的非限制性实例可以是紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、美登素或其类似物或衍生物、阿里他汀或其功能性肽类似物或衍生物、尾海兔素10或15或其类似物、伊立替康或其类似物、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、卡里奇霉素或其类似物或衍生物、抗代谢物、烷化剂、铂衍生物、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、雷查霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物、抗生素、吡咯[2，1-c][1，4]-苯并二吖庚因(PDB)、毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I，葡萄球菌肠毒素A、及美洲商陆抗病毒蛋白。
例如，所述治疗性部分是美登素衍生物，其是选自安丝菌素或mertansine(DM1)的美登醇。在另一实例中，所述治疗性部分是阿里他汀或其功能性肽类似物或衍生物，其是一甲基阿里他汀E(MMAE)或F(MMAF)。在另一实例中，所述治疗性组分是抗代谢物，选自氨甲喋呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨和克拉屈滨。在另一实例中，所述治疗性部分是烷化剂，选自氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、氮烯唑胺(DTIC)、甲基苄肼和丝裂霉素C。在另一实例中，所述治疗性部分是铂衍生物，其是顺铂或卡铂。在另一实例中，所述治疗性部分是抗生素，选自更生霉素、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、去甲氧基柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素和氨茴霉素(AMC)。在另一实例中，所述治疗性部分是毒素，选自白喉毒素及其活性片段和杂交分子、蓖麻蛋白毒素、霍乱毒素、志贺样毒素、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属外毒素、alorin、皂草素、蒴莲素、gelanin、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素。
在本文提供的缀合物的任何实例中，所述抗体与靶向剂是直接连接的。例如，所述抗体与靶向剂是通过接头连接的。所述接头可以是肽或多肽或者是化学接头。所述接头可以是可裂解接头或不可裂解接头。所述接头可以与抗体上一或多个游离巯基缀合或者可以与一或多个伯胺缀合。
本文提供了核酸分子，其包括编码本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的一或多个重链，的核苷酸序列。本文还提供了核酸分子，其包括编码本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的一或多个轻链，的核苷酸序列。本文还提供了包括本文提供的核酸分子的载体，及包括本文提供的载体的细胞。本文提供的细胞的实例包括原核细胞和真核细胞。
本文提供了组合，其包括本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或抗原结合片段，以及化疗剂。化疗剂可选自烷化剂、亚硝基脲、拓扑异构酶抑制剂和抗体。在一些实例中，化疗剂是与第一种抗体不同的另外的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，所述另外的抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗及其抗原结合片段或其变体。
本文提供了试剂盒，其包括在一或多个容器中的本文提供的抗体或抗原结合片段或者本文提供的组合，以及使用说明书。
本文提供了药物组合物，其包括本文提供的任何具有条件活性的抗-EGFR抗体或抗原结合片段，如本文提供的任何修饰的抗-EGFR抗体或抗原结合片段，及药物可接受的运载体或赋形剂。所述药物组合物还可包括本文提供的任何组合，所述组合包括本文提供的抗体或抗原结合片段及另外的药剂。本文提供的药物组合物可以配制为凝胶、软膏、液体、悬浮液、气雾剂、片剂、药丸、粉末和/或可配制为全身、肠道外、外敷(topical)、口服、粘膜、鼻内、皮下、雾化、静脉内、支气管、肺、阴道、外阴阴道、食管、或者口腔食管(oroesophageal)施用。本文提供的药物组合物可以配制为用于单一剂量施用或者多剂量施用。在一些实例中，本文提供的药物组合物是持续释放配制物。
本文提供了治疗应答抗-EGFR抗体治疗的病症的方法。在一些实例中，所述方法是治疗对象中应答抗-EGFR抗体治疗的病症，包括给对象施用药物有效量的本文提供的任何药物组合物。
本文还提供了治疗应答抗-EGFR抗体治疗的病症的方法。在一些实例中，所述方法用于治疗对象中应答抗-EGFR抗体治疗的病症，包括：a)鉴定具有应答抗-EGFR抗体治疗的病症的对象，所述对象呈现出与施用抗-EGFR抗体相关的副作用；及b)给所述对象施用具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，及修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。在这种实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是修饰的抗体，其包括在未修饰的抗-EGFR抗体的可变重链、可变轻链或这二者中的氨基酸置换，并且所述修饰的抗-EGFR抗体是在肿瘤微环境中具有条件活性的。在一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体是西妥昔单抗、其抗原结合片段或者其变体，其不包括所述氨基酸置换并特异性结合EGFR。
在本文的方法中，在除了pH不同之外相同的条件下测量时，在pH 6.0-pH 6.5或大约pH 6.0-pH 6.5与在pH 7.4或大约pH 7.4相比，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，可呈现出较高的EGFR结合活性比率。在本文的方法中，在除了pH不同之外相同的条件下测量时，在pH 6.0-pH 6.5或大约pH6.0-pH 6.5与在pH 7.4或大约pH 7.4相比，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，可呈现出EGFR结合活性至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0或更高的比率。
在本文方法的一些实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是修饰的抗-EGFR抗体或其片段，其与未修饰的抗体相比，在选自pH 6.0-pH 7.0的pH条件下与在pH7.4下具有较高活性，或者所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段与未修饰的抗体相比，在选自pH 6.0-pH 7.0的pH条件下比在pH 7.4下具有较低活性。
在本文提供的方法中，对于治疗性施用，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，的剂量可根据在肿瘤微环境中其与参考或未修饰抗体的相对活性而调整。因此，所述剂量可以更低(特别是如果在肿瘤微环境中，参考的具有条件活性的抗体(例如修饰的抗体)较参考的或未修饰的抗体活性更高)，更高或者大约相同或者相同。在所述剂量较低的情况中，可由于较低的剂量而减少副作用。在某些方面，呈现出对肿瘤微环境增加的选择性的具有条件活性的抗体可以比现有相似治疗更高的剂量施用，使得效力增加。剂量可以由本领域专业技术人员根据经验容易地确定。
在本文提供的方法的任何实例中，已经施用了所述抗体或其片段的对象是经鉴定在其基底角化细胞中呈现出与抗-EGFR抗体结合EGFR受体相关的副作用的对象。副作用包括但不限于，例如，痤疮样皮疹、丘疹脓包性皮疹、头发生长异常、干痒皮肤和柔性甲周炎、毛细血管扩张、色素沉着、无皮疹瘙痒症、红斑、口腔溃疡、过敏反应、呼吸困难、咳嗽、哮喘、肺炎、低氧血症、呼吸功能不全/衰竭、肺栓塞、胸腔积液和非特异性呼吸紊乱、发热、发冷、无力/不适、粘膜表面问题、恶心、胃肠问题、腹痛、头痛和低镁血症。
在实施本文提供的方法的任何实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是修饰的抗-EGFR或其抗原结合片段。所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的VH链或其部分包括一或多个氨基酸置换，其对应选自如下的参照SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸位置的氨基酸置换：T023K、T023H、T023R、T023A、T023C、T023E、T023G、T023I、T023M、T023N、T023P、T023S、T023V、T023W、T023L、V024R、V024A、V024F、V024G、V024I、V024M、V024P、V024S、V024T、V024L、V024E、S025H、S025R、S025A、S025C、S025D、S025E、S025F、S025G、S025I、S025M、S025P、S025Q、S025T、S025V、S025L、G026H、G026R、G026D、G026F、G026M、G026N、G026P、G026Q、G026S、G026Y、G026L、F027H、F027R、F027A、F027D、F027E、F027G、F027M、F027P、F027Q、F027S、F027T、F027V、F027W、F027Y、F027L、S028K、S028H、S028R、S028A、S028D、S028I、S028M、S028P、S028Q、S028V、S028W、S028L、L029K、L029H、L029A、L029D、L029G、L029I、L029M、L029N、L029S、L029V、T030H、T030R、T030D、T030G、T030I、T030M、T030N、T030P、T030S、T030V、T030W、T030Y、N031K、N031H、N031D、N031E、N031G、N031I、N031T、N031V、N031L、Y032H、Y032R、Y032C、Y032M、Y032N、Y032T、Y032V、Y032L、G033E、G033M、G033S、G033T、G033Y、V034A、V034C、V034I、V034M、V034P、V034L、H035I、H035Q、W036K、W036A、W036I、W036V、W036Y、V050K、V050H、V050A、V050D、V050E、V050G、V050I、V050N、V050Q、V050T、V050L、I051K、I051H、I051A、I051C、I051E、I051G、I051N、I051Q、I051S、I051V、I051Y、I051L、W052I、W052N、W052Y、S053H、S053R、S053A、S053C、S053G、S053I、S053M、S053P、S053Q、S053L、S053T、S053V、S053Y、G054H、G054R、G054A、G054C、G054D、G054P、G054S、G055H、G055R、G055M、G055S、G055Y、N056K、N056A、N056P、N056S、N056V、N056G、T057H、T057R、T057L、T057A、T057C、T057D、T057F、T057M、T057N、T057Q、T057W、T057Y、D058L、D058G、D058M、D058N、D058Q、Y059H、Y059R、Y059A、Y059C、Y059D、Y059E、Y059G、Y059I、Y059P、Y059Q、Y059S、Y059T、Y059V、Y059W、N060K、N060A、N060C、N060D、N060F、N060G、N060P、N060Q、N060S、N060T、N060Y、T061N、T061Q、P062G、F063H、F063R、F063L、F063A、F063C、F063D、F063G、F063M、F063N、F063Q、F063S、F063V、T064R、T064L、T064C、T064F、T064G、T064N、T064Q、T064V、S065H、S065R、S065L、S065C、S065E、S065F、S065G、S065I、S065M、S065N、S065P、S065Q、S065T、S065W、S065Y、R066L、R066A、R066C、R066E、R066F、R066N、R066P、R066Q、R066S、R066T、R066V、R066G、L067A、L067C、L067D、L067E、L067I、L067M、L067Q、L067S、L067T、L067V、L067Y、S068K、S068H、S068R、S068L、S068C、S068D、S068E、S068F、S068G、S068I、S068N、S068Q、S068T、S068V、I069A、I069C、I069G、I069Y、N070H、N070R、N070L、N070D、N070E、N070F、N070G、N070I、N070P、N070Q、N070S、N070T、N070V、N070Y、K071H、K071R、K071L、K071A、K071C、K071F、K071G、K071Q、K071S、K071T、K071V、K071W、K071Y、D072K、D072H、D072R、D072L、D072A、D072G、D072I、D072M、D072N、D072Q、D072S、D072V、D072W、D072Y、N073H、N073R、N073L、N073A、N073C、N073G、N073I、N073M、N073P、N073Q、N073S、N073T、N073V、N073W、N073Y、S074K、S074H、S074R、S074L、S074A、S074C、S074D、S074E、S074G、S074I、S074M、S074P、S074T、S074V、S074Y、K075H、K075R、K075L、K075A、K075C、K075E、K075F、K075M、K075Q、K075T、K075V、K075W、K075Y、S076H、S076R、S076L、S076A、S076C、S076D、S076E、S076F、S076M、S076P、S076Q、S076T、S076Y、Q077H、Q077R、Q077L、Q077A、Q077E、Q077G、Q077I、Q077M、Q077N、Q077S、Q077V、Q077W、Q077Y、Y093H、Y093V、Y093W、Y094R、Y094L、R097H、R097W、A098P、L099N、L099W、T100H、T100L、T100A、T100D、T100I、T100N、T100P、T100Q、T100S、T100V、T100Y、Y101H、Y101E、Y101F、Y101M、Y101W、Y102R、Y102C、Y102D、Y102I、Y102N、Y102W、D103R、D103L、D103A、D103C、D103I、D103P、D103Q、D103Y、Y104H、Y104L、Y104D、Y104F、Y104I、Y104M、Y104S、Y104V、E105H、E105T、F106L、F106V、F106W、F106Y、A107K、A107H、A107R、A107L、A107C、A107D、A107E、A107G、A107N、A107S、A107T、A107Y、Y108K、Y108H、Y108R、Y108L、Y108C、Y108F、Y108I、Y108N、Y108S、Y108T、Y108V、Y108W、W109I、W109M、W109Y、G110R、G110A、G110M、G110P、G110T、Q111K、Q111H、Q111R、Q111L、Q111D、Q111E、Q111G、Q111M、Q111P、Q111S、Q111T、Q111W、Q111Y、Q111V、G112A、G112N、G112P、G112S、G112T、G112Y、Y104D/Q111P和V24E/F27R/R97H/Q111P，对应的氨基酸位置通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO：3所示的VH链而鉴定，及所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换；和/或修饰的VL链或其部分，其包含氨基酸置换，所述氨基酸置换选自如下参照SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸位置的氨基酸置换：D001W、I002C、I002V、I002W、L003D、L003F、L003G、L003S、L003T、L003V、L003W、L003Y、L003R、L004C、L004E、L004F、L004I、L004P、L004S、L004T、L004V、L004W、L004K、L004H、L004R、T005A、T005C、T005D、T005E、T005F、T005G、T005N、T005S、T005W、T005L、T005K、T005H、T005R、T005P、R024A、R024C、R024F、R024L、R024M、R024S、R024W、R024Y、R024G、A025C、A025G、A025L、A025V、S026A、S026C、S026D、S026I、S026M、S026N、S026V、S026W、S026L、S026G、S026H、S026R、Q027A、Q027D、Q027E、Q027F、Q027I、Q027M、Q027N、Q027P、Q027T、S028A、S028D、S028N、S028Q、S028L、S028K、S028H、I029A、I029E、I029F、I029S、I029T、I029R、G030A、G030E、G030F、G030I、G030M、G030P、G030Q、G030S、G030V、G030Y、G030L、G030K、G030H、G030R、T031A、T031F、T031G、T031M、T031S、T031V、T031W、T031L、T031K、T031H、N032G、I033F、I033G、I033M、I033T、I033V、I033H、I048M、I048S、I048L、I048K、K049A、K049E、K049F、K049G、K049N、K049Q、K049S、K049T、K049V、K049Y、K049L、K049H、K049R、A051T、A051L、S052A、S052C、S052D、S052E、S052G、S052I、S052M、S052Q、S052V、S052W、S052R、S052K、E053G、S054M、I055A、I055F、S056G、S056L、S056A、S056C、S056D、S056E、S056F、S056N、S056P、S056Q、S056V、S056W、S056H、S056R、S056K、Y086F、Y086M、Y086H、Y087L、Y087C、Y087D、Y087F、Y087G、Y087I、Y087N、Y087P、Y087S、Y087T、Y087V、Y087W、Y087K、Y087H、Y087R、Q089E、N091L、N091A、N091C、N091I、N091M、N091S、N091T、N091V、N091H、N091R、N092C、N092D、N092L、N092M、N092S、N092T、N092V、N092W、N092Y、N092H、N092K、N092R、N093T、T096L、T096C、T096M、T096V、T097L、T097A、T097D、T097G、T097Q、T097S、T097V、T097K、T097R、F098A、F098M、F098S、F098V、F098Y、G099L、G099D、G099E、G099F、G099I、G099M、G099N、G099S、G099T、G099V、G099K、G099H、Q100C、Q100D、Q100E、Q100F、Q100I、Q100M、Q100N、Q100P、Q100T、Q100V、Q100W、Q100Y、Q100K、Q100H和Q100R，对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO：4所示的VL链而鉴定的，及所述其部分足以形成抗原结合位点并包括所述氨基酸置换。
在本文提供的方法的实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体或其变体可包括重链和轻链，所述重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列；或者所述重链具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：9呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列。
在本文提供的方法的一些实例中，所述未修饰的抗体、其抗原结合片段或其变体是人源化的。在本文提供的方法的一些实例中，所述未修饰的抗体、其抗原结合片段或其变体包括SEQ ID NO：28所示的可变重链和SEQ ID NO：29所示的可变轻链。在本文提供的方法的一些实例中，所述未修饰的抗体、其抗原结合片段或其变体是其抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。
在本文提供的方法的一些实例中，所述未修饰的抗-EGFR抗体、其抗原结合片段或其变体是Fab片段，其包括具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：5呈现至少7％序列相同性的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQID NO：2呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列的轻链。
在本文提供的方法的任何实例中，所述具有条件活性的抗-EGFR抗体，如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，可包括可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，所述可变重链如SEQ ID NO：30-557、1063、1064、1062、1093、1098-1107、1112-1131、1134-1137或1146-1152中任一或者如与SEQ ID NO：30-557、1063、1064、1062、1093、1098-1107、1112-1131、1134-1137或1146-1152中任一呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示，所述可变轻链如SEQ ID NO：810-1061、1067-1068、1138-1145或1153-1159中任一或者如与SEQ ID NO：810-1061、1067-1068、1138-1145或1153-1159中任一呈现至少75％序列相同性的氨基酸序列所示的。
在本文提供的方法的任何实例中，应答抗-EGFR抗体治疗的病症是肿瘤、癌症或者转移。应答抗-EGFR抗体治疗的病症的例子是头颈癌、非小细胞肺癌或者结肠直肠癌。在本文提供的方法中，施用所述抗体的对象包括哺乳动物，例如，人。
在本文提供的方法的实例中，所述药物组合物可以外敷(topically)、肠道外、局部(locally)和系统地施用。在一些实例中，所述药物组合物是经鼻内、肌肉内、皮内、腹膜内、静脉内、皮下、口腔或者通过肺部施用施用的。
本文提供的方法可包括组合治疗，其中另一抗肿瘤疗法，如手术、辐射、化疗、病毒治疗及其它抗肿瘤抗体，是与所述抗体治疗一起、在其之前、期间、之后及与其间隔施用。可以在组合治疗中施用的化疗剂包括但不限于，例如，伊立替康、辛伐他汀和5-氟尿嘧啶(5-FU)。本文提供的方法可包括施用一或多种另外的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段。另外的抗-EGFR抗体的非限制性实例包括西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗及其抗原结合片段。
在本文提供的方法中，所述药物组合物和抗癌剂可以配制为单一组合物或者单独的组合物。所述药物组合物及抗癌剂可以相继、同时或者间隔施用。
在本文提供的方法中，所述抗体的施用剂量可以是0.1mg/kg或大约0.1mg/kg-100mg/kg或大约100mg/kg，例如0.5mg/kg或大约0.5mg/kg-50mg/kg或大约50mg/kg、5mg/kg或大约5mg/kg-50mg/kg或大约50mg/kg、1mg/kg或大约1mg/kg-20mg/kg或大约20mg/kg、1mg/kg或大约1mg/kg-100mg/kg或大约100mg/kg、10mg/kg或大约10mg/kg-80mg/kg或大约80mg/kg，或者50mg/kg或大约50mg/kg-100mg/kg或大约100mg/kg或更高，或者剂量为0.01mg/m2或大约0.01mg/m2-800mg/m2或大约800mg/m2或更高，如0.01mg/m2或大约0.01mg/m2、0.1mg/m2或大约0.1mg/m2、0.5mg/m2或大约0.5mg/m2、或大约1mg/m2、5mg/m2或大约5mg/m2、10mg/m2或大约10mg/m2、15mg/m2或大约15mg/m2、20mg/m2或大约20mg/m2、或大约25mg/m2、或大约30mg/m2、35mg/m2或大约35mg/m2、40mg/m2或大约40mg/m2、45mg/m2或大约45mg/m2、或大约50mg/m2、100mg/m2或大约100mg/m2、150mg/m2或大约150mg/m2、200mg/m2或大约200mg/m2、250mg/m2或大约250mg/m2、300mg/m2或大约300mg/m2、400mg/m2或大约400mg/m2、500mg/m2或大约500mg/m2、600mg/m2或大约600mg/m2、700mg/m2或大约700mg/m2或者800mg/m2或大约800mg/m2或者更高。
在本文的方法的一些方面中，所述对象患有肿瘤，所述肿瘤不含有赋予抗-EGFR治疗抗性的标记，如其中所述标记是KRAS、NRAS或BRAF中的突变。例如，所述对象具有KRAS突变阴性的表达表皮生长因子受体(EGFR)结肠直肠癌。
在本文方法的其它实例中，所述对象含有肿瘤，所述肿瘤具有赋予抗-EGFR治疗抗性的标记，如该标记是KRAS、NRAS或BRAF中的突变，所述抗体或其片段有效针对具有这种标记的肿瘤。
本文提供的组合物可以用于治疗应答抗-EGFR抗体治疗的任何病症，例如肿瘤、癌症和转移。在一些实例中，应答抗-EGFR抗体治疗的病症是头颈癌、非小细胞肺癌或其它肺癌或结肠直肠癌。
附图简述
图1：单克隆抗体西妥昔单抗的序列。
图1示出西妥昔单抗(SEQ ID NO：1和2)的序列。图1A示出重链序列。图1B示出轻链序列。可变链以下划线示出，选择修饰的残基以粗体斜体字示出。
图2：抗-EGFR抗体的比对。
图2示出西妥昔单抗重链和轻链与其它抗-EGFR抗体的示例性比对。“*”表示所比对的残基是相同的，“：”是指所比对的残基是不同的，但是是相似的且在所比对的位置含有保守氨基酸残基，“.”是指所比对残基是相似的且在所比对的位置含有半保守氨基酸残基。氨基酸置换的示例性非限制性的对应位置以加亮表示。例如，图2A示出西妥昔单抗(重链可变区(VH，SEQ ID NO：3)及轻链可变区(VL，SEQ ID NO：4))与Hu225(VH如SEQ ID NO：28所示，VL如SEQ ID NO：29所示)的比对；图2B示出西妥昔单抗(重链可变区(VH，SEQ ID NO：3)和轻链可变区(VL，SEQ ID NO：4))与参考抗-EGFR抗体(VH如SEQ ID NO：3所示及VL如SEQ ID NO：10所示)的比对。
图3：抑制EGF抗原诱导的EGFR磷酸化。
图3示出西妥昔单抗和HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体对EGFR磷酸化的抑制。图3A示出EGF诱导的A431细胞磷酸化的抑制。图3B示出以磷酸化EGFR的浓度针对抗体(西妥昔单抗或HC-Y 104D抗-EGFR抗体)浓度绘图的剂量依赖性抑制作用。图3C示出EGF诱导的新生儿角化细胞的磷酸化抑制。
图4：成人角化细胞或者新生儿角化细胞在存在西妥昔单抗或修饰的HC-Y104D抗-EGFR抗体的条件下的细胞生长抑制。
图4示出使用西妥昔单抗或HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体的成人角化细胞或者新生儿角化细胞的生长。图4A示出使用西妥昔单抗或HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体的成人角化细胞的生长。图4B示出使用西妥昔单抗或HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体的新生儿角化细胞的生长。
图5：施用西妥昔单抗或修饰的HC-Y104D抗-EGFR抗体的体内动物模型。
图5示出在小鼠异种移植肿瘤模型中西妥昔单抗和HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体对肿瘤生长的抑制。
图6：西妥昔单抗和修饰的HC-Y104D抗-EGFR抗体之间在肿瘤与皮肤结合的不同。
图6示出在施用单一静脉内剂量的抗体之后，在7天的时程，DL755-标记的西妥昔单抗和修饰的HC-Y104D抗体结合异种移植肿瘤与结合人皮肤移植物的比率。
发明详述
大纲
A.定义
B.EGFR及抗-EGFR抗体
1.EGFR
2.抗-EGFR抗体及副作用
3.西妥昔单抗
a.结构
b.功能
C.修饰的抗-EGFR抗体及具有条件活性的抗-EGFR抗体
1.修饰的抗-EGFR抗体
a.重链修饰
b.轻链修饰
c.示例性的修饰的抗-EGFR抗体及其片段
2.人源化的抗-EGFR抗体
3.另外的修饰
4.缀合物
a.靶向剂
i.Maytansinoid药物部分
ii.阿里他汀和海兔毒素药物部分
iii.细胞毒素部分
iv.靶向输送的核酸
b.接头
i.肽接头
ii.化学接头
D.鉴定及评估抗-EGFR抗体性质和活性的方法
1.结合测定法
a.固体支持物结合测定
i.表面等离子共振
ii.生物层干涉量度法(Bio-layer interferometry)
iii.免疫测定法
a)ELISA
b)免疫沉淀
c)Western印迹
d)免疫组织化学
e)放射免疫测定法
b.溶液结合测定法
i.等温滴定热量测定法(ITC)
ii.分光光度测定法
2.基于细胞的测定法
3.动物模型
a.评估副作用
4.药动学和药效学测定
E.鉴定、生成和生产抗-EGFR抗体的方法
1.鉴定具有条件治疗性的蛋白质
2.生成和生产抗-EGFR抗体
a.载体
b.细胞和表达系统
i.原核表达
ii.酵母
iii.昆虫
iv.哺乳动物细胞
V.植物
3.纯化
F.药物组合物、配制物、试剂盒、制品和组合
1.药物组合物和配制物
2.制品/试剂盒
3.组合
G治疗性应用
1.示例性的疾病和病症
a.癌症
b.非癌性过度增殖性疾病
c.自身免疫疾病或紊乱
d.炎性紊乱
e.感染性疾病
f.其它疾病和病症
2.治疗对象
a.选择过表达EGFR的对象
b.选择呈现出EGFR相关多态性的对象
c.鉴定呈现出抗-EGFR相关副作用的对象
i.皮肤毒性
ii.低镁血症
d.选择或鉴定治疗对象的其它方法
3.剂量
4.施用途径
5.组合治疗
H.实施例
A.定义
除非特别指出，本文使用所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。除非特别指出，在本文中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公开的材料均以其参考形式全部并入本文。在本文中术语有多个定义的情况中，以其在此章节的含义为准。在参考URL或其它这种标识符或地址时，应理解这种标识符可以改变，及互联网上的特定信息可以变来变去，但是通过搜索互联网可以发现等价信息。对其的参考表明这种信息的可利用性和公开传播。
如本文所用，具有条件活性蛋白质是在一种环境中、特别是在一种体内环境中比第二种环境活性更高。例如，具有条件活性蛋白质可以是在肿瘤环境中比在非肿瘤环境如在皮肤、胃肠道中的非肿瘤环境或其它非肿瘤环境中活性更高。
如本文所用，具有“在肿瘤微环境中的条件活性”或者“在肿瘤微环境中具有条件活性的”治疗剂是一种如本文提供的抗-EGFR抗体(例如修饰的抗-EGFR抗体)的治疗剂，其在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境(例如健康或无病变组织或细胞，如皮肤的基底层)中更具治疗活性。在肿瘤微环境中的条件活性可以在体内或体外评估。例如，在肿瘤微环境中的条件活性可以在结合测定中在体外评估，所述结合测定比较在肿瘤微环境中存在的条件(低pH(例如pH 6.0-6.5)或者升高的乳酸盐浓度(例如10mM-20mM))下与非肿瘤微环境中存在的条件(如中性pH(例如7.0-7.4)或者低乳酸盐浓度(例如1mM-5mM))下的与EGFR的结合。如果在肿瘤环境条件(例如pH 6.0-6.5和/或10mM-20mM乳酸盐)下比在非肿瘤环境条件(例如pH 7.0-7.4及1mM-5mM乳酸盐)下的活性(例如结合活性)比率更高，则存在条件活性。例如，如果所述活性比率是至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0或更高，则存在所述在肿瘤环境中的条件活性。在一些情况中，如果所述活性比率高于5.0，如至少6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高，则存在所述在肿瘤环境中的条件活性。
本文提供的在肿瘤微环境中具有条件活性的抗-EGFR抗体包括这样的抗体，其与不具有修饰的相同抗体相比含有一或多个修饰(例如氨基酸置换、插入或删除)，并且由于所述修饰，其在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中更具活性。例如，修饰以使其具有条件活性的抗体通常含有在西妥昔单抗或其抗原结合片段或其变体中的一或多个修饰。所述变体包括具有除了本文提供的修饰之外的修饰的那些变体，如通过人源化降低免疫原性。典型地，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与对应的形式的未修饰的西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体相比在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中活性更高。例如，条件活性可得自修饰的抗-EGFR抗体在非肿瘤环境中与未修饰抗体相比的降低的活性(例如与EGFR的结合活性)，同时与未修饰的抗体相比在肿瘤环境中保留或呈现相似活性或增加的活性。
如本文所用，疾病或非疾病微环境的“模拟条件”是指对应在体内环境中存在的条件的体外或体内测定条件。例如，如果微环境特征在于低pH，则模拟所述微环境的条件包括具有低pH的缓冲液或测定条件。
如本文所用，在肿瘤微环境中存在的条件包括与非肿瘤微环境(例如健康或非疾病细胞或组织)相比存在于其中的条件。存在于肿瘤微环境中的条件包括增加的血管化、缺氧、低pH、增加的乳酸盐浓度、增加的丙酮酸盐浓度、增加的间隙液压及改变的代谢物或指示肿瘤的代谢。例如，存在于肿瘤微环境中的条件是低于7.4的低pH，典型地，5.6-6.8或大约5.6-6.8，如低于或大约或为pH 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。在另一实例中，存在于肿瘤微环境中的条件是高乳酸盐浓度，5mM-20mM或大约5mM-20mM乳酸，例如10mM-20mM乳酸如15mM-18mM，特别是至少或至少大约或者是16mM、16.5mM或17mM乳酸。
如本文所用，存在于非肿瘤微环境中的条件包括在肿瘤微环境中不存在的一或多种条件。为了本文的目的，一或多种所述条件是在肿瘤微环境和非肿瘤微环境中存在的，但是在这两种微环境中不同的对应的性质或特性，如pH、乳酸盐浓度或者丙酮酸盐浓度。存在于非肿瘤微环境(例如皮肤基底层)中的条件是大约7.0-大约7.8的pH，如至少或大约或为pH 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8(见例如美国专利号7781405)，在一些实例中是pH7.4。例如，所述pH是7.0-7.4或大约7.0-7.4之间的中性pH。存在于非肿瘤微环境(例如皮肤基底层)中的条件是乳酸盐浓度为0.5-5mM乳酸盐，例如0.2mM-4mM乳酸，如0.5、1、2、3、4或5mM乳酸。
如本文所用，“低pH”是指5.6-6.8或大约5.6-6.8的pH范围，如低于或大约为或者为pH 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。
如本文所用，“在相同条件下比较”蛋白质的记载是指将不同的蛋白质进行相同或基本相同的处理，由此可影响蛋白质或药剂的活性或性质的任一或多个条件在测试剂之间不改变或者基本不改变。例如，当比较修饰的抗-EGFR抗体与未修饰的抗-EGFR抗体的活性时，任和一或多个条件在所比较的多肽之间和之中是相同或基本相同的，所述条件例如是所述多肽的量或浓度，配制物中除了活性剂(例如修饰的抗-EGFR抗体)之外赋形剂、运载体或其它成分的存在包括其量，温度，pH，贮存时间，贮存容器，贮存性质(例如搅动)和/或与暴露或使用相关的其它条件。
如本文所用，“不良作用”或“副作用”或“不良事件”或“不良副作用”是指与施用治疗剂相关的有害的、有毒的和/或不希望的作用。例如，与施用抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相关的副作用为本领域技术人员已知并在本文中描述。这种副作用包括，例如，皮肤病学的或皮肤的毒性，如皮疹。副作用或不良作用根据毒性分级，各级毒性评分提供每个级别的定义。示例性的这种评分是国家癌症研究所常用毒性标准版本2.0，世界卫生组织或不良事件常见术语标准(CTCAE)评分的评分。通常地，所述评分如下：1级＝轻度副作用；2级＝中度副作用；3级＝严重副作用；4级＝危及生命或致残副作用；5级＝致命。严重性的评级在医生或其它卫生保健专业人员的经验范围内。
如本文所用，表皮生长因子受体(EGFR，Uniprot登记号P00533，如SEQ ID NO：6所示)是指酪氨酸激酶生长因子受体，其是受体酪氨酸激酶的ErbB家族成员，其与配体结合并由所述配体激活，所述配体如表皮生长因子(EGF)以及其它内源性EGF样配体包括TGF-α、双调蛋白、结合肝素的EGF(HB-EGF)和β细胞素(betacellulin)。基于激活，EGFR参与对细胞生长、增殖、存活和运动性重要的信号级联。除了存在于肿瘤细胞上之外，表皮生长因子受体是普遍存在的，随机分布于除了造血细胞和表皮来源细胞之外的正常细胞表面。例如，EGFR在皮肤角化细胞上表达。
如本文所用，抗-EGFR抗体是指任何这样的抗体，其特异性结合EGFR并阻断配体与EGFR结合，从而导致EGFR的竞争性抑制及EGFR激活的抑制。因此，抗-EGFR抗体是EGFR抑制剂。本文提及的抗-EGFR抗体包括特异性结合EGFR的全长抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，西妥昔单抗(225，也称作爱必妥并以之销售)是一种抗-EGFR抗体，其是嵌合的(小鼠/人)单克隆抗体，是EGFR抑制剂。西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1(重链)和SEQID NO：2(轻链)所示的氨基酸序列。
如本文所用，西妥昔单抗的抗原结合片段是指衍生自西妥昔单抗但是少于西妥昔单抗全长的抗体，但是其含有至少一部分足以形成抗原结合位点的抗体可变区(例如一或多个CDRs)，从而保留西妥昔单抗的结合特异性和/或活性。示例性的西妥昔单抗的抗原结合片段包括这样的抗体，其含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列(可变重链)和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列(可变轻链)，或者含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的足以结合抗原的部分。例如，示例性的西妥昔单抗抗原结合片段是Fab抗体，其含有SEQ ID NO：5(VH-CH1)和SEQ ID NO：2(轻链VH-CL)所示的氨基酸序列。
如本文所用，西妥昔单抗的变体是指衍生自西妥昔单抗或其抗原结合片段的抗体，其呈现出在西妥昔单抗中除了本文提供的修饰之外的一或多个修饰，并特异性结合EGFR。例如，西妥昔单抗的变体包括人源化变体以降低毒性。示例性的西妥昔单抗变体包括这样的抗体，其具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的可变重链氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列呈现至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的可变轻链氨基酸序列，及不含有本文提供的任何修饰(在其修饰之前)并特异性结合EGFR。例如，示例性的本文提供的西妥昔单抗变体是具有SEQ ID NO：1所示的可变重链和SEQ ID NO：10所示的可变轻链的抗体，或者具有SEQ ID NO：28所示的可变重链和SEQ ID NO：29所示的可变轻链的抗体，或者具有SEQ ID NO：8所示的重链和SEQ ID NO：9所示的轻链的抗体，及其对应的抗体形式。应理解最初不含有本文提供的修饰的西妥昔单抗变体可用作未修饰的抗体，且可以进一步修饰以含有本文提供的修饰。
如本文所用，关于可变重链、可变轻链或者这二者中的修饰中的“二者”是指抗体含有在可变重链中的一或多个修饰及在抗体可变轻链中的一或多个修饰。
如本文所用，“未修饰的抗体”是指选择用于进行本文提供的修饰的起始多肽重链和轻链或其片段。所述起始靶多肽可以是野生型或参考形式的抗体，其是主要参考多肽，所评估的是对所述主要参考多肽的活性的。例如，西妥昔单抗对于本文的修饰是主要的或参考多肽。可以改变或突变未修饰的或起始靶抗体，由此使其与主要或参考形式的抗体不同，但是在本文中，相对于本文产生的随后修饰的多肽(例如西妥昔单抗的抗原结合片段或其变体)仍称作起始的未修饰的靶蛋白质。因此，可以选择本领域已知的现有蛋白质，与未修饰的参考蛋白质相比，其已经修饰以具有特定活性或性质的希望的增加或降低，并将所述现有蛋白质用作起始未修饰的靶蛋白质。例如，已经从主要或参考形式通过一或多个单一氨基酸改变而修饰并具有希望的性质增加或降低，如降低的免疫原性的蛋白质，可以是用于进一步修饰相同或不同的性质的靶蛋白质，在本文称作未修饰的蛋白质。
如本文所用，“修饰的抗-EGFR抗体”或者“抗-EGFR抗体变体”是指这样的抗-EGFR抗体，与参考的或未修饰的抗-EGFR抗体相比，在其氨基酸序列中含有如本文所述至少一个氨基酸添加、删除或置换。示例性的参考或未修饰的抗-EGFR抗体是SEQ ID NO：1(重链)和2(轻链)或者SEQ ID NO：8(重链)和SEQ ID NO：9(轻链)所示的全长抗-EGFR抗体或者其抗原结合片段，或者其抗体变体，所述抗原结合片段如SEQ ID NO：3(可变重链)和SEQ ID NO：4(可变轻链)、SEQ ID NO：5(VH-CH1)和SEQ ID NO：2(VL)、或者SEQ ID NO：3(可变重链)和SEQ ID NO：10(可变轻链)所示的抗-EGFR抗体多肽；所述抗体变体的重链或轻链或其部分与所述任何SEQ ID NO呈现出至少68％、69％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性，从而，所得抗体特异性结合EGFR。修饰的抗-EGFR抗体可具有多达150个氨基酸置换，只要所得修饰的抗-EGFR抗体呈现出结合EGFR即可。典型地，修饰的抗-EGFR抗体含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸置换。应理解修饰的抗-EGFR抗体除了本文所述的至少一个氨基酸添加、删除或置换之外也可包括任何一或多个其它修饰。
如本文所用，“修饰”是指多肽的氨基酸序列或者核酸分子中的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸和核苷酸的删除、插入和置换。修饰多肽的方法对本领域技术人员而言是常规的，如通过使用重组DNA方法学进行。
如本文所用，当涉及核酸或多肽序列时提及的“删除”是指与序列，如靶多核苷酸或多肽或者天然或野生型序列，相比删除一或多个核苷酸或氨基酸。
如本文所用，当涉及核酸或氨基酸序列提及的“插入”描述在靶、天然的、野生型或其它相关序列中包含一或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比含有一或多个插入的核酸分子在所述序列的线性长度内含有一或多个另外的核苷酸。如本文所用，核酸和氨基酸序列中的“添加”描述与另一序列相比在任一末端添加核苷酸或氨基酸。
如本文所用，“取代”或“置换”是指用另一核苷酸或氨基酸置换天然的、靶、野生型或其它核苷酸或多肽序列中的一或多个核苷酸或氨基酸，而不改变所述分子的长度(如以残基数目所描述)。因此，在分子中的一或多个取代不改变所述分子的氨基酸残基或核苷酸数目。与特定多肽相比的氨基酸置换可以在沿着多肽序列长度的氨基酸残基编号表示。例如，修饰的多肽具有在氨基酸序列第19位的氨基酸修饰，所述修饰是半胱氨酸(Cys；C)取代异亮氨酸(Ile；I)，可以表示为I19C、Ile19Cys或者简单地表示为C19，以表示在修饰的第19位置的氨基酸是半胱氨酸。在这个实例中，具有所述取代的分子在未修饰多肽的Ile 19的具有修饰。为了本文的目的，由于修饰是在抗体的重链(HC)或轻链(LC)中，因此修饰也可以HC-或LC-表示，以指示改变的多肽链。
如本文所用，“在对应...的位置”或者“对应”公开的序列，如序列表中所示的序列，中的核苷酸或氨基酸位置的核苷酸或氨基酸位置的记载，是指根据与公开的序列进行比对而鉴定的核苷酸或氨基酸位置，所述比对使用标准比对算法如GAP算法使相同性最大化。为了本文的目的，本文提供的用于修饰的残基参考SEQ ID NO：3所示的可变重链和SEQID NO：4所示的可变轻链中所示的氨基酸位置。因此，可以通过将所提及的重链序列或其部分与SEQ ID NO：3所示的序列比对和/或将所提及的轻链序列或其部分与SEQ ID NO：4所示的序列比对而确定对应的残基。通过比对序列，本领域技术人员可以，例如，使用保守和相同氨基酸残基作为指导，鉴定对应的残基。通常地，为了鉴定对应的位置，将所述氨基酸序列进行比对以便获得最高的顺序匹配(见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carrillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48：1073)。在图2中提供示例性的比对，示例性的基于对应的匹配的残基的氨基酸置换在表5和表7中示出。
如本文所用，序列比对是指使用同源性匹配两或多个核苷酸或氨基酸序列。典型地，以50％或更高相同性相关的两或更多个序列是匹配的。一组匹配的序列是指在对应的位置匹配的两或更多个序列，及可包括衍生自RNA的匹配序列，如EST及其它cDNA，其与基因组DNA序列匹配。相关的或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。典型地，这些方法使匹配最大化，包括如使用手工比对的及使用众多的可获得的比对程序(例如BLASTP)的及本领域技术人员已知的其它的方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可使用保守和相同的氨基酸残基为指导鉴定相似的部分或位置。进一步地，本领域技术人员也可以采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导，以发现在人和非人序列之间和之中的对应的氨基酸或核苷酸残基。对应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构比对。在其它情况中，可以鉴定对应的区域。本领域技术人员可采用保守氨基酸残基做指导以发现人与非人序列之间和之中的对应的氨基酸残基。
如本文所用，多肽如抗体的“性质”是指由多肽呈现出的任何性质，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白质稳定性、蛋白酶解抗性、构型稳定性、耐热性，及pH条件耐受性。性质的变化可改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽的结合特异性的变化可以改变结合抗原的能力，和/或多肽的各种结合活性，如亲和性或亲合力，或者体内活性。
如本文所用，多肽如抗体的“活性”或者“功能活性”是指由所述多肽呈现的任何活性。这种活性可以根据经验确定。示例性的活性包括但不限于与生物分子相互作用的能力，例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或者二聚体化，及酶活性，如激酶活性或蛋白酶解活性。对于抗体(包括抗体片段)，活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和性(例如高或低亲和性)、抗原结合的亲合力(例如高或低亲合力)、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、效应子功能，如促进抗原中和或者清除、病毒中和的能力，及体内活性，如预防病原体感染或侵袭的能力，或者促进清除的能力或者渗透身体内特定组织或液体或细胞的能力。活性可以使用认可的测定法体外或体内评估，所述测定法如ELISA、流式细胞术、表面等离子共振或者测量结合或解离速率的等价的测定、免疫组织化学和免疫荧光组织学和显微镜学、基于细胞的测定、流式细胞术与结合测定(例如淘选(panning)测定)。例如，对于抗体多肽，可以通过测量结合亲和性、亲合力和/或结合系数(例如结合/解离速率)及其它体外活性或者通过测量各种体内效应如免疫效应，例如抗原清除、抗体渗透或定位于组织、免受疾病如感染、血清或其它液体抗体效价或者本领域熟知的其它测定法而评估活性。表明多肽呈现出活性的这种测定的结果可以与所述多肽的体内活性相关联，其中体内活性可以称作治疗活性或生物学活性。修饰的多肽的活性可以是未修饰的多肽活性的任何百分比水平，包括但不限于，与未修饰的多肽相比，是其活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高活性。确定修饰的抗体(例如变体)的功能性的测定为本领域熟知。
如本文所用，“呈现出至少一种活性”或者“保留至少一种活性”是指与不含有所述修饰的靶或未修饰的多肽相比，修饰的多肽如变体抗体或其它治疗性多肽(例如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段)呈现出的活性。保留靶多肽的活性的修饰的或者变体多肽可以呈现出改良的活性、降低的活性，或者保持未修饰的多肽的活性。在一些情况中，修饰的或者变体多肽与靶多肽或未修饰的多肽相比可保留增加的活性。在一些情况中，修饰的或变体多肽与未修饰的或靶多肽相比可保留降低的活性。修饰的或变体多肽的活性可以是未修饰的或靶多肽的活性的任何百分比水平，包括但不限于，与未修饰的或靶多肽相比，是其活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。在其它实施方案中，活性的改变是比未修饰或靶多肽活性高至少大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或者更高倍数。活性保留测定依赖于保留的活性。这种测定可以在体外或体内进行。活性可以使用例如本领域已知的测定及下文实施例描述的测定法，例如但不限于ELISA和淘选测定，进行测量。与未修饰的或靶多肽的活性相比，修饰的或变体多肽的活性也可以根据在施用所述多肽之后的体内治疗或生物学活性或结果而进行评估。
如本文所用，关于修饰的抗-EGFR抗体的“增加的活性”是指当在相同条件下检测时，与不含有所述氨基酸置换的未修饰的抗-EGFR抗体相比，所述修饰的抗-EGFR抗体呈现出更高的活性。例如，修饰的抗-EGFR抗体呈现出未修饰的或参考的抗-EGFR抗体活性的至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高的活性。
如本文所用，“结合(bind)”、“结合(bound)”或其语法变化是指分子参与任何与另一分子的吸引的相互作用，导致两个分子彼此紧密接近的稳定结合。结合包括但不限于非共价键、共价键(如可逆和不可逆的共价键)，并包括分子间相互作用，所述分子如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子如化学化合物包括药物。示例性的结合(bond)是抗体-抗原相互作用和受体-配体相互作用。当抗体“结合”特定抗原时，结合是指抗体在抗体结合(combine)位点通过抗体-抗原同源(cognate)相互作用而特异性识别抗原。结合也可以包括多肽的多个链的关联，如抗体链通过二硫键相互作用。
如本文所用，结合活性是指分子如多肽的特性，其涉及所述分子是否及怎样结合一或多个结合伴侣。结合活性包括与结合伴侣结合的能力、其与结合伴侣结合的亲和性(例如高亲和性)、其与结合伴侣结合的亲合力、与结合伴侣的键的强度和/或与结合伴侣结合的特异性。
如本文所用，“亲和性”或者“结合亲和性”描述两或多个分子如结合伴侣之间的相互作用强度，典型地，两个结合伴侣之间非共价相互作用的强度。抗体或其抗原结合片段对于抗原表位的亲和性是单一抗体结合位点与表位之间的全部非共价相互作用的强度的度量。低亲和性抗体-抗原相互作用是弱的，所述分子趋于快速分离，而高亲和性抗体-抗原结合是强的，所述分子保持较长时间结合。计算亲和性的方法为本领域熟知，如确定结合/解离常数的方法。例如，高抗体亲和性是指所述抗体以高于或等于大约106M-1、高于或等于大约107M-1、高于或等于大约108M-1或者高于或等于大约109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的平衡结合常数(KA)特异性结合靶蛋白质。也可以通过10-4M、10-6M-10-7M或者10-8M、10-10M、10-11M或10-12M或者更低的平衡解离常数(KD)表征抗体。亲和性可以根据经验估计，或者亲和性可以通过对比确定，例如通过对比一种抗体与另一抗体对于特定抗原的亲和性。例如，这种亲和性可以通过使用常规技术容易地确定，所述常规技术如通过平衡透析；使用BIAcore2000仪器、使用由厂商提供的一般程序；使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定，或者通过本领域技术人员已知的另一方法。亲和性数据可以通过例如Scatchard et al.，AnnN.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)的方法进行分析。
如本文所用，抗体亲合力是指多价抗体与其同源抗原之间的多个相互作用的强度，如含有多个结合位点的抗体与具有重复表位或表位阵列的抗原的结合。高亲合力抗体与低亲合力抗体相比具有较高强度的这种相互作用。
如本文所用，“亲和性常数”是指用于测量抗体与抗原的亲和性的结合常数(Ka)。亲和性常数越高，抗体与抗原的亲和性越高。亲和性常数以摩尔浓度的倒数为单位表示(即M-1)，及可以从通过结合-解离反应的速度常数计算，所述速率常数通过抗体反应的标准动力学方法(例如免疫测定、表面等离子共振或者本领域已知的其它动力学相互作用测定)进行测量。抗体的结合亲和性也可以用解离常数或Kd表示。解离常数是结合常数的倒数，Kd＝1/Ka。因此，亲和性常数也可以用Kd表示。
如本文所用，当用于描述抗体结合亲和性时，术语“相同”是指结合常数(Ka)或解离常数(Kd)是在参考抗体的亲和性的大约1-100倍或者1-10倍以内(比参考抗体高1-100倍的亲和性或者低1-100倍的亲和性，或者在这个范围内的任何数值或范围或值)。
如本文所用，当用于描述结合常数(Ka)或解离常数(Kd)时，“基本相同”是指结合常数在比参考抗体的结合常数Ka高或低大约5-5000倍以内(比参考抗体高5-5000倍或者低5-5000倍)。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或者“免疫特异性结合”在本文可互换使用，是指抗体或其抗原结合片段与同源抗原通过所述抗体的抗体结合位点与抗原之间的非共价相互作用形成一或多个非共价键的能力。典型地，免疫特异性结合(或者特异性结合)EGFR的抗体是以大约1×107M-1或1×108M-1或更高的亲和性常数Ka(或者1×10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))与EGFR结合的抗体。亲和性常数可以通过针对抗体反应的标准动力学方法确定，例如免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11：54；Englebienne(1998)Analyst.123：1599)、等温滴定量热法(ITC)或者本领域已知的其它动力学相互作用测定(见例如Paul，ed.，FundamentalImmunology，2nd ed.，Raven Press，New York，pages 332-336(1989)；也见美国专利No.7,229,619关于示例性的计算抗体结合亲和性的SPR和ITC方法的描述)。实时检测和监测结合速度的仪器和方法已知并可商购(例如BiaCore 2000，Biacore AB，Upsala，Sweden and GEHealthcare Life Sciences；Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27：335)。免疫特异性结合特定抗原(例如EGFR)的抗体或抗原结合片段可以通过，例如，免疫测定如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子共振或者本领域技术人员已知的其它技术进行鉴定。
如本文所用，术语“表面等离子共振”是指一种光学现象，其通过检测生物传感器基质中蛋白质浓度改变而可以分析实时相互作用，例如使用BiaCore系统(GE HealthcareLife Sciences)进行。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然或是部分或全部合成，如重组，产生的，包括含有免疫球蛋白分子的至少一部分可变重链和轻链的其任何片段，其足以形成抗原的抗原结合位点以及，当装配时，特异性结合。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指含有两个重链(以H和H’表示)和两个轻链(以L和L’表示)的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或者是其足以形成抗原结合位点的部分(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，每条轻链可以是全长轻链或者是其足以形成抗原结合位点的部分(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一个轻链(分别为L和L’)配对。典型地，抗体最低限度地包括可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的全部或至少一部分。抗体也可以包括所有或部分恒定区。
为了本文的目的，术语抗体包括全长抗体及其部分，包括抗体片段如抗-EGFR抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fvs(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fabs(scFab)、双特异抗体、抗-个体基因型(抗-Id)抗体，或者上述任何抗体的抗原结合片段。抗体也包括合成的抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)和类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的形式是指抗体的特殊结构。本文的抗体包括全长抗体及其部分，例如Fab片段或其它抗体片段。因此，Fab是抗体的特定形式。
如本文所用，关于抗体的“对应的形式”是指当比较两个抗体的性质或活性时，使用所述抗体的相同形式比较该性质。例如，如果指出抗体与第一种抗体的对应的形式的活性相比具有较低活性，意味着该抗体的特定形式如Fab与所述第一种抗体的Fab形式相比具有较低活性。
如本文所用，全长抗体是具有两个全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两个全长轻链(VL-CL)及铰链区的抗体，如通过分泌抗体的B细胞产生的人抗体及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，抗体片段或抗体部分是指全长抗体的任何部分，其少于全长但是含有至少足以形成抗原结合位点(例如一或多个CDRs)的所述抗体的可变区的一部分，并因此保留结合特异性和/或全长抗体的活性；抗体片段包括通过酶处理全长抗体产生的抗体衍生物，以及合成地如重组产生的衍生物。示例性的抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd片段(见例如Methods in MolecularBiology，Vol 207：Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods andProtocols(2003)；Chapter 1；p 3-25，Kipriyanov)。所述片段可包括多个连接在一起的链，如通过二硫键桥连和/或通过肽接头连接。抗体片段通常含有至少大约50个氨基酸，典型地，至少200个氨基酸。
如本文所用，Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链(VL)结构域组成。
如本文所用，dsFv是指具有工程化的分子间二硫键的Fv，所述二硫键使VH-VL配对稳定。
如本文所用，Fd片段是含有抗体重链的可变结构域(VH)和一个恒定区结构域(CH1)的片段。
如本文所用，Fab片段是由木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所得的抗体片段，或者合成产生的(如通过重组方法)具有相同结构的片段。Fab片段含有轻链(含有VL和CL)及含有重链可变结构域(VH)和一个重链恒定区结构域(CH1)的另一条链。
如本文所用，F(ab’)2片段是由胃蛋白酶在pH 4.0-4.5消化免疫球蛋白所得的抗体片段，或者合成(如通过重组方法)产生的具有相同结构的片段。所述F(ab’)2片段本质上含有两个Fab片段，其中每条重链部分含有另外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸残基。
如本文所用，Fab’片段是含有一半F(ab’)2(一个重链和一个轻链)的片段。
如本文所用，Fd’片段是含有F(ab’)2片段的一个重链部分的抗体片段。
如本文所用，Fv’片段是仅含有抗体分子的VH和VL结构域的片段。
如本文所用，hsFv是指抗体片段，其中已经用异源二聚体的卷曲-螺旋结构域取代了通常存在于Fab片段中的恒定结构域(见例如Arndt et al.(2001)J Mol Biol.7：312：221-228)。
如本文所用，scFv片段是指含有以任何顺序通过多肽接头共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头的长度是使两个可变结构域基本上没有干扰地桥连的长度。示例性的接头是(Gly-Ser)n残基，其具有一些分散于各处的Glu或Lys残基以增加溶解性。
如本文所用，双特异抗体是二聚的scFv；典型地，双特异抗体具有比scFv较短的肽接头，优选是二聚体化的。
如本文所用，多肽“结构域”是多肽的一部分(三或多个、通常5、10或更多个氨基酸的序列)，其是结构性和/或功能性可区别或可定义的。示例性的多肽结构域是多肽的一部分，其在由一或多个结构基序(例如通过环区域连接的α螺旋和/或β链的组合)组成的多肽内可形成独立折叠的结构，和/或其通过特定功能活性，如酶活性、二聚体化或抗原结合，进行识别。多肽可具有一或多个，典型地，多于一个，不同的结构域。例如，多肽可具有一或多个结构结构域及一或多个功能结构域。单一多肽结构域可以基于结构和功能而区分。结构域可包含连续的线性氨基酸序列。或者，结构域可包含多个不连续的氨基酸部分，其沿着所述多肽的线性氨基酸序列不连续。典型地，多肽含有多个结构域。例如，抗体分子的每条重链和每条轻链含有多个免疫球蛋白(Ig)结构域，每个长度为大约110个氨基酸。本领域技术人员熟知多肽结构域，且可以通过与其它这种结构域的结构和/或功能同源性而鉴定它们。本文为了举例说明，提供了定义，但是应理解通过名称而识别特定的结构域在本领域技术以内。如果需要，可以采用合适的软件鉴定结构域。
如本文所用，多肽的功能区是含有至少一个功能结构域(其赋予特定功能，如与生物分子相互作用的能力，例如通过抗原结合、DNA结合、配体结合或者二聚化，或者通过酶活性如激酶活性或蛋白酶解活性)的多肽的区域；示例性的多肽功能区是抗体结构域，如VH、VL、CH、CL，及其部分如CDR，包括CDR1、CDR2和CDR3，或者抗原结合部分，如抗体结合位点。
如本文所用，多肽的结构区是含有至少一个结构结构域的多肽区域。
如本文所用，Ig结构域是由本领域技术人员如此识别的结构域，其特征在于称作免疫球蛋白(Ig)折叠的结构，所述结构含有两个β-折叠片，每个折叠片含有通过环连接的反平行β氨基酸链。Ig折叠中的这两个β片层通过疏水性相互作用和保守的链内二硫键夹心在一起。抗体链内的各个免疫球蛋白结构域可基于功能进一步区分。例如，轻链含有一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL)，而重链含有一个可变区结构域(VH)及三或四个恒定区结构域(CH)。各VL、CL、VH和CH结构域是免疫球蛋白结构域的实例。
如本文所用，抗体的可变结构域是抗体重链或轻链的特异性Ig结构域，其含有在不同抗体中不同的氨基酸序列。每条轻链和每条重链具有一个可变区结构域(VL和VH)。所述可变结构域提供抗原特异性，因此负责抗原识别。每个可变区含有CDR，其是抗原结合位点结构域的一部分，及框架区(FR)。
如本文所用，“超变区”、“HV”、“互补决定区”、“CDR”和“抗体CDR”可互换使用，是指每个可变区内多个部分之一，其一起形成抗体的抗原结合位点。每个可变区结构域含有三个CDR，称作CDR1、CDR2和CDR3。这三个CDR沿着线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中是邻近的。CDR位于连接可变结构域的β片层的平行链的环内。
如本文所用，“抗原结合结构域”、“抗原结合位点”、“抗原组合位点”和“抗原结合(combining)位点”同义使用，是指抗体内识别同源抗原并与其物理性相互作用的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规的抗原结合位点，各含有重链可变区的部分和轻链可变区的部分。常规的抗原结合位点含有连接可变区结构域内反平行β链的环。所述抗原结合位点可含有可变区结构域的其它部分。每个常规的抗原结合位点含有来自重链的三个超变区和来自轻链的三个超变区。所述超变区也称作互补决定区(CDR)。
如本文所用，关于抗体重链或轻链或者可变重链或轻链，“其部分”是指其足以形成抗原结合位点的连续部分，由此当装配成含有重链和轻链的抗体时，其含有可变重链(VH)和可变轻链(VL)的至少1或2个、典型3、4、5或所有6个CDR，使其足以保留含有所有6个CDR的对应的全长抗体的至少一部分结合特异性。通常地，足够的抗原结合位点需要重链的CDR3(CDRH3)。典型地，其进一步需要轻链的CDR3(CDRL3)。如本文所述，本领域技术人员已知CDR且可以基于Kabat或Chothia编号进行鉴定(见例如Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，and Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于抗体可变区结构域内的结构域，其位于β片层内；在其氨基酸序列方面，FR区与超变区相比更保守。
如本文所用，恒定区结构域是抗体重链或轻链中的结构域，在抗体之中，其含有与可变区结构域相比更保守的氨基酸序列。每条轻链具有一个轻链恒定区(CL)结构域，每条重链含有一或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型含有CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM含有CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原的相互作用及抗体臂旋转。抗体恒定区可发挥效应子功能，例如但不限于清除与抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用而进行。
如本文所用，“Kabat编号”是指IgG1 Kabat抗体的索引编号(见例如Kabat，E.A.etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。例如，基于Kabat编号，CDR-LI对应残基L24-L34；CDR-L2对应残基L50-L56；CDR-L3对应残基L89-L97；CDR-H1对应残基H31-H35，根据长度是35a或35b；CDR-H2对应残基H50-H65；及CDR-H3对应残基H95-H102。本领域技术人员可使用Kabat鉴定恒定区的区域。表1和表2示出示例性抗体西妥昔单抗使用kabat编号和EU编号方案的对应的残基。
如本文所用，“EU编号”或“EU索引”是指在Edelman et al.，ProcNatl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85中描述的EU抗体的编号方案。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 Kabat抗体的EU索引编号，如Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242所述。本领域技术人员经常使用EU编号或者如在Kabat中的EU编号对抗体轻链和重链的Fc区域的氨基酸残基进行编号。例如，本领域技术人员可使用EU编号鉴定恒定区的区域。例如，根据Kabat编号，所述CL结构域对应残基L108-L216，或者根据EU编号对应L108-L214。CH1对应残基118-215(EU编号)或者114-223(Kabat编号)；CH2对应残基231-340(EU编号)或者244-360(Kabat编号)；CH3对应残基341-446(EU编号)或者361-478(Kabat编号)；CDR-L2对应残基L50-L56；CDR-L3对应残基L89-L97；CDR-H1对应残基H31-H35，根据长度是35a或35b；CDR-H2对应残基H50-H65；及CDR-H3对应残基H95-H102。表1和表2示出示例性抗体西妥昔单抗使用Kabat和EU编号的对应的残基。顶行(粗体字)示出氨基酸残基编号；第二行(粗体字)提供了氨基酸残基的1-字母代码，其通过顶行的数字表示位置；第三行(斜体字)表示根据Kabat编号方案的对应的Kabat编号；地四行(非粗体，非斜体)表示根据EU编号的对应的EU索引编号。
表1：西妥昔单抗轻链的Kabat和EU编号
表2：西妥昔单抗重链的Kabat和EU编号
如本文所用，“抗体铰链区”或者“铰链区”是指在γ、δ、α抗体同种型的重链中天然存在的多肽区域，其在与其它抗体结构域无同源性的CH1与CH2结构域之间。这个区域富集脯氨酸残基并给予IgG、IgD和IgA抗体灵活性，使得Fab部分的两个“臂”(每个臂含有一个抗体结合位点)可以移动，随着其结合抗原而彼此呈现各种角度。这种灵活性使得Fab臂移动以对准所述抗体结合位点以与细胞表面上的或其它抗原上的表位相互作用。铰链区内的两个链间二硫键使两条重链之间的相互作用稳定。在本文提供的一些实施方案中，合成产生的抗体片段含有一或多个铰链区，例如通过两个抗体链之间的相互作用促进稳定性。示例性的铰链区是二聚化结构域。
如本文所用，当用于描述衍生自另一抗体如单克隆抗体的抗体片段时，短语“衍生自”是指抗体片段(例如Fab、F(ab’)、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段)的工程化，其保留原始抗体的结合特异性。这种片段可以通过本领域已知的各种方法产生，包括但不限于酶裂解、化学交联、重组方式或其组合。通常地，衍生的抗体片段与亲代抗体共有相同或基本相同的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，由此所述抗体片段与亲代抗体结合相同表位。
如本文所用，“亲代抗体”或者“来源抗体”是指从其衍生抗体片段(例如Fab、F(ab’)、F(ab)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段)的抗体。
如本文所用，术语“表位”是指抗体决定簇所结合的抗原上的任何抗原决定簇。典型地，表位决定簇含有化学活性的表面分子(如氨基酸或糖侧链)群，及典型地，具有特异性三维结构特性，以及特异性电荷特性。
如本文所用，人源化抗体是指经修饰以包含“人”氨基酸序列的抗体，由此给人施用时不引起免疫应答。典型地，人源化抗体含有衍生自非人物种免疫球蛋白的互补决定区(CDR或超变环)，抗体分子的剩余部分主要来自人免疫球蛋白。本领域已知制备这种抗体的方法。例如，编码单克隆抗体的DNA可以通过重组DNA技术改变，以编码其中非可变区的氨基酸成分基于人抗体的抗体。本领域已知鉴定这种区域的方法，包括计算机程序，其为鉴定免疫球蛋白的可变和非可变区而设计。因此，通常地，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、典型两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环对应非人免疫球蛋白的那些，及所有或基本所有的FR是那些人免疫球蛋白序列。任选地，人源化抗体也包含免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分，典型地，人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于可变区，典型地，人源化抗体是与衍生自人VH基因区段的最接近的VH区呈现出高于56％序列相同性如至少57％、58％、59％、60％、65％、70％或更高序列相同性，及与衍生自人VL基因区段的最接近的VL区呈现出至少75％序列相同性，如至少76％、77％、78％、79％、80％、85％或更高的序列相同性的抗体。因此，人源化抗体与人源化之前亲代或参考的或未修饰的抗体相比，与其最接近的衍生自V种系区段的人V区呈现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更高的序列相同性。
如本文所用，种系基因区段是指来自种系的免疫球蛋白(Ig)可变(V)的、多样的(D)和接合(J)或恒定(C)基因其编码免疫球蛋白重链或轻链(κ和λ)。在种系中有多个V、D、J和C基因区段，但是基因重排导致在每个功能重排的基因中每种区段仅出现一个。例如，功能重排的重链含有一个V、一个D和一个J，功能重排的轻链基因含有一个V和一个J。因此，这些基因区段载于生殖细胞中，但是不能转录及翻译成重链和轻链，直至其排列成为功能基因。在骨髓中B细胞分化期间，这些基因区段通过能产生1010以上特异性的动态遗传系统而随机重排(shuffling)。为了本文的目的，所述基因区段通过组合或汇编各个种系区段而在体外重排。
在本文中可变种系区段是指V、D和J群、亚群、基因或其等位基因。基因区段序列可以从已知数据库中获取(例如National Center for Biotechnology Information(NCBI)，国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)，Kabat数据库和Tomlinson’s Vbase数据库(Lefranc(2003)Nucleic Acids Res.，31：307-310；Martin et al.，BioinformaticsTools for Antibody Engineering in Handbook of Therapeutic Antibodies，Wiley-VCH(2007)，pp.104-107；也见公开的国际PCT申请No.WO2010/054007)。
如本文所用，关于种系区段，“群”是指免疫球蛋白的核心编码区，即编码重链或轻链的可变(V)基因、多样性(D)基因、接合(J)基因或者恒定(C)基因。示例性的种系区段类群包括VH、DH、JH、VL(Vκ或Vλ)和JL(Jκ或Jλ)。
如本文所用，关于种系区段，“亚群”是指一系列序列，其由核苷酸序列相似性或相同性定义。通常地，亚群是在给定物种中属于相同群[V、D、J或C]，且在核苷酸水平呈现至少75％相同性的一系列基因。亚群基于IMGT命名法分类(imgt.cines.fr；见例如Lefranc etal.(2008)Briefings in Bioinformatics，9：263-275)。通常地，亚群代表多基因家族。
如本文所用，基因的等位基因是指由于与参考基因序列相比在编码区中的一或多个核苷酸不同(例如取代、插入或删除)而具有序列多样性的种系序列。因此，属于相同亚群的IG序列在其编码序列可高度相似，但是呈现出高度多样性。亚群等位基因基于IMGT命名法，以两个代号(figure number)之前的一个星号(*)进行分类。
如本文所用，关于种系区段，“家族”是指通过氨基酸序列相似性或相同性定义的种系区段序列系列。通常地，一个种系家族包括一个基因的所有等位基因。
如本文所用，“衍生自种系区段”的V基因区段是指VH或VL核酸序列中的对应的核苷酸，其通过重组事件衍生自V种系基因(VH或VL种系区段)。
如本文所用，抗体重链(VH区)或轻链(VL区)或其部分或片段中的V区是指由通过重组事件衍生自对应的V种系区段基因的核苷酸编码的氨基酸。
如本文所用，多聚化结构域是指促进多肽分子与含有互补的多聚化结构域的一或多个另外的多肽分子稳定相互作用的氨基酸序列，所述互补的多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域以与第一个结构域形成稳定的多聚体。通常地，多肽与多聚化结构域直接或间接接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区及相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。多聚化结构域可以是，例如，免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM以及其修饰的形式的Fc结构域或其部分。
如本文所用，二聚化结构域是多聚化结构域，其促进两个多肽序列(例如但不限于抗体链)之间的相互作用。二聚化结构域包括但不限于含有促进在两个多肽序列之间形成二硫键的半胱氨酸残基的氨基酸序列，如全部或部分全长抗体铰链区，或者一或多个二聚化序列，其是已知促进多肽之间相互作用的氨基酸序列(例如亮氨酸拉链、GCN4拉链)。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或者“Fc结构域”是指含有抗体重链恒定区的多肽，但不包括第一个恒定区免疫球蛋白结构域。因此，Fc是指IgA、IgD和IgE的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，或者IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域。任选地，Fc结构域可包括这些结构域的全部或部分柔性铰链N-末端。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG的示例性的Fc结构域，Fc含有免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3，及任选在Cγ1与Cγ2之间的全部或部分铰链区。Fc区域的边界可以改变，但是典型地，包括至少部分铰链区。此外，Fc还包括任何等位基因的或物种变体或者任何变体或修饰的形式，如改变与FcR的结合或者改变Fc-介导的效应子功能的任何变体或修饰的形式。
如本文所用，“Fc嵌合体”是指嵌合的多肽，其中一或多个多肽与Fc区或其衍生物直接或间接地连接。典型地，Fc嵌合体组合免疫球蛋白的Fc区与另一多肽。本领域技术人员已知Fc多肽的衍生物或修饰的Fc多肽。
如本文所用，嵌合多肽是指含有来自至少两个不同多肽或者来自单一多肽的两个非连续部分的部分的多肽。因此，嵌合多肽通常包括来自一个多肽的全部或部分氨基酸残基的序列和来自另一不同多肽的全部或部分氨基酸的序列。这两部分可以直接或间接连接，及可以通过肽键、其它共价键或其它非共价相互作用连接，所述非共价相互作用具有足够强度的以在平衡条件和生理条件如在等渗pH7缓冲盐水中条件下保持所述嵌合多肽的大部分完整性。
如本文所用，融合蛋白是经工程化以含有对应接合在一起的两个不同多肽的氨基酸序列的多肽，所述工程化通过如从含有编码所述两个多肽的两个核酸的载体中表达所述融合蛋白，所述两个核酸沿着载体长度彼此紧密接近，如相邻。因此，融合蛋白是指含有通过肽键直接或间接连接的两个，或来自两个的部分，或多个蛋白质或肽的嵌合蛋白。这两个分子在构建体中可以是相邻的或者由接头或间隔多肽分隔。
如本文所用，“接头”或者“间隔”肽是指接合两个多肽序列的短氨基酸序列(或者编码这种氨基酸序列的核酸)。“肽接头”是指接合两个多肽序列的短氨基酸序列。示例性的多肽接头是接合肽转导结构域与抗体的接头，或者在合成的抗体片段如scFv片段中接合两个抗体链的接头。接头是熟知的，在所提供的方法中可以使用任何已知接头。示例性的多肽接头是(Gly-Ser)n氨基酸序列，其具有一些散布的Glu或Lys残基以增加溶解性。本文中描述了其它示例性的接头，任何这些及其它已知的接头可用于本文提供的组合物和方法中。
如本文所用，“标签”或者“表位标签”是指氨基酸序列，典型地，其加入多肽如本文提供的抗体的N-或C-末端。包括融合于多肽的标签可帮助多肽纯化和/或检测。典型地，标签或标签多肽是指这样的多肽，其具有足够的残基以提供抗体识别的表位或者可用于检测或纯化，但是也是足够短的，由此不干扰其所连接的多肽的活性。典型地，标签多肽是足够独特的，所以与其特异性结合的抗体基本上不与其连接的多肽中的表位交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少5或6个氨基酸残基，通常大约8-50个氨基酸残基，典型地，9-30个氨基酸残基。所述标签可以与多聚体中的一或多个嵌合多肽连接，并使检测所述多聚体或者从样品或混合物中回收所述多聚体成为可能。这种标签为众所周知的，且可容易地合成和设计。示例性的标签多肽包括用于亲和性纯化的那些标签，且包括FLAG标签、His标签、流感血凝素(HA)标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：2159-2165)、c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(见例如Evan et al.(1985)Molecularand Cellular Biology 5：3610-3616)，以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.(1990)Protein Engineering 3：547-553)。典型地，用于检测表位加标签的抗体的抗体在本文称作二抗。
如本文所用，标记或可检测部分是一种可检测标志物(例如荧光分子、化学发光分子、生物发光分子、造影剂(例如金属)、放射性核素、生色团、可检测肽，或者催化可检测产物形成的酶)，其可以直接或间接附着或连接于分子(例如抗体或其抗原结合片段，如本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段)或者与其关联，及可以在体内或体外检测。所述检测方法可以是本领域已知的任何方法，包括已知的体内和/或体外检测方法(例如通过目测成像、磁共振(MR)光谱、超声信号、X-射线、γ-射线光谱(例如正电子发射断层摄影术(PET)扫描、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、荧光光谱或吸收)。间接检测是指测量物理现象，如与所述可检测部分直接或间接结合的原子、分子或组合物的能量或粒子发射或吸收(例如检测与一抗(例如本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段)结合的标记的二抗或其抗原结合片段。
如本文所用，“核酸”是指至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，典型地，包括通过磷酸二酯键接合在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。术语“核酸”还包括核酸类似物，如肽核酸(PNA)、硫代磷酸DNA及其它这种类似物和衍生物或者其组合。核酸也包括DNA和RNA衍生物，其含有例如核苷酸类似物或者除了磷酸二酯键之外的“骨架”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸键、硫酯键或者肽键(肽核酸)。该术语还包括由核苷酸类似物、单链(有义或反义)和双链核酸形成的RNA或DNA的等价物、衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
如本文所用，分离的核酸分子是与所述核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子分开的核酸分子。“分离的”核酸分子，如cDNA分子，当是通过重组技术产生时可以是基本没有其它细胞材料或者培养基，或者当是化学合成时基本没有化合物前体或其它化合物。示例性的本文提供的分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域，“可操纵地连接”是指所述核酸区域彼此功能性相关。例如，编码前导肽的核酸可以与编码多肽的核酸可操纵地连接，从而所述核酸可以被转录和翻译，以表达功能性融合蛋白，其中所述前导肽实现融合多肽的分泌。在一些情况中，编码第一种多肽(例如前导肽)的核酸与编码第二种多肽的核酸可操纵地连接，所述核酸转录为单一mRNA转录物，但是所述mRNA转录物的翻译可导致两个多肽之一表达。例如，琥珀终止密码子可位于编码第一个多肽的核酸与编码第二个多肽的核酸之间，由此当导入部分琥珀阻抑物细胞(partial amber suppressor cell)中时，所得单一mRNA转录物可以翻译产生含有第一个和第二个多肽的融合蛋白，或者可以翻译仅产生第一个多肽。在另一实例中，启动子可以与编码多肽的核酸可操纵地连接，从而所述启动子调节或介导所述核酸的转录。
如本文所用，关于，例如，合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽，“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用，天然存在的α-氨基酸的残基是在自然界中发现的那20个α-氨基酸残基，其在人体内通过负载tRNA分子与其同源mRNA密码子的特异性识别掺入蛋白质中。
如本文所用，“多肽”是指共价结合的两或多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
如本文所用，“肽”是指长度为2至40或大约40个氨基酸的多肽。
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。为了本文的目的，所提供的抗体中含有的氨基酸包括20个天然存在的氨基酸(表3)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如其中α-碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，在本文提及的各个多肽的氨基酸序列中出现的氨基酸根据其熟知的三字母或一字母缩写识别(见表3)。在各种核酸分子和片段中出现的核苷酸以本领域常用的标准单字母命名法命名。如本文所用，“氨基酸残基”是指根据多肽在其肽键的化学消化(水解)形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基通常是“L”异构体形式。“D”异构体形式的残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与在J.Biol.Chem.，243：3557-59(1968)中所述及37 C.F.R.§§1.821-1.822采用的标准多肽命名法保持一致，氨基酸残基的缩写在表3中示出。
表3：对应表
本文中以公式表示的所有氨基酸残基序列具有从左至右方向，其是常规的氨基末端至羧基末端的方向。此外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表(表3)中列出的氨基酸，修饰的、非天然的和不常见的氨基酸。此外，在氨基酸残基序列的起始或末端处破折号“-”表示与另外的、一或多个氨基酸残基的序列或者与氨基末端基团如NH2或者与羧基末端基团如COOH的肽键。
在肽或蛋白质中，合适的保守氨基酸取代为本领域技术人员已知，通常可以进行取代而不改变所得分子的生物学活性。本领域技术人员意识到通常地在多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见例如Watson et al.，MolecularBiology of the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
这种取代可以根据如下表4所示的示例性的取代进行。
表4
原始残基 保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
其它取代也是允许的，可以根据经验确定或者根据其它已知的保守或非保守取代确定。
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指在多肽中出现的20个L-氨基酸。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有以天然氨基酸类似的结构但是已经结构性修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。非天然存在的氨基酸因此包括，例如，除了20个天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-立体异构体。示例性的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，包括但不限于2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(Baad)、β-丙氨酸/β-氨基-丙酸(Bala)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸/哌啶酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(Baib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链素(Des)、2，2’-二氨基庚二酸(Dpm)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟基赖氨酸(Hyl)、别-羟基赖氨酸(Ahyl)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、异锁链素(Ide)、别-异亮氨酸(Aile)、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、6-N-甲基赖氨酸(MeLys)、N-甲基缬氨酸(MeVal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)和鸟氨酸(Orn)。
如本文所用，DNA构建体是单链或双链的线性或环形DNA分子，其含有组合的DNA区段并以自然界中未发现的方式并列。DNA构建体的存在是人工操纵的结果，并包括所操纵的分子的克隆及其它拷贝。
如本文所用，DNA区段是具有指定属性的较大DNA分子的一部分。例如，编码指定多肽的DNA区段是较长DNA分子(如质粒或质粒片段)的一部分，当从5’至3’方向读取时，所述DNA区段编码所述指定多肽的氨基酸序列。
如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离白天然来源、在体外合成或者组合天然与合成分子制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写为nt)或碱基对(缩写为bp)为单位给出。术语核苷酸在上下文允许时用于单链和双链分子。当该术语用于双链分子时，其用于表示全部长度，且应理解相当于术语碱基对。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可以略为不同，其末端可以是交错的；因此双链多核苷酸分子内的全部核苷酸不是都可以配对的。这种未配对的末端通常长度不超过20个核苷酸。
如本文所用，通过使用重组DNA方法的重组方式产生是指使用熟知的分子生物学技术表达由克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用，“表达”是指由此通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以使用本领域已知的任何方法评估，所述方法包括例如确定从宿主细胞中产生的多肽的量的方法。这种方法可包括但不限于通过ELISA确定细胞裂解物中多肽的量、在凝胶电泳之后考马斯蓝染色、Lowry蛋白质测定以及Bradford蛋白质测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞也可以用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中包含的核酸复制，从而扩增所述核酸。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体被转化进合适的宿主细胞中时，从所述载体可以表达一或多个异源蛋白质。所述载体包括其中可以导入编码多肽或其片段的核酸的那些载体，典型地，通过限制性消化和连接进行。载体也可以包括含有编码多肽如修饰的抗-EGFR抗体的核酸的那些载体。所述载体用于将编码多肽的核酸导入宿主细胞中以扩增所述核酸或者表达/展示由所述核酸编码的多肽。所述载体典型地保留游离基因(episomal)，但是可以设计为实现将基因或其部分整合进基因组的染色体中。载体还涵盖人工染色体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这种运载工具的选择和应用为本领域技术人员熟知。载体也可以包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化病毒，其与外来基因可操纵地连接以(作为运载工具或穿梭载体)将所述外来的基因转移进细胞中。
如本文所用，“表达载体”包括能表达DNA的载体，所述DNA与能实现这种DNA片段表达的调节序列，如启动子区域，可操纵地连接。这种额外的区段可包括启动子和终止子序列，及任选可包含一或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、聚腺苷信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，在导入合适的宿主细胞中时使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些载体，及保留游离基因的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中的那些载体。
如本文所用，“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基序列或者核酸分子中的核苷酸序列。
如本文所用，“序列相同性”是指检测与参考多肽或多核苷酸之间对比相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列比对以鉴定相似性或相同性区域而确定。为了本文的目的，序列相同性通常通过比对鉴定相同残基而确定。所述比对可以是局部或整体的。可以鉴定所比较的序列之间的匹配、错配和缺口。缺口是在所比对的序列的残基之间没有氨基酸或核苷酸插入，由此比对相同或相似的特性。通常地，可以有内部或末端缺口。当使用缺口罚分时，序列相同性可以末端缺口不罚分而确定(例如末端缺口不罚分)。或者，序列相同性可以不考虑缺口，以相同位置数/所比对的序列总长度×100确定。
如本文所用，“整体比对”是从开始至末端对比两个序列，每个序列中的每个字母仅比对一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，均进行比对。例如，基于“整体比对”的50％序列相同性是指在比对两个对比序列的全长序列中，在每100个核苷酸长度，50％的残基是相同的。应理解甚至在比对的序列的长度不相同时，整体比对也可以用于确定序列相似性。除非选择“末端缺口不罚分”，在确定序列相同性中考虑序列末端的不同。通常地，在其全长具有明显相似性的序列上使用整体比对。示例性的进行整体比对的算法包括Needleman-Wunsch算法(Needleman et al.J.Mol.Biol.48：443(1970)。示例性的进行整体比对的程序是可公开获得的，包括在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上可获得的整体序列比对工具及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可获得的程序。
如本文所用，“局部比对”是比对两个序列，但是仅比对序列中呈现相似性或相同性的那些部分。因此，局部比对确定一个序列的亚区段是否存在于另一序列中。如果无相似性，无比对结果返回。局部比对算法包括BLAST或Smith-Waterman算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))。例如，基于“局部比对”的50％序列相同性是指在任何长度的两个所对比序列的全长序列比对中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性的区域具有50％在所述相似性或相同性区域中相同的残基。
为了本文的目的，序列相同性可以通过标准比对算法程序确定，使用由每个供应商确立的默认参数进行。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元对比矩阵(含有相同性数值为1，无相同性为0)及Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14：6745(1986)的加权对比矩阵，如Schwartz and Dayhoff， eds.，Atlas of Protein Sequence and Structure，NationalBiomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口中每个符号额外罚分0.10；及(3)末端缺口不罚分。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同性”或其它列举百分比相同性的相似变化的核苷酸序列或者任两个多肽是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同性”或其它列举百分比相同性的相似变化的氨基酸序列，可以使用已知的计算机算法基于局部或整体比对而确定(见例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，其提供了很多已知的和可公开获得的比对数据库和程序的链接)。通常地，为了本文的目的，序列相同性是使用计算机算法基于整体比对确定的，如可得自NCBI/BLAST
(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&Page_TYPE＝BlastHome)的Needleman-Wunsch整体序列比对工具；LAlign(William Pearson implementing theHuang and Miller algorithm(Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357))；及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可获得的来自Xiaoqui Huang的程序。典型地，每个所比较的多肽或核苷酸的全长序列在整体比对中对每个序列的全长进行比对。当所比较的序列长度基本相同时，也可以使用局部比对。
因此，如本文所用，术语“相同性”是指检测多肽或多核苷酸与参考多肽与多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸90-100％的百分比相同性。在90％或更高水平的相同性表示假设例如比较长度为100个氨基酸或核苷酸的检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸，所述检测多肽或多核苷酸中不超过10％(100中的10个)的氨基酸或核苷酸不同于参考多肽或多核苷酸的氨基酸或核苷酸。相似性比较可以在检测与参考多核苷酸之间进行。这种差别可以在氨基酸序列整个长度随机分布的点突变表示，或者其可以集簇在不同长度的一或多个位置直至最大允许度，例如10/100氨基酸不同(大约90％相同性)。差异也可以是由于氨基酸残基的删除或截短所致。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或删除。根据所比较的序列的长度，在大约85-90％以上的同源性或相同性水平，结果可不依赖于程序和缺口参数设定；这种高水平相同性可容易地评估，通常不依靠软件确定。
如本文所用，二硫键(也称作S-S键或者二硫桥)是源自巯基基团偶联的单一的共价键。蛋白质中的二硫键是在半胱氨酸残基的巯基基团之间形成的，且稳定多肽结构域如抗体结构域之间的相互作用。
如本文所用，“偶联”或者“缀合”是指通过共价或非共价相互作用附着。
如本文所用，当涉及一种部分如诊断性或治疗性部分与抗体或其抗原结合片段附着时，短语“与抗体缀合”或者“与抗体连接”或者其语法变化，是指所述部分与所述抗体或其抗原结合片段通过任何已知的用于连接肽的方式附着，例如通过重组方式或者翻译后通过化学方式产生融合蛋白。缀合可以采用各种连接剂中之任一以实现缀合，包括但不限于肽或化合物接头或者化学交联剂。
如本文所用，“Maytansinoid药物部分”是指抗体-药物缀合物亚结构，其具有美登素化合物的结构。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(U.S.Pat.No.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生maytansinoid，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。已经报道了合成的美登醇和美登醇类似物。见例如美国专利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533以及Kawai etal(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451。
“游离半胱氨酸氨基酸”是指具有巯基官能团(-SH)及未配对为分子内或分子间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基。其可以工程化进亲代抗体中。
如本文所用，“接头”、“接头单位”或者“连接”是指含有原子链的肽或化学部分，其使抗体共价附着于药物部分或治疗性部分。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet，(1991)Annu.Rev.Immunol，9：457-92第464页的表3中概括了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定(美国专利No.5,500,362；美国专利No.5,821,337)。这种测定的有用的效应细胞包括周围血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。二者选一或者另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，如在Clynes et al(1998)PNAS(USA)，95：652-656中公开的动物模型。
如本文使用，“治疗性活性“是指治疗性多肽的体内活性。通常地，治疗性活性是与疾病或病症的治疗相关的活性。例如，抗-EGFR抗体的治疗性活性包括对EGFR磷酸化、信号传导(signaling)和细胞生长的抑制性活性，及特别是对肿瘤细胞生长的抑制性活性。修饰的多肽的治疗性活性可以是未修饰多肽的任何水平的治疗活性百分比，包括但不限于与未修饰多肽相比其治疗性活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高。
如本文所用，术语“评估”包括定量和定性确定，这是从获得存在于样品中的蛋白质如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的活性的绝对值的意义上说，也是从获得表示活性水平的指数、比率、百分比、图像及其它值的意义上说。评估可以是直接或间接的。
如本文所用，“疾病或紊乱”是指生物体中的病理学状况，其由于包括但不限于感染、获得性病症、遗传病症等的原因或病症，且特征在于可辨认的症状。
如本文所用，“EGFR-相关疾病或病症”或者“应答抗-EGFR抗体治疗的病症”是指与异常EGFR信号传导或EGFR过表达相关或由其导致的任何疾病或病症。这种疾病和病症为本领域已知，并在本文中描述了这种疾病的实例。例如，EGFR-相关疾病或病症或者应答抗-EGFR抗体治疗的病症包括癌症，例如但不限于结肠直肠癌、头颈鳞状细胞癌及非小细胞肺癌。
如本文所用，“治疗”患有疾病或病症的对象是指在治疗后所述对象的症状部分或全部减轻，或者保持稳定。因此，治疗涵盖了预防、治疗和/或治愈。预防是指预防潜在的疾病和/或预防疾病症状恶化或疾病进展。治疗也涵盖了本文提供的任何抗体或其抗原结合片段或者本文提供的组合物的任何药物应用。
如本文所用，“预防”或者其语法等价形式是指降低发生疾病或病症的风险的方法。
如本文所用，“药物有效剂”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂、常规治疗药物包括小分子药物和治疗性蛋白质。
如本文所用，“治疗作用”是指由治疗对象造成的作用，所述治疗改变，典型地，改良或减轻疾病或病症的症状，或者治愈疾病或病症。
如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指在给对象施用后至少足以产生治疗作用的药剂、化合物、材料或者含有化合物的组合物的量给对象施用。因此，这是预防、治愈、减轻、阻止或部分阻止疾病或紊乱的症状所必需的数量。
如本文所用，“治疗效力”是指药剂、化合物、材料或者含有化合物的组合物在已经施用所述药剂、化合物、材料或含有化合物的组合物的对象中产生治疗作用的能力。
如本文所用，“预防有效量”或者“预防有效剂量”是指当给对象施用时具有想要的预防作用的药剂、化合物、材料或含有化合物的组合物给对象施用的量，所述预防作用例如预防或延迟疾病或症状的发生或复发、降低疾病或症状发生或复发的可能性、或者降低病毒感染的发生率。通过施用一剂不必须出现完全的预防作用，可以仅在施用一系列剂量之后出现。因此，预防有效量可以在一或多次施用中施用。
如本文所用，通过治疗如通过施用药物组合物或者其它治疗剂减轻特定疾病或紊乱的症状是指因为施用所述组合物或治疗剂或与其相关的任何所述症状的永久或短暂的、持续的或瞬时的减轻。
如本文所用，“前药”是药物活性物质的前体或衍生形式，所述药物活性物质与亲代药物相比对于肿瘤细胞的细胞毒性较低，且能酶促激活或者转变为活性更高的亲代形式(见例如Wilman，1986，Biochemical Society Transactions，615th Meeting Belfast，14：375-382；及Stella et al.，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery，”Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，(ed.)：247-267，Humana Press，1985)。
如本文所用，“抗癌剂”是指对恶性细胞和组织具有破坏性或毒性的任何药剂。例如，抗癌剂包括杀死癌细胞或者另外抑制或削弱肿瘤或癌细胞生长的药剂。示例性的抗癌剂是化疗剂。
如本文所用，“抗血管发生剂”或者“血管发生抑制剂”是阻断或者干扰血管发生的化合物。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是由于表达EGFR受体家族成员的非癌细胞过度生长导致的病症。
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，如人。
如本文所用，患者是指人患者。
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴；啮齿类动物如小鼠和大鼠；家禽如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；猪和其它动物。非人动物是除人以外的动物。本文提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数多肽是动物来源，包括哺乳动物来源。
如本文所用，“组合物”是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水溶液、非水溶液或者其任何组合。
如本文所用，“组合”是指两或多个项目之间或之中的关联。所述组合可以是两或多个单独的项目，如两个组合物或两个集合，可以是其混合物，如两或多个项目的单一混合物，或者其任何变化。组合的元件通常是功能关联或相关的。
如本文所用，组合治疗是指施用两或多种不同的治疗，如抗-EGFR抗体(或其抗原结合片段)及一或多种治疗。可以提供并单独、相继、间隔施用不同的治疗剂，或者可以在一个组合物中提供。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，其任选地包括其它元件，如另外的试剂和使用所述组合或其元件的说明书，用于以下目的，包括但不限于激活、施用、诊断和评估生物学活性或性质。
如本文所用，“单位剂量形式”是指如本领域已知地适于人和动物对象的物理分立的单位，并单独包装。
如本文所用，“单一剂量配制物”是指直接施用的配制物。
如本文所用，多剂量配制物是指含有多个剂量的治疗剂的配制物，其可以直接施用以提供几个单一剂量的治疗剂。所述剂量可以在几分钟、几小时、几周、几天或几个月期间施用。多剂量配制物可允许剂量调节、剂量合并和/或剂量分开。由于多剂量配制物使用一段时间，因此其通常含有一或多种防腐剂以防止微生物生长。
如本文所用，“生产的产品”是制造和销售的产物。如在本申请中所用，该术语涵盖在包装品中包含的本文提供的任何组合物。
如本文所用，“液体”是指可以流动的任何组合物。因此液体涵盖半固体、糊、溶液、水相混合物、凝胶、乳液、乳霜形式的组合物及其它这种组合物。
如本文所用，分离的或纯化的多肽或蛋白质(例如分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物学活性部分(例如分离的抗原结合片段)基本没有来自所述蛋白质所源自的细胞或组织的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当其是化学合成的时，基本没有化合物前体或其它化合物。如果制备物呈现出通过本领域技术人员用这些方法评估纯度的标准分析方法所确定的没有可容易地检测到的杂质，可确定其是基本游离的或者足够纯的，由此进一步纯化不显著改变所述物质的物理和化学性质，如酶和生物学活性，所述分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)。纯化化合物以产生基本化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加化合物的特异性活性。如本文使用，“细胞提取物”或者“裂解物”是指从裂解的或破坏的细胞中产生的制备物或流分。
如本文所用，“对照”是一种样品，其除了不用检测参数处理之外与检测样品是基本相同的，或者如果其是血浆样品，其可以来自未受感兴趣的病症影响的正常志愿者。对照还可以是内部对照。
如本文所用，除非上下文明确指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数的所指对象。因此，提及一种多肽，其包含“一个免疫球蛋白结构域”包括具有一或多个免疫球蛋白结构域的多种多肽。
如本文所用，除非特别指出是指仅一个选项或者选项是互斥的，术语“或者”用于是指“和/或”。
如本文所用，范围和量可以表示为“大约”的特定数值或范围。大约也包括精确量。因此，“大约5个氨基酸”是指“大约5个氨基酸”，也指“5个氨基酸”。
如本文所用，“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或事实发生或不发生，及该描述包括其中所述事件或事实发生的情况及不发生的情况。例如，任选地变体部分是指所述部分是变体或非变体。
如本文所用，除非另外指出，任何保护基团、氨基酸及其它化合物的缩写根据其常用用法、公认的缩写或者IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(see，Biochem.(1972)11(9)：1726-1732)。
为了公开清楚，但非限制性地，本发明的详细描述分成如下章节。
B.EGFR和抗-EGFR抗体
抗-EGFR抗体是已知的，并且对于各种适应征得到认可，所述适应征包括转移的结肠直肠癌(MCRC)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)和非小细胞肺癌(NSCLC)。抗-EGFR抗体包括但不限于(西妥昔单抗，C225或IMC-C225)、Zhu的11F8(WO 2005/090407)、EMD 72000(马妥珠单抗)、维克普比TM(帕尼单抗；ABX-EGF)、TheraCIM(尼妥珠单抗)和Hu-Max-EGFR(zalutumumab)。然而，当给给对象施用施用时，这些治疗性抗体导致对对象的不良副作用(Eng C.(2009)Nat.Rev.Clin.Oncol.，6：207-218)。这限制了其应用。例如，抗-EGFR抗体与显著的和特征性的不良事件相关，如皮肤毒性和消化障碍(包括恶心、呕吐、腹泻)，其通常导致中断给药和治疗中止。例如，EGFR在皮肤的前角化细胞和基底细胞中高表达。抗-EGFR抗体的阻塞皮肤前体中EGFR信号传导导致皮肤前体生长抑制、细胞凋亡和炎症。这样可导致皮肤毒性，如皮疹及其它皮肤损害。
本文发现副作用可以通过提供这样的抗体而降低，所述抗体呈现出在靶向疾病组织如肿瘤具有增加的活性，但是在非疾病组织或器官、特别是与副作用相关的组织位点(例如皮肤或真皮的基底层)的活性降低。作为治疗，抗-EGFR抗体的活性主要靶向于肿瘤环境，所述环境呈现出酸性pH及增高的乳酸盐水平，例如在10-15mM乳酸盐之间。
相反，许多副作用定位的真皮呈现出中性pH和正常乳酸盐水平。实体肿瘤特征性的条件状况如低pH和缺氧的不同可以以杠杆作用提供在肿瘤的疾病微环境中活性更高的抗体。因此，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其在肿瘤微环境中是具有条件活性的，及与在正常组织中相比在肿瘤微环境中存在的条件下呈现出改变的活性或增加的活性。例如，本文提供的抗体在低pH和/或高乳酸盐条件下比在中性pH或低乳酸盐条件下活性更高。作为这种改变的活性的结果，用所述抗体处理的对象具有较少和/或降低的副作用。
特别地，本文提供了抗-EGFR抗体，其在中性pH条件下与在较低pH如pH5.8-6.8、如肿瘤的酸性pH环境条件下相比呈现出降低的活性，例如结合活性。在另一实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体在增高的乳酸盐浓度如在10-15mM乳酸盐浓度下呈现出增加的活性，例如结合活性。在其它的实例中，本文提供的抗-EGFR抗体在降低的pH和增高的乳酸盐水平条件下以增加的活性，如结合活性，结合。本文提供的抗-EGFR抗体呈现出改变的活性，由此当施用时其赋予降低的或较少的副作用。
1.EGFR
表皮生长因子受体(Uniprot登记号P00533；SEQ ID NO：6)是一种170kDA的I型糖蛋白。EGFR是受体酪氨酸激酶ErbB家族的成员，包括HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR存在于细胞表面，并含有三个结构域，包括胞外配体结合结构域、胞内酪氨酸激酶结构域和跨膜亲脂性区段。除了其存在于肿瘤细胞表面之外，表皮生长因子受体是普遍存在的，随机分布在正常细胞表面上，但不包括造血细胞和表皮来源细胞。
表皮生长因子受体(EGFR；也称作受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-1、ErbB-1、HER1)是一种酪氨酸激酶生长因子受体，参与对于细胞生长、增殖、存活和迁移重要的信号级联。EGFR活性通过内源性配体如表皮生长因子(EGF)以及其它内源性EGF样配体包括TGF-α、双调蛋白、结合肝素的EGF(HB-EGF)和β细胞素的结合而刺激或激活。基于配体结合，配体-EGFR复合物经历二聚化及在细胞中内在化。EGFR与其它单体EGFR分子形成同源二聚体，或者与另一HER受体如HER2、ErbB-3或ErbB-4形成异源二聚体。EGFR二聚化发动内在的细胞内蛋白质-酪氨酸激酶活性。从而，二聚化通过在细胞质尾部中的酪氨酸残基自主磷酸化而激活细胞内蛋白质激酶。这些磷酸酪氨酸残基作为下游效应子的停靠位点，如适体(adaptor)分子和导致各种信号转导途径的起始的酶，包括有丝分裂原激活的蛋白激(MAPK)、Akt/磷脂酰肌醇-3-OH激酶(PI3K)和c-Jun N-末端激酶(JNK)，从而调节参与DNA合成、细胞增殖、细胞迁移、细胞存活和细胞粘附的各种促有丝分裂机制。
通过激活的生长因子受体的异常信号转导在许多实体肿瘤中是常见的(Yardenand Sliwkowski(2001)Nat Rev Mol Cell Biol 2：127-137)。EGFR已经在许多实体人肿瘤中观测到，包括神经胶质瘤和结肠癌、头颈癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌和膀胱癌(Herbst and Hong(2002)Seminars in Oncology 29(5)Suppl.14：18-30)。正是如此，EGFR是抗癌治疗的有吸引力的靶。EGFR在调节细胞存活和细胞凋亡、血管发生、细胞迁移和转移中起重要作用(Herbst et al.(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1(4)：719-732)。异常EGFR信号传导和EGFR过表达已经在各种癌症中观测到，并与不良的预后和增高的扩散或转移危险相关(Herbst et al.(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1(4)：719-732)。EGFR激活与血管内皮生长因子(肿瘤血管发生的刺激物)分泌的显著的上调相关(Petit atal.(1997)Am J Pathol151：1523-1530)。
2.抗-EGFR抗体及副作用
靶向和抑制异常EGFR信号传导的治疗剂包括抗-EGFR抗体。抗-EGFR抗体通过与表皮生长因子受体(EGFR)结合而起作用。抗-EGFR抗体通过竞争及抑制配体如EGF与EGF的胞外配体结合结构域的结合而起作用。结果是细胞质结构域磷酸化及所得信号转导事件被抑制。因此，抗-EGFR抗体可以是通过阻断EGFR-介导的细胞信号传导和细胞生长成为有效的治疗剂。
然而，抗-EGFR抗体不能区分癌细胞和正常细胞，因此不良的副作用是常见的。例如，EGFR广泛分布于上皮组织，导致许多EGFR抑制剂共有的皮肤毒性(Herbst and Hong(2002)Seminars in Oncology 29(5)Suppl.14：18-30)。在人皮肤中，EGFR在基底角化细胞中表达，并可以刺激表皮生长、抑制分化及促进伤口愈合(Lacouture and Melosky(2007)Skin Therapy Lett.12，1-5；Nanney et al.(1990)J.Invest.Dermatol 94(6)：742-748；Lacouture，M.E.(2006)Nat Rev Cancer 6：803-812)。EGFR功能的抑制可削弱角化细胞的生长和迁移，引起炎症性趋化因子表达，导致皮疹(Lacouture，M.E.(2006)Nat Rev Cancer6：803-812)。在用EGFR抑制剂处理时增加的角化细胞的细胞凋亡与用EGFR抑制剂治疗的对象中皮疹的发生相关(Lacouture，M.E.(2006)Nat Rev Cancer 6：803-812)。角化细胞位于基底层，即皮肤的最深层，其pH在7.0-7.2之间。真皮内的血管提供营养和表皮废物清除，从而使得表皮，特别是基底层最易受全身循环的抗-EGFR治疗的影响。
与抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相关的最常见的副作用是皮肤病学反应，在45-100％的患者中可见(Le and Perez-Soler(2009)Target Oncol4：107-119)。常见的皮肤病学反应包括痤疮样皮疹、丘疹脓疱性皮疹、毛发生长异常、干燥和发痒的皮肤以及触痛性甲周炎症(Eng(2009)Nat Rev Clin Oncol 6：207-218；Monti et al.(2007)Int J BiolMarkers 22：S53-S61；Saif and Kim(2007)Expert Opin Drug Saf6：175-182)。另外的皮肤病学反应包括毛细管扩张、色素沉着、无皮疹瘙痒症、红斑和口腔溃疡(Eng(2009)NatRev Clin Oncol 6：207-218)。西妥昔单抗在大约5-15％患者中激发免疫应答，一些患者报道有严重过敏性反应(Chung et al.(2008)N Engl J Med 358：1109-1117)。这些超敏性反应与西妥昔单抗上的半乳糖-α-1，3-半乳糖寡糖相关，其诱导IgG抗体产生(Chung et al.(2008)N Engl J Med 358：1109-1117)。进一步的副作用包括肺毒性，包括呼吸困难、咳嗽、哮喘、肺炎、血氧不足、呼吸功能不全/呼吸衰竭、肺栓塞、胸腔积液和非特异性呼吸紊乱(Hoag et al.(2009)J Experimental&Clinical Cancer Research 28：113)。其它副作用包括发热、发冷、乏力/不适、粘膜表面问题、恶心、胃肠道问题、腹痛、头痛和低镁血症(Eng(2009)Nat Rev Clin Oncol 6：207-218；Fakih and Vincent，(2010)Curr.Oncol.17(S1)：S18-S30；Int.Pat.No.WO2011059762)。
本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体呈现出与非肿瘤细胞靶位相比的肿瘤细胞选择性，所述非肿瘤细胞如基底角化细胞及其它基底细胞。因此，具有条件活性的抗-EGFR抗体与目前使用的抗-EGFR抗体相比当给患者施用时可导致降低的副作用，包括消除、最小化或降低全身性副作用，包括皮肤毒性，同时保留其阻断EGFR信号传导的能力。其与现有的治疗剂相比也允许给药以实现增加的效力。
3.西妥昔单抗
本文提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体包括修饰的抗-EGFR抗体，其与抗-EGFR抗体西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体(例如人源化形式西妥昔单抗，如Hu225)相比是修饰的。西妥昔单抗(也称作C225或IMC-C225)是小鼠/人嵌合的IgG1单克隆抗体，其结合人表皮生长因子受体。西妥昔单抗衍生自M225，其使用来自人A431鳞状细胞癌细胞的EGFR作为免疫原进行鉴定(Gill et al.(1984)J Biol Chem 259：7755-7760；Sato et al.，(1983)Mol Biol Med 1：511-529；Masui et al.，(1984)Cancer Res44：1002-1007；Kawamoto et al.(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：1337-1341)。M225抑制表皮生长因子与EGF受体结合，是EGF刺激的酪氨酸激酶活性的体内拮抗剂(Gill et al.(1984)J BiolChem 259：7755-7760)。
a.结构
西妥昔单抗是全长小鼠/人嵌合的IgG1抗体。全长抗体含有四个多肽链，两个相同的重(H)链(每个通常含有大约440个氨基酸)和两个相同的轻(L)链(每个含有大约220个氨基酸)。轻链以两种不同的形式存在，称作kappa(κ)和lambda(λ)。每个链被组织成一系列组织为免疫球蛋白(Ig)结构域的结构域。Ig结构域特征在于称作Ig折叠的结构，其含有两个β-折叠片，每个均含有通过环连接的反平行β链。Ig折叠中这两个β片层通过疏水性相互作用和一个保守的链内二硫键夹心在一起。抗体链中多个Ig结构域被组织成可变(V)结构域和恒定(C)区结构域。可变结构域通过称作互补决定区(CDR)或超变区(HV)的三部分赋予所述抗体抗原特异性。CDR区域在抗体中被明确定义并普遍地编号(见例如Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，及Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；AbM(Martin et al.(1989)Proc NatlAcad Sci USA 86：9268-9272；Martin et al.(1991)Methods Enzymol 203：121-153；Pederson et al.(1992)Immunomethods 1：126)。这三个重链CDR和三个轻链CDR一起组成抗体的抗原结合位点(抗体结合位点)，其与同源抗原物理性相互作用并提供抗体的特异性。恒定区促进补体和效应细胞活化。如同CDR区域，恒定区在抗体中使用EU索引和Kabat编号方案进行明确定义及普遍地编号，(见例如Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。轻链具有两个结构域，对应C区(CL)和V区(VL)。重链具有四个结构域，V区(VH)及C区中的三或四个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，及在一些情况中具有铰链区。每条重链通过二硫键与轻链连接，两个重链通过二硫键彼此连接。重链的连接是通过已知称作铰链区的重链柔性区介导的。
西妥昔单抗含有来自小鼠单克隆抗体225(M225)的可变区和人恒定区，包括人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：1069)和人Cκ轻链恒定区(SEQ ID NO：1071)。西妥昔单抗的完全重链具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO：1111所示的核苷酸序列编码，轻链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO：1110所示的核苷酸序列编码。重链由小鼠可变结构域(VH，SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-119，如SEQ ID NO：3示出)及人恒定区结构域CH1-CH2-铰链区-CH3，包括CH1(SEQ ID NO：1的氨基酸残基120-222)、铰链区(SEQ IDNO：1的氨基酸残基223-238)、CH2(SEQ ID NO：1的氨基酸残基239-342)及CH3(SEQ ID NO：1的氨基酸残基343-449)，组成。轻链由小鼠可变结构域(VL，SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-107，如SEQ ID NO：4示出)及人κ轻链恒定区(Cκ，SEQ ID NO：2的氨基酸残基108-213)组成。
西妥昔单抗的CDR包括VH CDR 1(SEQ ID NO：3的氨基酸残基26-35，根据AbM定义(Martin et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9268-9272；Martin et al.(1991)Methods Enzymol 203：121-153；Pedersen et al.(1992)Immunomethoda 1：126)，或者SEQID NO：3的氨基酸残基31-35，根据Kabat定义，分别如SEQ ID NO：14和15所述)；VH CDR 2(SEQ ID NO：3的氨基酸残基50-65，如SEQ ID NO：16所示)；VH CDR 3(SEQ ID NO：3的氨基酸残基98-108，如SEQ ID NO：17所示)；VL CDR 1(SEQ ID NO：4的氨基酸残基24-34，如SEQID NO：18所示)；VL CDR 2(SEQ ID NO：4的氨基酸残基50-56，如SEQ ID NO：19所示)；及VLCDR 3(SEQ ID NO：4的氨基酸残基89-97，如SEQ ID NO：20所示)。
根据Kabat编号(Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)，西妥昔单抗的CDR包括VH CDR 1(氨基酸残基26-35，根据AbM定义，或者氨基酸残基31-35，根据Kabat定义)；VH CDR 2(氨基酸残基50-65)；VH CDR 3(氨基酸残基95-102)；VLCDR 1(氨基酸残基24-34)；VL CDR 2(氨基酸残基50-56)；及VL CDR 3(氨基酸残基89-97)。
先前已经确定与EGFR的胞外结构域(sEGFR)结合的西妥昔单抗Fab的晶体结构(Liet al.，(2005)Cancer Cell 7：301-311)。西妥昔单抗通过部分重叠天然配体表皮生长因子的表位结合表皮生长因子受体的结构域III(SEQ ID NO：6的氨基酸残基310-514)。西妥昔单抗的残基L27Gln、L50Tyr、L94Trp、H52Trp、H58Asp、H101Tyr、H102Tyr、H103Asp和H104Tyr与sEGFR的结构域III接触。西妥昔单抗的轻链通过西妥昔单抗的VLCDR 1残基L27Gln结合sEGFR的残基N473结合EGFR的C-末端结构域。VH CDR 3残基H102Tyr突出进入结构域III的大β片层表面上的疏水性口袋内，与sEGFR的Q384和Q408的谷氨酰胺侧链产生氢键。VH CDR 2和VH CDR 3位于疏水性口袋，通过sEGFR的H52Trp和S418与sEGFR的H104Tyr和S468之间侧链与侧链间氢键、H54Gly和H103Asp羰基氧与sEGFR S440和R353之间的侧链与主链相互作用及H56Asn与sEGFR的S418和Q384之间的间接氢键锚定。除了阻断EGF与sEGFR的结合，西妥昔单抗的可变重链空间上阻断结构域I，从而防止结构域II形成(adopt)二聚化必需的构象。
已经报道并已知西妥昔单抗的其它变体。Hu225，一种人源化形式西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的可变重链及具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的可变轻链。与西妥昔单抗(225)相比，Hu225含有在框架区氨基酸残基的氨基酸置换，包括在可变轻链(VL)中的置换(取代)，在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：29所示的Hu225VL)中位置9的缬氨酸(V)由甘氨酸(G)置换、I10T、V13L、V19A、S20T、F21L、R39K、T40P、N41G、G42Q、S43A、S60D、S74T、N76S、S77R、V78L、S80P、I83F、D85V、A100Q和L106I，及可变重链(VH)中的置换(取代)，在对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：28所示的Hu225VH)中位置1的谷氨酰胺(Q)由谷氨酸(E)置换、K5V、Q6E、P9G、S16G、Q17G、S19R、I20L、T21S、T23A、V24A、S40A、S68T、S76N、Q77T、F79Y、F80L、K81Q、Q86R、S87A、N88E、I92V和A119S。其它的西妥昔单抗变体包括具有SEQ ID NO：8所示的重链和SEQ ID NO：9所示的轻链的那些变体。已经描述及本领域已知许多其它变体(见例如美国专利No.7,657,380、7,930,107、7,060,808、7,723,484，美国专利公开No.2011014822、2005142133、2011117110，国际专利公开No.WO2012003995、WO2010080463、WO2012020059、WO2008152537及Lippow et al.(2007)Nat Biotechnol.25(10)：1171-1176所述)。本文所述修饰可以在任何西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体中，包括本领域已知的任何抗体中。
b.功能
西妥昔单抗结合正常和肿瘤细胞上的EGFR的胞外结构域，阻止配体结合及随后的活化(Li et al.，(2005)Cancer Cell 7：301-311；Blick et al.，(2007)Drugs 67(17)：2585-2607)。西妥昔单抗竞争性抑制表皮生长因子与转化生长因子α(TGF-α)的结合，阻止细胞生长及转移扩散。即西妥昔单抗的结合阻断酪氨酸受体激酶的磷酸化和活化，导致细胞生长抑制、诱导细胞凋亡、降低基质金属蛋白酶分泌及降低血管内皮细胞生长因子产生。西妥昔单抗通过抑制血管发生也可以诱导抗肿瘤作用。西妥昔单抗以剂量依赖性方式抑制VEGF、IL-8和bFGF在高度转移性的人TCC 253JB-V细胞中表达，并降低微血管密度(Perrotte et al.(1999)，Clin.Cancer Res.，5：257-264)。西妥昔单抗可在体外和体内下调肿瘤细胞中VEGF表达(Petit et al.(1997)，Am.J.Pathol.，151：1523-1530；Prewett etal.(1998)，Clin.Cancer Res.4：2957-2966)。西妥昔单抗也参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和受体内在化。
C.修饰的抗-EGFR抗体及具有条件活性抗-EGFR抗体
本文提供了具有条件活性的抗-EGFR抗体或抗原结合片段，如修饰的或变体抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其在肿瘤微环境中与在非患病或非肿瘤微环境如皮肤或皮肤基底层中相比呈现出更高或更强的活性。这种抗体包括在肿瘤环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境(例如皮肤基底层)中存在的条件下相比呈现出较高的人表皮生长因子受体(EGFR)或其可溶片段的结合活性。由于在肿瘤微环境中呈现出较高的结合活性，本文提供的抗-EGFR抗体呈现出针对肿瘤的选择性活性，及在非肿瘤微环境中对细胞的降低的结合活性。这种通过其条件性结合活性实现的选择性使对非肿瘤细胞如皮肤基底角化细胞的不希望的活性最小化。因此，当给对象施用本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段时，其赋予降低的或较少的副作用。
改变的pH微环境是在肿瘤微环境中发现的最常见的微环境(见例如FoghAndersen et al.(1995)Clin.Chem.，41：1522-1525；Bhujwalla et al.(2002)NMRBiomed.，15：114-119；Helmlinger et al.(1997)Nature Med.，3：177；Gerweck andSeetharaman(1996)，Cancer Res.56(6)：1194-1198)。例如，在许多肿瘤中，“Warburg效应”产生pH范围在5.6-6.8的微环境。也已经发现升高的乳酸盐水平与多种肿瘤相关，包括但不限于头颈癌、转移性结肠直肠癌、子宫颈癌和鳞状细胞癌(见例如Walenta et al.(1997)American Journal of Pathology 150(2)：409-415；Schwickert et al.(1995)CancerResearch 55：4757-4759；Walenta et al.(2000)Cancer Research 60：916-921；Guo etal.(2004)J Nucl Med 45：1334-1339；Mathupala et al.(2007)J Bioenerg Biomembr39：73-77；Holroyde et al.(1979)Cancer Research 39：4900-4904；Schurr和(2007)Neuroscience 147：613-619；Quenneta et al.(2006)Radiotherapy and Oncology 81：130-135)。在许多肿瘤中，“Warburg效应”产生乳酸盐浓度在10-15mM之间的微环境。与肿瘤微环境相反，其中由施用抗-EGFR抗体造成的许多副作用所定位的真皮呈现出中性pH和正常的乳酸盐水平。
本文提供的抗-EGFR抗体、包括修饰的抗-EGFR抗体及任何抗-EGFR抗体的抗原结合片段，在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以较高的结合活性结合EGFR(特别是人EGFR)，所述肿瘤微环境包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一，非肿瘤微环境包括pH7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一。在肿瘤微环境中条件下与在非肿瘤微环境中条件下相比较高的结合活性可以是至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高的活性比率。
通常地，活性比率在存在生理水平蛋白质条件下呈现。在体内或生理环境中，间隙蛋白质浓度(如白蛋白)在任何地方均为血浆的20-50％。血清含有大约60-80g/L蛋白质，已经证实各种组织含有12mg/mL-40mg/mL间隙蛋白质(见例如Aukland and Reed(1993)Physiological Reviews，73：1-78)。因此，在这些条件下呈现出在体内选择性活性和条件活性的抗-EGFR抗体在存在10mg/mL-50mg/mL蛋白质、如至少12mg/mL-40mg/mL蛋白质(例如至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL或40mg/mL蛋白质)条件下呈现出活性比率，所述蛋白质可以在血清如人血清中提供，或者作为血清白蛋白如人血清白蛋白，或者与所述抗体或受体不相互作用的壳体蛋白质，或者另外直接改变抗体-受体相互作用的蛋白质提供。例如，所述蛋白质在血清中提供，在存在20％-50％血清(vol/vol)如20％-50％人血清如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％血清(vol/vol)条件下执行选择或鉴定抗-EGFR抗体的测定和方法。因此，在本文提供的特定实例中，本文提供的抗-EGFR抗体包括修饰的抗-EGFR抗体及任何抗-EGFR抗体的抗原结合片段在肿瘤微环境存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以较高的结合活性结合EGFR(特别是人EGFR)，所述肿瘤微环境包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，非肿瘤微环境包括pH 7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比的较高结合活性通常在这样的条件下存在，其中蛋白质浓度在肿瘤微环境条件下或在非肿瘤微环境条件下是基本相同或相同的。在特定的实例中，所述活性比率可以是至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
特别地，本文提供的抗体包括在存在10mg/mL-50mg/mL蛋白质如至少12mg/mL-40mg/mL蛋白质(例如至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL或40mg/mL蛋白质)的条件下，在pH 6.0-pH 6.5与在中性pH(例如7.4)条件下相比，以较高结合活性结合表皮生长因子受体(EGFR)的那些抗体。例如，本文提供的抗体包括在存在20％-50％血清(vol/vol)如20％-50％人血清如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％血清(vol/vol)的条件下，在pH 6.0-pH 6.5与在中性pH(例如7.4)相比，以较高结合活性结合表皮生长因子受体(EGFR)的那些抗体。例如，在pH6.0-pH 6.5条件下与在中性pH(例如pH7.4)条件下相比结合活性比率高于1.0，例如至少为或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
本文提供的具有条件活性抗体，包括本发明的修饰的抗-EGFR抗体，是在存在10mg/mL-50mg/mL蛋白质，如至少12mg/mL-40mg/mL蛋白质(例如至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL或40mg/mL蛋白质)的条件下，在升高的10-20mM的乳酸盐浓度与在0.5mM-5mM的乳酸盐浓度相比，以较高结合活性结合表皮生长因子受体(EGFR)的那些抗体。例如，本文提供的具有条件活性的抗体，包括本发明的修饰的抗-EGFR抗体，是在存在20％-50％血清(vol/vol)如20％-50％人血清如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％血清(vol/vol)条件下，在升高的10-20mM的乳酸盐浓度与在0.5mM-5mM的乳酸盐浓度相比，以较高结合活性结合表皮生长因子受体(EGFR)的那些抗体。例如，在10-20mM如大约16mM的乳酸盐条件下与在1mM-5mM条件下相比的结合活性比率高于1.0，例如至少为或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体在存在10mg/mL-50mg/mL蛋白质如至少12mg/mL-40mg/mL蛋白质(例如至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL或40mg/mL蛋白质)的条件下，在pH6.0或pH6.5及乳酸盐浓度为10mM-20mM条件下与在中性pH(大约pH 7.4)及乳酸盐浓度为1mM-5mM的条件下相比呈现出增加的结合活性。例如，本文提供的抗-EGFR抗体在存在20％-50％血清(vol/vol)如20％-50％人血清如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％血清(vol/vol)的条件下，在pH 6.0或pH 6.5及乳酸盐浓度为10mM-20mM与在中性pH(大约pH 7.4)及乳酸盐浓度1mM-5mM条件下相比，呈现出增加的结合活性。例如，在pH 6.0或6.5及10-20mM如大约16mM乳酸盐条件下与在中性pH(例如7.4)及1mM-5mM乳酸盐条件下相比结合活性比率大于1.0，例如至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
在肿瘤微环境中的上述条件下与在非肿瘤微环境中的条件下的结合活性比率可以基于本领域技术人员已知的评估抗体或抗原结合片段与EGFR(例如人EGFR)结合的任何方法确定或评估。示例性的测定法在章节D中描述。在一个实例中，所述结合活性是在肿瘤微环境中的任何上述条件下及在非肿瘤微环境中的任何上述条件下在体外在固相结合测定中确定的，如在免疫测定(例如酶联免疫吸附测定；ELISA)。在这种实例中，所述结合活性可以由分光光度度量表示(例如与应用的特定检测方法相容的光密度和吸光波长)，及结合活性比率可以是在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下在相同抗体浓度(例如抗体浓度为1ng/mL-100ng/mL)下相比的结合分光光度度量的比率。这在本文的实施例中进行例证。如果从分光光度度量或者在固相免疫测定中的其它相似定量测量中确定的活性比率高于1.0，例如至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高，则抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是具有条件活性的抗体。
在另一实例中，结合活性是以在肿瘤微环境中的任何上述条件下及在非肿瘤微环境中的任何上述条件下的结合的动力学测量(例如解离常数KD，结合常数KA，解离速率或其它结合亲和性的动力学参数)确定的。这种度量可以使用本领域技术人员已知的任何结合测定法确定。在特定的实例中，基于亲和性的生物传感器技术用作测量结合亲和性。示例性的生物传感器技术包括例如Biacore技术、BioRad ProteOn、Reichert、GWC技术、IBIS SPIR成像、Nomadics SensiQ、Akubio RAPid、ForteBio Octet、Iasys、Nanofilm及其它技术(见例如Rich et al.(2009)Analytical Biochemistry，386：194-216)。在这种实例中，结合活性可以解离常数(KD)表示，结合活性的比率可以是在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比的紧密亲和性的比率。例如，结合活性比率为至少2.0是指亲和性至少紧密2倍，结合活性比率为至少3.0是指亲和性至少紧密3倍，结合活性比率为至少4.0是指亲和性至少紧密4倍，结合活性比率为至少5.0是指亲和性至少紧密5倍，结合活性为至少10.0是指亲和性至少紧密10倍，其中每个比率均是在肿瘤微环境中的条件下与在非肿瘤微环境中的条件下相比。本文提供的抗-EGFR抗体或抗原结合片段在肿瘤微环境中存在的条件下典型地具有低于1x10-8M、5x10-9M、1x10-9M、5x10-10M、1x10-10M、5x10-11M、1x10-11M或更低的结合EGFR(例如人EGFR)或其可溶性片段的解离常数(KD)。在另一实例中，结合活性可以解离速率表示，结合活性的比率可以是在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比的koff比率。例如，至少2.0的结合活性比率是指抗体呈现出解离速率减慢至少2倍，至少3.0的结合活性比率是指抗体呈现出解离速率减慢至少3倍，至少4.0的结合活性比率是指抗体呈现出解离速率减慢至少4倍，至少5.0的结合活性比率是指抗体呈现出解离速率减慢至少5倍，至少10.0的结合活性比率是指抗体呈现出解离速率减慢至少10倍，其中每个比率均是在肿瘤微环境中的条件下与在非肿瘤微环境中条件下相比。这在本文的实例中进行了例证。如果使用结合的动力学度量确定的活性比率高于1.0，例如至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高，则抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是具有条件活性的。
在进一步的实例中，结合活性是在评估在肿瘤微环境中的结合及在非肿瘤微环境中的结合的体内结合活性测定中确定的。示例性的非肿瘤微环境是抗体与含有角化细胞的皮肤基底层结合。结合测定可以使用已知含有在各环境中表达EGFR的细胞的动物模型进行。特别地，所述动物模型表达人EGFR。例如，可以使用鼠动物模型或其它哺乳动物模型，其是通过异种移植方法以工程化微环境来含有表达人EGFR的肿瘤或非肿瘤细胞而产生。这在本文使用肿瘤异种移植方法(例如使用A431细胞或其它人肿瘤细胞)和皮肤异种移植方法例证。在这种实例中，对所述抗体或其抗原结合片段进行可检测标记，例如荧光标记。在这种实例中，所述结合活性可以产生的可检测信号表示(例如荧光信号强度)，结合活性的比率可以是在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下结合的可检测信号(例如荧光信号)的强度比率。染色强度可以通过根据对照或参考抗体的染色标准化。这在本文提供的实施例中例证。如果在两个环境中的体内结合中确定的活性比率高于1.0，例如至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高，则抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是具有条件活性的。
通过在肿瘤微环境中的条件活性，如在肿瘤微环境中存在的条件(例如低pH，如pH6.0，及增高的乳酸盐浓度如10-20mM)下增加的结合活性，本文提供的抗体在肿瘤微环境中与在非患病环境中相比呈现出针对EGFR的增加的抑制性活性。这种抑制性活性包括但不限于抑制配体诱导的磷酸化、二聚化和/或细胞生长。作为这种活性的结果，当给患有肿瘤如实体瘤的对象体内施用时，本文提供的抗体呈现出肿瘤生长抑制。肿瘤生长与不存在所施用的抗体的条件下的肿瘤生长相比可以抑制30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。当在肿瘤模型中评估时，本文提供的抗-EGFR抗体的功能活性可以低于、相似于或高于现有的抗-EGFR治疗，如西妥昔单抗治疗，只要在非患病组织中活性降低(例如皮肤皮疹发生率)。例如，本文提供的抗-EGFR抗体在体内动物肿瘤模型如本文所述A431模型中呈现出与西妥昔单抗相似的体内效力，与西妥昔单抗相比具有较低的结合亲和性(较高的Kd)。
本文提供的具有条件活性抗-EGFR抗体如本文提供的修饰的抗-EGFR抗体呈现出条件和选择性肿瘤特异性活性，由此在给对象施用时，与施用另一种现有的抗-EGFR治疗的对象相比，所述对象呈现出降低或减少的副作用，所述现有治疗例如是西妥昔单抗治疗(例如对应的形式的野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列)。例如，所提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出降低的皮肤毒性。皮肤毒性如皮疹可以通过本领域技术人员已知及本文描述的标准测定法评估。例如，本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出减少至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍或更高的皮疹，如在灵长类动物模型中评估。
本领域技术人员已知怎样鉴定或产生具有条件活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其在肿瘤微环境中比在非肿瘤微环境中呈现出更高的活性。例如，可以产生抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体的文库，及可以使用本文在章节D中描述的程序和方法筛选。在如下章节中，描述了示例性的抗-EGFR抗体，包括示例性的衍生自西妥昔单抗的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段或其变体，其呈现出上述改变的性质和活性。应理解当装配成抗体时，所得抗-EGFR抗体或其抗原结合片段最低限度含有可变重链和可变轻链或足以结合EGFR抗原(例如人EGFR)或其可溶片段的其部分。
1.修饰的抗-EGFR抗体
本文提供了修饰的或变体抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。所述修饰的抗-EGFR抗体包括具有条件活性的抗体，由此其在肿瘤微环境中比在非患病环境如皮肤或皮肤基底层中呈现出更高或更强的活性。本文提供的抗体是抗-EGFR抗体西妥昔单抗的变体或其衍生物。应理解当装配成抗体时，所得抗-EGFR抗体或其抗原结合片段最低限度含有可变重链和可变轻链或其足以结合EGFR抗原(例如人EGFR)或其可溶片段的部分，其中可变重链或轻链之一或这两个链是修饰的。如上文所述，这种修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包括这样的抗体，其在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以较高的结合活性结合EGFR(特别是人EGFR)，所述肿瘤微环境包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8(例如pH 6.0-6.5)的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM(例如10mM-20mM，如至少16mM)的乳酸盐浓度这两者或两者之一，非肿瘤微环境包括pH 7.0-7.8为大约pH 7.0-7.8(例如pH为7.0-7.4)的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM(例如1mM-4mM)的乳酸盐浓度这两者或两者之一。在肿瘤微环境中的条件下与在非肿瘤微环境中的条件下相比较高的结合活性可以是活性比率为至少或高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体包括在pH 6.0或pH 6.5与对应的形式的未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比呈现出增加或降低或相似的结合活性的那些抗体，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQID NO：8所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。在一些实例中，所述抗体在pH 6.0与对应的形式未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比呈现出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。通常地，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体在pH 6.0或pH 6.5与对应的形式未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比呈现出100％-500％，如至少100％或更高的(即增加的)结合活性，如为或大约或至少100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更高的结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。
在一些实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体在pH 7.4呈现出对应的形式的未修饰的西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体的30％-95％的EGFR结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗、其抗原结合片段或其变体如西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。例如，本文提供的抗-EGFR抗体在中性pH(例如pH7.4)呈现出不含有氨基酸修饰(例如置换)的参考或未修饰的西妥昔单抗的至少30％结合活性，如为或大约或至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的结合活性。在特别的实例中，本文提供的抗体在pH 6.0或pH 6.5与未修饰的西妥昔单抗抗体或其抗原结合片段或其变体在相同条件下的结合活性相比保留或呈现出相似或增加的结合活性，但是在中性pH(例如pH 7.4)与对应的形式未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体在pH 7.4相比呈现出降低的结合活性，如低于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ IDNO：9所示的轻链氨基酸序列。例如，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体包括与不含有所述修饰的参考抗-EGFR抗体相比在pH 7.4呈现30％-95％的EGFR结合活性及在pH 6.0呈现100％-500％的EGFR结合活性的那些抗体，所述参考抗-EGFR抗体如对应的形式的西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列或者具有SEQID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体包括在增高的乳酸盐水平例如10-20mM的乳酸盐呈现出降低的、增加的或相似的EGFR结合活性的那些抗体。通常地，所述抗体与对应的形式未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比在10-20mM乳酸盐浓度呈现出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在一些情况中，所述抗体在10-20mM乳酸盐浓度条件下与对应的形式的未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比呈现出增加的结合活性，例如100％-500％的活性，如高于100％的结合活性，例如至少或大约至少110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更高的结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。
在一些实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体在正常乳酸盐水平(例如0-5mM乳酸盐)与对应的形式未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体相比呈现出30％-95％的EGFR结合活性，所述未修饰的西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗，其具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。例如，本文提供的抗体在10-20mM乳酸盐条件下与西妥昔单抗的结合活性在相同条件下相比保留或呈现出相似的结合活性，但是在1mM-5mM乳酸盐条件下与对应的形式野生型西妥昔单抗在1mM-5mM条件下相比呈现出降低的结合活性，如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的结合活性，所述野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。在其它的实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与不含有修饰的参考的或未修饰的抗-EGFR抗体如对应的形式的野生型西妥昔单抗相比在正常乳酸盐水平(例如0-5mM乳酸盐)呈现出其30％-95％的EGFR结合活性，及在增高的乳酸盐水平(例如10-20mM乳酸盐)呈现出100％-500％的EGFR结合活性，所述野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。
在本文提供的示例性的实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与不含有修饰的参考的抗-EGFR抗体如对应的形式野生型西妥昔单抗相比在pH 7.4呈现出30％-95％的EGFR结合活性，在pH 6.0呈现出100％-500％的EGFR结合活性，在正常乳酸盐水平(例如0-5mM乳酸盐)呈现出30％-95％的EGFR结合活性，及在增高的乳酸盐水平(例如10-20mM乳酸盐)呈现出100％-500％的EGFR结合活性，所述野生型野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的轻链氨基酸序列。例如，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体呈现出在酸性pH(例如pH 6.0)增加的EGFR结合，在增高的乳酸盐水平(例如16.6mM乳酸盐)增加的EGFR结合，在中性pH(例如pH 7.4)降低的EGFR结合，和/或在正常乳酸盐水平(例如1mM乳酸盐)降低的EGFR结合。
在本文的其中结合活性在肿瘤微环境中存在的条件下增加的实例中，所提供的抗体与对应的形式未修饰的西妥昔单抗或其抗原结合片段或其变体如野生型西妥昔单抗相比可以呈现出在pH 6.0或pH 6.5增加的EGFR结合亲和性，和/或在中性pH(例如pH 7.4)降低的结合亲和性，所述野生型西妥昔单抗具有SEQ ID NO：1所示的重链氨基酸序列和SEQID NO：2所示的轻链氨基酸序列，或者SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。在特定的实例中，本文提供的抗-EGFR抗体在pH 7.4呈现出(例如Kd)降低至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍或更多的体外结合亲和性，而在pH 6.0保留相当的EGFR结合活性。
示例性的本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是与参考抗-EGFR抗体相比含有修饰的那些抗体，所述参考抗-EGFR抗体具有SEQ ID NO：1、3、5、8或28任一所示的重链和SEQ ID NO：2、4、9、10或29任一所示的轻链，或者重链具有与SEQ ID NO：1、3、5、8具有至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列及轻链具有与SEQ ID NO：2、4、9、10或29具有至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。本文提供的修饰的抗-EGFR抗体包括抗-EGFR抗体西妥昔单抗的变体，其与西妥昔单抗相比具有改变的性质。在示例性的实施方案中，抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是修饰的，由此其靶向肿瘤环境，例如通过在与肿瘤相关的或特异于肿瘤的条件下结合EGFR而进行。
本文所述的修饰可以在任何西妥昔单抗抗-EGFR抗体或其变体抗体中。例如，所述修饰可以在西妥昔单抗抗体中产生，所述抗体含有：具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的轻链，或者SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链；或者在SEQ ID NO：1或8所示的重链和/或SEQ ID NO：2或9所示的轻链的序列变体中产生，所述变体与所述重链或轻链呈现至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。在一些实例中，所述修饰是在人源化西妥昔单抗抗体中产生的，所述抗体含有SEQ ID NO：28所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：29所示的轻链氨基酸序列；或者在与SEQ ID NO：28所示的重链和/或SEQ ID NO：29所示的轻链呈现至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列变体中产生。
通常地，所述修饰在这种抗体的可变区中产生。例如，所述修饰在这种西妥昔单抗抗体的重链和/或轻链可变区中产生，例如在含有SEQ ID NO：3所示的可变重链和SEQ IDNO：4所示的可变轻链的序列中，或者在具有SEQ ID NO：3所示的可变重链和SEQ ID NO：10所示的可变轻链的序列中。所得修饰的抗-EGFR抗体可以是全长IgG1抗体，或者可以是其片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。进一步地，所得修饰的抗-EGFR抗体可含有除了IgG1之外的一个结构域。
所述修饰可以是单一氨基酸修饰，如单一氨基酸置换(取代)、插入或删除，或者多个氨基酸修饰，如多个氨基酸置换、插入或删除。示例性的修饰是氨基酸置换，包括单一或多个氨基酸置换。本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与不含有所述修饰的抗-EGFR抗体相比可含有至少或数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的修饰的位置。在一些实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与未修饰的西妥昔单抗或其抗原结合片段或其变体相比仅含有1个或者仅含有2个氨基酸置换。所述氨基酸置换可以是保守取代，如表4中所示的，或者是非保守取代，如本文所述任何非保守取代。应理解含有赋予如本文描述的条件活性的示例性的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可以通过如下文所述的人源化进一步修饰，只要所得抗体在肿瘤微环境中与在非肿瘤微环境中相比保留条件活性即可。
为了本文的目的，提及修饰的位置和氨基酸时，包括氨基酸置换，参照SEQ ID NO：3所示的可变重链和SEQ ID NO：4所示的可变轻链。本领域技术人员已知怎样在另一抗-EGFR抗体中产生本文提供的任何修饰，所述产生通过鉴定如SEQ ID NO：1、5、8或28所示的另一重链中或者SEQ ID NO：2、9、10或29所示的另一轻链中或其变体中的对应的氨基酸残基进行，所述变体与SEQ ID NO：1、2、5、8-10或28-29任一序列呈现至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性。在另一抗-EGFR抗体中的对应的位置可以通过比对抗-EGFR抗体重链或轻链与参考的抗-EGFR的SEQ ID NO：3所示的重链或SEQ ID NO：4所示的轻链而鉴定。例如，图2示出抗-EGFR抗体与SEQ ID NO：3和4的比对，及示例性的对应的位置的鉴定。对于修饰(例如氨基酸置换)，对应的氨基酸残基可以是任何氨基酸残基，不需要与SEQ ID NO：3或4所示的残基相同。典型地，通过与SEQ ID NO：3或4中残基比对鉴定的对应的氨基酸残基是与SEQ ID NO：3或4相同的氨基酸残基，或者是其保守或半保守的氨基酸残基(见例如图2)。也应理解示例性的本文提供的置换可以在抗-EGFR抗体重链或轻链的对应的残基进行，只要所述置换与未修饰形式的抗-EGFR抗体重链或轻链中不同即可。基于这个描述及本文其它描述，本领域技术人员已知怎样产生含有任一或多个所述突变的修饰的抗-EGFR抗体，及检测如本文所述的性质或活性。
抗-EGFR抗体中的修饰也可以对还含有其它修饰的抗-EGFR抗体进行，所述其它修饰包括在所述抗体可变区中的修饰及在所述抗体的恒定区中的修饰，例如在CH1、铰链区、CH2、CH3或CL区。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体可以通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可以应用本领域已知的在靶蛋白质中实现任何一或多个氨基酸突变的任何方法。所述方法包括标准定点或随机诱变编码核酸分子，或者固相多肽合成方法。例如，编码抗-EGFR抗体的重链或轻链的核酸分子可以进行诱变，如编码核酸的随机诱变、易错PCR、定点诱变、重叠PCR、基因重排或者其它重组方法。然后编码抗-EGFR抗体的核酸可以导入宿主细胞中异源表达。因此，本文还提供了编码本文提供的任何修饰的抗-EGFR抗体的核酸分子。
下文提供了在西妥昔单抗抗体或其抗原结合片段的可变重链和/或可变轻链或其部分中相对于SEQ ID NO：3所示的可变重链和SEQ ID NO：4所示的可变轻链的示例性的修饰的非限制性实例。
a.重链修饰
本文提供了含有修饰如氨基酸置换的抗-EGFR抗体，在西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体的可变重链中对应含有SEQ ID NO：3所示的重链的西妥昔单抗抗体中氨基酸残基。所得修饰可以在重链或其部分中，如SEQ ID NO：1、3、5、8或28所示的，或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的其变体中。所述修饰可以在互补决定区(CDR)或者框架区中。
例如，本文提供了含有可变重链或其部分的修饰的抗-EGFR抗体，其在对应参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、93、94、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112的任何位置具有至少一个氨基酸置换或取代。例如，所述氨基酸位置可以是在对应下列取代的位置的置换：参照SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置23的苏氨酸(T)置换(T23)、V24、S25、G26、F27、S28、L29、T30、N31、Y32、G33、V34、H35、W36、V50、I51、W52、S53、G54、G55、N56、T57、D58、Y59、N60、T61、P62、F63、T64、S65、R66、L67、S68、I69、N70、K71、D72、N73、S74、K75、S76、Q77、Y93、Y94、R97、A98、L99、T100、Y101、Y102、D103、Y104、E105、F106、A107、Y108、W109、G110、Q111或G112。
参考Kabat编号方式，可以通过例如氨基酸置换或取代而修饰的重链中的这些位置包括但不限于对应位置23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、90、91、94、95、96、97、98、99、100、100a、100b、100c、101、102、103、104、105或106的任何位置。在一些实例中，在对应上述任何位置的位置修饰的(例如置换)氨基酸残基是SEQ ID NO：3所示的氨基酸的保守残基或半保守残基(见例如图2)。
在一个实例中，本文提供改良修饰的抗-EGFR抗体，其含有在一或多个CDR例如CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中具有修饰的可变重链。例如，本文提供了含有可变重链的修饰的抗-EGFR抗体，所述可变重链在CDR1中在对应参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的任何位置，在CDR2中在对应参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65的任何位置，在CDR3中在对应参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或108的任何位置，具有一或多个氨基酸置换。
在其它实例中，本文提供了含有可变重链的修饰的抗-EGFR抗体，所述可变重链含有在框架区(FW)重链FW1、FW2、FW3或FW4中的修饰。例如，本文提供改良的含有可变重链的修饰的抗-EGFR抗体，所述可变重链重链FW1在对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置23、24或25的任何位置、在重链FW2对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置37或37的任何位置、在FW3对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、93、94或97的任何位置及在FW4对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置109、110、111或112的任何位置，具有一或多个氨基酸置换。
本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其在可变重链或其部分中具有至少一个氨基酸置换，对应表5所示的参照SEQ ID NO：3所示的位置的置换。
示例性的本文提供的在可变重链或其部分中含有修饰的修饰的抗-EGFR抗体是如上述在肿瘤环境中呈现具有条件活性的那些抗体。例如，示例性的本文提供的抗体包括在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以高于1.0倍，如高于1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0或更多倍的更高结合亲和性结合EGFR(特别是人EGFR)那些抗体，所述肿瘤微环境中存在的条件包括pH 5.6-6.8或大约pH5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 6.0和/或16.6mM乳酸盐)和10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境中的条件包括pH7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 7.4和/或1mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。
例如，如本文所述具有条件活性的示例性的修饰的抗-EGFR抗体含有在对应SEQID NO：3所示的重链氨基酸位置的位置24、25、27、28、29、30、31、32、50、53、54、58、59、63、64、67、68、72、73、74、75、76、77、97、100、101、104、107、111的位置具有一或多个氨基酸置换的可变重链。例如，所述氨基酸位置可以是在对应下列取代的位置的置换：参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置24的缬氨酸(V)置换(V24)、S25、F27、S28、L29、T30、N31、Y32、V50、S53、G54、D58、Y59、F63、T64、L67、S68、D72、N73、S74、K75、S76、Q77、R97、T100、Y101、Y104、A107、Q111。例如，示例性的本文提供的抗-EGFR抗体含有对应如下重链置换的一或多个氨基酸置换：V24I、V24L、V24E、S25C、S25G、S25I、S25M、S25V、S25Q、S25T、S25L、S25H、S25R、S25A、S25D、F27R、S28C、L29H、T30F、N31H、N31I、N31T、N31V、Y32T、V50L、S53G、G54D、G54S、G54R、G54C、G54P、D58M、Y59E、F63R、F63C、F63G、F63M、F63V、F63P、F63S、T64N、T64V、L67G、S68F、S68Q、D72K、D72L、D72P、D72M、D72W、N73Q、S74H、S74R、S74D、S74G、S74Y、K75H、K75G、K75W、K75P、S76I、S76V、Q77R、Q77E、R97H、T100I、T100P、Y101W、Y104D、Y104F、Y104S、Y105V、A107N、Q111I、Q111P、Q111V。
在特别的实例中，示例性的本文提供的修饰包括抗-EGFR抗体重链修饰，所述修饰在对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置24、25、27、30、53、72、97、104和111的位置。例如，所述氨基酸位置可以是在对应下列置换的位置的置换：SEQ ID NO：3所示的氨基酸位置的位置24的缬氨酸(V)置换(V24)、S25、F27、T30、S53、D72、R97、Y104或Q111。示例性的本文提供的修饰的抗-EGFR抗体中的氨基酸置换包括但不限于重链残基置换：在对应24的位置以谷氨酸(E)置换，在对应25的位置以C置换，在对应25的位置以V置换，在对应27的位置以R置换，在对应30的位置以F置换，在对应53的位置以G置换，在对应72的位置以L置换，在对应97的位置以H置换，在对应104的位置以D置换，或者在对应111的位置以P置换。例如，本文提供的抗-EGFR抗体含有一或多个氨基酸置换，对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链置换V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D或Q111P。所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可含有在可变重链中的仅一个氨基酸置换。典型地，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在可变重链中含有至少两或多个上述氨基酸置换，如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H、Y104D或Q111P中的至少2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸置换。所述抗-EGFR或其抗原结合片段在重链中可含有另外的修饰，如下文小节3中描述，或者是如本文所述抗体的人源化结果。特别地，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其含有重链残基Y104的氨基酸置换，如氨基酸置换Y104D、Y104F或Y104S。
重链中的非限制性氨基酸置换在表6中根据SEQ ID NO：3所示的编号示出。表中示出了含有氨基酸置换的可变重链的示例性SEQ ID NO。对于本文提供的可变重链中的任何氨基酸置换，应理解所述置换可以在另一抗-EGFR抗体的对应的位置产生，通过与SEQ IDNO：3所示的序列比对而进行(见例如图2)，从而所述对应的位置是匹配的位置。因此，所述抗体可含有重链恒定区或其部分。在特别的实例中，所述氨基酸置换可以在如SEQ ID NO：1、3、5、8或28任一所示的西妥昔单抗重链或其部分的对应的位置，或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的变体中对应的位置，只要含有修饰的可变重链或其部分的所得修饰的抗体在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比呈现出结合活性比率高于1.0即可，所述肿瘤微环境中的条件包括pH5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 6.0和/或16.6mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境中的条件包括pH 7.0-7.8大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 7.4和/或1mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。
b.轻链修饰
本文提供了含有修饰如在西妥昔单抗抗体、其抗原结合片段或其变体的可变轻链中的氨基酸置换的修饰的抗-EGFR抗体，对应含有SEQ ID NO：4所示的可变轻链的西妥昔单抗抗体中氨基酸残基。所得修饰可以在SEQ ID NO：2、4、9、10或29所示的轻链中，或者在与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的变体中。所述修饰可以在互补决定区(CDR)或者在框架区中。
例如，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其在可变轻链或其部分含有至少一个氨基酸置换或取代，在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置1、2、3、4、5、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、48、49、51、52、53、54、55、56、86、87、89、91、92、93、96、97、98、99或100的任何位置。例如，所述氨基酸位置可以是在对应以下置换的位置的置换：SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置1的天冬氨酸(D)置换(D1)、I2、L3、L4、T5、R24、A25、S26、Q27、S28、I29、G30、T31、N32、I33、I48、K49、A51、S52、E53、S54、I55、S56、Y86、Y87、Q89、N91、N92、N93、T96、T97、F98、G99或A100。根据Kabat编号方式，可以通过例如氨基酸置换或取代修饰的轻链中的示例性的位置包括但不限于对应位置1、2、3、4、5、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、48、49、51、52、53、54、55、56、86、87、89、91、92、93、96、97、98、99或100的任何位置。在一些实例中，在对应任何上述位置的位置被修饰(例如置换)的氨基酸残基是SEQ ID NO：2、4、9、10或29所示的氨基酸的保守氨基酸残基或者半保守氨基酸残基。
在一个实例中，本文提供了含有可变轻链的抗-EGFR抗体，所述轻链在CDR具有修饰如CDRL1、CDRL2或CDRL3。例如，本文提供了在轻链中含有一或多个氨基酸置换的修饰的抗-EGFR抗体，所述置换在CDR1中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置24、25、26、27、28、29、30、31、32或33的任何位置，在CDR2中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置51、52、53、54、55或56的任何位置，在CDR3中对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置89、91、92、93、96或97的任何位置。
在其它实例中，本文提供了含有可变轻链的修饰的抗-EGFR抗体，所述可变轻链含有在框架区(FW)的修饰，如轻链FW1、FW2、FW3或FW4。例如，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有在轻链FW中的一或多个氨基酸置换，所述置换在FW1中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置1、2、3、4或5的任何位置，在FW2中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置48或49的任何位置，在FW3中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置86或87的任何位置，及在FW4中在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置98、99或100的任何位置。
本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有在可变轻链或其部分中的至少一个氨基酸置换，对应表7中示出的根据SEQ ID NO：4所示的位置的任何置换。
示例性的本文提供的在可变轻链或其部分中含有修饰的抗-EGFR抗体是在如上述肿瘤环境中呈现条件活性的那些抗体。例如，示例性的本文提供的抗体包括在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以高于1.0倍，如高于1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0或更高倍数的更高结合活性结合EGFR(特别是人EGFR)的那些抗体，所述肿瘤微环境条件包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 6.0和/或16.6mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境条件包括pH7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 7.4和/或1mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。
例如，如本文所述示例性的具有条件活性的修饰的抗-EGFR抗体含有具有一或多个氨基酸置换的可变轻链，所述氨基酸置换在对应SEQ ID NO：4所示的轻链氨基酸位置的位置4、5、24、29、56或91的一或多个位置。例如，所述氨基酸位置可以是在对应以下置换的位置的置换：SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置4的亮氨酸(L)置换(L4)、T5、R24、I29、S56或N91。例如，示例性的本文提供的抗-EGFR抗体含有一或多个氨基酸置换，其对应轻链置换或者L4C、L4F、L4V、T5P、R24G、I29S、S56H或N91V置换。所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段可仅含有在可变轻链中一个氨基酸置换。典型地，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段在可变轻链中含有至少两或多个上述氨基酸置换，如来自SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的L4C、L4F、L4V、T5P、R24G、I29S、S56H或N91V中的至少2、3、4、5或6个氨基酸置换。所述抗-EGFR或其抗原结合片段在轻链中可含有另外的修饰，例如下文小节3中所述，或者是如本文所述抗体人源化的结果。
在特别的实例中，示例性的本文提供的修饰包括抗-EGFR抗体轻链在对应SEQ IDNO：4所示的氨基酸位置的位置29的修饰。例如，所述氨基酸位置可以是在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸位置的位置29的异亮氨酸(I)置换(I29)。在本文提供修饰的抗-EGFR抗体的中示例性的氨基酸置换包括但不限于在对应位置29用丝氨酸(S)置换一个轻链残基。例如，本文提供的抗-EGFR抗体含有对应在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中I29S轻链置换的一个氨基酸置换。
如上述重链中的任何修饰及本文所述的轻链中的任何修饰可以在抗-EGFR抗体或其抗原结合片段组合。这种修饰的非限制性实例包括HC-Y104D/LC-I29S、HC-Y104D/HC-Q111P/LC-I29S、HC-S25C/LC-I29S或者HC-Q111P/LC-I29S。
对于本文提供的可变轻链中的任何氨基酸置换，应理解所述置换可以在另一抗-EGFR抗体的对应的位置产生，通过与SEQ ID NO：4所示的序列比对而进行(见例如图2)，从而所述对应的位置是匹配的位置。在特别的实例中，所述氨基酸置换可以在SEQ ID NO：2、4、9、10或29所示的西妥昔单抗轻链或者与其具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的其变体中的对应的位置，只要所得含有修饰的可变轻链的修饰的抗体在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比呈现出结合活性比率高于1.0即可，所述肿瘤微环境条件包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 6.0和/或16.6mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境条件包括pH 7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 7.4和/或1mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。
c.示例性的修饰的抗-EGFR抗体及其片段
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体，如本文上述任何抗体，最低限度含有修饰的可变重链和/或修饰的可变轻链，或者当装配成抗体时其足以结合抗原的部分。本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有如SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131任一或者与SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，及如SEQ IDNO：4或10所示的可变轻链。在其它实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有SEQ IDNO：3所示的可变重链，及SEQ ID NO：558-1061或1065-1068或与SEQ ID NO：558-1061或1065-1068呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变轻链。
在一些实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其在可变重链和可变轻链中均含有修饰，从而所述抗-EGFR抗体含有SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131或者与SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，以及如SEQ ID NO：558-1061或1065-1068或者与SEQ ID NO：558-1061或1065-1068呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变轻链。在特别的实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR，其含有SEQ ID NO：495或者与SEQ ID NO：495呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，及如SEQ ID NO：639或SEQ ID NO：891或与SEQ ID NO：639或891呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变轻链(称作HC-Y104D/LC-I29S)。在另一实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR，其含有如SEQ ID NO：1062或者与SEQ IDNO：1062呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，及如SEQ ID NO：639或SEQ ID NO：891或者与SEQ ID NO：639或891呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变轻链(称作HC-Y104D/HC-Q111P/LC-I29S)。在进一步的实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR，其含有如SEQID NO：58或者与SEQ ID NO：58呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，及如SEQ ID NO：639或SEQ ID NO：891或者与SEQ ID NO：639或891呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变轻链(称作HC-S25C/LC-I29S)。在另一实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR，其含有如SEQ ID NO：547或者与SEQ ID NO：547呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列所示的修饰的可变重链，及如SEQ ID NO：639或SEQ ID NO：891或者与SEQ ID NO：639或891呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的修饰的可变轻链(称作HC-Q111P/LC-I29S)。
特别地，本文提供了修饰的抗-EGFR，其含有如SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1119、1124-1131或者与SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1119、1124-1131呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变重链，及如SEQ ID NO：4或10所示的可变轻链。
本文提供的抗体可以是全长IgG1抗体，或者来自IgG2、IgG3或IgG4的其它亚型。例如，所述抗-EGFR抗体可以是全长IgG1抗体，其含有来自西妥昔单抗的κ轻链恒定区(如SEQID NO：1071所示的)或者来自西妥昔单抗的IgG1重链恒定区(如SEQ ID NO：1069所示的)。所述重链恒定区也可以是SEQ ID NO：22所示的人IgG1重链，来自Ig类别的，如IgG2(如SEQID NO：23所示的)、IgG3(如SEQ ID NO：24所示的)或者IgG4(如SEQ ID NO：25所示的)，或者可以是SEQ ID NO：26、27或1070所示的修饰的IgG1重链恒定区。所述轻链恒定区也可以是人κ轻链(如SEQ ID NO：1072所示)或者人λ轻链(如SEQ ID NO：1073所示)。
例如，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的重链可包含如上述修饰的可变重链及SEQID NO：1069所示的IgG1重链。在另一实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的重链可包含如上述修饰的可变重链及SEQ ID NO：22所示的IgG1重链。在再一个实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的重链可包含如上述修饰的可变重链及SEQ ID NO：1070所示的IgG1重链。在一个实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的轻链可包含如上述修饰的可变轻链及SEQ ID NO：1071所示的κ轻链。在另一实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的轻链可包含如上述修饰的可变轻链及SEQ ID NO：1072所示的κ轻链。
例如，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131或与SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变重链，进一步包含对应SEQ ID NO：22、1069或1070所示的IgG1恒定区的氨基酸序列；以及SEQ IDNO：2或9所示的轻链。在一些实例中，本文提供了修饰的抗-EGFR抗体，其含有SEQ ID NO：1或8所示的可变重链；及如SEQ ID NO：558-1061或1065-1068或与SEQ ID NO：558-1061或1065-1068呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变轻链，进一步包含对应SEQ ID NO：1071或1072所示的κ轻链恒定区的氨基酸序列。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体还包括抗体片段，其是全长抗体的衍生物，含有少于全长抗体的全长序列的序列，但是保留全长抗体的至少一部分的特异性结合能力，例如重链和轻链的可变部分。所述抗体片段也可包括抗体的抗原结合部分，其可以插入抗体框架中(例如嵌合抗体)以保留亲代抗体的结合亲和性。示例性的抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段，及其它片段，包括修饰的片段(见例如Methods in Molecular Biology，Vol.207：Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25，Kipriyanov)。抗体片段可包括连接在一起的多个链，如通过二硫键连接及可以重组产生。抗体片段也可以含有合成的接头，如肽接头，以连接两或多个结构域。产生抗原结合片段的方法为本领域熟知，可用于修饰本文提供的任何抗体。抗体分子的片段可以通过例如酶解产生。例如，在通过木瓜蛋白酶进行蛋白酶解时，重链恒定区的二聚体、Fc结构域从两个Fab区域中裂解(即含有可变区的部分)。
单链抗体可以通过连接特定抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)而重组工程化。可变区的特定核酸序列可以通过标准分子生物学方法克隆，例如通过聚合酶链反应(PCR)及其它重组核酸技术。产生scFv的方法例如由Whitlow and Filpula(1991)Methods，2：97-105；Bird et al.(1988)Science242：423-426；Pack et al.(1993)Bio/Technology11：1271-77；及美国专利No.4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727、5,258,498描述。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的片段，如上文描述的任何片段，最低限度含有如上文所述的修饰的可变重链和/或修饰的可变轻链。本发明还提供了任何上述抗体的抗原结合片段，含有SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131所示的修饰的可变重链和/或SEQ ID NO：558-1061或1065-1068所示的修饰的可变轻链，或者与SEQ IDNO：30-1068、1093或1098-1131具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的可变链。例如，抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。
例如，这种抗-EGFR抗体可以是Fab片段，进一步含有来自西妥昔单抗的重链CH1恒定区(如SEQ ID NO：11所示的)或者来自西妥昔单抗的κ轻链恒定区(如SEQ ID NO：1071所示的)。重链CH1恒定区也可以是如SEQ ID NO：1108所示的人IgG1CH1恒定区。在一个实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的重链可包含本文上述的修饰的可变重链，如SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131所示的，以及SEQ ID NO：11所示的CH1重链。在另一实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的重链可包含如本文上述修饰的可变重链，如SEQ ID NO：30-557、1062-1064、1093、1098-1107或1112-1131所示的，以及SEQ IDNO：1108所示的CH1重链。在一个实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的轻链可包含如本文上述修饰的可变轻链，如SEQ ID NO：558-1061或1065-1068所示的，以及如SEQ ID NO：1071所示的κ轻链。在另一实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的轻链可含有如本文上述的修饰的可变轻链，如SEQ ID NO：558-1061或1065-1068所示的，以及如SEQ ID NO：1072所示的κ轻链。
在特别的实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体是单链抗体。单链抗体可以从本文提供的任何抗-EGFR抗体的抗原结合结构域中产生。使用重组技术产生单链抗体的方法为本领域熟知，如在例如Marasco et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893，Whitlow and Filpula(1991)Methods，2：97-105；Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Pack et al.(1993)Bio/Technology 11：1271-77；和美国专利No.4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727中描述的那些方法。
单链抗体可包含本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的轻链可变(VL)结构域或者其功能区，及重链可变(VH)结构域或者其功能区。在一些实例中，单链抗体的VL结构域或其功能区含有本文提供的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和/或互补决定区3(CDR3)。在一些实例中，所述单链抗体的VH结构域或其功能区含有本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。在一些实例中，所述单链抗体进一步含有肽接头。在这种实例中，肽接头可位于轻链可变结构域(VL)与重链可变结构域(VH)之间。
所述单链抗体在抗体的一或多个结构域之间可包含肽间隔物或接头。例如，抗体的轻链可变结构域(VL)可以通过柔性接头肽与重链可变结构域(VH)结合。各个肽接头为本领域熟知及可用于本文提供的方法中。肽接头可包括一系列甘氨酸残基(Gly)或丝氨酸(Ser)残基。示例性的多肽接头是具有氨基酸序列(Gly-Ser)n，(GlymSer)n or(SermGly)n的肽，其中m是1-6，通常为1-4，典型为2-4，n为1-30，或者1-10，典型为1-4，一些谷氨酸(Glu)或赖氨酸(Lys)残基散布其间以增加溶解性(见例如国际PCT申请No.WO96/06641所述，其提供了用于缀合的示例性的接头)。示例性的肽接头包括但不限于具有如下序列的肽：(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：21)，GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：1074)，GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：1075)，EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：1076)，EGKSSGSGSESKSTQ(SEQ ID NO：1077)，EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：1078)，GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：1079)，KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：1080)和ESGSVSSEELAFRSLD(SEQ ID NO：1081)。通常地，接头肽长度为大约1-50个氨基酸。本发明使用的接头也可增加细胞内利用性、血清稳定性、特异性和溶解性，或者提供增加的灵活性或解除位阻。连接部分在例如Huston et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-5883、Whitlow et al.(1993)ProteinEngineering6：989-995和Newton et al.，(1996)Biochemistry 35：545-553中描述。其它合适的肽接头包括并入本文作参考的美国专利No.4,751,180或4,935,233中描述的那些接头。
2.人源化抗-EGFR抗体
本文提供了人或人源化的抗-EGFR抗体。例如，在上文小节1中提供的任何已知的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，如含有修饰的重链和/或修饰的轻链的任何修饰的抗-EGFR，可以被人源化。人源化方法为本领域技术人员熟知。抗体人源化可用于使小鼠或其它非人抗体演变为人抗体。所得抗体含有增加的人序列及减少为无小鼠或非人抗体序列，同时保留与起始抗体相似的结合亲和性和特异性。
可以使用工程化或人源化非人或人抗体的方法，这些方法为本领域熟知。通常地，人源化或工程化的抗体具有来自非人来源例如但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其它哺乳动物的一或多个氨基酸残基。向其输入人氨基酸残基，因此所述人氨基酸残基通常称作“输入”残基，其典型来自已知人序列的“输入”可变、恒定或其它结构域。已知的人Ig序列在例如如下网页中公开：ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；atcc.org/phage/hdb.html；sciquest.com/；www.abcam.com/；antibodyresource.com/onlinecomp.html；public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html；mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html；whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm；library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html；antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html；immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html；biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html；nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html；biodesign.com/table.asp；icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；isac-net.org/sites_geo.html；aximt1.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEPStart.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links 1.html；recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/；mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；ibt.unam.mx/vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；antibody.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html；jerini.de/fr_products.htm；patents.ibm.con/ibm.html.Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)。
如本领域所已知，这种输入序列可用于降低免疫原性或者降低、增强或修饰结合、亲和性、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或者任何其它合适的特性。通常地，部分或全部非人或人CDR被保留，而可变区和恒定区的非人序列用人或其它氨基酸置换。抗体也可任选被人源化，保留对抗原的高亲和性及其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，人源化抗体可以任选通过分析亲代序列及各个概念性人源化产物的方法制备，使用亲代和人源化序列的三维模型进行。三维免疫球蛋白模型是常用的，且为本领域技术人员熟知。可利用例证和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些展示允许分析所述残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有和输入的序列中选择FR残基并组合，以便获得希望的抗体特性，如对靶抗原的亲和性增加。通常地，CDR残基直接及大部分参与影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程化可以使用任何已知方法进行，例如但不限于在Winter(Jones et al.，Nature 321：522(1986)、Riechmann et al.，Nature 332：323(1988)、Verhoeyen et al.，Science 239：1534(1988))、Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)、Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)、Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)、Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993)、美国专利No.5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、PCT/：US98/16280、US96/18978、US9I/09630、US9I/05939、US94/01234、GB89/01344、GB9I/01134、GB92/01755、WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246中所述那些方法，所述文献包括其中引用的参考文献均并入本文作参考。
典型地，起始的参考或亲代抗体，通常是部分非人的抗体，在本文被人源化的是这样的抗体，其在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比的结合活性比率高于1.0，例如通常至少高于2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0或更高，所述肿瘤微环境条件包括pH 5.6-6.8或大约pH 5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH6.0和/或16.6mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境条件包括pH 7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一(例如pH 7.4和/或1mM乳酸盐)及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。示例性的这种抗体是这样的抗体，其含有SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1119、1124-1131或者与SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1119、1124-1131呈现至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的序列所示的可变重链以及SEQID NO：4或10所示的可变轻链。
例如，抗体人源化可以通过如下方式进行，例如合成含有被人源化的靶抗体(例如上述任何抗体)的六个CDR的组合文库，符合读框地与各个人框架集合融合。例如，所述CDR可衍生自SEQ ID NO：495、1062、1112、1114-1119、1124-1131所示的序列的任一或多个的CDRH1(根据AbM定义的氨基酸残基26-35，或者根据Kabat定义的氨基酸残基31-35)、CDRH2(氨基酸残基50-65)或者CDRH3(氨基酸残基95-102)，和/或可以衍生自SEQ ID NO：4或10所示的序列的任一或多个的CDRL1(氨基酸残基24-34)、CDRL2(氨基酸残基50-56)或者CDRL3(氨基酸残基89-97)。可以利用含有所有已知重链和轻链人种系基因的代表性基因的人框架文库。然后可以筛选所得组合文库与感兴趣的抗原的结合情况。这种方法可以根据维持亲代抗体的结合活性选择完全人框架的最有利的组合。然后人源化的抗体可以通过各种技术进一步优化。
技术人员可以产生的以实现人源化的氨基酸取代的数目依赖于许多因素，包括上述那些因素。通常地，对于抗-EGFR抗体、片段或变体而言的氨基酸置换(取代)、插入或删除的数目不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，如1-30个或者如本文限定的之中的任何范围或数值。
抗-EGFR抗体中为功能必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，supra，Chapters 8，15；Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后者在分子的每个残基导入单一丙氨酸突变。然后使用本文所述任何方法检测所得突变分子的生物学活性，例如但不限于与EGFR的结合。对于抗体结合关键的位点也可以通过结构分析鉴定，如结晶、核磁共振或者光亲和性标记(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)及de Vos，et al.，Science 255：306-312(1992))。
本文提供的人源化克隆包括与其最接近的人VH基因区段种系序列呈现出至少56％序列相同性，如至少57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％或更高的序列相同性，以及与其最接近的人VL基因区段种系序列呈现至少75％、76％、77％、78％、79％、80％或更高序列相同性的任何克隆。人种系区段的序列为本领域技术人员已知及可利用。例如，基因区段序列可从已知数据库中获取(例如国家生物技术信息中心(NCBI)，国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)，Kabat数据库及Tomlinson’sVbase数据库(Lefranc(2003)Nucleic Acids Res.，31：307-310；Martin et al.，Bioinformatics Tools for Antibody Engineering in Handbook of TherapeuticAntibodies，Wiley-VCH(2007)，pp.104-107；see also published International PCTApplication No.WO2010/054007)。进一步地，数据库是可用于搜索最接近的种系序列，如来自国家立生物技术信息中心(NCBI；www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)的IgBlast，其设计目的是为分析Ig序列的V(可变)区。在进行这种搜索中，查询序列必须含有以一部分V基因区段(例如可变重链的残基1-97；可变轻链的残基1-95)。
在一个实例中，本文提供的人源化克隆衍生自称作Y104D/Q111P(DP)的抗-EGFR抗体，其具有SEQ ID NO：1062所示的可变重链和SEQ ID NO：4或10所示的可变轻链。在另一实例中，本文提供的人源化克隆衍生自称作T30F/Y104D/Q111P(FDP)的抗-EGFR抗体，其具有SEQ ID NO：1125所示的可变重链和SEQ ID NO：4或10所示的可变轻链。这种人源化克隆的非限制性实例在表8中示出。表8-10示出每个克隆的可变重链和轻链的SEQ ID NO(SEQ)。表9和10还概括了人源化克隆与亲代西妥昔单抗的可变序列及与称作IGHV3-33(VH)和IGKV6-21(VL)的其最接近的人V区种系序列的序列相同性(见例如Nagdelaine-Beuzelin et al.(2007)Critical Reviews in Oncology/Hematology(2007)64：210-225)。使用IgBlast鉴定的每个克隆的最接近的种系序列也以粗体字标示。
因此，本文提供了包含可变重链和轻链的抗-EGFR抗体，其具有如下所示的氨基酸序列：可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1139或者与SEQ ID NO：1139呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1138或者与SEQ ID NO：1138呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1140或者与SEQ ID NO：1140呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1141或者与SEQ ID NO：1141呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1135或者与SEQ ID NO：1135呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1134或者与SEQ ID NO：1134呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1143或者与SEQ ID NO：1143呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1142或者与SEQ ID NO：1142呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1144或者与SEQ ID NO：1144呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1137或者与SEQ ID NO：1137呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1136或者与SEQ ID NO：1136呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1145或者与SEQ ID NO：1145呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1147或者与SEQ ID NO：1147呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1153或者与SEQ ID NO：1153呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1154或者与SEQ ID NO：1154呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1155或者与SEQ ID NO：1155呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1151或者与SEQ ID NO：1151呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1156或者与SEQ ID NO：1156呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1148或者与SEQ ID NO：1148呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1149或者与SEQ ID NO：1149呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1150或者与SEQ ID NO：1150呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1158或者与SEQ ID NO：1158呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1152或者与SEQ ID NO：1152呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1159或者与SEQ ID NO：1159呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1157或者与SEQ ID NO：1157呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；
可变重链，如SEQ ID NO：1146或者与SEQ ID NO：1146呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示；及可变轻链，如SEQ ID NO：1186或者与SEQ ID NO：1186呈现至少85％序列相同性的氨基酸序列所示。
任何上述抗-EGFR抗体可进一步包含重链恒定区或轻链恒定区或者其部分。所述恒定区可以是任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类(例如IgG2a和IgG2b)。在特别的实例中，本文提供的抗体可以是全长抗体，其进一步包含来自IgG1抗体或者其它IgG2、IgG3或IgG4亚型的恒定区。例如，所述抗-EGFR抗体可以是全长IgG1抗体，其是含有来自西妥昔单抗的κ轻链恒定区(SEQ ID NO：1071所示)或者来自西妥昔单抗的IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：1069所示)的全长IgG1抗体。所述重链恒定区也可以是如SEQ ID NO：22所示的人IgG1重链，来自Ig类别的，如IgG2(示于SEQ ID NO：23)、IgG3(示于SEQ ID NO：24)或者IgG4(示于SEQ ID NO：25)，或者可以是如SEQ ID NO：26、27或1070所示的修饰的IgG1重链恒定区。所述轻链恒定区也可以是人κ轻链(示于SEQ ID NO：1072)或者人λ轻链(示于SEQ ID NO：1073)。
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体也可包括抗体片段，其是全长抗体的衍生物，含有少于全长抗体的全长序列，但是保留全长抗体的至少一部分特异性结合能力，例如重链和轻链的可变部分。所述抗体片段也可包括抗体的抗原结合部分，其可以被插入抗体框架中(例如嵌合抗体)，以保留亲代抗体的结合亲和性。示例性的抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段，及其它片段，包括修饰的片段(见例如Methods in Molecular Biology，Vol.207：Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25，Kipriyanov)。抗体片段可包括如通过二硫键连接在一起的多个链，及可以是重组产生的。抗体片段也可以包含合成的接头，如肽接头，以连接两或多个结构域。产生抗原结合片段的方法为本领域熟知，可用于修饰本文提供的任何抗体。抗体分子的片段可以例如通过酶裂解而产生。例如在通过木瓜蛋白酶裂解时，重链恒定区的二聚体、Fc结构域从两个Fab区域中裂解(即含有可变区的部分)。
单链抗体可以通过结合特定抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)而重组工程化。所述可变区的特定核酸序列可以通过标准分子生物学方法克隆，例如通过聚合酶链反应(PCR)及其它重组核酸技术。产生scFv的方法在例如Whitlow and Filpula(1991)Methods，2：97-105；Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Pack et al.(1993)Bio/Technology 11：1271-77；及么过专利No.4,946,778、5,840,300、5,667,988、5,658,727、5,258,498)中描述。
上述抗-EGFR或抗原结合片段，本文提供的抗-EGFR抗体，包括修饰的抗-EGFR抗体及任何抗-EGFR抗体的抗原结合片段在肿瘤微环境中存在的条件下与在非肿瘤微环境中存在的条件下相比以较高的结合活性结合EGFR(特别是人EGFR)，所述肿瘤微环境条件包括pH5.6-6.8或大约pH5.6-6.8的pH或者5mM-20mM或大约5mM-20mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)，所述非肿瘤微环境条件包括pH7.0-7.8或大约pH 7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM或大约0.5mM-5mM的乳酸盐浓度这两者或两者之一及10mg/mL-50mg/mL蛋白质(例如20％-50％人血清)。在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下相比较高的结合活性通常在其中所述蛋白质浓度在肿瘤微环境条件下与在非肿瘤微环境条件下基本相同或相同的条件下存在。在特别的实例中，所述活性比率可以是至少或高于2.0，通常高于3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更高。
任何上述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段当在哺乳动物细胞中产生时也产生显著的生产率，特别是与非人源化亲代抗体相比时。例如，含有编码上述任何抗-EGFR抗体的核酸(例如含有编码如表8所示的重链和轻链的核酸)的哺乳动物宿主细胞可以高于下列的浓度或以高于大约下列的浓度或以下列浓度表达所述抗体：1mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、8.0mg/mL、9.0mg/mL、10.0mg/mL或更高。
3.另外的修饰
本文提供的任何修饰的抗-EGFR抗体可含有一或多个另外的修饰。所述修饰(例如氨基酸置换)可以在重链或轻链的可变区或恒定区中。本文提供的修饰的抗-EGFR抗体可包含的另外的修饰例如包括但不限于在美国专利No.7,657,380、7,930,107、7,060,808、7,723,484，美国专利公开No.2011014822、2005142133、2011117110，国际专利公开No.WO2012003995、WO2010080463、WO2012020059、WO2008152537以及Lippow et al.(2007)Nat Biotechnol.25(10)：1171-1176中描述的那些修饰。本文提供的任何抗-EGFR抗体或其抗原结合片段中可包含的本领域中描述的氨基酸修饰的非限制性实例包括：在可变轻链(VL)中含有氨基酸置换(取代)的变体，所述置换在对应SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中位置1的天冬氨酸(D)由谷氨酸(E)置换、D1C、I2T、I2C、L3V、L3T、L3C、L4C、T5C、Q6C、S7C、P8C、V9C、V9A、V9D、V9G、V9P、V9S、I10T、I10S、I10F、I10C、L11Q、L11C、S12A、S12C、V13L、V13M、V13S、V13A、V13C、S14T、S14C、P15V、P15L、P15C、G16K、G16C、E17D、E17K、E17C、R18V、R18K、R18C、V19A、V19T、V19C、S20T、S20C、S20A、F21I、F21L、F21C、S22T、S22C、R24P、A25V、A25S、A25I、A25P、A25T、A25Y、A25C、A25F、A25M、A25L、A25W、S26D、Q27W、Q27E、Q27F、Q27Y、Q27T、Q27H、S28R、S28F、G30Y、G30C、G30H、G30K、G30Q、G30R、G30W、G30F、G30T、G30M、G30S、G30A、T31E、T31V、T31D、T31R、N32H、I33L、H34C、Q38K、R39K、T40P、T40S、N41G、N41D、G42Q、G42K、G42E、S43A、S43P、R45K、K49Y、K49F、Y50G、S53V、S60D、S60A、G64S、G64A、D70E、D70V、F71Y、S74T、N76S、N76T、S77R、S77G、V78L、E79Q、S80P、S80A、E81A、I83F、I83S、I83V、I83A、D85V、D85T、D85I、D85M、Y87S、Q89C、Q89H、Q90C、N91C、N91Q、N91L、N92C、N92L、N92R N92K、N92M、N92Y、N92H、N92E、N92F、N93A、N93D、N93E、N93V、N93K、N93C、W94F、W94Y、P95C、T96C、T96L、T96E、T97C、T97A、T97D、T97E、T97P、T97K、T97N、T97Q、T97I、T97G、T97L、T97H、T97R、T97S、G99A、A100G、A100Q、K103T、L104V and L106I的位置；
在可变重链(VH)中含有氨基酸置换(取代)的变体，所述置换在对应SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中位置1的谷氨酰胺(Q)由谷氨酸(E)置换、Q1C、V2C、Q3T、Q3C、L4C、K5Q、K5V、K5L、K5C、Q6E、Q6C、S7C、G8C、P9A、P9G、P9C、G10V、G10C、L11C、V12C、Q13K、Q13R、Q13C、P14C、S15G、S15T、S15C、Q16G、Q16R、Q16E、Q16C、S17T、S17C、L18C、S19K、S19R、S19T、S19C、I20L、I20C、T21S、T21C、T23A、T23K、T23C、V24A、V24C、S25C、F27G、S28N、S28T、L29I、T30S、T30K、N31V、N31D、N31I、N31T、N32S、Y32R、Y32W、G33A、G33D、G33E、G33Y、V34L、V34N、V34E、V34Q、V34S、V34W、H35S、V37I、S40A、S40P、P41T、G44A、L48V、L48I、G49S、G49A、V50L、V50Q、V50E、V50I、V50Y、V50N、I51G、I51M、I51S、I51Q、I51A、I51C、I51V、W52F、W52Y、W52G、W52T、S53Q、S53T、S53N、S53Y、G54A、G54V、G54L、G54I、G54S、G55D、G55A、G55E、G55H、G55F、N56A、N56G、N56S、N56T、T57A、T57D、T57G、T57S、T57E、T57P、D58Y、D58N、Y59A、Y59C、Y59E、Y59F、Y59G、Y59S、Y59W、T59H、Y59P、Y59Q、N60D、N60A、T61E、T61P、P62S、F63L、F63V、T64K、T64E、T64A、T64N、T64D、S65G、L67F、L67V、S68T、N70S、N70T、K71V、D72E、N73T、S74A、S76N、Q77T、Q77S、V78L、V78F、V78A、F79Y、F79S、F79V、F80L、F80M、K81Q、K81T、K81E、K81Q、M82L、N83T、N83S、S84N、L85M、L85V、Q86R、Q86D、Q86T、S87A、S87P、N88E、N88V、N88G、N88A、N88D、I92T、I92V、A96C、R97C、A98C、L99C、L99E、T100D、T100C、T100A、Y101C、Y101W、Y101A、Y102C、Y102F、Y102A、Y102W、D103E、D103P、D103C、Y104C、E105C、E105N、E105D、E105Y、F106C、F106D、F106Y、A107C、A107D、Y108C和Y108F的位置；以及
在重链恒定区中含有氨基酸置换(取代)的变体，例如在铰链区、CH2和CH3区，包括根据EU索引编号在位置230的脯氨酸(P)由丙氨酸(A)置换、E233D、L234D、L234E、L234N、L234Q、L234T、L234H、L234Y、L234I、L234V、L234F、L235D、L235S、L235N、L235Q、L235T、L235H、L235Y、L235I、L235V、L235F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239F、S239T、S239H、S239Y、V240I、V240A、V240T、V240M、F241W、F241L、F241Y、F241E、F241R、F243W、F243LF243Y、F243R、F243Q、P244H、P245A、P247V、P247G、V262I、V262A、V262T、V262E、V263I、V263A、V263T、V263M、V264L、V264I、V264W、V264T、V264R、V264F、V264M、V264Y、V264E、D265G、D265N、D265Q、D265Y、D265F、D265V、D265I、D265L、D265H、D265T、V266I、V266A、V266T、V266M、S267Q、S267L、S267T、S267H、S267D、S267N、E269H、E269Y、E269F、E269R、E269T、E269L、E269N、D270Q、D270T、D270H、E272S、E272K、E272I、E272Y、V273I、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276S、N276E、N276R、N276L、N276Y、Y278T、Y278E、Y278K、Y278W、E283R、Y296E、Y296Q、Y296D、Y296N、Y296S、Y296T、Y296L、Y296I、Y296H、N297S、N297D、N297E、S298H、T299I、T299L、T299A、T299S、T299V、T299H、T299F、T299E、V302I、W313F、E318R、K320T、K320D、K320I、K322T、K322H、V323I、S324T、S324D、S324R、S324I、S324V、S324L、S324Y、N325Q、N325L、N325I、N325D、N325E、N325A、N325T、N325V、N325H、K326L、K326I、K326T、A327N、A327L、A327D、A327T、L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A、P329F、A330L、A330Y、A330V、A330I、A330F、A330R、A330H、A330S、A330W、A330M、P331V、P331H、I332D、I332E、I332N、I332Q、I332T、I332H、I332Y、I332A、E333T、E333H、E333I、E333Y、K334I、K334T、K334F、T335D、T335R、T335Y、D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225E、T225K、T225W、P227E、P227K、P227Y、P227G、P228E、P228K、P228Y、P228G、P230E、P230Y、P230G、A231E、A231K、A231Y、A231P、A231G、P232E、P232K、P232Y、P232G、E233N、E233Q、E233K、E233R、E233S、E233T、E233H、E233A、E233V、E233L、E233I、E233F、E233M、E233Y、E233W、E233G、L234K、L234R、L234S、L234A、L234M、L234W、L234P、L234G、L235E、L235K、L235R、L235A、L235M、L235W、L235P、L235G、G236D、G236E、G236N、G236Q、G236K、G236R、G236S、G236T、G236H、G236A、G236V、G236L、G236I、G236F、G236M、G236Y、G236W、G236P、G237D、G237E、G237N、G237Q、G237K、G237R、G237S、G237T、G237H、G237V、G237L、G237I、G237F、G237M、G237Y、G237W、G237P、P238D、P238E、P238N、P238Q、P238K、P238R、P238S、P238T、P238H、P238V、P238L、P238I、P238F、P238M、P238Y、P238W、P238G、S239Q、S239K、S239R、S239V、S239L、S239I、S239M、S239W、S239P、S239G、F241D、F241E、F241Y、F243E、K246D、K246E、K246H、K246Y、D249Q、D249H、D249Y、R255E、R255Y、E258S、E258H、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262E、V262F、V264D、V264E、V264N、V264Q、V264K、V264R、V264S、V264H、V264W、V264P、V264G、D265Q、D265K、D265R、D265S、D265T、D265H、D265V、D265L、D265I、D265F、D265M、D265Y、D265W、D265P、S267E、S267Q、S267K、S267R、S267V、S267L、S267I、S267F、S267M、S267Y、S267W、S267P、H268D、H268E、H268Q、H268K、H268R、H268T、H268V、H268L、H268I、H268F、H268M、H268W、H268P、H268G、E269K、E269S、E269V、E269I、E269M、E269W、E269P、E269G、D270R、D270S、D270L、D270I、D270F、D270M、D270Y、D270W、D270P、D270G、P271D、P271E、P271N、P271Q、P271K、P271R、P271S、P271T、P271H、P271A、P271V、P271L、P271I、P271F、P271M、P271Y、P271W、P271G、E272D、E272R、E272T、E272H、E272V、E272L、E272F、E272M、E272W、E272P、E272G、K274D、K274N、K274S、K274H、K274V、K274I、K274F、K274M、K274W、K274P、K274G、F275L、N276D、N276T、N276H、N276V、N276I、N276F、N276M、N276W、N276P、N276G、Y278D、Y278N、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278H、Y278V、Y278L、Y278I、Y278M、Y278P、Y278G、D280K、D280L、D280W、D280P、D280G、G281D、G281K、G281Y、G281P、V282E、V282K、V282Y、V282P、V282G、E283K、E283H、E283L、E283Y、E283P、E283G、V284E、V284N、V284T、V284L、V284Y、H285D、H285E、H285Q、H285K、H285Y、H285W、N286E、N286Y、N286P、N286G、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290N、K290H、K290L、K290W、P291D、P291E、P291Q、P291T、P291H、P291I、P291G、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293N、E293R、E293S、E293T、E293H、E293V、E293L、E293I、E293F、E293M、E293Y、E293W、E293P、E293G、E294K、E294R、E294S、E294T、E294H、E294V、E294L、E294I、E294F、E294M、E294Y、E294W、E294P、E294G、Q295D、Q295E、Q295N、Q295R、Q295S、Q295T、Q295H、Q295V、Q295I、Q295F、Q295M、Q295Y、Q295W、Q295P、Q295G、Y296K、Y296R、Y296A、Y296V、Y296M、Y296G、N297Q、N297K、N297R、N297T、N297H、N297V、N297L、N297I、N297F、N297M、N297Y、N297W、N297P、N297G、S298D、S298E、S298Q、S298K、S298R、S298I、S298F、S298M、S298Y、S298W、T299D、T299E、T299N、T299Q、T299K、T299R、T299L、T299F、T299M、T299Y、T299W、T299P、T299G、Y300D、Y300E、Y300N、Y300Q、Y300K、Y300R、Y300S、Y300T、Y300H、Y300A、Y300V、Y300M、Y300W、Y300P、Y300G、R301D、R301E、R301H、R301Y、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304N、S304T、S304H、S304L、V305E、V305T、V305Y、K317E、K317Q、E318Q、E318H、E318L、E318Y、K320N、K320S、K320H、K320V、K320L、K320F、K320Y、K320W、K320P、K320G、K322D、K322S、K322V、K322I、K322F、K322Y、K322W、K322P、K322G、S324H、S324F、S324M、S324W、S324P、S324G、N325K、N325R、N325S、N325F、N325M、N325Y、N325W、N325P、N325G、K326P、A327E、A327K、A327R、A327H、A327V、A327I、A327F、A327M、A327Y、A327W、A327P、L328D、L328Q、L328K、L328R、L328S、L328T、L328V、L328I、L328Y、L328W、L328P、L328G、P329D、P329E、P329N、P329Q、P329K、P329R、P329S、P329T、P329H、P329V、P329L、P329I、P329M、P329Y、P329W、P329G、A330E、A330N、A330T、A330P、A330G、P331D、P331Q、P331R、P331T、P331L、P331I、P331F、P331M、P331Y、P331W、I332K、I332R、I332S、I332V、I332F、I332M、I332W、I332P、I332G、E333L、E333F、E333M、E333P、K334P、T335N、T335S、T335H、T335V、T335L、T335I、T335F、T335M、T335W、T335P、T335G、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337N、S337H、S298A、K326A、K326S、K326N、K326Q、K326D、K325E、K326W、K326Y、E333A、E333S、K334A、K334E、Y300I、Y300L、Q295K、E294N、S298N、S298V、S298D、D280H、K290S、D280Q、D280Y、K290G、K290T、K290Y、T250Q、T250E、M428L、M428F、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、V264I、V264T、V264Y、E272Y、K274E、Y278T、N297D、T299A、T299V、T299I、T299H、K326T、L328A、L328H、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N及I332Q。
4.缀合物
本发明还提供了缀合物，其含有本发明提供的具有条件活性的抗-EGFR抗体，其直接或者通过接头间接连接一或多个靶向剂。这些缀合物含有如下成分：抗体(Ab)、(接头(L))q、(靶向剂)m，以式Ab-(L)q-(靶向剂)m表示，其中q是0或更多，m是至少1。因此，本文提供的缀合物含有一或多种靶向剂，与本文提供的抗体共价连接，所述抗体对于肿瘤微环境是具有条件活性的或选择性的并结合EGFR。
因此，这些缀合物也称作抗体-药物缀合物(ADC)或者免疫缀合物，可用于靶向输送细胞毒性剂或细胞抑制剂，即药物，以在癌症的治疗中杀死或抑制肿瘤细胞。这种缀合物呈现出希望被消除的肿瘤细胞选择性，对非患病细胞则无选择性，从而对正常细胞不引起不可接受水平的毒性。因此，所述缀合物实现最大效力及最小毒性和降低的副作用。因此，这种化合物可用于本发明描述的癌症或其它疾病或紊乱的诊断或治疗方法中。
如上所述，靶向剂的数目以变量m标明，其中m是1或更大的整数。所述靶向剂与本文提供的抗体通过由变量q标明的许多接头缀合，其中q是0或任何整数。选择变量q和m，由此所得缀合物与靶细胞，特别是在酸性微环境中肿瘤细胞的EGFR相互作用，及所述靶向剂被靶细胞内在化。典型地，m在1-8之间。q是0或更大，根据连接的靶与靶向剂的数目和/或接头的功能而定；q通常是0-4。当缀合物中存在一个以上的靶向剂时，所述靶向剂可以是相同或不同的。
所述靶向剂可以与抗-EGFR抗体直接或者通过一或多个接头共价连接。缀合物的元件中的任何合适的关联均涵盖，只要所得缀合物与靶细胞的EGFR相互作用即可，由此关联的靶向剂被内在化。因此，本文提供的缀合物可以作为融合蛋白产生，可以化学偶联，或者可包括融合蛋白一部分及化学连接的部分，或者其任何组合。
所述靶向剂也可以被修饰，以使其更适于与接头和/或抗-EGFR抗体缀合，或者以增加其细胞内活性。例如，在多肽靶向剂的情况中，这种修饰包括但不限于在N末端或C末端或其附近导入Cys残基、衍生以导入反应性基团如巯基基团，及在靶向剂的羧基末端加入淘选信号如(Xaa-Asp-Glu-Leu)n(SEQ ID NO.1190)，其中Xaa是Lys或Arg，优选Lys，及n是1-6，优选1-3(见例如Seetharam et al.(1991)J.Biol.Chem.266：17376-17381；及Buchneret al.(1992)Anal.Biochem.205：263-270)，使靶向剂定向于内质网。
在其它实例中，靶向剂可以被修饰以消除一或多个半胱氨酸残基，例如以在优选的位置提供更可预见的巯基缀合。必须小心以避免改变所得修饰的靶向剂的特异性，除非这种改变是希望的。在所有情况中，可以根据经验确定特定的修饰。
所述接头L通过共价键使所述抗体附着于靶向剂。所述接头可以是肽或非肽，可以选择以解除或降低由靶向剂与抗-EGFR抗体的接近所致的位阻，和/或增加或改变缀合物的其它性质，如靶向部分的特异性、毒性、溶解性、血清稳定性和/或细胞内利用性，和/或增加抗-EGFR抗体与靶向剂之间键连的灵活性。
当考虑融合蛋白时，选择接头，由此所得核酸分子编码融合蛋白，其结合肿瘤微环境中表达EGFR的细胞，并被所述细胞内在化，所有或部分内在化的蛋白质优选输送至细胞质。也考虑几个接头可以连接在一起以使用每个接头的有利性质。在这种情况中，缀合物的接头部分可以含有多于50个氨基酸残基。残基数不重要，只要所得融合蛋白结合白细胞的EGFR及通过将靶向剂输送至细胞质和/或细胞核的途径使连接的靶向剂内在化即可。
所述靶向剂可以是蛋白质、肽、核酸、小分子、治疗部分，或者其它药剂，其中希望向所选择的肿瘤细胞群进行靶向输送。这种靶向剂包括但不限于细胞毒性剂、DNA和RNA核酸酶、毒素、药物或其它药剂。治疗性部分包括但不限于细胞毒性部分、放射性同位素、化疗剂、裂解肽和细胞因子。示例性的治疗性部分包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、美登素及其类似物或衍生物、阿里他汀或其功能肽类似物或其衍生物、多拉司他汀10或15或其类似物、伊立替康或其类似物、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素、卡里奇霉素或其类似物或衍生物、抗代谢物、烷化剂、铂衍生物、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、雷查霉素(CC-1065)或者其类似物或衍生物、抗生素、吡咯[2，1-c][1，4]-苯并二氮(PDB)、毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素A，及美洲商陆抗病毒蛋白。
在这些方法中药物也可以用作靶向剂。这种药物包括5-氟尿嘧啶、长春花生物碱及抗生素如更生霉素、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、柔红霉素、氨甲喋呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素和氨茴霉素(AMC)、新制癌菌素(Takahashi et al.(1988)Cancer61：881-888)及长春地辛(Rowland et al.，(1986)Cancer Immunol Immunother 21(3)：183-187)。
用于抗体-毒素缀合物中的毒素包括细菌毒素如白喉毒素及其活性片段及杂交分子，植物毒素如蓖麻毒素(美国专利No.4,753,894；美国专利No.5,629,197；美国专利No.4,958,009；美国专利No.4,956,453)，小分子毒素如格尔德霉素(Mandler et al.(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler et al.(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10：1025-1028；Mandler et al.(2002)Bioconjug.Chem.13：786-791)，maytansinoid，如DM1、DM3和DM4(EP 1391213；Chari(2008)Acc Chem Res 41：98-107；Liu et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)，及卡里奇霉素(calicheamicin)(Damle(2004)Expert Opin Biol Ther 4：1445-1452；Lode et al.(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman et al.(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。最后，可以应用阿里他汀肽、阿里他汀E(AE)、monomethyl阿里他汀E(MMAE)和monomethyl阿里他汀F(MMAF)、尾海兔素的合成类似物(Doronin et al.(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)。其它毒素包括霍乱毒素、志贺样毒素、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌素外毒素、alorin、皂草素、蒴莲根毒素、甘丙肽、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素，及依诺霉素毒素。所述毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或者拓扑异构酶抑制等机制发挥其细胞毒性和抑制细胞生长作用。
a.靶向剂
所述靶向剂可以是蛋白质、肽、核酸、小分子、治疗性部分，或者希望靶向输送至选择的肿瘤细胞群的其它药剂。这种靶向剂包括但不限于细胞毒性剂、DNA和RNA核酸酶、毒素、药物或者其它药剂。
i.Maytansinoid药物部分
Maytansinoid药物部分在美国专利No.8,142,784中描述。美登素化合物通过抑制微管蛋白质(微管蛋白)的聚合而抑制有丝分裂期间微管形成，从而抑制细胞增殖(Remillard et al.(1975)Science 189：1002-1005；美国专利No.5,208,020)。美登素及maytansinoids是高度细胞毒性的，但是其在癌症治疗中的临床应用由于其归因于不佳的肿瘤选择性的严重副作用而显著受限。使用美登素的临床试验由于对中枢神经系统和胃肠道系统的严重不良作用已经中断(Issel et al.(1978)Can.Treatment.Rev.5：199-207)。
Maytansinoid药物部分在抗体-药物缀合物中是引人注目的药物部分，因为其是：(i)相对易于通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化而制备，(ii)便于用适于通过非二硫键接头与抗体缀合的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，及(iv)有效对抗许多肿瘤细胞系。
适用作maytansinoid药物部分的美登素化合物为本领域熟知，可根据已知方法自天然来源分离，使用遗传工程技术产生(见Yu et al.(2002)PNAS99：7968-7973)，或者根据已知方法合成制备美登醇和美登醇类似物。
示例性的maytansinoid药物部分包括具有修饰的芳香环的那些，例如C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(通过安丝菌素P2的氢化铝锂还原而制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌去甲基化或使用LAH脱氯而制备)；及C-20-去甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰基氯酰化而制备)；以及具有在其它位置修饰的那些部分。
示例性的maytansinoid药物部分还包括具有修饰的那些，例如C-9-SH，通过美登醇与H2S或P2S5反应而制备(美国专利No.4,424,219)；C-14-烷氧甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；从Nocardia中制备的C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)；通过链霉菌对美登醇转化而制备的C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)；从滑桃树(Trewia nudiflora)中分离的C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和美国专利No.4,315,929)；通过链霉菌对美登醇去甲基化而制备的C-18-N-去甲基(美国专利No.4,362,663和美国专利No.4,322,348)；及通过美登醇的三氯化钛/LAH还原而制备的4，5-脱氧基(美国专利No.4,371,533)。
已知美登素化合物上许多位置根据连接类型可用作键连位置。例如，对于形成酯键，具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置以及具有羟基的C-20位置均是合适的。
Maytansinoid药物部分可以通过直接缀合或者使用本文提供的任何接头与抗-EGFR抗体连接。在特别的实例中，细胞毒性剂或药剂是mertansine，也称作DM1(N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧基丙基)-美登素)。Mertansine可以通过4-巯基戊酸连接。Emtansine缀合物也可以用本发明的抗体形成，使用接头4-(3-巯基-2，5-二氧-1-吡咯烷基甲基)-环己基羧酸(MCC)。
ii.阿里他汀和海兔毒素药物部分
阿里他汀和海兔毒素在公开的美国专利申请No.US201I/0217321中描述。海兔毒素和阿里他汀已经示出干扰微管动力学、GTP水解及核与细胞分裂(Woyke et al.(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)，及具有抗癌活性(美国专利No.5,663，149)和抗真菌活性(Pettit et al.(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。进一步地，阿里他汀是高效的、合成的、稳定的及耐受化学修饰，以允许接头附着(Senter(2009)Curr Opin Chem Biol 13：235-244)。
由于阿里他汀是合成的，因此可以进行整体结构修饰以显著改变亲代药物的性质。例如，monomethyl阿里他汀F(MMAF)末端是氨基酸残基苯丙氨酸，这样削弱了细胞膜通透性(Doronina et al.，(2006)Bioconjug Chem.17：114-124)。因此，MMAF与ADC的缀合可促进抗原阳性细胞的选择性药物摄取(Doronina et al.，(2006)Bioconjug Chem.17：114-124；Doronina et al.，(2003)Nat Biotechnol.21：778-784)。
所述dolastatin或阿里他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO 2002/088172)。示例性的阿里他汀实施方案包括N-末端和C-末端连接的monomethyl阿里他汀药物部分MMAE和MMAF(Senter et al.(2004)“Proceedings ofthe American Association for Cancer Research，”Volume 45，Abstract Number 623，and presented Mar.28，2004；U.S.Publication No.2011/0020343)。
海兔毒素或阿里他汀可以通过直接缀合或者使用本文提供的任何接头与抗-EGFR抗体连接。在特别的实例中，海兔毒素或阿里他汀可以用肽接头如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)与抗-EGFR抗体连接。
iii.细胞毒素部分
适用于所述方法和组合物中的细胞毒素包括小分子，如DNA裂解剂，及蛋白质样细胞毒素，包括但不限于细菌、真菌、植物、昆虫、蛇和蜘蛛毒素。考虑掺入本文提供的缀合物中的示例性的细胞毒素的氨基酸序列在表11中示出。
表11：示例性的毒素的氨基酸序列
(a)DNA裂解剂
适于作为细胞毒素包含于本发明方法中使用的嵌合配体-毒素中的DNA裂解剂的实例包括但不限于蒽醌-寡吡咯-甲酰胺、苯并咪唑、leinamycin、代纳霉素A(dynemycinA)、烯二炔，以及其生物学活性类似物或衍生物(即具有基本等价的生物学活性的那些)。已知的类似物和衍生物在例如Islam et al.，J.Med.Chem.342954-61，1991；Skibo et al.，J.Med.Chem.37：78-92，1994；Behroozi et al.，Biochemistry 35：1568-74，1996；Helissey et al.，Anticancer Drug Res.11：527-51，1996；Unno et al.，Chem.Pharm.Bull.45：125-33，1997；Unno et al.，Bioorg.Med.Chem.，5：903-19，1997；Unno et al.，Bioorg.Med.Chem.，5：883-901，1997；及Xu et al.，Biochemistry 37：1890-7，1998)中公开。其它实例包括但不限于endiyne醌亚胺(美国专利No.5,622,958)；2，2r-二(2-氨乙基)-4-4'-二噻唑(Lee et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.40：151-7，1996)、epilliticine-手性铜缀合物(Routier et al.，Bioconjug.Chem.，8：789-92，1997)。
(b)抗代谢物
可用作细胞毒素包含于嵌合配体-毒素中的抗代谢物的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、美法仑、道诺霉素、阿霉素、氮芥和丝裂霉素c。
(c)蛋白质样细胞毒素
可用于掺入本发明方法中使用的嵌合配体-毒素中的蛋白质样细胞毒素的实例包括但不限于1型和2型核糖体失活蛋白质(RIP)。有用的1型植物RIP包括但不限于石竹素30、石竹素32、剪秋萝甙、皂草素1-9、美洲商陆激活的蛋白质(PAP)、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异株泻根毒蛋白-L、异株泻根毒蛋白、大肠菌素1和2、丝瓜素-A、丝瓜素-B、丝瓜素-S、19K-蛋白质合成抑制蛋白(PSI)、15K-PSI、9K-PSI、a-kirilowin、β-kirilowin、白树毒素、地肤子皂苷、地肤子皂苷-II、地肤子皂苷-Ic、MAP-30、α-苦瓜素、β-苦瓜素、天花粉蛋白、TAP-29、栝楼素(trichokirin)、大麦RIP、亚麻RIP、麦芽凝集素、玉米RIP、Asparin 1和2(Stirpe et al.，Bio/Technology 10：405-12，1992)。有用的2型RIP包括但不限于沃氏藤黄辛、蓖麻毒素、nigrin-b、CIP-29、相思豆毒素、蒴莲素、ebulitin-a、ebulitin-β、ebulitin-γ、vircumin、黄樟毒蛋白及其生物学活性酶亚基(Stirpe et al.，Bio/Technology 10：405-12，1992；Pastan et al.，Annu.Rev.Biochem.61：331-54；Brinkmann and Pastan，Biochim.et Biophys.Acta 1198：27-45，1994；及Sandvig andVan Deurs，Physiol.Rev.76：949-66，1996)。
(d)细菌毒素
可用作细胞毒素的细菌毒素的实例包括但不限于志贺毒素和志贺样毒素(即具有相同活性或结构的毒素)，以及其催化亚基和生物功能片段。这些细菌毒素也是2型RIP(Sandvig and Van Deurs，Physiol.Rev.76：949-66，1996；Armstrong，J.Infect.Dis.，171：1042-5，1995；Kim et al.，Microbiol.Immunol.41：805-8，1997，and Skinner etal.，Microb.Pathog.24：117-22，1998)。有用的细菌毒素的另外的实例包括但不限于假单胞菌属外毒素和白喉毒素(Pastan et al.，Annu.Rev.Biochem.61：331-54；及Brinkmannand Pastan，Biochim.et Biophys.Acta 1198：27-45，1994)。截短形式和突变体的毒素酶促亚基也可用作细胞毒素部分(Pastan et al.，Annu.Rev.Biochem.61：331-54；Brinkmannand Pastan，Biochim.et Biophys.Acta 1198：27-45，1994；Mesri et al.，J.Biol.Chem.268：4853-62，1993；Skinner et al.，Microb.Pathog.24：117-22，1998；及美国专利No.5,082,927)。其它靶向剂包括但不限于34个以上的所描述的RNase毒素的大肠杆菌素家族成员，包括大肠杆菌素A、B、D、E1-9、阴沟肠杆菌素DF13和真菌Rnase、α-帚曲毒蛋白(Ogawa et al.Science 283：2097-100，1999；Smarda et al.，Folia Microbiol(Praha)43：563-82，1998；Wool et al.，Trends Biochem.Sci.，17：266-69，1992)。
(e)卟啉及其它光激活的毒素
卟啉是熟知的可光激活的毒素，其可容易地与蛋白质交联(见例如美国专利No.5,257,970；美国专利No.5,252,720；美国专利No.5,238,940；美国专利No.5,192,788；美国专利No.5,171,749；美国专利No.5,149,708；美国专利No.5,202,317；美国专利No.5,217,966；美国专利No.5,053,423；美国专利No.5,109,016；美国专利No.5,087,636；美国专利No.5,028,594；美国专利No.5,093,349；美国专利No.4,968,715；美国专利No.4,920,143和国际申请WO 93/02192)。
iv.用于靶向输送的核酸
本文提供的缀合物也可以用于输送核酸至白细胞。所述核酸包括用于修饰细胞基因组及从而实现遗传治疗作用的DNA，以及用作反义剂的DNA和RNA。所述核酸包括反义RNA、DNA、核酶及用作反义剂的其它寡核苷酸。所述核酸也可包括RNA运输信号，如病毒包装序列(见例如Sullenger et al.(1994)Science 262：1566-1569)。所述核酸也包括DNA分子，其编码完整基因或者编码用于基因治疗中的蛋白质。
可以输送至细胞以置换缺陷的基因以实现基因治疗作用的DNA(或RNA)包括编码肿瘤特异性细胞毒性分子如肿瘤坏死因子、病毒抗原及使细胞易感于抗癌剂的其它蛋白质的DNA，以及编码基因如与囊性纤维化相关的缺陷基因(CFTR)的DNA(见例如国际专利申请WO 93/03709，其基于U.S.Application Serial No.07/745,900；及Riordan et al.(1989)Science245：1066-1073)。
如本文所述使用的核酸和寡核苷酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法合成(见例如WO 93/01286，其基于U.S.Application Serial No.07/723,454；美国专利No.5,218,088；美国专利No.5,175,269；美国专利No.5,109,124)。用作反义剂的寡核苷酸和核酶的鉴定为本领域技术人员熟知。编码靶向输送以进行基因治疗的基因的选择也在本领域技术人员技术水平内。例如，本领域技术人员熟知这种寡核苷酸的希望的性质、长度及其它特性。设计反义寡核苷酸以抵抗内源性核酸裂解酶的降解，所述反义寡核苷酸包括但不限于：硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、砜、硫酸盐、羰自由基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯及其它这种连接(见例如Agrawal et al.(1987)Tetrahedron Lett.28：3539-3542；Miller etal.(1971)J.Am.Chem.Soc.93：6657-6665；Stec et al.(1985)Tetrahedron Lett.26：2191-2194；Moody et al.(1989)Nucl.Acids Res.17：4769-4782；Letsinger et al.(1984)Tetrahedron40：137-143；Eckstein(1985)Annu.Rev.Biochem.54：367-402；Eckstein(1989)Trends Biochem.Sci.14：97-100；Stein(1989)In：Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression，Cohen，ed，Macmillan Press，London，pp.97-117；Jager et al.(1988)Biochemistry 27：7237-7246)。
(a)反义核苷酸，包括：反义寡核苷酸、三链(triplex)分子、哑铃状寡核苷酸、DNA、胞外蛋白质结合寡核苷酸及小核苷酸分子
反义核苷酸是特异性结合具有互补序列的mRNA的寡核苷酸，从而阻止所述mRNA的翻译(见例如Altman等的美国专利No.5,168,053，Inouye的美国专利No.5,190,931，Burch的美国专利No.5,135,917，Smith and Clusel et al.(1993)Nucl.Acids Res.21：3405-3411所述美国专利No.5,087,617，其描述了哑铃状反义寡核苷酸)。三链分子是指单链DNA，其靶向双链DNA，从而阻止转录(见例如Hogan等的美国专利No.5,176,996，其描述了产生结合双链DNA上靶位点的合成的寡核苷酸的方法)。
(b)核酶
核酶是特异性裂解信使RNA的RNA构建体。已知有至少5类核酶参与RNA链的裂解和/或连接。核酶可以靶向任何RNA转录物，及可以催化性裂解这种转录物(见例如Cech等的美国专利No.5,272,262，美国专利No.5,144,019，及美国专利Nos.5,168,053、5,180,818、5,116,742和5,093,246，其描述了核酶及产生其的方法)。任何这种核糖体均可以与具有条件活性的抗-EGFR抗体连接以在酸性条件下输送至携带EGFR的细胞。
所述核酶可以作为编码核酶DNA与真核启动子，如真核病毒启动子，通常为晚期启动子，连接被输送至靶细胞，由此在导入核中时，所述核酶被直接转录。在这种情况中，所述构建体还包括核易位序列，通常作为靶向剂的一部分或者作为接头的一部分，以使其适于输送连接的核酸至核。
(c)编码用于靶向输送的治疗产物的核酸
编码考虑使用的治疗产物的DNA是编码正确拷贝抗癌剂的DNA，如肿瘤坏死因子和细胞毒性剂，如针对携带EGFR的肿瘤细胞的志贺毒素A1或者皂草素。所述缀合物用包括核易位序列(NTS)。如果缀合物设计为靶向剂和连接的DNA在细胞质中裂解，然后NTS应包含与接头的保持结合DNA的部分中，由此当内在化时，所述缀合物将被输送至细胞核。核易位序列(NTS)可以是异源序列或者可以衍生自所选择的趋化因子受体靶向剂。典型的共有NTS序列含有一个氨基末端脯氨酸或甘氨酸，随后是在7-9个氨基酸阵列中的至少三个碱性残基(见例如Dang et al.(1989)J.Biol.Chem.264：18019-18023，Dang et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：4048-4054)。
(d)核酸与蛋白质的偶联
为了实现本发明所述化学缀合，将靶向剂与核酸直接或者通过一或多个接头连接。将在5’末端、3’末端和别处的核酸缀合于蛋白质的氨基和羧基末端及其它位点的方法为本领域技术人员已知(参见例如Goodchild，(1993)In：Perspectives in BioconjugateChemistry，Mears，Ed.，American Chemical Society，Washington，D.C.pp.77-99)。例如，使用紫外光放射(Sperling et al.(1978)Nucleic Acids Res.5：2755-2773；Fiser etal.(1975)FEBS Lett.52：281-283)、双功能化合物(et al.(1978)Eur.J.Biochem.89：353-359；及Oste et al.(1979)Mol.Gen.Genet.168：81-86)以及光化学交联(Vanin et al.(1981)FEBS Lett.124：89-92；Rinke et al.(1980)J.Mol.Biol.137：301-304；Millon et al.(1980)Eur.J.Biochem.110：485-492)连接蛋白质与核酸的。
特别地，试剂N-乙酰-N’-(对-乙醛酰基苯基)胱胺和2-亚氨基四氢硫杂茂已经用于通过形成混合的二硫键将DNA与蛋白质偶联，如α2巨球蛋白(α2M)(见Cheng et al.(1983)Nucleic Acids Res.11：659-669)。N-乙酰-N'-(对-乙醛酰基苯基)胱胺与非配对的鸟嘌呤残基特异性反应，及基于还原产生游离的巯基基团。2-亚氨基四氢硫杂茂与蛋白质反应产生巯基基团，然后其通过分子间二硫键互换作用与衍生化的DNA缀合。任何键均可以使用，条件是在所述缀合物被内在化时，所述靶向核酸是具有活性的。因此，预期所述键的裂解可能是必需的，尽管对一些试剂如与启动子连接的编码核酶的DNA或者编码输送至核的治疗剂的DNA而言，这种裂解可能不是必需的。
硫醇键可容易地使用异双功能试剂形成。胺也已经附着于水溶液中未保护的寡核苷酸或核酸的末端5’磷酸盐，通过核酸与在pH 6咪唑缓冲液中水溶性碳化二亚胺如1-乙基-3’[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺(EDC)或N-乙基-N’(3-二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)反应，产生5’磷酸咪唑烷(5'phosphorimidazolide)。将5’磷酸咪唑烷与含氨基分子和乙二胺反应，获得稳定的氨基磷酸酯(见例如Chu et al.(1983)Nucleic AcidsRes.11：6513-6529；及WO 88/05077，其指定美国)。特别地，将DNA溶液用pH6的EDC饱和，在4℃搅拌温育过夜。然后将所得溶液通过加入例如大约3体积的100mM柠檬酸盐缓冲液缓冲至pH 8.5，加入大约5μg-20μg趋化因子受体靶向剂，在4℃搅拌所得混合物大约48小时。未反应的蛋白质可以通过柱层析从混合物中除去，使用例如SEPHADEX G75(Pharmacia)，使用0.1M碳酸铵溶液pH 7.0作为洗脱缓冲液。分离的缀合物可以冻干并贮存直至使用。
美国专利No.5,237,016提供了制备在其5’末端是溴乙酰化的核苷酸及将所得寡核苷酸与硫醇基团反应的方法。在其5’末端溴乙酰基团的寡核苷酸衍生化可以通过5’-氨基己基-氨基磷酸酯寡核苷酸与溴乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应而制备，如美国专利No.5,237,016所述。美国专利No.5,237,016也描述了制备硫醇衍生化核苷酸的方法，其随后可与所选择的生长因子上的硫醇基团反应。简而言之，硫醇衍生化核苷酸是使用5’-磷酸化核苷酸在两个步骤中制备的：(1)在一个反应步骤中磷酸盐基团与咪唑在存在二酰亚胺条件下反应及咪唑离去基团由胱胺替代；及用与二硫苏糖醇还原胱胺接头的二硫键(也见Chu et al.(1988)Nucl.Acids Res.16：3671-3691，其描述了相似的方法)。5’-磷酸化起始寡核苷酸可以通过本领域技术人员已知的方法制备(见例如Maniatis et al.(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，p.122)。
反义寡聚物或核酸如甲基膦酸酯寡核苷酸(MP-寡聚物)可以通过与SPDP或SMPB反应而衍生化。所得MP-寡聚物可以通过HPLC纯化，然后与趋化因子受体靶向剂偶联。将MP-寡聚物(大约0.1μM)溶解于大约40-50μl的1∶1乙腈/水中，向其中加入磷酸盐缓冲液(pH 7.5，终浓度0.1M)和在大约1ml磷酸盐缓冲盐水中的1mg MP-寡聚物。使所述反应在室温进行大约5-10小时，然后用大约15μL0.1碘乙酰胺终止。所述缀合物可以在肝素琼脂糖Hi Trap柱(1ml，Pharmacia)上纯化并用线性或逐步梯度洗脱。所述缀合物应在0.6M NaCl中洗脱。
b.接头
接头L通过共价键使抗体与靶向剂附着。接头是一种双功能或多功能部分，其可用于将一或多个靶向剂与抗-EGFR抗体连接以形成抗体-药物缀合物(ADC)。ADC可使用具有反应功能性的接头以使靶向剂与抗-EGFR抗体结合容易地制备。抗-EGFR抗体的半胱氨酸硫醇基团或者胺基团例如N末端或赖氨酸侧链可以与接头试剂、靶向剂或靶向剂-接头试剂的官能团形成键。
接头优选在胞外环境中是稳定的，由此抗体-药物缀合物(ADC)是稳定的并保持完整，即在转运或输送至靶细胞之前抗体保持与靶向剂连接。因此，接头在靶细胞外部是稳定的，及一旦在细胞内部时可以被裂解或者使得抗体和靶向剂以一些有效速率解离。考虑的接头是(i)不干扰抗体的特异性结合性质，(ii)允许细胞内输送缀合物或靶向剂，(iii)保持稳定及完整，即不被裂解，直至缀合物已经输送或转运至其靶向部位；及(iv)不干扰靶向剂的细胞毒性、杀细胞作用或者抑制细胞生长作用。ADC的稳定性可以通过标准分析技术如质谱分析和/或HPLC测量。
接头有两个反应性官能团，以允许抗体与靶向剂的共价附着，并因此在反应性(reactive sense)上呈现出二价。可用于附着两或多个功能或生物学活性部分，如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原及报道基因的这种化学交联试剂是已知的，并且已经描述了其用于产生缀合物的方法(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques；AcademicPress：New York，p234-242)。
在一些实例中，接头是反应性官能团，其具有与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。有用的抗体上的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基基团。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应，与抗体单位形成共价键。接头上的有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼及芳酰肼。抗体上的亲电子基团提供了便于接头附着的位点。
i.肽接头
接头可以是肽接头，其包含一或多个氨基酸单元。肽接头可以通过固相或液相合成方法制备(E.Schroder and K.Lubke，The Peptides，volume 1，pp76-136(1965)Academic Press)，这些方法为肽化学领域熟知，包括t-BOC化学(Geiser et al.″Automation of solid-phase peptide synthesis″in Macromolecular Sequencing andSynthesis，Alan R.Liss，Inc.，1988，pp.199-218)及Fmoc/HBTU化学(Fields，G.andNoble，R.(1990)″Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids″，Int.J.Peptide Protein Res.35：161-214)，在自动合成仪如Rainin Symphony Peptide Synthesizer(Protein Technologies，Inc.)，or Model 433(Applied Biosystems)上制备。基于肽的接头与水解或还原剂不稳定的接头相比具有更多优势，因为蛋白酶解是酶促的，所述酶可以针对在肿瘤细胞中优先表达而选择。组织蛋白酶B-可裂解的肽接头缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)及其修饰如马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(mc-vc)、苯丙氨酸-赖氨酸、Ala-Leu-Ala-Ala(SEQ ID NO：1201)及其它三/四肽是示例性的肽接头，其已经用于ADCs中(Dosio et al.，(2010)Toxins 3：848-883；Doronina et al.，(2006)Bioconjug Chem.17：114-124；Doronina et al.，(2003)NatBiotechnol.21：778-784；Sanderson et al.，(2005)Clin Cancer Res 11：843-852；Ducryand Stump(2010)Bioconjug Chem.21：5-13)。示例性的不可裂解的肽接头包括N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸。其它肽接头在No.2011/0020343中描述。
优选的肽接头是可以掺入融合蛋白中并在宿主细胞如大肠杆菌中表达的那些接头。这种接头包括：酶底物，如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、因子Xa底物及肠激酶底物；增加溶解性、灵活性和/或细胞内可裂解性的接头，包括如(glymser)n和(sermgly)n，其中m是1-6，优选1-4，更优选2-4，n是1-6，优选1-4，更优选2-4(见例如国际PCT申请号WO 96/06641，其提供了示例性的用于缀合物中的接头)。在一些实施方案中，可包含几个接头以利用每个接头的希望的性质。
ii.化学接头
ADC也可以使用不可裂解的部分或者化学交联剂接头制备。不可裂解的接头包括酰胺接头及具有琥珀酸盐间隔物的酰胺和酯键连(Dosio et al.，(2010)Toxins 3：848-883)。示例性的化学交联接头包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)和SIAB(琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯)。SMCC是一种氨基-巯基交联接头，其在中等长度的环己烷稳定的间隔物臂的相对端含有NHS-酯和马来酰亚胺反应基团。SIAB是短的NHS-酯和碘乙酰交联接头以进行氨基-巯基缀合。其它示例性的交联剂包括但不限于硫醚接头、化学不稳定的腙接头4-巯基戊酸、BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB及SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，以及双马来酰亚胺试剂如DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4，这些是可以商购的(PierceBiotechnology，Inc.)。双马来酰亚胺试剂使得抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基团以相继的或同时的方式附着于含有硫醇的靶向剂或者接头中间物。除了马来酰亚胺之外的其它硫醇反应性官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。其它示例性的接头及其使用方法在U.S.公开No.2005/0276812和Ducryand Stump(2010)Bioconjug Chem.21：5-13中描述。
接头任选可以由调节溶解性或反应性的基团取代。例如，磺酸盐取代基可增加所述试剂的水溶解性及促进接头与抗体或药物部分的偶联反应，或者促进抗-EGFR Ab-L与靶向剂或者靶向剂与抗-EGFR Ab的偶联反应，根据用于制备ADC的合成途径而定。
其它接头也可以通过商业来源获得，如得自Molecular Biosciences Inc.(Boulder，Colo.)，或者根据Toki et al.(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872、美国专利No.6,214,345、WO 02/088172、U.S.2003130189、U.S.2003096743、WO 03/026577、WO 03/043583和WO 04/032828所述方法合成。例如，接头如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺丁酰氨基苄基-DOTA)可以通过用异丙基氯甲酸酯(Aldrich)激活的氨基苄基-DOTA与4-马来酰亚胺丁酸(Fluka)反应而制备，根据Axworthy et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4)：1802-1807)所述进行。DOTA-马来酰亚胺与半胱氨酸工程化的抗体的游离半胱氨酸氨基酸反应，并在抗体上提供的金属复合物配体(Lewis et al.(1998)Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合接头标记试剂如DOTA-NHS(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)可商购(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。
所述接头可以是树枝状类型接头，通过分支的多功能接头部分使一个以上的药物部分与抗体共价附着(Sun et al.(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun et al.(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11：1761-1768；King etal.(2002)Tetrahedron Letters43：1987-1990)。树枝状接头可增加靶向剂与抗体的摩尔比率，即荷载(loading)，这可增加ADC的潜力。因此，在抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，大量药物部分可以通过树枝状接头附着。示例性的树枝状接头在美国专利公开No.2005/0276812中描述。
D.鉴定和评估抗-EGFR抗体性质和活性的方法
本文提供的抗-EGFR抗体是基于在肿瘤微环境中与在非肿瘤微环境中呈现的选择性活性及条件活性而选择的。这种抗体可以通过对比抗体或抗体集合在两种不同条件下的活性的筛选方法或者其它方法鉴定，所述两种不同条件是模拟或反映在肿瘤微环境或非肿瘤微环境中存在的条件。所鉴定的抗体或其抗原结合片段可以在本领域技术人员已知的各种测定中进一步表征，以评估临床性质如治疗效力、EGFR亲和性、副作用、药动学和药效学性质。
如本文所述，表征实体肿瘤的条件的差异如低pH和缺氧可以起到杠杆作用，提供在患病的肿瘤微环境中活性更高的抗体。在进行这种测定或方法中，也发现其它蛋白质的浓度是影响或支配选择和条件活性的一个条件，因此其是用于筛选测定中的一个参数。例如，如实施例3所示，与不存在加入的蛋白质相对比，存在加入的蛋白质增加所选择的抗体的活性或条件活性的比率，这个差异在生理浓度蛋白质条件下更大(例如25％人血清)。在体内或生理环境中，间隙蛋白质浓度(如白蛋白)在任何地方都是血浆的20-50％。血清含有大约60-80g/L蛋白质，已经证实各种组织含有12mg/mL-40mg/mL间隙蛋白(见例如Auklandand Reed(1993)Physiological Reviews，73：1-78)。因此，为了模拟这些环境，选择或鉴定抗-EGFR抗体的测定和方法在存在10mg/mL-50mg/mL蛋白质条件下进行，这例如可以在血清如人血清提供，或者作为血清白蛋白如人血清白蛋白或者与所述抗体或受体不相互作用或者直接改变抗体-受体相互作用的其它蛋白质。在一些实例中，选择或鉴定抗-EGFR抗体的测定和方法在存在12-40mg/mL蛋白质如至少12mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL或40mg/mL蛋白质的条件下进行。在其它实例中，蛋白质在血清中提供，选择或鉴定抗-EGFR抗体的测定和方法在存在20％-50％血清(vol/vol)如20％-50％人血清、如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％血清(vol/vol)的条件下进行。
特别地，抗-EGFR的具有条件活性可以通过以双重形式进行测定而确定，从而每个测定在不同条件下进行两次，如不同的pH和/或乳酸盐浓度及在存在生理浓度总蛋白质条件下。因此，评估或选择在肿瘤微环境具有条件活性的抗-EGFR抗体的方法包括在第一系列条件(例如在肿瘤微环境中存在的条件)下评估活性的任何测定或方法，所述条件包括20-50％血清(vol/vol)或10-50mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)及大约pH5.8-6.8的酸性pH和/或10mM-20mM的增高水平的乳酸盐。例如，第一系列的条件可包括至少25％血清(vol/vol)或者12-40mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)，及大约pH6.0-6.5的酸性pH和/或15mM-20mM的增高的乳酸盐水平。在这种方法中，在第二系列的条件下评估抗-EGFR抗体活性，所述条件包括20-50％血清(vol/vol)或10-50mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)，及接近中性pH或大约7.0-7.4的中性pH和/或0.5-5mM的乳酸盐浓度。例如，第二系列的条件包括至少25％血清(vol/vol)或者12-40mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)，及大约7.0-7.2的pH和/或1mM-4mM的乳酸盐浓度。典型地，在这种实例中，加入的以模拟生理环境的蛋白质(如血清蛋白质)的量在两个系列的条件下是相同或基本相同的，但是在一种条件与另一种条件下可以变化±25％或更低。
选择在第一系列条件下与在第二系列条件下相比呈现出更高活性的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段作为针对肿瘤微环境具有条件活性或选择性的抗-EGFR抗体。例如，选择在第一系列条件下与第二系列条件下相比活性比率为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0或更多的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。典型地，为了用作肿瘤微环境的选择性治疗剂，所述抗-EGFR抗体或其抗原结合片段是在第一系列条件(例如在肿瘤微环境中存在的条件)与第二系列条件(例如在非肿瘤微环境中存在的条件)相比呈现出至少至少3.0或更高的抗体的活性比率。
可以如本文所述筛选和/或评估在肿瘤微环境中的具有条件活性的特异于EGFR的抗-EGFR抗体包括特异于EGFR的任何抗体。这种抗体可以使用杂交瘤方法产生，例如通过在体外免疫合适的宿主动物或者免疫淋巴细胞，随后与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤(例如Kohler et al.(1975)Nature，256：495，Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，pp.59-103(Academic Press，1986))。例如，抗体可以用表达EGFR的细胞、EGFR衍生的肽或前体抗原免疫。所述抗原可以具有运载体以增强其免疫原性，可以作为具有佐剂的配制物提供并施用，和/或可以在多次注射中施用。抗体也可以通过重组DNA方法产生(例如美国专利No.4,816,567)。
抗-EGFR抗体也包括修饰的抗-EGFR抗体。修饰的抗-EGFR抗体可以衍生自任何已知的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。例如，示例性的抗-EGFR抗体包括例如(西妥昔单抗，C225或IMC-C225)、Hu225、Zhu(WO 2005/090407)的11F8、EMD 72000(马妥珠单抗)、维克替比TM(帕尼单抗；ABX-EGF)、TheraCIM(尼妥珠单抗)以及Hu-Max-EGFR(zalutumumab)。这种抗体的突变体或变体形式的文库可以通过本领域已知方法产生，以在未修饰的参考抗体导入氨基酸置换、添加或删除。本领域技术人员已知怎样产生用于本文方法中修饰的或变体蛋白质。诱变方法为本领域熟知，包括例如定点诱变，如QuikChange(Stratagene)或饱和诱变。诱变方法包括但不限于位点介导的诱变、PCR诱变、盒式诱变、定点诱变、随机点诱变、使用含有尿嘧啶的模板诱变、寡核苷酸定向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用具有缺口的双链DNA诱变、点错配修复、使用修复缺陷的宿主株系诱变、限制-选择及限制-纯化、删除诱变、通过全基因合成诱变、双链破裂修复，以及本领域技术人员已知的许多其它方法。在本发明的方法中，诱变可以在蛋白质的全长或者蛋白质的一个区域内实现。所述突变可以合理地或随机产生。在产生的集合或文库的一些实例中，每个被置换的氨基酸单独地由19个剩余的氨基酸或者由少于19个剩余的氨基酸置换，如在每个位置或位置子集由10、11、12、13、14、15、16、17或18个剩余的氨基酸置换。
可以如本文所述根据其条件活性评估或筛选全长抗体或其抗原结合片段。因此，所述抗体可以是任何形式抗体，只要其最低限度地含有足够的可变重链部分和足够的可变轻链部分以免疫特异性结合EGFR即可。在一些实例中，抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的片段或变体可以用于本文提供的测定中，如本文描述的或本领域已知的任何变体或片段。
此外，如本文提供的那些体外测定和体内动物模型可以用于测量修饰的抗-EGFR抗体的活性和/或副作用。本文提供的测定包括可以可检测或其它可测量方式检测或评估抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性的任何测定。本文提供的测定可以开发为高通量形式，以一次性以双重形式评估众多的抗-EGFR抗体如蛋白质变体的活性。
这种测定可以在体外或体内进行。所评估的活性可以是抗-EGFR抗体的任何活性，如结合EGFR的活性、细胞生长抑制(CGI)活性或肿瘤生长抑制活性。例如，在体外结合测定中可以使用固体支持物结合测定或者溶液结合测定，其中所述结合是在上述条件下进行的。在其它实例中，结合测定可以在体内进行，其中对比与肿瘤中存在的细胞与非肿瘤中存在的细胞的结合。特别地，体内结合测定可以通过评估所施用的抗体与肿瘤细胞相对于与皮肤基底角化细胞的结合或对其定位而进行。这在本发明中使用异种移植物或皮肤移植模型例证。也可以应用其它模型。
本文提供了示例性的测定法。所述测定不是限制性的。本领域技术人员已知的任何测定均可用于本文提供的方法中，以鉴定、选择或表征抗-EGFR抗体，包括检测结合的测定、功能性测定、体内测定、动物模型和临床测定。下文提供示例性的测定的描述。
1.结合测定
例如，可以测定抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体结合EGFR的能力。可以通过本领域技术人员已知的任何方法评估本文提供的抗-EGFR抗体的结合EGFR的能力。下文描述示例性的测定。在一些实例中，EGFR的片段或变体可用于本文提供的测定中。例如，EGFR可以表达为可溶蛋白质。例如，可用于本文描述的测定中的可溶的EGFR是可溶的EGF受体胞外结构域(sECD)。
结合测定可以在溶液、悬浮液或固体支持物中进行。例如，可以将EGFR固定于固体支持物上(例如碳或塑料表面、组织培养皿或芯片)并与抗体接触。未结合的抗体或靶蛋白质可以洗去，然后检测结合的复合物。结合测定可以在一定条件下进行，以降低非特异性结合，如通过使用高离子强度缓冲液(例如0.3-0.4M NaCl)与非离子洗涤剂(例如0.1％Triton X-100或Tween 20)和/或封闭蛋白质(例如牛血清白蛋白或明胶)。在这种测定中也可以包含阴性对照以测量背景结合。结合亲和性可以使用Scatchard分析(Munson et al.，(1980)Anal.Biochem.，107：220)、表面等离子共振、等温热量测定、定量ELISA或者本领域技术人员已知的其它方法确定(例如Liliomet al.(1991)J.Immunol Methods.143(1)：119-25)。
本发明描述的测定包括双重测定对比方法，其中结合是在两个不同结合条件下确定的。不同结合条件的非限制性实例包括pH，例如与中性pH(例如pH 7.4)相比的低pH(例如pH 6.0或pH 6.5)，或者乳酸盐浓度，如与低乳酸盐浓度(0-5mM)相比的高乳酸盐浓度(10-20mM)。也包括蛋白质浓度，包括20-50％血清(vol/vol)或10-50mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)。本发明所述测定的任何步骤可以在双重条件下进行，以模拟两种不同的结合条件。例如，在所述测定是ELISA的情况中，ELISA的任何步骤如包被、封闭、与检测分子(例如治疗性抗体或其抗原结合片段或变体)温育或者检测，均可以在本文所述条件下进行。在所述测定中，可分别及单独筛选修饰的抗-EGFR抗体与其同源结合伴侣(例如EGFR)在这两种模拟条件下的结合。可以评估并对比所述修饰的抗-EGFR抗体与同源结合伴侣(例如EGFR)的结合活性。测量结合的测定的实例包括溶液结合测定和固体支持物结合测定，如表面等离子共振和免疫测定如ELISA。
在一些实例中，可以测定本文提供的抗-EGFR抗体在不同的pH条件如低pH和中性pH条件下免疫特异性结合EGFR的能力。在一些实例中，所述测定可鉴定在低pH条件下与在中性pH条件下相比具有较高活性如结合活性的修饰的抗-EGFR抗体。在本发明的特定实例中，修饰的抗-EGFR抗体或其变体与EGFR或可溶的EGFR的结合活性可以在低pH(＜7.4)及增高的乳酸浓度条件下，及在大约pH7.3-7.4生理水平pH及低乳酸盐浓度条件下评估。此外，在结合测定中可包含人血清(例如5％或25％人血清)以进一步模拟天然环境。
这种测定可以例如在溶液中(例如Houghten(1992)Bio/Techniques13：412-421)、在珠上(Lam(1991)Nature354：82-84)、在芯片上(Fodor(1993)Nature364：555-556)、在细菌上(美国专利No.5,223,409)、在孢子上(美国专利Nos.5,571,698、5,403,484和5,223,409)、在质粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或者在噬菌体上(Scott and Smith(1990)Science249：386-390；Devlin(1990)Science249：404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382；及Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)进行。
可以标记所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体，以便可以评估和确定所述结合活性。例如，为了检测结合活性，可以将抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体用可检测的部分或标签标记以便于检测。本领域技术人员可根据测定条件选择合适的可检测部分或标签。例如，一些二级试剂如抗-Ig抗体不可用于在含有人血清的溶液中检测修饰的蛋白质(其是抗体)的结合。此外，抗-IgG抗体不可用于检测生物分子(其是抗体)的结合。
本领域技术人员已知的能被检测或鉴定的任何可检测的部分或其它部分均可以使用。所述部分或标签可以与检测分子如治疗性蛋白质或抗体直接连接或例如使用接头间接连接。连接可以在治疗性抗体的N或C末端。可用于本发明方法中的示例性的标签和部分包括但不限于表12中列出的任何标签和部分。
本领域技术人员已知的能连接所述可检测部分与所述治疗性抗体的任何接头均可以使用。示例性的接头包括甘氨酸富集的柔性接头(-G4S-)n，其中n是正整数，如1(SEQ IDNO：1094)、2(SEQ ID NO：1095)、3(SEQ ID NO：21)、4(SEQ ID NO：1096)、5(SEQ ID NO：1097)或更大数。
结合测定可以在溶液中进行，通过将修饰的抗-EGFR抗体粘附在固体支持上，或者通过将EGFR粘附在固体支持物上。在下文小节中提供可用于测量修饰的抗-EGFR抗体与EGFR之间的结合的示例性的测定的描述。
a.固体支持物结合测定
评估本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性的测定包括结合测定，其中在抗-EGFR抗体与EGFR的一或两者附着于固体支持物表面的条件下测量其结合。例如，在溶液中所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以与固定在固体支持物上的EGFR相互作用，或者溶液中的EGFR可以与固定在固体支持物上的修饰的抗-EGFR抗体相互作用。固体支持物结合测定可以与溶液结合测定对比，因为在固相上的固定可便于结合的抗-EGFR抗体与未结合的抗-EGFR抗体分离。本领域技术人员已知的任何固体支持物结合测定均可用于本文提供的方法中，包括表面等离子共振、生物层干涉测量和ELISA。
i.表面等离子共振
表面等离子共振(SPR)可以在高灵敏性测定中检测未标记的分子的结合，其通过测量样品中分析物分子与固定的分子的分子结合时发生的折射率改变而检测(Piliariket al.，(2009)Methods Mol Biol.503：65-88)。当表面等离子波(这是金属中电子的集体振荡)在金属/绝缘体界面激发时发生SPR。SPR在角度和波长的特定组合降低反射光强度。分子结合可以改变折射指数和金属薄膜上超薄有机物(绝缘体)层的厚度，这改变SPR共振条件。
在一些实例中，SPR动力学分析可用于确定修饰的抗-EGFR抗体与EGFR结合的结合速率和解离速率(见例如BiaCore 2000，Biacore AB，Upsala，Sweden and GE HealthcareLife Sciences；Malmqvist et al.(1993)Curr Opin Immunol.5(2)：282-6；Garcia-Ojedaet al.(2004)Infect Immun.72(6)：3451-60)。SPR动力学分析包括分析来自芯片的抗原与其表面上固定的抗体的结合与解离。使用SPR测量抗-EGFR抗体与EGFR的可溶胞外结构域的结合在本领域技术人员能力范围内(例如Saxena et al.(2011)，J.Clin.Oncol.29(suppl)：e13030)。
例如，具有一或多种抗-EGFR抗体如一或多种修饰的抗-EGFR抗体的溶液可以经过免疫固定的EGFR，或者具有EGFR的溶液可以经过固定的抗-EGFR抗体。结合速率可以通过以时间的函数测量SPR信号而测量。在结合后，可以将缓冲溶液经过所述固体支持物，以时间的函数测量解离速率。从结合速率和解离速率中，可以计算平衡结合常数(Jecklin et al.(2009)，J.Mol.Recognit.22(4)：319-29；Nguyen et al，(2007)Methods.42(2)：150-61；Tanious et al.(2008)，Methods Cell Biol.84：53-77)。通过使用SPR检测与EGFR的结合而测量抗-EGFR抗体活性在本领域技术人员能力范围内(见例如Alvarenga et al.(2012)Anal.Biochem421(1)：138-151)。
ii.生物层干涉测量
本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过生物层干涉测量法测量所述抗体与EGFR的结合而评估。生物层干涉测量法是一种无标记的检测生物分子相互作用的方法，通过测量从两个表面(在生物传感器尖端的固定的生物分子层，及内部参考层)反射的可见光的干涉图而进行。溶液中分子与固定的生物分子的结合增加所述生物分子层的厚度，这样导致波长改变。在结合后，可以将固定的生物分子与缓冲液接触，测量分子的解离。与固定的生物分子的结合可以实时测量，可以确定结合速率常数、解离速率常数、结合亲和性和结合特异性。例如，链霉亲和素可以附着于生物层，生物素化的sEGFR可以结合链霉亲和素生物层。在合适缓冲液中的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以加入所述生物层中并与sEGFR接触。抗-EGFR抗体的浓度可以根据经验选择或者基于本领域技术人员已知的因素选择，如接近预期的解离常数、抗体的溶解性、温度和缓冲液条件。sEGFR与抗-EGFR抗体之间的结合可以通过测量从光学层和生物层中反射的光产生的干涉图中的改变而定量。可以测量结合动力学以计算结合速率常数。为了测量解离速率常数，可以将传感器在合适的缓冲液中温育，及可以测量抗-EGFR抗体与EGFR的解离。抗-EGFR抗体的结合亲和性可以根据动态解离速率常数与动态结合速率常数的比率而计算。测量修饰的抗-EGFR抗体与EGFR之间解离常数的示例性的生物层干涉测定在实施例5中描述。
iii.免疫测定
可用于分析抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的结合的免疫测定例如包括但不限于western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Meso Scale Discovery(MSD、Gaithersburg、Maryland)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、ELISPOT、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定、免疫组织化学或者免疫电子显微镜检测。这种测定在本领域是常规及熟知的(见例如Ausubel et al.，Eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York，以其全部内容并入本文作参考)。其它测定形式包括脂质体免疫测定(LIA)，其使用设计为结合特异性分子(例如抗体)并释放包囊的试剂或标志物的脂质体。然后释放的化合物可以根据标准技术检测(见Monroe et al.，(1986)Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41)。非限制性的示例性的免疫测定在下文简要描述。
a)ELISA
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与EGFR之间的结合可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。ELISA是一种免疫学测定，可用于检测蛋白质/配体相互作用，如抗体/抗原相互作用。典型地，在ELISA中，抗体/抗原相互作用通过测量与抗体/抗原复合物直接或间接连接的酶标志物中发出的信号而检测。
例如，ELISA可包括如下步骤：1)用EGFR或其变体包被固相；2)将所述固相与封闭剂一起保温以封闭所述固相上非特异性结合位点；3)将所述固相与修饰的抗-EGFR抗体一起温育；4)与能结合修饰的抗-EGFR抗体的二级检测剂温育，如标记的二抗，其能检测修饰的抗-EGFR抗体，但不是测定缓冲液中的人血清成分；及5)检测所述二级检测剂。进一步地，在所述方法的任何步骤之间可以包括一或多个洗涤步骤(例如1、2、3、4或更多个洗涤步骤)。
在所述双重形式或双重测定中，可以将EGFR在相同的标准条件下固定。典型地，用于在这两个条件下促进吸附或固定的缓冲液是中性或生理缓冲液。示例性的生理缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、Ringers或Krebs缓冲液。pH和缓冲能力是测定条件的变量，可以由本领域技术人员根据经验确定或者选择。示例性的生理缓冲液是Krebs-Ringer Bicarbonate(KRB)缓冲液(Sigma Aldrich，CatalogNo.K4002)。进一步地，固体支持物上的固定的药剂，典型为同源结合伴侣的吸附或固定是在不含有人血清的缓冲液中实现的，因为人血清在接触步骤或筛选中使用以模拟天然环境条件。
在KRB缓冲液或前体相似生理缓冲液中不同浓度的EGFR可以吸附在固体支持物上。例如，可以吸附大约1-50nM，例如3-30nM，如5-20nM，例如大约3、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或50nM。吸附的EGFR的量是结合剂的函数，可以根据经验确定，如通过使用已知结合靶抗原的对照物确定。吸附可以任何希望的时间长度和温度进行，以使得同源结合蛋白结合固体支持物上的结合位点。例如，吸附通常在4℃-37℃进行，如在4℃、室温(即22℃)或37℃进行。吸附时间通常为30分钟-48小时或更长时间，且可以随着温度而变化。
在将EGFR粘附于支持物之后，可以作为两个独立测定进行所述方法的随后步骤。例如，将支持物单独处理以在两个不同测定条件下进行结合测定，如在低pH及在中性pH条件下。所述条件也可包括20-50％血清(vol/vol)或10-50mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)。在一些实例中，应理解在进行单独的测定中，变化的唯一条件是缓冲液条件。在平行的测定中时间和温度温育条件通常是相同的。
在一些实例中，在加入抗-EGFR抗体之前，典型地，封闭所述固相支持物表面上的非特异性结合位点。因此，典型地，将所述抗-EGFR抗体与EGFR接触的步骤可以在封闭步骤之后进行。固体支持物的封闭可以降低与固体支持物的非特异性结合、降低背景信号、降低与吸附的蛋白质的非特异性结合，及稳定吸附的蛋白质。封闭条件的选择在本领域技术人员能力范围内。在本文提供的方法中可以使用本领域描述的任何封闭条件。
典型地，温育反应可以任何希望的时间长度和温度进行，以使得抗-EGFR抗体与EGFR结合。例如，结合通常在4℃-37℃进行，如在4℃、室温或37℃进行。结合时间通常为30分钟至48小时或更长时间，与温度成函数。例如，接触可以用1mM乳酸pH7.4和25％人血清进行。分别地，所述接触步骤可以用16.5mM乳酸pH6.0和25％人血清进行。在每个接触反应中，接触可以是在室温(即22℃)进行1小时。所述固体支持物可以在用于结合的相同缓冲液中洗涤以除去任何未结合的靶抗原。在一些实例中，ELISA测定够可以在存在不同浓度的修饰的抗-EGFR抗体的条件下进行。通常地，在系列稀释液中检测不同浓度。可以检测全部的上清、稀释的上清或纯化的蛋白质。
结合EGFR的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以使用本领域技术人员已知的任何测定或方法选择或鉴定。典型地，所述反应可以任何希望的时间长度和温度进行，以使得可以检测所述结合分子或蛋白质。例如，检测通常是在4℃-37℃进行，如在4℃、室温或37℃进行。结合时间通常是30分钟至48小时或更长时间，与温度成函数。典型地，所述结合分子或蛋白质的结合是在室温进行30分钟至4小时或大约30分钟至4小时，如1小时至2小时，例如大约1小时。所述固体支持物可以是用于结合的相同缓冲液中洗涤，以除去任何未结合的靶抗原。
在每个测定条件下确定了结合活性后，对比在第一个条件(例如低pH和/或增高的乳酸浓度)下与第二个条件(例如正常pH和/或低乳酸浓度)下的结合活性。例如，可以对比每个孔中的光密度(或者两或多个孔的平均值)(见例如表15和16)。在一些实例中，每个孔中的光密度(或者两或多个孔的平均值)除以修饰的抗-EGFR抗体的浓度以计算特异性活性。在一些实例中，将所述特异性活性标准化以提供每个修饰的抗-EGFR抗体的标准化的特异性活性(NSA)，通过将修饰的抗-EGFR抗体的特异性活性除以参考抗体的特异性活性计算，所述参考抗体例如是抗-EGFR亲代抗体，如西妥昔单抗(见例如表16)。
可以鉴定抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体，其在低pH下比在中性pH下具有更高的活性。在一些实例中，可以鉴定在低pH比在中性pH下具有增加的结合活性的修饰的抗-EGFR抗体。例如，可以鉴定在低pH下NSA高于在中性pH下的NSA的抗-EGFR抗体。在一些实例中，抗-EGFR抗体具有高于1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0或更高的在低pH的NSA/在中性pH的NSA的比率。在一些实例中，鉴定出抗-EGFR抗体在低pH的NSA高于阈值，如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或更高。在一些实例中，鉴定出抗-EGFR抗体在中性pH的NSA低于临界值，如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或更高。在低pH比在中性pH更活性的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可包括符合一或多个这些标准的抗-EGFR抗体。在一些实例中，所述低pH是pH6.0或pH6.5。在一些实例中，所述中性pH是pH7.4。
本文所述的ELISA方法在实施例1中例证。关于ELISA方法的步骤和该方法的成分的进一步描述在下文提供。
可用于本文提供的结合测定中的固体支持物包括能与分子如检测分子或蛋白质的同源结合伴侣如配体、受体或抗原粘附的任何载体。典型地，为了便于高生产量筛选变体检测分子(例如抗体变体如抗-EGFR抗体变体的文库或集合)，将同源结合伴侣粘附于固体支持物上。在本文提供的方法中用作固体支持物的运载体例如包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁性固体支持物，如包括磁铁的固体支持物。所述固体支持物可以是一或多个珠或颗粒、微球体、管或平板的表面、滤膜及本领域已知的其它固体支持物。示例性的固体支持物系统包括但不限于由例如玻璃、硅、金属、尼龙、纤维素、塑料或复合材料构建的平面，包括多孔平板或膜；或者可以是珠的形式，如硅胶珠、可控多孔玻璃珠、磁珠(Dynabead)或者纤维素珠。进一步地，可调整这种方法以在悬浮液中或以柱形式使用。
本领域技术人员已知怎样根据特定测定条件选择合适的固体支持物。例如，镍包被的微板不太适于Hia标签的蛋白质的结合，因为缓冲液pH可影响抗原包被Ni包被的但非高结合的平板。本领域技术人员已知怎样确定固体支持物是否适用于不同的pH条件。
检测分子或同源结合伴侣可以通过本领域技术人员已知的任何方法固定在固体支持物上。可以使用共价或非共价附着方法。典型地，所述检测分子或同源结合伴侣(如配体或抗原)通过从水溶液培养基中吸附而固定。在一些实例中，吸附可以在模拟患病的微环境(如肿瘤或癌症微环境)的条件下、在模拟正常微环境条件下或者在本领域技术人员已知的标准条件下进行。例如，吸附可以使用pH范围6.0-7.4或大约6.0-7.4，在一些实施方案中为pH7.4或大约pH7.4，的缓冲液进行。特别地，为了实现吸附，可以使用高结合微板作为固体支持物。高结合平板为本领域技术人员已知，及可便利地购自各个厂商(见例如NuncMaxisorp flat-bottom plates available from eBioscience，San Diego，CA，Cat.No.44-2404-21；Costar96-well EIA/RIA Stripwell plate，Costar2592)。
也可以使用其它粘附模式，如共价偶联或者将靶蛋白质粘附于固体基质的其它熟知方法。治疗性蛋白质和/或同源结合伴侣的共价附着方法包括化学交联方法。反应物可在所述支持物与所述蛋白质或同源结合伴侣上的官能团之间产生共价键。可以化学反应的官能团的实例是氨基、硫醇和羧基基团。N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺、N-水合琥珀酰亚胺(N-hydrosuccinimide)和戊二醛是示例性的与官能团反应的反应物。在其它实例中，检测分子和/或同源结合伴侣可以间接附着于固体支持物，通过例如但不限于免疫亲和性或配体-受体相互作用的方法(例如生物素-链霉亲和素或者谷胱甘肽S-转移酶-谷胱甘肽)进行。例如，检测分子可以包被在ELISA平板或者气体相似的可寻址阵列。
封闭溶液包括含有人、牛、马或前体血清白蛋白的那些溶液。典型地，所述封闭溶液含有人血清。固体支持物如平板的封闭可以使用其中加入一或多种封闭剂的结合测定缓冲液进行。示例性的封闭剂包含1-5％牛血清白蛋白、1-5％脱脂奶粉和25％人血清。洗涤剂如Tween-20和防腐剂如硫柳汞可以加入所述封闭溶液中。结合测定缓冲液包括即肿瘤微环境缓冲液或者正常生理缓冲液。典型地，将水相蛋白质溶液-固体支持物混合物维持30分钟、1小时或更长时间，可以根据温度变化。封闭反应可以在任何温度进行，通常可以在4℃-37℃进行，如在4℃、室温(即22℃)或37℃进行。在一些实例中，使所述反应或大约4℃-37℃温度进行至少1小时。例如，可以在室温1小时实现封闭。在温育和封闭后，可以将所得固相漂洗除去未结合的蛋白质，之后与检测分子(例如治疗性蛋白质或抗体或其变体)接触。
示例性的酶标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶。可以加入以产生信号的酶底物的实例包括PNPP(p-硝基苯基磷酸二钠盐)、ABTS(2，2’-联氮基二[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)、OPD(邻-苯二胺二盐酸盐)及TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)(SOMA Labs，Romeo，Mich.)，包括Sureblue TMB Microwell PeroxidaseSubstrate1-component(KPL，#52-00-03)。所述反应可以通过加入终止反应物(例如TMB终止溶液)终止。确定在合适波长(即450nm)的吸光度。
对于荧光，大量荧光计是可利用的。对于化学发光物，如辣根过氧化物酶(HRP)，可利用光度计或胶片。以酶检测，可以使用荧光测量、发光测量、光谱光度测量或者目测荧光、化学发光或生色产物。例如，抗-标签反应物可以与辣根过氧化物酶(HRP)或者其它可检测剂缀合。
存在荧光、放射性或其它可检测部分可以帮助检测。典型地，由于抗-EGFR抗体被标签，因此使用抗标签反应物进行检测。抗标签反应物的选择与用于结合分子或蛋白质的标签相关。此外，所述抗标签反应物的选择与测定中使用的环境条件(例如pH)相容。本领域技术人员已知怎样鉴定或选择这种反应物，及检测其与测定条件的相容性。例如，实施例例证了这种方法。
抗-标签反应物可容易地获得，例如得自商业来源或其它来源。可在本发明方法用于检测的示例性的抗标签反应物包括但不限于抗-FLAG抗体或抗-Myc抗体(得自如Abcam，Cambridge，MA；GeneTex，Irvine，CA)。
典型地，在本文的方法中，检测结合的复合物的方法是能定量的方法，由此可以评估活性的水平。例如，标记可以产生信号，如生色信号、化学发光信号、化学荧光信号或者放射性信号。根据标记的性质，可以应用各种技术检测或者检测并定量所述标记。例如，定量方法包括但不限于分光光度测量、荧光和放射性方法。
b)免疫沉淀
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过免疫沉淀检测与EGFR的结合而评估。免疫沉淀方案通常包括将一群细胞在裂解缓冲液如1％NP-40Alternative、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM激活的原钒酸钠、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮抑肽酶或者在RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠pH7.2、1％Trasylol)中裂解。所述裂解缓冲液可补加蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)。另外的步骤可包括在细胞裂解物中加入修饰的抗-EGFR抗体，在40℃温育一段时间(例如1-4小时)，在细胞裂解物中加入蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠，在40℃温育大约1小时或更长时间，将所述珠在裂解缓冲液中洗涤并将其重悬浮于SDS/样品缓冲液中。修饰的抗-EGFR抗体免疫沉淀EGFR的能力可以通过例如western印迹分析评估。本领域技术人员已知可以被修饰以增加抗体与抗原的结合及降低背景(例如用琼脂糖珠预清除细胞裂解物)的参数。关于免疫沉淀的进一步论述可见例如Ausubel et al.，Eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York at10.16.1。
c)Western印迹
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过Western印迹检测与EGFR的结合而评估。Western印迹分析通常包括制备提取物样品(例如从表达EGFR的组织中或者从来自患有可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的疾病或紊乱如本文所述疾病或紊乱的对象或患者的组织中)。另外的步骤包括将该样品在聚丙烯酰胺凝胶(例如根据抗原的分子量使用8％-20％SDS-PAGE)中电泳或者通过2-D凝胶电泳(见例如WO 04/043276)，将来自聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品移至如消化纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜，将所述膜在封闭溶液(例如具有3％BSA或脱脂奶粉的PBS)中封闭，将该膜在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween20)中洗涤，用在封闭缓冲液中稀释的初级抗体(即感兴趣的抗体)探测该膜，在洗涤缓冲液中洗涤该膜，用在封闭缓冲液中稀释的与酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I)缀合的第二种抗体(其识别初级抗体，例如抗-人抗体)探测该膜，将该膜在洗涤缓冲液中洗涤，并检测所述抗原的存在。本领域技术人员已知可以修饰以增加检测信号和降低背景噪音的参数。关于western印迹方案的进一步论述可见例如Ausubel et al.，Eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York at10.8.1。
d)免疫组织化学
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过免疫组织化学检测与EGFR的结合而评估。免疫组织化学通常包括制备组织样品(例如从表达EGFR的组织或者从来自患有可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的疾病或紊乱如本文所述疾病或紊乱的对象或患者的组织中)，固定所述组织以保持蛋白质分子在其天然构象，将所述样品浸入透化反应物(例如Tween，Nonidet P40)中以透化组织。用封闭溶液(例如具有3％BSA或脱脂奶粉的PBS)封闭所述样品，在洗涤缓冲液(例如PBS-Tween20)中洗涤该样品，用在封闭缓冲液中稀释的抗-EGFR抗体(如本文所述修饰的抗-EGFR抗体)探测该样品，将该样品在洗涤缓冲液中洗涤，用在封闭缓冲液中稀释的与荧光染料(例如异硫氰酸荧光，Alexa fluor，若丹明)缀合的第二种抗体(其识别抗-EGFR抗体)探测该样品，将该样品在洗涤缓冲液洗涤，及通过荧光显微镜检测所述抗原的存在与否。本领域技术人员已知可以被修饰以增加检测信号及降低背景噪音的参数。
e)放射免疫测定
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过放射免疫测定检测与EGFR的结合而评估。可以例如通过竞争性结合测定确定修饰的抗-EGFR抗体与抗原如EGFR的结合亲和性及抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，包括将标记的(例如3H或125I标记的)抗原与感兴趣的抗体在存在增加量的未标记的抗原条件下温育，及检测与标记的抗原结合的抗体。本文提供的抗-EGFR抗体与EGFR的亲和性及结合解离速率可以从Scatchard绘图分析数据中确定。与第二种抗体的竞争也可以使用放射免疫测定确定。在这种情况中，将EGFR抗原如EGFR可溶片段与和标记的(例如3H或125I标记的)化合物缀合的本文提供的抗-EGFR抗体在存在增加量的未标记的第二种抗体的条件下温育。
b.溶液结合测定
溶液结合测定可用于测量本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性。在一些实例中，溶液结合测定用于测量抗-EGFR抗体与EGFR或其片段或变体如可溶的EGFR片段的结合。技术人员可选择溶液结合测定以测量本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的结合。下文是关于可以使用的示例性的溶液结合测定的简要描述。然而，这不意味着是限制性的，本领域技术人员已知的任何溶液结合测定均可用于本文提供的方法中，包括平衡透析、竞争性结合测定(例如Myers et al.，(1975)Proc.Nail.Acad.Sci.USA)、放射标记的结合测定(例如Feau et al.，(2009)J.Biomol.Screen.14(1)：43-48)、量热法(包括等温滴定量热法(ITC)和示差扫描量热法(例如Perozzo et al.，(2004)J.Recept Signal.TransductRes.24(1-2)：1-52；Holdgate(2001)Biotechniques31(1)：164-166，168，170)，Celej etal.(2006)Anal.Biochem.350(2)：277-284))，以及分光光度荧光测定，包括荧光共振能量转移测定。本发明的方法中在溶液中确定结合活性的条件可以由本领域技术人员基于本文的描述而确定。例如，可以调整上文论述的条件以适于在固体支持物上进行结合测定。
i.等温滴定量热法(ITC)
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以通过等温滴定量热法(ITC)评估。在ITC中，将一个结合伴侣滴定在含有另一结合伴侣的溶液中，从而产生或吸收热，这通过量热计定量。ITC可用于以纳米摩尔或更低数量检测反应物中的热效应。例如，可以进行等温滴定量热法以测量参与治疗性蛋白质与同源结合伴侣结合的所有热力学参数，包括结合自由能(ΔG)、结合焓(ΔH)和熵(ΔS)，及热容量改变(ΔCp)。这些特征的分析可帮助解释修饰的抗-EGFR抗体与EGFR之间结合的活性和热力学参数(Perozzo et al.，(2004)J.Recept.Signal.Transduct.Res.24(1-2)：1-52)。使用ITC通过检测与EGFR的结合而测量抗-EGFR抗体的活性在本领域技术人员能力范围内(见例如Alvarenga et al.(2012)Anal.Biochem421(1)：138-151)。
ii.分光光度测定法
分光光度测定法可用于测量本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性。抗-EGFR抗体与EGFR的结合可通过本领域技术人员已知的任何分光光度测定法检测，包括UV-vis分光光度测量技术、荧光测定如荧光共振能量转移测定和荧光猝灭测定(Wu etal.(2007)，J.Pharm.Biomed.Anal.44(3)：796-801)。例如，可以检测由于抗-EGFR抗体与EGFR结合所致荧光或UV/vis吸收中的改变，如固有荧光的猝灭。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体和/或EGFR可以用荧光标记或UV/vis标记进行标记。标记抗-EGFR抗体在技术人员能力范围内(见例如Gleysteen et al.(2008)Head&Neck30(6)：782-789；Rosenthal etal.(2007)Mol.Cancer Ther.6：1230-1238)。在测量分光镜信号之后，可以计算观测的结合常数(例如Zhang et al.(2009)Spectrochim ActaA Biomol.Spectrosc.72(3)：621-626)。
2.基于细胞的测定
测量本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体活性的测定包括基于细胞的测定。可以使用的细胞系包括本领域描述的任何细胞系或者可得自贮库如美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细胞系。技术人员可以选择具有希望的性质的细胞系。通常地，使用已知表达EGFR的细胞系进行测定。这种细胞为本领域技术人员已知。例如，可以参照ATCC目录(atcc.org)鉴定细胞系。如果希望特定细胞类型，或者这种细胞和/或其立即可获来源的方式也为本领域已知。科学文献分析可容易地揭示适当地选择表达EGFR的细胞。可用于基于细胞的测定中以筛选本文提供的抗-EGFR抗体的表达EFGR的细胞系包括DiFi人结肠直肠癌细胞、A431细胞(ATCC CRL-1555)、Caco-2结肠直肠腺癌细胞(ATCC HTB-37)、HRT-18结肠直肠腺癌细胞(ATCC CCL-244)、HT-29结肠直肠腺癌细胞(ATCC HTB-38)、人新生角化细胞和MCF10A上皮细胞(ATCC CRL-10317)(见例如Olive et al.(1993)In Vitro Cell DevBiol.29A(3Pt1)：239-248；Wu et al.(1995)J.Clin.Invest.95(4)：1897-1905)。可用于本文描述的基于细胞的测定中的细胞例如包括本文所述或本领域已知的任何细胞，包括本文所述肿瘤或癌细胞。
在一些实例中，测量本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性的测定是使用来自与抗-EGFR抗体副作用如本文描述的或本领域已知的任何副作用相关的组织的细胞系进行。例如，测定可以使用皮肤细胞系进行。EGFR在一些细胞类型中表达，包括角化细胞如基底角化细胞和毛囊的外毛根鞘；以及外分泌腺和皮脂腺的细胞(Albanell et al.(2002)J.Clin.Oncol.20(1)：110-124；Lacouture，and Melosky(2007)Skin TherapyLett.12，1-5；Nanney et al.(1990)J.Invest.Dermatol94(6)：742-748)。在一些实例中，测量本文提供的抗-EGFR抗体的活性的基于细胞的测定使用如下细胞进行：角化细胞，如人新生儿角化细胞；来自毛囊的外毛根鞘的细胞；及外分泌腺和皮脂腺的细胞。可用于测量本文提供的抗-EGFR抗体的活性的基于细胞的测定中的其它细胞包括例如黑素细胞，如新生儿黑素细胞、Langerhans细胞、成纤维细胞、Merkel’s细胞、神经细胞、腺细胞、皮脂腺的细胞(皮脂腺细胞)、及成纤维细胞例如皮肤成纤维细胞和伤口成纤维细胞。培养这种细胞的方法在本领域技术人员的能力范围内(见例如Limat and Hunziker(1996)Methods MolMed.2：21-31；Abdel-Naser et al.(2005)Egypt.Dermatol.Online J.1(2)：1)。
表达EGFR的细胞系可以通过瞬时或稳定转染而产生。此外，可以评估任何初始细胞或细胞系的表达EGFR情况，例如使用荧光标记的抗-EGFR抗体和荧光激活的细胞淘选(FACS)进行。示例性的细胞系包括A549(肺)、HeLa、Jurkat、BJAB、Colo205、H1299、MCF7、MDA-MB-231、PC3、HUMEC、HUVEC和PrEC。
在一些实例中，将纯化或未纯化的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体外源加入细胞中。在一些实例中，可以将编码修饰的抗-EGFR抗体的一或多个核酸导入适于在细胞如本文所述细胞中表达的载体中。细胞可以用所述载体转染，及抗-EGFR抗体治疗蛋白由所述细胞表达。所述抗-EGFR抗体可以作为分泌的可溶的分子或细胞内抗体表达。转染方法为本领域技术人员已知(见例如Kaufman R.J.(1990)Methods in Enzymology185：537-566；Kaufman et al.(1990)Methods in Enzymology185：537-566；Hahn and Scanlan(2010)Top.Curr.Chem.296：1-13)，包括例如化学方法如聚阳离子环式糊精载体(例如Cryan etal，(2004)Eur JP harm Sci.21(5)：625-33)和脂质体复合物，包括阳离子脂质体(例如Gaoand Huang(1995)Gene Ther.2(10)：710-722)。可以使用的示例性的阳离子脂质体包括在美国专利No.7,989,606中描述的那些脂质体，包括3-β-[N-(N′，N′-二甲基-乙胺)-1-氨基甲酰]-胆固醇(DC-Chol)、1，2-二(油酰氧-3-三甲基胺基-丙烷(DOTAP)(见例如International Pat.Publ No.WO 98/07408)、赖氨酰磷脂酰乙醇胺(L-PE)、脂多胺如脂精胺、N-(2-羟乙基)-N，N-d-二甲基-2，3-双(十二烷基氧)1-丙基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、N(1，2，3-二油酰氧)丙基-N，N，N-三乙胺(DOTMA)、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、Lipofectin和Lipofectamine(Thiery，et al.Gene Ther.(1997)；Felgner，et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.(1995)；Eastman，et al.，Hum.Gene Ther.(1997))。转染方法还包括非化学方法，如电穿孔方法(Chu et al.(1987)，Nucl.Acid.Res.15(3)1311-1326)、声孔效应(例如Kumon，et al(2009)，Ultrasound Med Biol.35(3)：494-506)、基因枪(例如O’Brien and Lummis(2004)Methods33(2)：121-125)及病毒转导(例如Flotte and Carter(1995)Gene Ther.2(6)：357-362)。
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性可以例如使用可检测与细胞表面结合的任何测定评估。活性也可以通过评估抗-EGFR抗体功能活性而评估。在一些实例中，所述测定基于抗-EGFR抗体结合EGFR及介导一些事物化学事件例如效应子功能如细胞裂解、吞噬作用、配体/受体结合抑制、生长和/或增殖抑制及凋亡的能力。
这种测定通常包括监测细胞对修饰的抗-EGFR抗体的应答，例如细胞存活、细胞死亡、细胞吞噬作用、细胞裂解、细胞形态学改变或者转录活性如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，细胞增殖测定、细胞死亡测定、流式细胞计量术、细胞分离技术、荧光激活的细胞淘选(FACS)、位相差显微镜检查、荧光显微镜检查、受体结合测定、细胞信号测定、免疫细胞化学、报道基因测定、细胞形态学(例如细胞体积、核体积、细胞直径及核直径)、配体结合、底物结合、核酸酶活性、细胞凋亡、趋化作用或细胞迁移、细胞表面标志物表达、细胞增殖、GFP阳性和染料稀释测定(例如用结合细胞膜的染料的细胞追踪测定)、DNA合成测定(例如3H-胸苷和荧光DNA-结合染料如BrdU或Hoechst染料FACS分析)及核焦点测定，这些均是测量本文提供的修饰的抗-EGFR抗体活性的合适的测定。可以测量的其它功能活性包括但不限于配体结合、底物结合、核酸内切酶和/或核酸外切酶活性、已知和未鉴定的遗传标志物的转录改变(例如northern印迹)、细胞代谢中的改变、关于细胞增殖的改变、细胞表面标志物表达、DNA合成、标志物和染料稀释测定(例如GFP和细胞追踪测定)、接触抑制、裸鼠中肿瘤生长等等。
例如，可以评估本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的调节已知表达EGFR的细胞的一或多个表型的作用。表型测定、其使用的试剂盒和反应物为本领域技术人员熟知，并在本文用于测量修饰的抗-EGFR抗体的活性。可以购自任一商家的代表性的表型测定包括确定细胞存活力、细胞毒性、增殖或细胞存活(Molecular Probes，Eugene，Oregon；PerkinElmer，Boston，Mass.)，基于蛋白质的测定，包括酶促测定(Panvera，LLC，Madison，Wis.；BD Biosciences，Franklin Lakes，N.J.；Oncogene Research Products，San Diego，Calif.)、细胞调节、信号转导、炎症、氧化过程和细胞凋亡(Assay DesignsInc.，Ann Arbor，Mich.)、甘油三酯积聚(Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo.)、血管发生测定、管形成测定、细胞因子和激素测定及代谢物测定(Chemicon International Inc.，Temecula，Calif.；Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.)。
确定适于特定表型测定的细胞(即本文描述的或本领域已知的表达EGFR的任何细胞)可以用抗-EGFR抗体以及对照抗体处理。在一些实例中，包括EGF或其片段以便实现受体的激活。在处理结束时，可以通过本文所述或本领域已知的一或多种方法分析处理和未处理的细胞。在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体的活性可以通过测量细胞形态学中的改变、测量EGFR磷酸化或者细胞增殖而评估。
可以进行所述测定以评估抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体对EGFR和/或表达EGFR的细胞的作用。在一些实例中，EGFR的活性可以在存在EGF或另一刺激剂条件下在存在或不存在本文提供的抗-EGFR抗体条件下刺激，以确定所述抗体是否调节(例如抑制)EGF或另一刺激剂的作用。例如，所述抗-EGFR抗体可阻断EGF与EGFR相互作用的能力。因此，本发明的筛选方法可允许鉴定拮抗性抗-EGFR抗体。
例如，EGFR磷酸化测定可用于测量本文提供的抗-EGFR抗体抑制EGFR磷酸化的能力。EGF与EGFR的胞外结构域的结合诱导受体二聚化及酪氨酸磷酸化，可导致不受控的增殖(Seshacharyulu et al.(2012)Expert.Opin.Ther.Targets.16(1)：15-31)。本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可抑制EGF与EGFR的结合并降低EGFR磷酸化(见例如美国专利No.8,071,093)。因此，本文提供的抗-EGFR抗体的活性可以通过检测磷酸化的EGFR评估。在一些实例中，磷酸化的EGFR可以使用本领域已知或本文描述的方法通过ELISA在细胞裂解物中检测(见例如实施例6和图3)。修饰的抗-EGFR抗体对抑制作用的剂量依赖性可以通过磷酸化EGFR的浓度与修饰的抗-EGFR抗体的浓度绘图确定。EGFR的酪氨酸磷酸化形式可以使用EGFR Phospho ELISA试剂盒检测，例如得自Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、RAYBIO(Norcross，Ga)或者Thermo Scientific(Rockford，IL)。
生长测定可用于测量所述修饰的抗-EGFR抗体的活性。该测定可测量抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体对表达EGFR的细胞的生长抑制。可将细胞温育足够时间以使得细胞生长(例如12小时或者1、2、3、4、5、6、7天或更长时间)。细胞生长可以通过本领域已知的任何方法测量，包括3H-胸苷掺入测定、5-溴-2-脱氧鸟苷(BrdU)ELISA、四唑微板测定及酸性磷酸酶测定(例如Maghni et al.(1999)J.Immunol.Method.223(2)：185-194)。细胞生长也可以使用试剂盒测量，所述试剂盒得自Invitrogen(Cyquant NF细胞增殖测定试剂盒)、Cambrex(ViaLight HS(高灵敏性)BioAssay)、Promega(CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay，Guava Technologies(CellGrowth assay)、Stratagene(Quantos细胞增殖测定)(例如Assays for Cell Proliferation Studies，GeneticEng.Biotechnol.News.26(6))。在一些实例中，细胞生长可以根据无抗体的细胞生长标准化。在示例性的生长测定中，细胞可以加入96孔平板的孔中，其中含有包含待测定的抗-EGFR抗体的正常生长培养基。示例性的细胞生长测定在实施例7中描述。
3.动物模型
也可以使用动物模型进行体内研究，以评估本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的治疗活性。可以给患有考虑使用本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗的疾病和病症的动物模型施用抗-EGFR抗体。这种动物模型为本领域已知，包括但不限于异种癌症模型，其中人癌症植入体或传代的异种移植物组织被导入免疫损害的动物如裸鼠或SCID小鼠中(见例如Klein.et al.(1997)Nature Medicine3：402-408)。可以使用测量肿瘤形成、肿瘤衰退或转移的抑制的测定预测效力。动物模型也可用于评估本文提供的抗-EGFR抗体的副作用。
各种肿瘤细胞系或肿瘤动物模型为本领域技术人员已知并在本文描述。例如，可以将所述抗-EGFR抗体施用于携带肿瘤的动物，监测体重和肿瘤体积。在进一步的实例中，为了评估不良的副作用，可以将所述抗-EGFR抗体施用于正常动物，监测体重。所述抗-EGFR抗体的活性可以通过监测表示可通过施用抗-EGFR抗体治疗的疾病或病症的治疗的参数而评估。例如，表示抗肿瘤发生的参数是肿瘤大小的缩减和/或肿瘤进展的延缓。因此，例如可以评估抗-EGFR抗体以鉴定降低肿瘤生长或大小的那些抗体。肿瘤大小可以在用抗-EGFR抗体治疗的携带肿瘤的人或动物模型中在体内评估。肿瘤缩减或肿瘤大小可以通过本领域已知的各种已知测定评估，如通过体重、体积或身体测量。
可以产生携带肿瘤的动物模型。体内肿瘤可以通过任何已知方法产生，包括通过在免疫缺陷的啮齿类动物中接种或植入肿瘤细胞(例如通过皮下注射)产生的异种移植肿瘤，通过将小鼠或大鼠肿瘤细胞系接种(例如通过皮下注射)进如对应的免疫感受态小鼠或大鼠品系中而产生的同基因肿瘤模型，通过植入在动物模型中的原发肿瘤的转移产生的转移瘤，通过将肿瘤细胞植入相同物种作为肿瘤细胞来源而产生的同种异基因肿瘤，以及通过对细胞遗传操纵产生的自发肿瘤。所述肿瘤模型可以通过将肿瘤细胞注射进其来源的组织或器官中而原位产生，例如将乳腺肿瘤细胞植入小鼠乳腺脂肪垫中。在一些实例中，使用异种移植模型或者同基因模型。例如，肿瘤可以通过在免疫感受态宿主(同基因的)或者免疫缺陷的宿主(例如裸鼠或SCID小鼠；异种移植)的右侧腋窝皮下注射肿瘤细胞悬浮液(例如1×106至5×106个细胞/动物)而建立。所述动物模型包括在本文描述的或本领域已知的任何生物体中的模型，例如哺乳动物包括猴和小鼠模型。
所述肿瘤可以是同基因的、同种异基因的或者异基因的。所述肿瘤可表达内源或外源EGFR。外源EGFR表达可以使用本领域已知或本文描述的重组表达方法实现，通过用合适的核酸转染或转导细胞进行。示例性的细胞系包括EGFR转染的NIH3T3、MCF7(人乳腺)、人表皮样鳞状细胞癌A431、口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞系BcaCD885、COLO356/FG胰腺癌细胞系及LS174T结肠直肠肿瘤(见例如Santon et al.，(1986)Cancer Res.46：4701-05和Ozawaet al.，(1987)Int.J.Cancer40：706-10；U.S.Pat.Pub.No.20110111059；Reusch et al.(2006)Clin.CancerRes.12(1)：183-190；及Yang et al.(2011)Int.J.Nanomedicine6：1739-1745)。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以在各种原位肿瘤模型中检测。这些动物模型由技术人员用于研究进展的癌症如胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌的病理生理学和治疗。免疫剥夺的小鼠包括但不限于无胸腺裸鼠或SCID小鼠可用于从注射供体患者的人肿瘤细胞或片段的器官内部位(例如胰腺、前列腺或乳腺)播散的局部和全身性肿瘤的评分。
在一些实例中，抗-EGFR靶向蛋白的检测可包括研究在灵长类动物(例如食蟹猴模型)中的效力，以便于评估携带EGFR抗原的特定靶细胞的耗竭。其它灵长类动物模型包括但不限于恒河猴。
例如，肿瘤的接受体可以是任何合适的小鼠品系。所述接受体可以是一或多个免疫相关功能的免疫感受态或者免疫损害的，包括但不限于nu/nu、SCID和浅褐色鼠。其中可以植入肿瘤细胞的动物例如包括BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、重度组合的免疫缺陷的/浅褐色鼠(SCID-Beige)(见例如U.S.Pat.Pub.No.20110111059；Reusch et al.(2006)Clin.Cancer Res.12(1)：183-190；Yang et al.(2011)Int.J.Nanomedicine6：1739-1745)。其它实例包括裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括knockins和knockouts)。例如，本文提供的抗-EGFR抗体可以在小鼠癌症模型如异种移植小鼠中检测。在这种方法中，肿瘤或肿瘤细胞系移植或注射进小鼠中，随后将小鼠用抗-EGFR抗体处理以确定所述抗-EGFR抗体降低或抑制癌症生长和转移的能力。本发明还涵盖使用SCID小鼠模型，其中用人周围血淋巴细胞(PBLs)注射免疫缺陷的小鼠。
示例性的小鼠如裸鼠或SCID小鼠中人肿瘤异种移植模型包括但不限于人肺癌(A549细胞，ATCC No.CCL-185)、人乳腺肿瘤(GI-101A细胞，Rathinavelu et al.，(1999)Cancer Biochem.Biophys.，17：133-146)、人卵巢癌(OVCAR-3细胞，ATCC No.HTB-161)、人胰腺癌(PANC-1细胞，ATCC No.CRL-1469和MIA PaCa-2细胞，ATCC No.CRL-1420)、DU145细胞(人前列腺癌细胞，ATCC No.HTB-81)、人前列腺癌(PC-3细胞，ATCC#CRL-1435)、结肠癌(HT-29细胞)、人黑素瘤(888-MEL细胞，1858-MEL细胞或1936-MEL细胞，见例如Wang etal.，(2006)J.Invest.Dermatol.126：1372-1377)，及人纤维肉瘤(HT-1080细胞，ATCCNo.CCL-121)以及人间皮瘤(MSTO-211H细胞)。示例性的小鼠中大鼠肿瘤异种移植模型包括但不限于神经胶质瘤(C6细胞，ATCC No.CCL-107)。示例性的小鼠肿瘤同种移植物模型包括但不限于小鼠黑素瘤(B16-F10细胞，ATCC No.CRL-6475)。示例性的小鼠中猫肿瘤异种移植模型包括但不限于猫纤维肉瘤(FC77.T细胞，ATCC No.CRL-6105)。示例性的小鼠中狗肿瘤异种移植模型包括但不限于狗骨肉瘤(D17细胞，ATCC No.CCL-183)。人异种移植模型和同基因肿瘤模型的非限制性实例在下表13和14中示出。
施用抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的途径可以是本文所述或本领域已知的任何施用途径，如腹膜内、肿瘤内或静脉内。所述抗-EGFR抗体可以本文所述或本领域已知的各种剂量施用。例如，所述修饰的抗-EGFR抗体可以施用携带肿瘤的模型，剂量为大约0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg或更高，或在此之间。在一些实例中，示例性的剂量包括但不限于0.01mg/m2或大约0.01mg/m2-800mg/m2或大约800mg/m2，例如，0.01mg/m2、0.1mg/m2、0.5mg/m2、1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、35mg/m2、40mg/m2、45mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2及700mg/m2，或大约为上述值。应理解本领域技术人员可以在mg/kg与mg/m2单位之间识别及转变剂量(见例如Michael J.Derelanko，TOXICOLOGIST’S POCKET HANDBOOK，CRC Press，p.16(2000))。
肿瘤大小和体积可以基于本领域技术人员已知的技术监测。例如，肿瘤大小和体积可以通过X线照相、超声成像、尸检、使用测径器、通过microCT或通过18F-FDG-PET监测。肿瘤大小也可以目测。在特别的实例中，肿瘤大小(直径)是使用测径器直接测量。在其它实例中，肿瘤体积可以使用通过测径器或超声评估获得的平均肿瘤直径(D)测量值测量。体积可以通过公式V＝D3×π/6(使用测径器测量的直径)、V＝[长度×(宽度)2]/2确定，其中长度是最长直径，宽度是与长度垂直的最短直径，或者V＝D2×d×π/6(使用超声测量的直径，其中d是深度或厚度)。例如，检测器测量可以由肿瘤长度(l)和宽度(w)组成，肿瘤体积以长度×宽度2×0.52计算。在另一实例中，可使用microCT扫描测量肿瘤体积(见例如Huang et al.(2009)PNAS，106：3426-3430)。在这种实例中，可以为小鼠注射Optiray Pharmacy碘佛醇注射用74％造影剂(例如741mg的碘佛醇/mL)，麻醉小鼠，使用MicroCat1A扫描仪或其它相似扫描仪(例如IMTek)(40kV，600μA，196旋转步长，总角度或旋转＝196)进行CT扫描。图像可以使用软件重建(例如RVA3软件程序；ImTek)。肿瘤体积可以通过使用可用软件(例如Amira3.1软件；Mercury Computer Systems)确定。在一些实例中，在第0天皮下注射肿瘤，原发肿瘤的体积可以在指定时间点测量。
一旦植入的肿瘤达到预定大小或体积，可以施用修饰的抗-EGFR抗体。进展的肿瘤可以目测，肿瘤大小和肿瘤体积可以使用本领域技术人员已知的任何技术测量。例如，肿瘤体积或肿瘤大小可以使用本文描述的任何技术测量。在施用本文提供的修饰的抗-EGFR抗体之后，可以在一段时间内以周期性间隔评估或测量肿瘤体积和大小，例如在感染后每小时、每6小时、每12小时、每24小时、每36小时、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每3周、每个月或者更长时间。可以产生肿瘤体积随着时间的平均变化图表。这在实施例8中例证。可以计算在曲线下的总面积(AUC)。治疗指数也可以使用公式AUC未处理的动物-AUC处理的动物/AUC未处理的×100计算。
通常地，以相同方式、在相同时间及使用相同类型肿瘤细胞产生携带肿瘤的动物用作对照。这种对照的携带肿瘤的动物包括保持未处理(未施用修饰的抗-EGFR抗体)的那些动物。其它对照动物包括施用本领域已知的抗-EGFR抗体的那些动物。示例性的这种抗-EGFR抗体是西妥昔单抗。在其中携带肿瘤的动物施用已知的抗-EGFR抗体作为对照的实例中，施用的对照抗体的量可以与修饰的抗-EGFR抗体的量相同。
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的活性的评估可包括鉴定与对照处理或未处理的携带肿瘤的动物相比介导降低肿瘤大小(例如直径)、体积或重量的抗体。应理解与对照处理的或未处理的携带肿瘤的动物相比肿瘤大小、体积或重量降低是指所述抗-EGFR抗体自身介导肿瘤衰退或缩减，或者与对照处理的或未处理的携带肿瘤的动物相比所述抗-EGFR抗体介导延缓的肿瘤进展。在肿瘤进展中的肿瘤缩减或延缓是表示抗肿瘤发生的参数。
例如，可以选择与对照处理的或未处理的携带肿瘤的动物相比，基于目测动物中肿瘤大小的介导肿瘤大小或体积降低的抗-EGFR抗体。在其它实例中，选择与未处理的携带肿瘤的动物相比或者与用参考抗-EGFR抗体处理的携带肿瘤的动物相比，通过本领域已知的任何测量方法(例如使用测径器)评估肿瘤直径降低的介导肿瘤大小或体积降低的抗-EGFR抗体。应理解可以在感染后任何预定时间点进行肿瘤大小或体积对比，并可以由本领域技术人员根据经验确定。在一些实例中，可以在处死未处理对照动物当天进行对比。在其它实例中，可以分析总AUC，对比AUC值作为随着时间的肿瘤大小和体积的指征。
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体对肿瘤大小或体积的作用可以用对照处理的动物与抗-EGFR抗体-处理的动物相比在施用后指定时间的肿瘤大小或肿瘤体积的比率表示(对照处理的动物的肿瘤大小或体积/修饰的抗-EGFR抗体-处理的动物的肿瘤大小或体积)。评估可包括鉴定导致动物中呈现高于1.0的肿瘤缩减比率、例如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更高的抗-EGFR抗体。在特别的实例中，所述结果以在处理期间的总AUC面积的比率表示(对照处理的动物的肿瘤大小或体积的AUC/修饰的抗-EGFR抗体处理的动物的肿瘤大小或体积的AUC)。可以选择导致对象中通过AUC测量的肿瘤缩减比率高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更高的抗-EGFR抗体。应理解比率为1.2或5是指所述修饰的抗-EGFR抗体与参考或对照抗体相比导致降低的肿瘤大小或体积，及导致120％或500％的抗-肿瘤发生活性。
在特别的实例中，治疗指数根据测量抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体对肿瘤大小或体积的作用而确定。抗-EGFR抗体的治疗指数与对照的抗-EGFR抗体的治疗指数相比为至少或为至少大约或为120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或更高。
在其它实例中，可以从所述动物中收获肿瘤并称重。施用抗-EGFR抗体与从对照的携带肿瘤的动物中收获的肿瘤相比可导致肿瘤重量降低。该重量也可以与在施用后相同时间从对照处理的动物中收获的肿瘤相对比。重量的变化可以肿瘤重量比率表示(对照处理的动物的肿瘤重量/抗-EGFR处理的动物的肿瘤重量)。抗-EGFR抗体可导致对象呈现出高于1.0的肿瘤重量比率，例如高于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更高。应理解肿瘤重量比率为1.2或5是指所述抗-EGFR抗体与参考或对照抗体相比导致肿瘤重量降低及导致120％或500％的抗-肿瘤发生活性。
在特别的实例中，可以评估所述抗-EGFR抗体对动物其它器官或组织中的作用。例如，可以从所述动物中收获其它器官，进行称重和/或检查。
a.评估副作用
评估安全性和耐受性的研究为本领域已知并可用于本发明中。在施用抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体之后，可以监测任何不良反应的发生，如本文所述或本领域已知的任何不良反应。可以进行动物研究以评估不良的副作用，如在标准药理学分析中不能评估的或者仅在重复施用所述修饰的抗-EGFR抗体之后发生的副作用。在一些实例中，可以在两个物种如啮齿类动物和非啮齿类动物中进行测定，以保证不忽视任何未预期的副作用。通常地，这些模型可以测量各种毒性，包括基因毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖/发育毒性、致癌性。
可以测量的以评估副作用的其它参数包括标准测量采食量、体重、抗体形成、临床化学及宏观和微观检验标准器官/组织(例如心脏毒性)。其它测量参数包括注射部位创伤及任何中和性抗体的度量。可以评估所述抗-EGFR抗体与正常组织的交叉反应性、免疫原性/抗体产生及缀合物或接头毒性。这种研究可以个性化以处理特定关系及遵从ICH S6指导(见例如“Preclinical Safety Evaluation Of Biotechnology-DerivedPharmaceuticals，”International Conference on Harmonisation Of TechnicalRequirements For Registration of Pharmaceuticals For Human Use，1997年7月(2011年6月附录))。正如此，一般的原理包括产物是充分鉴定的及已经除去杂质/污染物，检测材料在整个进展中是可比的，及GLP顺从性。
可以评估本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体以鉴定导致对象呈现出降低和/或很少的副作用如不良副作用的那些抗体。例如，可以检测所述抗-EGFR抗体的表示其副作用的参数。修饰的抗-EGFR抗体的降低的副作用可包括本文所述或本领域已知的抗-EGFR抗体的任何副作用。副作用可以在健康动物模型或者在患病动物模型，如本文所述动物模型中评估。
在一些实例中，评估所述对象表示抗-EGFR抗体副作用如本文所述或本领域已知的副作用的性质，所述副作用包括皮肤毒性及低镁血症。例如，西妥昔单抗的副作用包括本文所述和/或本领域技术人员已知的任何副作用，包括有症状的低镁血症、甲沟炎、发热、皮肤毒性、面部和躯干上部的丘疹脓疱性皮疹、毛发生长异常、脱发、面部毛发和睫毛过度生长、皮肤干痒，及触痛性甲周炎(Eng(2009)Nat.Rev.6：207-218；Schrag etal.J.Natl.Cancer Inst.97(16)：1221-1224；Lacouture，and Melosky(2007)SkinTherapy Lett.12：1-5)。在一些实例中，西妥昔单抗的副作用包括皮肤病学毒性，包括丘疹脓疱性出疹、皮肤干、、瘙痒、视力和指甲改变、痤疮样皮肤反应、痤疮样囊性皮疹、痤疮样皮疹、斑丘疹皮疹、单形性脓疱皮损、丘疹脓疱性反应(Lacouture，and Melosky(2007)SkinTherapy Lett.12，1-5)。与施用抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相关的其它皮肤病学毒性包括瘙痒、红斑及甲沟炎(Lacouture，and Melosky(2007)Skin Therapy Lett.12，1-5)。
本领域技术人员已知怎样鉴定和分类这种副作用。在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体副作用通过在动物中评估皮肤毒性而评估。例如，如本文别处所述，低镁血症可以通过测量血清镁的水平而诊断和/或评估。丘疹脓疱性皮疹和痤疮样皮疹可以在动物模型如小鼠模型和食蟹猴模型中鉴定，通过观测包括丘疹(小的突起的丘疹)和脓疱(小的脓性水疱)的皮疹发生而鉴定。皮肤干燥可以通过薄和无光泽的皮肤、毛孔细小及纸样薄的皮肤质地而鉴定。皮肤色素沉着可以通过由于黑色素过度沉积所致皮肤变暗而鉴定。皮肤瘙痒可以通过观测动物抓痒刮痕而评估。甲沟炎可以通过检查评估。例如，皮肤毒性的存在可以在其中将人皮肤移植在小鼠上的小鼠模型中评估(见例如Nanney et al.(1996)J.Invest.Dermatol.106(6)：1169-1174)。此外，皮肤病学副作用可以在其它动物模型中评估。例如，可以在食蟹猴中评估施用西妥昔单抗后在注射部位的炎症及外皮的脱落情况。在鼻道、食管和舌的上皮粘膜中可观测到相似作用，及在肾小管上皮中的退行性改变。可以评估的其它上皮毒性包括结膜炎、眼睛红肿及肠道菌群紊乱迹象(见例如Lutterbuese etal.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.107(28)：12605-12610；European Medicines Agency(2009)Summary of product characteristics(爱必妥))。
可以在动物模型中评估的其它不良反应包括皮疹、注射部位反应如水肿或肿胀、头痛、发热、乏力、寒战、面红、头晕、荨麻疹、哮喘或胸闷、恶心、呕吐、身体僵直、背痛、胸痛、肌肉痉挛、癫痫或抽搐、血压改变及过敏或严重超敏性反应。在一些实例中，表示修饰的抗-EGFR抗体的副作用的性质包括如下一或多种性质，如对象的存活力、体重减轻、存在如发热、皮疹或其它过敏反应、乏力或腹痛、抗体在对象中诱导免疫应答、抗体的组织破坏力。典型地，在安全性和耐受性研究中可以施用一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或降低浓度的抗-EGFR抗体的作用。
在施用本文提供的抗-EGFR抗体之后在患者或对象中发生的不良反应的类型和严重性可以评估并与在施用本领域已知或本文所述另一抗-EGFR抗体如抗-EGFR抗体之后在患者或对象中发生的不良反应相对比。可以评估在施用本文提供的抗-EGFR抗体及另一种抗-EGFR抗体之后发生的不良反应之间的差异。
因此，本文所述任何参数均可以评估以作为抗-EGFR抗体的毒性/安全性的指示。可以选择导致在对象中呈现出最小毒性的抗-EGFR抗体。在评估副作用的动物模型中，本文提供的抗-EGFR抗体的施用剂量和方法可包括本文描述的任何施用剂量和方法。对照对象可包括未施用抗-EGFR抗体或者施用参考抗-EGFR抗体如西妥昔单抗或其变体的那些对象。
5.药动学和药效学测定
可以使用本文所述或本领域已知的方法进行本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的药动学(PK)和药效学(PD)测定(见例如Klutchko，et al.，(1998)J.Med.Chem.41：3276-3292)。示例性的测量参数通常包括在施用后的最大(峰值)血浆浓度(Cmax)、峰值时间(即当出现最大血浆浓度时，Tmax)、最小血浆浓度(即在两次给药之间最小的血浆浓度，Cmin)、清除半衰期(T1/2)及曲线下面积(即通过时间对应血浆浓度绘图产生的曲线下的面积，AUC)。施用的修饰的抗-EGFR抗体的绝对生物利用度可以通过对比在皮下施用后的曲线下面积(AUCsc)与在静脉内施用后的AUC(AUCiv)而确定。绝对生物利用度(F)可以使用公式F＝([AUC]sc×剂量sc)/([AUC]iv×剂量iv)计算。在施用后血浆中抗-EGFR抗体的浓度可以使用本领域已知的适于评估血液样品中抗体浓度的任何方法测量。示例性的方法包括但不限于ELISA和浊度测定法。另外的测量参数可包括在静脉内施用后获得的浓度-时间数据和生物利用度的分部分析。也可以在动物模型中进行生物分布、放射剂量测定(对于放射标记的抗体或Fc融合体)及PK研究，所述动物模型包括本文所述或本领域已知的动物模型，包括啮齿类动物模型。这种研究可在一些或所有施用的剂量评估耐受性，对局部组织的毒性，优选定位于啮齿类动物异种移植模型和靶细胞(例如CD20阳性细胞)的耗竭。药效学研究包括但不限于靶向特异性肿瘤细胞或封闭发信号机制，测量表达EGFR的细胞的耗竭或信号。
PK和PD测定可以在本文所述或本领域已知的任何动物模型中进行，包括健康动物模型、患病动物模型和人。筛选修饰的抗-EGFR抗体的PD和/或PK性质可用于定义PD、PK的最佳平衡，及修饰的抗-EGFR抗体赋予的治疗效力。例如，本领域已知Fc受体的阵列在各种免疫细胞类型以及不同组织中不同表达。Fc受体的不同的组织分布可影响本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的药动学(PD)和药效学(PK)性质。
在药动学研究中可以施用一系列剂量和不同的给药频率，以评估增加或降低浓度的修饰的抗-EGFR抗体的作用。施用的修饰的抗-EGFR抗体的药动学性质如生物利用度可以用或不用共施用本文所述治疗剂或方案而评估。例如，可以给狗如贝高犬施用单独的修饰的抗-EGFR抗体或者与本文所述一或多种治疗剂或方案一起施用。所述修饰的抗-EGFR抗体可以在施用治疗剂或方案之前、期间或之后施用。可以在不同时间点取血样，通过如浊度测定法确定血浆中修饰的抗-EGFR抗体的量。然后可以测量AUC，可以确定与或不与另外的治疗剂或方案共施用的修饰的抗-EGFR抗体的生物利用度。可以进行这种研究以评估施用的抗-EGFR抗体的共施用对于药动学性质如生物利用度的作用。
可以跨越大约6000倍的剂量范围(大约0.05-300mg/kg)单次或重复施用所述修饰的抗-EGFR抗体，以使用血浆浓度和清除率，以及测量在稳定状态的分布体积和全身性吸收水平评估半衰期。
E.鉴定、产生和生产抗-EGFR抗体的方法
1.鉴定条件治疗性蛋白质
具有条件活性的治疗性蛋白质，例如抗体，如本文提供的修饰的抗-EGFR抗体，在疾病微环境中比在无病微环境(如健康或正常环境)中活性更高，所述抗体可以通过允许定量和评估在不同环境中存在的条件下的活性的任何测定鉴定。这种测定在上文章节D中描述。可以对比活性，及可以鉴定在患病微环境中(或在患病环境中存在的条件下)与在正常环境中(或在无病或正常环境中存在的条件下)相比更具活性的那些治疗性蛋白质。结果是治疗性蛋白质被鉴定，其活性条件性靶向患病微环境，由此不希望的全身作用如副作用或不希望的活性被降低或最小化。
如在章节D中详细描述，测定可以在体内或体外进行。例如，鉴定具有条件活性分子的测定可以在体外进行，通过操纵缓冲液的一或多个条件以含有或模拟患病微环境中存在的与无病或健康或正常环境中存在的那些条件不同的一或多个条件。对于肿瘤环境，这些条件包括低或酸性pH如pH 5.8-6.8(例如pH 6.0-6.5)和/或增高的乳酸盐浓度(例如10mM-16mM)。相反，非肿瘤微环境中的条件包括中性pH(例如pH 7.0-7.4)和/或乳酸盐浓度为1mM-5mM。示例性的这种鉴定具有条件活性的治疗性蛋白质的测定在U.S.ApplicationSerial No.13/200,666和International Application No.PCT/US 11/50891中描述。模拟或模仿生理学条件包括20-50％血清(vol/vol)或10-50mg/mL蛋白质(例如血清白蛋白)。这种方法可用于鉴定具有条件活性的抗癌剂，包括具有条件活性的抗体例如抗-EGFR抗体及其它药剂，以便这种药剂在肿瘤中更具活性。也可以进行相似方法以鉴定任何具有条件活性的治疗性蛋白质，如抗炎剂，例如英利昔单抗(Remicade)、依那西普(Enbrel)，及其它相似药剂，以降低全身性免疫抑制活性。
2.产生和生产抗-EGFR抗体
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以使用标准细胞培养物及本领域已知的其它表达系统表达。在用于本文提供的方法中之前，可以纯化所述蛋白质。或者，可以在本文所述双重测定中筛选全部上清或稀释的上清。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以通过本领域技术人员已知的重组DNA方法产生。编码抗-EGFR抗体的DNA可以合成产生或者可容易地使用常规方法分离和测序(例如使用能特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。例如，已知产生或表达抗-EGFR抗体的任何细胞源均可作为这种DNA的优选来源。在另一实例中，一旦确定编码抗-EGFR的DNA的序列，可以使用基因合成技术构建核酸序列。
进一步地，诱变技术也可用于产生修饰形式的抗-EGFR抗体。DNA也可以被修饰。例如，基因合成或常规的分子生物学技术可用于实现核苷酸的插入、删除、添加或置换。例如，另外的核苷酸序列可以与核酸序列结合。在一个实例中，可以加入接头序列，如含有限制性核酸内切酶位点的序列，以将抗体基因克隆进载体如蛋白质表达载体中。此外，指定功能性DNA元件的另外的核苷酸序列可以与核酸分子可操纵地连接。示例性的这种序列包括但不限于设计为促进细胞内蛋白质表达启动子序列，及设计为促进蛋白质分泌的前导肽序列。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以表达为全长蛋白质或者不足全长的蛋白质。例如，抗体片段可以被表达。本文提供的核酸分子和蛋白质可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生。这种方法是常规的且为本领域技术人员所熟知。这些方法包括常规的生物学技术，包括基因合成、PCR、连接、克隆、转染和纯化技术。关于这些方法的描述在下文提供。
分离后，可将DNA置于表达载体中，然后被转染进宿主细胞中。在体的选择可根据希望的应用而定。例如，在插入核酸之后，所述载体典型用于转化宿主细胞，例如扩增蛋白质基因以复制和/或表达。在这种实例中，使用适于高水平表达的载体。
对于抗体的表达，通常将编码抗体重链的核酸克隆进载体中及将编码抗体轻链的核酸克隆进载体中。所述基因可以被克隆进单一载体中以双重表达或者克隆进单独的载体中。如果需要，载体也可以含有编码另外的恒定区或铰链区的进一步的序列以产生其它抗体形式。所述载体可以在宿主细胞中转染和表达。表达可以在本领域技术人员已知的任何细胞表达系统中。例如，宿主细胞包括不另外产生免疫球蛋白的细胞，以获得在重组宿主细胞中抗体的合成。例如，宿主细胞包括但不限于COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293FS细胞、HEK293-6E细胞、NSO细胞或者其它骨髓瘤细胞。本文描述了其它表达载体和宿主细胞。
在一个实例中，编码抗体重链的核酸连接在第一个表达载体中，编码抗体轻链的核酸连接在第二个表达载体中。所述表达载体可以相同或不同，但是其通常足够相容以允许蛋白质(重链和轻链)可比地从中表达。第一个和第二个表达载体通常典型以1∶1比率共转染进宿主细胞中。示例性的载体包括但不限于pγ1HC和pκLC(Tiller et al.(2008)JImmunol.Methods，329：112-24)。其它表达载体包括轻链表达载体pAG4622和重链表达载体pAH4604(Coloma et al.(1992)J Immunol.Methods，152：89-104)。所述pAG4622载体含有编码人κL链的C-区结构域的基因组序列和gpt可选择标记。所述pAH4604载体含有hisD可选择标记及编码人H链γ1C-区结构域的序列。在另一实例中，重链和轻链可以克隆进一个载体中，其具有重链和轻链的表达盒。
因此，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以产生或表达为全长抗体或者不足全长的抗体，包括但不限于其抗原结合片段，如Fab、Fab’、Fab铰链、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、scFv串联、Fv、dsFv、scFv铰链、scFv铰链(ΔE)双特异性抗体、Fd和Fd’片段。已经开发了许多技术用于生产抗体片段。传统地，这些片段通过对完整抗体的蛋白酶解消化而获得(见例如Morimoto et al.(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods，24：107-117；Brennance et al.(1985)Science，229：81)。片段也可以通过重组宿主细胞直接产生。例如，Fab、Fv和scFv抗体片段均可以在宿主细胞如大肠杆菌细胞中表达及从中分泌，因此使得大量这些片段可轻易产生。Fab’-SH片段也可以化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter et al.(1992)Bio/Technology，10：163-167)。根据另一方法，F(ab’)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。在一些实例中，所述修饰的抗-EGFR抗体是单链Fv片段(scFv)(见例如WO93/16185；美国专利No.5,571,894和美国专利No.5,587,458)。Fv和scFv是缺乏恒定区的具有完整组合位点的唯一种类；因此，在体内应用期间其适于降低非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白以在svFv的氨基或羧基末端产生效应子蛋白的融合。抗体片段也可以是线性抗体(见例如美国专利No.5,641,870)。这种线性抗体片段可以是单特异性的或者是双特异性的。产生抗体片段的其它技术为本领域技术人员已知。
例如，在表达时，抗体重链和轻链通过二硫键配对形成全长抗体或其片段。例如，为了表达全长Ig，可以将编码VH-CH1-铰链-CH2-CH3的序列克隆进第一个表达载体中，及将编码VL-CL结构域的序列克隆进第二个表达载体中。在与编码VL-GL结构域的第二个表达载体共表达时，全长抗体被表达。在另一实例中，为了产生Fab，可以将编码VH-CH1的序列克隆进第一个表达载体中，及将编码VL-CL结构域的序列克隆进第二个表达载体中。所述重链与轻链配对及Fab单体产生。各种IgG亚型的CH1、铰链区、CH2和/或CH3的序列为本领域技术人员已知(见例如U.S.Published Application No.20080248028)。相似地，也已知λ或κCL的序列(见例如U.S.Published Application No.20080248028)。本文提供了示例性的这种序列。
可以插入载体中以表达整个抗体及抗体片段的示例性的序列本文描述的抗体片段的序列(见例如SEQ ID NO：30-1068、1093、1098-1107、1112-1131和1134-1159)。例如，西妥昔单抗的可变重链和可变轻链(分别如SEQ ID NO：3和4示出)或者本文所述任何抗体的可变重链和可变轻链(例如分别如SEQ ID NO：30-1068、1093、1098-1107、1112-1131和1134-1159示出)，可以插入如本文所述或本领域技术人员已知的合适表达载体中。全部或部分重链或轻链的恒定区也可以插入或包含于载体中以表达IgG抗体或其片段。此外，VH-CH1和VL-CL序列可以插入合适的表达载体中以表达Fab分子。抗体的可变重链和可变轻链结构域(即分别如SEQ ID NO：30-1068、1093、1098-1107、1112-1131和1134-1159示出)可以在合适的表达载体中表达，如编码可变重链与可变轻链之间的接头的载体，以产生单链抗体。示例性的接头包括富集甘氨酸的柔性接头(-G4S-)n，其中n是正整数，如1(SEQ ID NO：1094)、2(SEQ ID NO：1095)、3(SEQ ID NO：21)、4(SEQ ID NO：1096)、5(SEQ ID NO：1097)或更大数。
a.载体
载体的选择可依赖于希望的应用。许多表达载体可利用并为本领域技术人员已知用于表达抗-EGFR抗体或其部分如抗原结合片段。表达抗体的选择受选择的宿主表达系统的影响。这种选择为本领域技术人员熟知。通常地，表达载体可包含转录启动子及任选增强子、翻译信号和转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有可选择标记，其允许选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增细胞中载体的拷贝数。载体通常可包含与连接的核酸分子可操纵地连接的另外的核苷酸序列(例如His标签、Flag标签)。对于抗体应用，载体通常包含编码恒定区的序列。因此，抗体或其部分也可以表达为融合蛋白。例如，可以产生融合蛋白以在多肽中加入另外的功能性。示例性的融合蛋白包括但不限于信号序列、表位标签(如为了定位的标签His6标签或myc标签或者为了纯化的标签，例如GST融合体)及指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合体。
例如，所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的表达可以通过本领域已知的任何启动子/增强子控制。合适的细菌启动子为本领域熟知及在下文描述。对于哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的其它合适的启动子为本领域熟知，其中一些在下文例证。用于指导异源核酸表达的启动子的选择依赖于特定应用。可以使用的启动子包括但不限于：真核表达载体含有的，包括SV40早期启动子(Bernoist and Chambon，Nature 290：304-310(1981))、Rous肉瘤病毒的3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto et al.Cell 22：787-797(1980))、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature 296：39-42(1982))；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或者tac启动子(DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983))；也见“Useful Proteins from RecombinantBacteria”：in Scientific American 242：79-94(1980))；植物表达载体，包括胭脂碱合成酶启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 303：209-213(1984))或者花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner et al.，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))，以及光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.，Nature 310：115-120(1984))；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Ga14启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子，及呈现组织特异性且已经用于转基因动物中的如下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift et al.，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，Hepatology 7：425-515(1987))、在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan et al.，Nature 315：115-122(1985))、在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.，Cell 38：647-658(1984)；Adams et al.，Nature 318：533-538(1985)；Alexander et al.，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder et al.，Cell 45：485-495(1986))、在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert et al.，Genes and Devel.1：268-276(1987))、在肝脏中具有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf et al.，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer et al.，Science 235：53-58 1987))、在肝脏中具有活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.，Genes and Devel.1：161-171(1987))、在骨髓细胞中具有活性的β球蛋白基因控制区(Magram et al.，Nature 315：338-340(1985)；Kollias et al.，Cell 46：89-94(1986))、在脑少突神经胶质细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.，Cell48：703-712(1987))、在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，Nature 314：283-286(1985))，及在下丘脑的促性腺激素细胞中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason et al.，Science234：1372-1378(1986))。
除了启动子之外，表达载体典型包含转录单位或表达盒，其含有为所述抗体或其部分在宿主细胞中表达所需的所有另外的元件。典型的表达盒包含与编码所述蛋白质的核酸序列可操纵地连接的启动子及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点及翻译终止所需的信号。表达盒的其它元件可包含增强子。此外，表达盒典型包含结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。所述终止区可得自与启动子序列相同的基因或者可以得自不同基因。
一些表达系统具有提供基因扩增的标志物如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。或者，不包含基因扩增的高产量表达系统也是合适的，如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，具有编码在多面体启动子或其它杆状病毒强启动子指导下的蛋白质的核酸序列。
为了本文的目的，对于表达抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体，载体可包含编码抗体恒定区的核苷酸序列，与编码抗体可变区的核酸序列可操纵地连接。所述载体可包含一个或所有的CH1、CH2、铰链区、CH3或CH4和/或CL的序列。通常地，如未了表达Fab，载体含有CH1或CL(κ或λ轻链)的序列。恒定区或铰链区的序列为本领域技术人员已知(见例如U.S.Published Application No.20080248028)。示例性的这种序列在本文中提供。
示例性的表达载体包括任何哺乳动物表达载体，如pCMV。对于细菌表达，这种载体包括pBR322、pUC、pSKF、pET23D，及融合载体如MBP、GST和LacZ。其它真核载体例如含有来自真核病毒的调节元件的任何载体可用作真核表达载体。这些载体包括例如SV40载体、乳头瘤病毒载体及衍生自Epstein-Bar病毒的载体。示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSCE，及使得蛋白质在如下启动子指导下表达的任何其它载体：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多面体启动子或者示出在真核细胞中有效表达的其它启动子。
本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体中的任何方法均可用于构建含有编码蛋白质或抗体链的核酸的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术及体内重组技术(遗传重组)。插入克隆载体中可通过例如将DNA片段连接进具有互补粘端的克隆载体中而实现。如果用于使DNA片段化的互补限制位点在克隆载体中不存在，则所述DNA分子的末端可以经酶修饰。或者，任何希望的位点可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端而产生，这些连接的接头可含有特异性化学合成的编码限制性核酸内切酶识别序列的核酸。
b.细胞和表达系统
通常地，可以工程化以表达异源DNA及具有分泌途径的任何细胞类型均适于表达本文提供的修饰的抗-EGFR抗体。表达宿主包括原核和真核生物体，如细菌细胞(例如大肠杆菌)、酵母细胞、真菌细胞、古生菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞，包括人细胞。表达宿主其蛋白质生产水平以及在表达的蛋白质上呈递的翻译后修饰的类型可不同。进一步地，表达宿主的选择通常相关于载体的选择及使用的转录和翻译元件。例如，表达宿主的选择通常但不总是依赖于利用的前体序列的选择。例如，许多异源信号序列可仅在相同物种的宿主细胞中表达(即昆虫细胞信号序列在昆虫细胞中最佳表达)。相反，其它信号序列可用于异源宿主中，如人血清白蛋白(hHSA)信号序列在酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞中充分起作用，及组织纤溶酶原激活物前/原序列已经证实在昆虫和哺乳动物细胞中起作用(Tanet al.，(2002)Protein Eng.15：337)。表达宿主的选择可以基于这些及全体因素进行，如监管和安全性考虑、生产成本及纯化的需要和方法。因此载体系统必须与使用的宿主细胞相容。
在真核宿主中表达可包括在酵母如酿酒酵母和毕赤酵母、在昆虫细胞如果蝇细胞及鳞翅类的细胞、在植物和植物细胞如烟草、玉米、水稻、海藻和柠檬中表达。为表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括在转基因动物中产生，例如包括在血清、乳汁和卵中产生。
重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔效应导入宿主细胞中，以便产生所述基因序列的多个拷贝。通常地，使用标准转染方法产生表达大量抗体量的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后将其使用标准技术纯化(见例如Colley et al.(1989)J.Biol.Chem.，264：17619-17622；Guide to Protein Purification，in Methods inEnzymology，vol.182(Deutscher，ed.)，1990)。真核和原核细胞的转化是根据标准技术进行的(见例如Morrison(1977)J.Bact.132：349-351；Clark-Curtiss and Curtiss(1983)Methods in Enzymology，101，347-362)。例如，将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的任何熟知方法均可以使用。这些方法包括使用磷酸钙沉淀、聚凝胺法、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体及任何其它熟知的方法以将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或者其它外来遗传物质导入宿主细胞。通常地，为了表达抗体，将宿主细胞用编码至少VH链的第一种载体及编码至少VL链的第二种载体转染。因此，仅需要使用的特定遗传工程方法能成功地将至少这两个基因导入能表达抗体多肽或其修饰形式的宿主细胞中。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以通过本领域已知的任何蛋白质产生方法产生，包括体外和体内方法，如将编码抗体的核酸分子导入宿主细胞或宿主动物中及在体外表达编码重组的抗体的核酸分子。原核生物特别是大肠杆菌提供改良产生大量重新组装的抗体或其部分及在蛋白质的表达和纯化应用中特别希望的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的一种简便及快速的技术。高生产量表达的大肠杆菌宿主菌株包括但不限于BL21(EMD Biosciences)和LMG194(ATCC)。示例性的这种大肠杆菌宿主菌株是BL21。高生产量表达的载体包括但不限于pBR322和pUC载体。
i.原核表达
原核生物特别是大肠杆菌提供了产生大量修饰的抗-EGFR抗体或其部分的系统。大肠杆菌转化是本领域技术人员熟知的一种鉴定及快速的技术。大肠杆菌表达载体可含有可诱导的启动子，其可用于诱导高水平蛋白质表达及用于表达对宿主细胞呈现一些毒性的抗体。示例性的可诱导的启动子包括lac启动子、trp启动子、杂交tac启动子、T7和SP6RNA启动子及温度调节的λPL启动子。
抗体或其部分可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是一种还原环境，及对一些抗体而言这可以导致不可溶的包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇和变性剂(例如胍-HCl和尿素)可用于再次溶解所述抗体。示例性的另一种方法是在细菌的周质间隙表达重组抗体或其片段，这提供了氧化环境及伴侣蛋白样和二硫化物异构酶，导致可溶的蛋白质产生。典型地，将前导序列融合于待表达的蛋白质，其指导所述蛋白质至细胞周质。然后将前导序列通过细胞周质内的信号肽酶除去。示例性的将表达的蛋白质易位进细胞周质的途径是Sec途径、SRP途径和TAT途径。示例性的细胞周质靶向前导序列包括来自果胶裂解酶基因的pelB前导序列、StII前导序列和DsbA前导序列。在一些情况中，细胞周质表达使得表达的蛋白质漏入培养基中。分泌的抗体允许从培养上清中快速及简便地纯化。非分泌的抗体可以通过渗透溶解得自细胞周质。与细胞质表达相似，在一些情况中，蛋白质可以变得不溶，可以使用变性剂和还原剂促进溶解和再折叠。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和溶解性。典型地，使用在25℃-37℃之间的温度。突变也可以用于增加表达的蛋白质的溶解性。典型地，细菌产生无糖基化的蛋白质。因此，糖基化可以在从宿主细胞中纯化后在体外加入。
ii.酵母
酵母如酿酒酵母、裂殖酵母、解脂耶氏酵母、乳酸克鲁维酵母和毕赤酵母是重组抗体或其部分的可用表达宿主。酵母可以用附加型复制载体转化或者通过同源重组的稳定染色体整合。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。示例性的这种启动子包括AOX1、GAL1、GAL7和GAL5及金属硫蛋白启动子如CUP1。表达载体通常包括可选择标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3以选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白如Bip和蛋白质二硫化物异构酶的共表达可改良表达水平和溶解性。此外，在酵母中表达的蛋白质可以指导分泌，使用分泌信号肽融合体如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号，及具有酵母细胞表面蛋白如Aga2p交配粘附受体或者Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合体。蛋白酶裂解位点如Kex-2蛋白酶裂解位点可以工程化以随着表达的多肽退出分泌途径而从其中除去融合序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。
iii.昆虫
昆虫细胞，特别是使用杆状病毒表达，可用于表达修饰的抗-EGFR抗体或其部分。昆虫细胞表达高水平的蛋白质及大多数翻译后修饰能由高等真核细胞使用。杆状病毒具有一个限制性宿主范围，其可改良真核表达的安全性和降低监管。典型的表达载体使用启动子以高水平表达，如多角体蛋白启动子和杆状病毒p10启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和Bombyxmori核型多角体病毒(BmNPV)，及昆虫细胞系如衍生自草地贪夜蛾的Sf9细胞和衍生自粉纹夜蛾的TN细胞。为了高水平表达，待表达的分子的核苷酸序列可以与病毒的多角体蛋白起始密码子的立即下游融合。为了产生能表达人抗体的杆状病毒重组体，利用双重表达转移如pAcUW51(PharMingen)。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工并可用于分泌表达的蛋白质进入培养基中。
在昆虫细胞中表达本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的另一种表达系统是使用稳定转化的细胞。可以使用细胞系如衍生自草地贪夜蛾的Sf9细胞和来自粉纹夜蛾的TN来源的细胞进行表达。杆状病毒立即早期基因启动子IE1可用于诱导一致水平的表达。典型的表达载体包括pIE1-3和pI31-4转移载体(Novagen)。表达载体典型通过使用可选择标记如新霉素和潮霉素维持。
iv.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可用于表达抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体，包括其抗原结合片段。表达构建体可以转移至哺乳动物，通过病毒感染如腺病毒或者通过直接DNA转移如脂质、磷酸钙、DEAE-葡聚糖及通过物理方式如电穿孔和显微注射进行。哺乳动物细胞表达载体典型包含一个mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak一致序列)及聚腺苷酸化元件。这种载体通常包括转录启动子-增强子以高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是具有活性的。组织和细胞类型启动子和增强子也可用于表达。示例性的启动子/增强子区域包括但不限于来自如下基因的那些区域：如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白酶、肌球蛋白轻链2及促性腺激素释放激素基因控制。可选择标记可用于选择和维持具有所述表达构建体的细胞。示例性的可选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。修饰的抗-EGFR抗体可使用例如NEOR/G418系统、二氢叶酸还原酶(DHFR)系统或谷氨酰胺合成酶(GS)系统产生。GS系统使用联合表达载体如pEE12/pEE6，以表达重链和轻链。具有细胞表面信号分子如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合体可知道蛋白质以活性状态在细胞表面上表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性的细胞系包括本领域已知或本文所述的任何细胞系，例如CHO、Ba1b/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(不分泌)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。也可以使用调节为适合无血清培养基的细胞系，其促进分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化。一种这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42.)。
v.植物
转基因植物细胞和植物可用于表达本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体或其部分。表达构建体典型被移至植物，使用直接DNA转移如微粒轰击及PEG介导的转移进原生质体中，以及农杆菌介导的转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶宿主如拟南芥和烟草与单子叶宿主如玉米和水稻之间是不同的。用于表达的示例性的植物启动子包括花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子及玉米泛素-1(ubi-1)启动子。可选择的标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化的细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养基中维持为细胞、聚集体(愈伤组织)或者再生为完整植物。转基因植物细胞也可以包含工程化为产生蛋白酶或修饰的蛋白酶的海藻(见例如，Mayfield et al.(2003)PNAS 100：438-442)。由于植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，因此这可影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
3.纯化
抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗原结合片段可以通过本领域技术人员已知的或本文描述的任何方法纯化。蛋白质可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化为基本纯的程度，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析、离子交换层析或者柱层析。例如，抗体可以通过柱层析纯化。示例性的纯化本文提供的抗-EGFR抗体的一种方法是通过使用柱层析，其中固体支持物材料与蛋白质G连接，这是来自链球菌属的以高亲和性结合免疫球蛋白的细胞表面结合蛋白。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体可以通过柱层析纯化，其中固体支持柱材料与蛋白质A连接，这是来自葡萄球菌属的以高亲和性结合免疫球蛋白如IgG抗体的细胞表面结合蛋白(见例如Liu etal.(2010)MAbs 2(5)：480-499)。可用于纯化本文提供的抗-EGFR抗体的其它免疫球蛋白结合细菌蛋白包括蛋白质A/G，这是组合蛋白质A和蛋白质G的IgG结合结构域的一种重组融合蛋白；及蛋白质L，其是来自消化链球菌属的表面蛋白质(Bjorck(1988)J.Immunol.，140(4)：1194-1197；Kastem，et al.(1992)J.Biol.Chem.267(18)：12820-12825；Eliasson etal.(1988)J.Biol.Chem.263：4323-4327)。
所述抗-EGFR抗体可以纯化至60％、70％、80％纯度，典型至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯度。纯度可以通过标准方法如SDS-PAGE和考马斯染色评估。
从宿主细胞中纯化抗-EGFR抗体包括抗体或其部分的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞及从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可用作起始材料以产生裂解的细胞的提取物。此外，转基因动物产物可包括在乳汁或蛋中的多肽产产物，可以收集，及如果需要可以使用本领域的标准方法进一步提取蛋白质及进一步纯化。
当蛋白质由转化的细菌大量表达时，典型在启动子诱导之后表达，尽管表达可以是组成型的，但是多肽可以形成不溶的聚集体。有本领域技术人员已知的几种方案适于纯化多肽包涵体。多种变化也为本领域技术人员已知。
例如，在一种方法中，通常将细胞悬浮液离心，并将含有包涵体的沉淀重悬浮于不溶解但洗涤所述包涵体的缓冲液中，例如20mM Tris-HCl(pH7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl和2％Triton-X 100，非离子洗涤剂。必须重复洗涤步骤以除去尽可能多的细胞碎片。剩余的包涵体沉淀可以重悬浮于合适缓冲液中(例如20mM磷酸钠pH 6.8，150mM NaCl)。其它合适的缓冲液为本领域技术人员熟知。
或者，抗体可以从细菌细胞周质中纯化。在抗体输出进入细菌细胞周质的情况中，细菌细胞周质流分可以通过除了本领域技术人员已知的其它方法之外的冷冻渗透冲击而分离。例如，在一种方法中，为了从细胞周质中分离重组多肽，将细菌细胞离心形成沉淀。将该沉淀重悬浮于含有20％蔗糖的合适缓冲液中。为了裂解细胞，可以将细菌离心并将沉淀重悬浮于冰冷的5mM MgSO4中，并在冰浴中保持大约10分钟。将细胞悬浮液离心，倒出上清并贮存。上清中的重组抗-EGFR抗体可以通过本领域技术人员熟知的标准分离技术与宿主蛋白质分离，如本文所述分离技术。这些方法包括但不限于如下步骤：溶解性分级分离、大小差异过滤及柱层析。
F.药物组合物、配制物、试剂盒、生产产品及组合
1.药物组合物和配制物
本文提供了施用的任何抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。药物可接受的组合物是基于监管机构或其它机构的许可制备的或者根据普遍认可的用于动物和人体的药典制备的。典型地，所述化合物使用本领域熟知的技术和方法配制为药物组合物(见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，Fourth Edition，1985，126)。
所述药物组合物可用于治疗性、预防性和/或诊断性应用。本文提供的抗-EGFR抗体可以与药物可接受的运载体或稀释剂一起配制。通常地，这种药物组合物利用不明显损害所述抗体的生物学性质如结合其特异性表位(例如结合EGFR)的性质的成分。每种成分均是药物学和生理学可接受的，与其它组成部分是相容的及对患者无伤害。所述配制物可以便利地以单位剂量形式呈现，及可以通过制药领域熟知的方法制备，包括但不限于片剂、药丸、粉末、液体溶液或者悬浮液(例如包括可注射、可摄取的或局部配制物(例如滴眼剂、凝胶、糊、乳霜或软膏)、气雾剂(例如鼻喷雾剂)、脂质体、栓剂、阴道栓剂、可注射和可灌注的溶液及缓释形式。见例如Gilman，et al.(eds.1990)Goodman and Gilman’s：ThePharmacological Bases of Therapeutics，8th Ed.，Pergamon Press；and Remington’sPharmaceutical Sciences，17th ed.(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.；Avis，etal.(eds.1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications Dekker，NY；Lieberman，et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Dekker，NY；andLieberman，et al.(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse SystemsDekker，NY。当全身性施用时，所述治疗组合物是无菌的、无热原的、通常颗粒物质及在肠道外注射可接受的溶液中，具有应有的pH、等渗性和稳定性。这些条件为本领域技术人员已知。制备可胃肠外施用的组合物的方法为本领域技术人员熟知或者可显而易见，在例如"Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Formerly Remington’sPharmaceutical Sciences)″，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1995)中详细描述。
本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如固体、半固体、液体、粉末、水溶液或冻干形式。示例性的合适药物运载体为本领域已知，包括但不限于水、缓冲剂、盐水溶液、磷酸盐缓冲的盐水溶液，各种类型的增湿剂、无菌溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、明胶、甘油、碳水化合物如乳糖、蔗糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油一酸酯和甘油二酸酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、粉末等。本文提供的药物组合物可含有其它添加剂，包括例如抗氧化剂、防腐剂、抗微生物剂、止痛剂、粘合剂、崩解剂、色素、稀释剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、张度剂、运载工具、粘性剂、芳香剂、乳状液如油/水乳状液、乳化剂和悬浮剂如阿拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、海藻酸钠、皂土、卡波姆胶、角叉菜胶、羧基甲基纤维素、纤维素、胆固醇、凝胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、辛苯聚醇-9、油醇、聚乙烯吡啶酮、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、山梨聚糖酯、硬脂醇、黄芪胶、黄原胶，及其衍生物、溶剂，以及各种各样的组成成分如未经纤维素、柠檬酸、糊精、葡萄糖、液体葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化镁、偏磷酸钾、淀粉等(见Alfonso R.Gennaro(2000)Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，20th Edition.Baltimore，MD：Lippincott Williams&Wilkins)。这种运载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，及可以合适剂量给对象施用。稳定剂如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以防止所述组合物在机体内降解。
抗体的施用途径根据已知方法而定，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉、皮下、眼内、动脉内、鞘内注射或注入，吸入或损害内施用途径，或者通过持续释放系统，如下文所述。所述抗体典型通过注入或者通过推注持续施用。可以局部或全身性方式施用所述抗体。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗体可以与药物可接受的载体混合物制备。配制和施用所述化合物的技术为本领域技术人员已知(见例如“Remington’sPharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。这种治疗性组合物可以静脉内施用或者通过鼻或肺施用，优选作为液体或粉末气雾剂(冻干的)施用。所述组合物也可以根据需要经肠道外或皮下注射。当全身性施用时，所述治疗性组合物应是无菌的、无热原的及在具有应有的pH、等渗性和稳定性的药物可接受的溶液中。这些条件为本领域技术人员已知。
适用的药物组合物包括其中包含实现其指定目的有效量的一或多种抗-EGFR抗体。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。治疗有效剂量可以通过使用如本文所述体外和体内方法确定。因此，本文提供的抗-EGFR抗体当在药物制备物中时，可以单位剂量形式存在以施用。
治疗性配制物可以在许多常规剂量配制物中施用。简而言之，本文提供的抗体的剂量配制物是针对贮存或施用制备的，通过混合具有希望程度的纯度的化合物与生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂而成。这种材料在应用的剂量和浓度对于接受体是无毒性的，可包括缓冲液如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其它有机酸盐缓冲液；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量肽(低于大约10个残基)如聚精氨酸，蛋白质如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；抗衡离子如钠和/或非离子表面活性剂如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
当用于体内施用时，所述修饰的抗-EGFR抗体配制物应是无菌的，及可以根据常规的制药实践配制。这可在冻干和重建之前或之后通过灭菌滤膜过滤而容易地实现。所述抗体一般以冻干形式或在溶液中贮存。其它载体如天然存在的植物油如芝麻、花生或棉籽油或者合成的脂肪运载体如油酸乙酯等可以是希望的。根据公认的制药实践可以掺入缓冲液、防腐剂、抗氧化剂等。
所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以0.1-10mg/mL或大约0.1-10mg/mL的浓度提供，例如为或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10mg/mL或更高浓度。溶液的体积可以为1-100mL或大约1-100mL，例如为或大约0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mL或更多。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体提供在磷酸盐缓冲盐水中。例如，所述抗-EGFR抗体可以提供在50-mL一次性的小瓶中，其含有100mg的抗-EGFR抗体，在磷酸盐缓冲盐水中浓度为2mg/mL。
本文提供的抗-EGFR抗体可以冻干以贮存及在使用前在合适的运载体中复水。这个技术已经示出对于常规的免疫球蛋白和蛋白质制品是有效的，可以使用本领域已知的冻干和复水技术。
本文提供的抗-EGFR抗体可以作为控制释放或持续释放组合物提供。本领域已知配制药丸和胶囊的聚合材料，其可以实现控制或持续释放本文提供的抗体(见例如MedicalApplications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Langer and Peppas(1983)J.Macromol.Sci.23：61；see also Levy et al.(1985)Science 228：190；Duringet al.(1989)Ann.Neurol.25：351；Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71：105；美国专利No.5,679,377、5,916,597、5,912,015、5,989,463、5,128,326；及PCT PublicationNos.WO99/15154和WO 99/20253)。用于持续释放配制物中的示例性的聚合物包括但不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-co-乙烯乙酸酯)、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚交酯(PLA)、聚(交酯-co-乙交酯)(PLGA)和聚正酯。通常地，持续释放配制物中使用的聚合物是惰性的无可滤去的杂质、贮存稳定的、无菌及可生物降解的。本领域已知的生产持续释放配制物的任何技术均可用于产生含有本文提供的一或多种抗-EGFR抗体的持续释放配制物。
在一些实例中，所述药物组合物含有本文提供的抗-EGFR抗体及一或多种另外的抗体。在一些实例中，所述一或多种另外的抗体包括但不限于本文描述的或本领域已知的抗-EGFR抗体，例如ABX-EGF或西妥昔单抗。
2.生产产品/试剂盒
抗-EGFR抗体或编码抗-EGFR抗体的核酸或其衍生物或生物学活性蛋白质的药物组合物可以包装为含有包装材料、有效治疗可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的疾病或病症如本文所述或本领域已知疾病和病症的药物组合物、及指示所述抗体或核酸分子用于治疗感染、疾病或紊乱的标签的生产产品。所述药物组合物可以含有单次施用或多次施用剂量的单位剂量形式包装。包装的组合物可含有冻干粉末的含有本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的药物组合物，其可以在施用之前重建(例如用水或盐水重建)。
本文提供的生产产品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如，美国专利No.5,323,907、5,052,558和5,033,252，所述专利均以其全部内容并入本文作参考。示例性的药物包装材料包括但不限于发泡包装、瓶、管、吸入器(例如加压定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、喷雾器(例如喷嘴或超声喷雾器)及其它单一呼吸液体系统(single breath liquid systems))、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶，以及适于选择的配制和指定施用和治疗模式的任何包装材料。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体、编码所述抗体的核酸分子、药物组合物或者组合也可以试剂盒形式提供。试剂盒可任选包含一或多种成分，如使用说明书、装置和其它试剂(例如无菌水或盐水溶液以稀释所述组合物和/或重建冻干的蛋白质)，以及实施所述方法的成分如管、容器和注射器。示例性的试剂盒可包含本文提供的抗-EGFR抗体，及可任选包含使用说明书、给对象施用抗-EGFR抗体的装置、检测对象中抗-EGFR抗体的装置、检测得自对象的样品中抗-EGFR抗体的装置，以及给对象施用另外的治疗剂的装置。
所述试剂盒可任选包含使用说明书。说明书典型包括描述修饰的抗-EGFR抗体及任选试剂盒中其它成分、及施用方法包括确定对象适当状态、适当剂量、给药方案、及适当施用抗-EGFR抗体的方法的真实表达。说明书也可以包括在治疗期间监测对象的指导。
试剂盒也可以包含本文描述的药物组合物及诊断物品。例如，这种试剂盒可包括测量对象中选择的抗-EGFR抗体的浓度、量或活性的物品。
在一些实例中，所述抗-EGFR抗体提供在诊断试剂盒中以检测分离的生物学样品(例如肿瘤细胞如得自对象的循环肿瘤细胞或者从对象中切除的肿瘤细胞)中EGFR。在一些实例中，诊断试剂盒含有一或多种抗-EGFR抗体和/或一或多种对照抗体的面板(即本领域已知的非-EGFR结合抗体或者EGFR抗体如西妥昔单抗)，其中所述面板中的一或多种抗体是本文提供的修饰的抗-EGFR抗体。
本文提供的试剂盒还可包含给对象施用抗-EGFR抗体的装置。本领域已知的给对象施用药物的任何各种装置均可包含在本文提供的试剂盒中。示例性的装置包括但不限于皮下注射器针头、静脉内注射针头和导管。典型地，施用试剂盒中修饰的抗-EGFR抗体的装置与施用修饰的抗-EGFR抗体希望的方法相容。
3.组合
本文提供了本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与第二种药剂如第二种抗-EGFR抗体或前体治疗剂或诊断剂的组合。组合可包含根据本文提供的方法实现治疗的任何抗-EGFR抗体或试剂。例如，组合可包含任何抗-EGFR抗体和化疗剂。组合也可包含本文提供的抗-EGFR抗体及一或多种另外的治疗性抗体。例如，所述另外的治疗剂是抗癌剂，如化疗剂，如章节G所述。本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的组合也可包含含有所述抗-EGFR抗体的药物组合物或者含有编码抗-EGFR抗体的核酸的宿主细胞。本文提供的组合可以配制为单一组合物或者在单独的组合物中。
G.治疗应用
本文提供的抗-EGFR抗体或其片段可用于本领域技术人员已知的抗-EGFR抗体应用的任何目的。例如，本文描述的抗-EGFR抗体可用于一或多种的治疗性、诊断性、工业和/或研究目的。特别地，本文提供的方法包括本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗性应用。在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体可用于杀死包含EGFR的靶细胞，如癌细胞。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体可阻断、拮抗或折磨(agonize)EGFR。通过这种活性，本文提供的抗-EGFR抗体或其片段可施用患者或对象以治疗应答抗-EGFR抗体治疗的任何病症，包括但不限于肿瘤、癌症或转移。所述治疗性应用包括施用治疗有效量的抗-EGFR抗体，单独施用或者与其它治疗或药剂组合施用。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其片段可用作治疗剂以治疗其中使用现有抗-EGFR抗体如西妥昔单抗的任何疾病或病症。当施用所述抗-EGFR抗体时，导致对象与施用其它抗-EGFR抗体之后观测到的副作用相比呈现出降低或减轻的副作用。如本文别处论述，当施用现有的抗-EGFR抗体如西妥昔单抗时可导致对象呈现出局部或全身性副作用，特别是皮肤副作用。这些副作用限制了治疗性应用。在许多情况中，这些副作用与在中性生理pH环境如在皮肤真皮中结合EGFR相关。本文提供的方法包括施用本文提供的抗-EGFR，其在低pH(如大约pH 5.6-6.8，例如低于或大约或为pH 5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8)下比中性pH(如大约pH 6.8-7.6，例如低于或大约或为pH 6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)活性更高。任选地，在低pH的条件包括增加的乳酸浓度，如大约10mM-30mM，例如10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM或更高浓度。例如，本文提供的抗-EGFR抗体在肿瘤环境(其可具有低pH和/或增加的乳酸浓度)比在中性生理环境中具有更高活性，所述中性生理环境与抗-EGFR抗体的一或多种副作用相关，如皮肤基底层。这样可以是有利的，通过仅针对患病组织如肿瘤组织的靶向治疗，降低或防止副作用包括局部和全身性副作用。
与降低的副作用相关的抗-EGFR抗体如本文提供的修饰的抗-EGFR抗体可以较高的给药方案使用，及可以具有改良的效力和安全性。与现有抗-EGFR抗体治疗如西妥昔单抗引起的那些相比可以降低的副作用包括本文所述或本领域已知的任何不希望的非治疗性作用，如恶心、呕吐、胸闷、头痛和相关的心血管作用如血压不稳定和动脉收缩、皮肤毒性、骨髓抑制、心脏毒性、脱发、肾功能紊乱、口腔炎、贫血、癫痫、免疫反应如急性过敏反应、血清病、抗体产生、感染、癌症、自身免疫疾病和心脏毒性。
在一些实例中，与施用现有抗-EGFR抗体治疗如西妥昔单抗导致的副作用相比，施用本文提供的抗-EGFR抗体将一或多种副作用的严重性相对于未修饰的EGFR抗体的所述一或多种副作用的严重性降低了至少或大约99％、至少或大约95％、至少或大约90％、至少或大约85％、至少或大约80％、至少或大约75％、至少或大约70％、至少或大约65％、至少或大约60％、至少或大约55％、至少或大约50％、至少或大约45％、至少或大约40％、至少或大约35％、至少或大约30％、至少或大约25％、至少或大约20％、至少或大约15％或者至少或大约10％。
所述方法可包括在治疗对象之前选择治疗的患者或对象，例如确定所述患者或对象是否具有EGFR依赖性疾病或病症。在一些实例中，本文提供的方法包括鉴定已经经历或正经历由施用抗-EGFR抗体如西妥昔单抗造成的副作用的患者或对象的步骤。技术人员使用本领域技术人员已知的和/或本文描述的检查和测定能容易地诊断这种病症、紊乱和副作用。
用抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗疾病和病症可以通过任何合适的施用途径使用合适的配制物实现，包括但不限于注入、皮下注射、肌肉注射、皮内注射、口服及外敷和经皮施用。
应理解虽然当施用本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体时可导致对象呈现出与施用其它抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相比减轻或降低的副作用，但是在施用时也可以发生一些副作用。应理解可耐受的副作用的数目和程度依赖于施用所述化合物的状况。例如，当治疗致命的疾病时，一些毒性和不希望的副作用是容许的，而这在治疗较轻的病症时是不容许的。治疗应用的有效量可依赖于疾病的严重度及对象的体重和一般状态，以及施用途径。局部施用治疗剂典型需要比任何全身性施用模式较小的剂量，但是在一些情况中所述治疗剂的局部浓度在局部施用后比全身性施用可安全实现的剂量更高。
这个章节提供了本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的示例性的应用和施用方法。这些描述的应用是举例说明而不限制本发明方法的应用。这种方法包括但不限于可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的任何病症或疾病的治疗方法。本领域主治医生可以鉴定这种疾病或病症。
1.示例性的疾病和病症
本文描述的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可用于抗体如抗-EGFR抗体可用于的任何治疗性目的(见例如Reeves et al.(2011)Otolaryngol Head Neck Surg.144(5)：676-84；Adams et al.(2008)Expert Rev Anticancer Ther.8(8)：1237-45；Belda-Iniesta et al.(2006)Cancer Biol Ther.5(8)：912-4；Liu et al.(2010)CancerChemother Pharmacol.65(5)：849-61)。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体施用患者以治疗可以用抗-EGFR抗体治疗的疾病或紊乱。在一些实例中，疾病的治疗包括在疾病的临床表现之后施用本文所述抗-EGFR抗体以防止疾病症状。在一些实例中，施用本文所述的抗-EGFR抗体以根除疾病。可以用本文描述的修饰的抗-EGFR抗体治疗的疾病或紊乱的实例包括自身免疫和炎性疾病、感染性疾病和癌症。
a.癌症
EGFR在多种人恶性疾病如肺癌、头颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和神经胶质瘤中的癌症发育和进展相关。EGFR-相关的分子因素如拷贝数和基因突变已经鉴定为是癌症的预测和预示因素(见例如Bronte et al.(2011)Front Biosci.3：879-887；Harding andBurtness(2005)Drugs Today41(2)：107-127)。例如，高EGFR表达与头颈鳞状细胞癌(HNSCC)患者不良预后相关(Szabo et al.(2011)Oral Oncol.47(6)：487-496)。
抗-EGFR抗体如本文描述的修饰的抗-EGFR抗体可以结合并阻止EGF受体的刺激。例如，修饰的抗-EGFR抗体与受体的结合可抑制表皮生长因子(EGF)的结合和/或导致抗体-受体复合物的内在化(Harding and Burtness，Drugs Today(Barc))。因此，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可例如阻止受体磷酸化及受体相关激酶活性的活化，最后停止受体介导的细胞信号传导。
由于本文提供的抗-EGFR抗体在低pH和/或增高的乳酸盐浓度下增加的活性，因此所述抗-EGFR抗体与在非靶细胞或组织中相比可优先在肿瘤微环境中起作用。本文所述修饰的抗-EGFR抗体及其片段可用于治疗表达EGFR的肿瘤，包括实体瘤。表达EGFR的肿瘤可以对其局部微环境中的EGF敏感，及可通过肿瘤产生的EGF或转化生长因子α(TGF-α)进一步刺激。可以通过本发明方法治疗或预防的疾病和病症包括例如其中肿瘤生长通过EGFR旁分泌和/或自分泌环刺激的那些疾病。本文所述方法可因此用于治疗未血管化或者尚未充分血管化的肿瘤。此外，抗-EGFR抗体如本文所述修饰的抗-EGFR抗体可抑制肿瘤相关的血管发生。EGFR刺激血管内皮与肿瘤的血管化相关。典型地，血管内皮受其它来源(例如肿瘤细胞)的EGF和/或TGF-α以旁分泌形式刺激。因此，本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可用于治疗患有血管化肿瘤或赘生物的对象。
改变的pH微环境是在疾病状态中发现的最常见的微环境，如肿瘤微环境，其是与其它性质如缺氧相比在疾病微环境中最一致的性质(见例如Fogh Andersen et al.(1995)Clin.Chem.，41：1522-1525；Bhujwalla et al.(2002)NMR Biomed.，15：114-119；Helmlinger et al.(1997)Nature Med.，3：177；Gerweck and Seetharaman(1996)，CancerRes.56(6)：1194-1198)。例如，在许多肿瘤中，“Warburg作用”产生pH为大约5.6-6.8的微环境，例如低于或大约或为pH5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8。因此，在酸性pH比在中性pH活性更高的抗-EGFR抗体如本文所述修饰的抗-EGFR抗体，可用于治疗表达EGFR的肿瘤，同时使在非靶疾病细胞或组织中的活性最小化。
此外，在许多肿瘤中，“Warburg作用”产生乳酸盐浓度在10-15mM之间的微环境。已经发现增高的乳酸盐水平与各种肿瘤的相关性，所述肿瘤包括但不限于头颈癌、转移的结肠直肠癌、宫颈癌和鳞状细胞癌(见例如Correlation of High Lactate Levels in Headand Neck Tumors with Incidence of Metastasis.Stefan Walenta，Ahmad Salameh，Heidi Lyng，Jan F.Evensen，Margarethe Mitze，Einar K.Rofstad，and WolfgangMueller-Klieser.(1997)American Journal of Pathology 150(2)：409-415；Correlation of High Lactate Levels in Human Cervical Cancer with Incidence ofMetastasis.Georg Schwickert，Stefan Walenta，Kolbein Suiulfor.Einar K.Rofstad，and Wolfgang Mueller-Klieser.(1995)Cancer Research 55：4757-4759；High LactateLevels Predict Likelihood of Metastases，Tumor Recurrence，and RestrictedPatient Survival in Human Cervical Cancers.Stefan Walenta，Michael Wetterling，Michael Lehrke，Georg Schwickert，KolbeinEinar K.Rofstad，and WolfgangMueller-Klieser.(2000)Cancer Research 60：916-921；In Vitro Proton MagneticResonance Spectroscopic Lactate and Choline Measurements，18F-FDG Uptake，andPrognosis in Patients with Lung Adenocarcinoma.JianFei Guo，Kotaro Higashi，Hajime Yokota，Yosinobu Nagao，Yoshimichi Ueda，Yuko Kodama，Manabu Oguchi，SuzukaTaki，Hisao Tonami，and Itaru Yamamoto.(2004)J Nucl Med 45：1334-1339；Lactateand malignant tumors：A therapeutic target at the end stage ofglycolysis.Saroj P.Mathupala，Chaim B.Colen，Prahlad Parajuli，Andrew E.Sloan(2007)J Bioenerg Biomembr 39：73-77；Lactate Metabolism in Patients withMetastatic Colorectal Cancer.Christopher P.Holroyde，Rita S.Axelrod，CharlesL.Skutches，Agnes C.Haff，Pavle Paul，and George A.Reichard.(1979)CancerResearch 39：4900-4904；Lactate，not pyruvate，is neuronal aerobic glycolysis endproduct：an in vitro electrophysiological study.A Schurr and R.S.Payne.(2007)Neuroscience 147：613-619；Tumor lactate content predicts for response tofractionated irradiation of human squamous cell carcinomas in nudemice.Verena Quennet，Ala Yarominab，Daniel Zipsb，Andrea Rosnerb，StefanWalentaa，Michael Baumannb，Wolfgang Mueller-Kliesera.(2006)Radiotherapy andOncology 81：130-135)。因此，在增高的乳酸盐浓度下比在正常生理乳酸盐浓度下活性更高的抗-EGFR抗体如本文所述修饰的抗-EGFR抗体，可用于治疗表达EGFR的肿瘤，同时使在非靶疾病细胞或组织中的活性最小化。
可以治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移瘤，以及难治肿瘤。难治肿瘤包括对单独的化疗剂、单独的抗体、单独的放疗或者组合治疗无反应或有抗性的肿瘤。难治肿瘤也涵盖呈现出被这种治疗抑制但是在5年内复发的肿瘤，有时在停止治疗后10年内复发。所述肿瘤可表达正常水平EGFR，或者其可以过表达EGFR，在正常水平的，例如，至少10、100或100倍表达。
表达EGFR及可由本文提供的修饰的抗-EGFR抗体及其片段治疗的肿瘤的实例包括癌瘤、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、腺癌、腺肉瘤和腺瘤。这种肿瘤可发生在几乎机体所有部分，包括例如乳腺、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、宫颈或肝脏。
可以由本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其片段治疗的肿瘤的实例是过表达EGFR的那些肿瘤。一些可以治疗的观测到过表达EGFR的肿瘤包括结肠直肠和头颈肿瘤(特别是头颈鳞状细胞癌)、脑瘤如神经胶质瘤以及肺、乳腺、胰腺、食管、膀胱、肾、卵巢、宫颈和前列腺的肿瘤。
可以由本文提供的抗-EGFR抗体及其抗体片段治疗的肿瘤的其它实例包括Kaposi’s肉瘤、CNS瘤、成神经细胞瘤、毛细管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移、黑素瘤、胃肠道和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(如多态性成胶质细胞瘤)及平滑肌肉瘤。可以表达EGFR的癌症例如包括但不限于淋巴瘤、胚细胞瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤和白血病或恶性淋巴瘤。这种癌症例如包括血液恶性肿瘤如Hodgkin’s淋巴瘤，非-Hodgkin’s淋巴瘤(Burkitt’s淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿、套细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、扩散性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多毛细胞性白血病和淋巴浆细胞性白血病)，淋巴细胞前体细胞肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤，及T细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤，胸腺瘤，成熟T和NK细胞肿瘤，包括周围T细胞白血病，成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤及大大颗粒淋巴细胞白血病，郎格汉斯组织细胞增生症，骨髓瘤如急性骨髓性白血病，包括成熟AML，不分化AML，急性早幼粒细胞白细胞病，急性骨髓单核细胞白血病，及急性单核细胞白血病，骨髓增生异常综合征，及慢性骨髓增生异常包括慢性髓细胞性白血病；中枢神经系统肿瘤如神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，室管膜瘤，及眼癌；实体瘤，如头颈癌(例如鼻咽癌，唾液腺癌和食管癌)，肺(例如小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和非鳞状细胞癌)，消化系统(例如胃癌，包括胃肠癌，胆管癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌及肛门癌瘤)，生殖系统(例如睾丸、阴茎或前列腺癌，子宫、阴道、外阴、宫颈、卵巢和子宫内膜癌)，皮肤(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光线性角化病)，肝脏(例如肝癌、肝癌瘤、肝细胞癌和肝细胞瘤(hepatoma))，骨(例如破骨细胞瘤和溶骨性骨癌)，其它组织和器官(例如胰腺癌，膀胱癌，肾癌，甲状腺癌，乳腺癌，腹膜癌及Kaposi’s肉瘤)，及脉管系统肿瘤(例如血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)。
b.非癌性过度增殖性疾病
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗体片段可用于治疗对象中非癌性过度增殖性疾病。EGFR是在G-蛋白质偶联的受体、细胞因子、受体酪氨酸激酶和整联蛋白对各种细胞应答如有丝分裂原激活的蛋白质激酶活化、基因转录和增殖发信号中一个关键途径元件。配体与EGFR结合可诱导细胞质酪氨酸残基的自主磷酸化，这样可起始细胞途径导致细胞增殖。过表达和/或过度刺激可以导致过度增殖。例如，EGFR vIII突变导致EGFR受体具有组成型激活的激酶功能，并刺激细胞增殖。本领域已知抗-EGFR抗体可治疗非癌性过度增殖性疾病。例如，Ménétrier’s病，一种罕见的癌前病变非癌性过度增殖性胃病，可以用西妥昔单抗治疗(Fiske et al.(2009)Sci Trasl.Med.1(8)：8ra18；Myers et al.(2012)Mol.Cell.Proteomics 11：10.1074/mcp.M111.015222，1-15)。
可以用本文提供的抗-EGFR抗体治疗的过度增殖性疾病包括例如可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的任何过度增殖性疾病，包括例如银屑病、日光性角化症及脂溢性角化病、疣、瘢痕疙瘩和湿疹。还包括由病毒感染导致的过度增殖性疾病，如乳头瘤病毒感染。不同类型的银屑病可展示不同特性，如脓样水疱(脓疱型银屑病)、重度皮肤脱落I(红皮病型银屑病)、水滴样斑点(滴状银屑病)和平滑发炎的损伤(反转型银屑病)。应理解银屑病的治疗包括治疗所有类型的银屑病(例如寻常型银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、关节型银屑病、副银屑病、掌跖脓疱病)。
c.自身免疫疾病或紊乱
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其片段可用于治疗自身免疫疾病或紊乱。可以用本文所述抗-EGFR抗体治疗的示例性的自身免疫疾病或紊乱包括但不限于同种异体胰岛移植排斥反应、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性Addison's病、抗中性粒细胞胞浆自身抗体(AN CA)、自身免疫性肾上腺病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性荨麻疹、Behcet's病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman's综合征、celiac spruce-皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病变、Churg-Strauss综合征、良性黏膜类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、Crohn's病、皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、因子VIII缺陷、纤维肌痛-纤维肌炎、血管球性肾炎、Grave’s病、Guillain-Barre、Goodpasture’s综合征、移植物抗宿主病(GVHD)、桥本氏甲状腺炎、血友病A、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、IgM多神经病、免疫介导的血小板减少症、幼年型关节炎、Kawasaki’s病、扁平苔藓、红斑狼疮、Meniere’s病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发血丙种球蛋白缺乏、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、Reynaud’s现象、Reiter’s综合征、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、综合征、实体器官移植排斥、全身肌强直综合征、全身性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓形成性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、脉管炎如疱疹样皮炎脉管炎、白癜风及Wegner’s肉芽肿病。
d.炎症性紊乱
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗体片段可用于治疗炎症性疾病或紊乱。可以用本文提供的修饰的抗-EGFR抗体治疗的炎症性疾病包括但不限于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性脓毒性关节炎、变态反应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变态反应性脉管炎、过敏反应、哮喘、动脉粥样硬化、由于慢性细菌或病毒感染所致慢性炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠状动脉疾病、脑炎、炎性肠病、炎性骨质溶解、与急性和迟发型超敏反应相关的炎症、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或神经脱髓鞘疾病、与组织创伤如烧伤和缺血相关的炎症、脑膜炎所致炎症、多器官损伤综合征、肺纤维化、脓毒性和感染性休克、Stevens-Johnson综合征、未分化的关节病，及未分化的脊椎关节病。
e.感染性疾病
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗体片段可用于治疗自身免疫疾病或紊乱。可以用本文所述抗-EGFR抗体治疗的感染性疾病包括但不限于由病原体所致疾病，如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生物。感染性疾病可以由病毒导致，包括：腺病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、Epstein-Barr病毒、hanta病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS病毒、天花和病毒性脑膜炎。感染性疾病也可以由细菌导致，包括：炭疽芽胞杆菌、伯氏疏螺旋体、空肠弯曲菌、沙眼衣原体、肉毒杆菌、破伤风梭菌、白喉杆菌、大肠杆菌、军团杆菌、幽门螺杆菌、分枝杆菌立克次体、支原体、奈瑟菌、百日咳杆菌、绿脓假单胞菌、肺炎链球菌、链球菌、葡萄球菌、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森菌。感染性疾病也可以由真菌导致，如烟曲霉菌、皮炎芽生菌、白色念珠菌、粗球孢子菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌。感染性疾病也可以由原生动物和寄生物导致，如衣原体、kokzidiose、利士曼原虫、疟疾、立克次体和锥体虫。
f.其它疾病和病症
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体及其抗体片段可用于治疗与EGFR表达相关和/或用现有抗-EGFR抗体如西妥昔单抗治疗的疾病和病症。可以用本文所述抗-EGFR抗体治疗的其它疾病和病症包括但不限于脏病症如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎及其它心肌病症；皮肤病症如酒糟鼻、痤疮和湿疹；骨和牙病症如骨质流失、骨质疏松症、Paget's病、Langerhans’组织细胞增多症、牙周病、废用性骨质疏松、骨软化、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性结构不良、骨转移、骨痛管理、体液恶性高钙血症、牙周重建、脊髓损伤及骨折；代谢性病症如Gaucher's病；内分泌病症如Cushing's综合征；以及神经病变。
2.治疗对象
用本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗的对象或候选者包括但不限于患有可以通过施用抗-EGFR抗体治疗的疾病或病症(如本文所述或本领域已知的疾病或病症)的对象如人。
a.过表达EGFR的对象的选择
在一些实例中，检查治疗对象或候选者的阳性EGFR表达迹象，使用本领域已知的方法如在膜和总匀浆上的Western印迹(WB)及在组织微阵列上的免疫组织化学测定(IHC)。此外，磷酸化的EGFR(pEGFR)可以通过在膜上Western印迹而测量(见例如Thariat et al.(2012)Clin.Cancer Res.18：1313)。EGFR评估可以使用例如EGFR PHARMDX评分指导(Dako，Glostrup，Denmark)评估。EGFR表达可以在包含最深的肿瘤侵润区的切片上评估，其可含有最大密度的EGFR-阳性细胞。这种方法为本领域技术人员已知(见例如Ervin-Haynes etal.(2006)J.Clin.Oncol.ASCO Annual Meeting Proceedings Part I.Vol.24，No.18S(June 20 Supplement)13000；Goldstein and Armin(2001)Cancer 92(5)：1331-1346；Bibeau et al.(2006)Virchows Arch.449(3)：281-287)。
b.呈现EGFR相关的多态性的对象的选择
在一些实例中，根据一或多个多态性筛选治疗对象或候选者，以预测本文提供的抗-EGFR抗体的效力。可以与本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的EGFR抗体相互作用的许多受体在人群中是多态性的。对于指定的患者或患者群，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体的效力可以受蛋白质中特定多态性存在与否的影响。例如，FcγRIIIa在位置158是多态性的，其通常是V(高亲和性)或F(低亲和性)。具有V/V纯合基因型的患者发起较强的天然杀伤(NK)应答，及观测到对抗-CD20抗体(利妥昔单抗)治疗具有更好的临床应答(Dall'Ozzoet.al.(2004)Cancer Res.64：4664-4669)。另外的多态性包括但不限于FcγRIIa R131或H131，已知这种多态性增加或降低Fc结合及随后的生物学活性，根据所述多态性而定。
在一些实例中，针对一或多个多态性筛选治疗对象或候选者，以预测本文提供的抗-EGFR抗体的效力。这种方法为本领域技术人员已知。这个信息可用于例如选择患者包含在临床试验中或除外，或者在同意后给医生和患者提供关于合适的剂量和治疗观点的指导。例如，在FcγRIIIa 158F纯合或杂合的患者中，抗体药物如抗-CD20mAb Rituximab可具有降低的效力(Carton 2002 Blood 99：754-758；Weng 2003 J.Clin.Oncol.21：3940-3947)；这种患者可示出对本文提供的修饰的抗-EGFR抗体更好的临床反应。
c.鉴定呈现出抗-EGFR-相关副作用的对象
在一些实例中，用本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗的对象或候选者包括但不限于已经经历由施用本领域已知的抗-EGFR抗体如任何抗-EGFR抗体造成的一或多种副作用的对象如人。给对象施用本文提供的抗-EGFR代替导致副作用的抗-EGFR抗体治疗可以导致对应的或改良的治疗效力，同时降低或减轻副作用。因此，在这种方法中，鉴定已经施用抗-EGFR抗体治疗而不是本文提供的抗-EGFR抗体、且呈现出与施用所述治疗剂相关的一或多个症状或副作用的对象。然后给所鉴定的患者施用本文提供的抗-EGFR抗体，并持续治疗。本文提供的抗-EGFR的剂量方案，包括剂量和频率与先前的抗-EGFR抗体治疗可以相同或不同。在一些情况中，所述剂量可以增加或降低。主治医生基于如下因素可以确定剂量方案，所述因素如治疗的特定对象、疾病或病症的性质、现有症状或副作用的性质及施用的本文提供的特定修饰的抗-EGFR抗体。
如本文别处所述，EGFR在许多正常人体组织中表达(Lacouture，and Melosky(2007)Skin TherapyLett.12，1-5)。因此，施用许多治疗性抗-EGFR抗体如西妥昔单抗可导致不希望的反应。这种副作用为本领域技术人员熟知，及可以评估或鉴定。鉴定由抗-EGFR抗体治疗导致的副作用的方法包括本文所述任何方法，如患者采访、患者体检和血液检查。可以评估的副作用包括本领域技术人员已知的与施用抗-EGFR抗体相关的任何副作用，包括本文所述任何副作用，如与施用西妥昔单抗相关的副作用。
例如，西妥昔单抗的副作用包括本文所述和/或本领域技术人员已知的任何副作用，包括有症状的低镁血症、甲沟炎、发热、皮肤病学毒性、面部和躯干上部的丘疹脓疱型皮疹、毛发生长异常、脱发、增加的面部毛发和睫毛的生长、皮肤干痒及触痛的甲周炎症(Eng(2009)Nat.Rev.6：207-218；Schrag et al.(2005)J.Natl.Cancer Inst.97(16)：1221-1224；Lacouture and Melosky(2007)Skin TherapyLett.12：1-5)。在一些实例中，西妥昔单抗的副作用包括皮肤病学毒性，包括丘疹脓疱性皮疹、皮肤干燥、瘙痒、视力和指甲改变、痤疮样皮肤反应、痤疮样皮疹、痤疮样囊性皮疹、痤疮样皮疹、斑丘疹、单形性脓疱性皮损、丘疹脓疱性反应(Lacouture and Melosky(2007)Skin Therapy Lett.12：1-5)。所述副作用可以通过外部事件触发和/或随时发生。例如，皮疹可以由日光暴露而触发及可发生如知觉障碍、红斑和水肿(例如1周)；丘疹脓疱性皮疹(例如2周)；及脱屑(crusting)(例如4周)等状况。如果皮疹得以成功治疗，在先前受丘疹脓疱性皮疹影响的区域可见红斑和干性皮肤(例如4-6周)。与施用抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相关的其它皮肤病学毒性包括瘙痒、红斑和甲沟炎(Lacouture，and Melosky(2007)Skin Therapy Lett.12，1-5)。例如，西妥昔单抗或大约5％的患者中激发免疫应答。这种免疫应答可导致免疫复合物介导的抗体或片段从循环中清除，产生不适于治疗的重复施用，从而降低对患者的治疗效果及限制了所述抗体的再次施用。
在一些实例中，副作用的严重性可以根据国家癌症研究所用于不良事件的普通标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE)v4.0评估，其描述了对副作用分级的标准。CTCAE包括1-5级，描述了每个不良作用的严重性的唯一临床描述。在CTCAE的一般指导下，1级不利事件是轻度的、无临床症状的或者轻度症状，仅可临床或诊断观测；及未表示干预。2级不利事件是中等的，表示需要最小的局部或非侵入性干预，限制适龄的有益的日常生活活动(ADL)。3级不利事件是重度或医学显著的但不立即致命的事件，表示要住院或延长住院，致残和限制自理ADL。4级不利事件是致命结果，表示紧急干预。5级不利事件分类为不利事件导致的死亡。因此，例如在经鉴定具有特定级别副作用的对象中施用抗-EGFR抗体可导致副作用降低，这通过在CTCAE v4.0下分类的副作用的级别降低而鉴定。在一些实例中，副作用的降低通过与副作用相关的症状的严重性降低而鉴定，包括本文所述或本领域技术人员已知的任何症状。
鉴定呈现出抗-EGFR抗体副作用的患者的其它方法为本领域技术人员已知，包括生活质量调查(例如Jonker et al.(2007)N.Engl.J.Med.357：2040-2048)。抗-EGFR抗体的副作用及本领域技术人员已知的鉴定副作用严重度的方法在下文描述。这些副作用只是举例而无限制之意。应理解本领域已知的或本文所述与施用抗-EGFR抗体如西妥昔单抗相关的任何副作用可以在对象中鉴定，从而随后可以用本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体治疗所述对象，由此这种副作用不再进一步恶化和/或被降低。
i.皮肤毒性
在人体皮肤中，EGFR在基底角化细胞中表达并可刺激表皮生长、抑制分化及促进伤口愈合(Lacouture，and Melosky(2007)Skin Therapy Lett.12：1-5；Nanney et al.(1996)J.Invest.Dermatol 94(6)：742-748)。EGFR功能的抑制可削弱角化细胞的生长和迁移，导致炎症性趋化因子表达。这些作用可导致炎症细胞募集及随后皮肤损伤，这样可导致副作用如本文所述副作用。皮肤基底层环境的pH是中性的(例如pH 7.0-7.2或大约pH 7.0-7.2)。因此，本文提供的在低pH比在中性pH具有增加的活性的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可具有降低的皮肤毒性和降低的副作用。得自皮肤中EGFR抑制的副作用实例及对其进行鉴定和分类的方法在下文描述。
丘疹脓疱性皮疹和痤疮样皮疹是通过由丘疹(小的凸起的丘疹)和脓疱(小的脓性水疱)组成的皮疹而鉴定，典型出现于面部、头皮和上胸部和背部。与痤疮不同，丘疹脓疱性皮疹不存在白头或黑头，可以是全身性的，痒或触痛(CTCAE v.4.03，U.S.Department ofHealth and Human Services，2010年6月14日发表)。丘疹脓疱性皮疹和痤疮样皮疹可以通过患者体检和/或通过临床采访而鉴定和分类。1级丘疹脓疱性皮疹或痤疮样皮疹分类为丘疹和/或脓疱覆盖＜10％身体表面积(BSA)，这可以与瘙痒或触痛症状相关。2级丘疹脓疱性皮疹或痤疮样皮疹分类为丘疹和/或脓疱覆盖10-30％BSA，这可以与瘙痒或触痛症状相关、与社会心理学影响相关、限制有益的日常生活活动(ADL)。3级丘疹脓疱性皮疹或痤疮样皮疹分类为丘疹和/或脓疱覆盖＞30％BSA，这可以瘙痒或触痛症状相关、限制自理ADL，及可以与局部重复感染相关，需要口服抗生素。4级丘疹脓疱性皮疹或痤疮样皮疹分类为丘疹和/或脓疱覆盖任何百分比的BSA，与瘙痒或触痛症状相关，与广泛的重复感染相关，需要静脉内注射抗生素，及有致命的结果。5级丘疹脓疱性皮疹或痤疮样皮疹分类为导致死亡(CTCAE v.4.03，U.S.Department of Health and Human Services，2010年6月14日发表；Schrag J.Natl.Cancer.Inst.97(16)：1221-1224)。
抗-EGFR抗体如西妥昔单抗的副作用例如是干性皮肤，特征为皮肤薄且无光泽、毛孔细小及纸样薄的皮肤肌理。干性皮肤可以通过患者体检和/或通过临床采访而鉴定和分类。1级干性皮肤分类为覆盖＜10％BSA，无相关的红斑或瘙痒。2级干性皮肤分类为覆盖10％-30％BSA，与红斑或瘙痒相关及限制有益的ADL。3级干性皮肤分类为覆盖＞30％BSA，与瘙痒和限制性自理ADL相关(CTCAE v.4.03，U.S.Department of Health and HumanServices，published June 14，2010；Schrag J.Natl.Cancer.Inst.97(16)：1221-1224)。
皮肤色素沉着是特征在于由于黑色素过度沉积所致皮肤发黑的副作用。皮肤色素沉着可以通过患者体检和/或通过临床采访而鉴定和分类。1级皮肤色素沉着分类为色素沉着覆盖＜10％BSA，无社会心理学影响。2级皮肤色素沉着分类为色素沉着覆盖＞10％BSA，与社会心理学影响相关(CTCAE v.4.03，U.S.Department of Health and HumanServices，2010年6月14日发表；Schrag J.Natl.Cancer.Inst.97(16)：1221-1224)。
瘙痒是特征在于强烈的痒觉的副作用。瘙痒可以通过患者体检和/或临床采访而评估。1级瘙痒分类为轻度或局部瘙痒，需要局部干预。2级瘙痒的症状包括强烈的或广泛的瘙痒、间歇的瘙痒、皮肤抓痕改变(例如水肿、丘疹形成、抓痕、苔藓样硬化、渗出/结痂)、限制性有益的ADL，需要口服药物干预。3级瘙痒的症状包括强烈的、广泛的和/或持久的瘙痒、限制性自理ADL或睡眠，需要口服皮质类固醇药物或免疫抑制剂治疗(CTCAE v.4.03，U.S.Department of Health and Human Services，2010年6月14日发表；SchragJ.Natl.Cancer.Inst.97(16)：1221-1224)。
甲沟炎是特征在于包括指甲周围软组织的感染性过程。甲沟炎可以通过患者体检和/或临床采访评估。1级甲沟炎分类为包括甲襞水肿或红斑及甲上皮破坏的症状。2级甲沟炎的症状可包括需要局部干预、口服药物干预(例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂)的甲襞水肿或疼痛红斑、脱甲(discharge)或甲板分离及限制性有益的ADL。3级甲沟炎的症状可包括限制性自理ADL，需要手术干预或静脉内注射抗生素。
ii.低镁血症
EGFR在肾脏中高度表达，特别是在髓袢的升支，在此70％的过滤的镁被重吸收。因此，与EGFR相互作用的抗体可干扰镁转运。低镁血症，即血液中镁的浓度降低，可以是施用抗-EGFR抗体的一个副作用。在一项研究中，接受西妥昔单抗治疗的5％的患者呈现出3级或4级低镁血症。
髓袢具有中性pH(例如pH 6.9-7.4)(Dieleman et al.(2001)J.Acquir ImmuneDefic Syndr.28(1)：9-13；Dantzler et al.(2000)Pflugers Arch.440(1)：140-148.)。因此，在低pH下比在中性pH下更具活性的本文提供的修饰的抗-EGFR抗体可减少低镁血症。
低镁血症可以通过测量血清镁水平而诊断和/或评估。例如，CTCAE分类I级低镁血症为血清镁浓度＜正常底限(LLN)，即1.2mg/dL；2级低镁血症的血清镁浓度为1.2-0.9mg/dL；3级低镁血症的血清镁浓度＜0.9-0.7mg/dL；4级低镁血症的血清镁浓度＜0.7mg/dL，及可以伴随致命结果；5级低镁血症导致死亡。此外，低镁血症的症状为本领域技术人员已知，包括乏力、感觉异常和血钙过低(CTCAE v.4.03，U.S.Department of Health and HumanServices，2010年6月14日发表；Schrag J.Natl.Cancer.Inst.97(16)：1221-1224)。
d.选择或鉴定治疗对象的其它方法
本发明也涵盖筛选治疗候选者的其它方法。例如，最近已经公开了Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)突变状态可以预测结肠直肠癌中西妥昔单抗治疗反应(VanCutsem et al.(2008)J.Clin.Oncol 26(May 20suppl)：Abstract 2)。KRAS是GTPase，在许多信号转导途径中起作用。在25％以上的结肠直肠癌中存在的编码KRAS的基因中的突变，可预测EGFR-抑制药物的成功。突变的KRAS基因的表达导致对EGFR抑制剂治疗的应答降低。KRAS突变可以通过可商购的实验室诊断剂检测。
3.剂量
在本文提供的方法中，可以施用治疗有效量的抗-EGFR抗体或抗体片段。这种剂量可以由本领域技术人员如主治医生根据经验确定。在一些实例中，对于特定疾病或病症，施用的剂量基于参考已知抗-EGFR抗体如西妥昔单抗的剂量。本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的治疗有效量可以根据经验确定，通过在已知的体外和体内系统中检测抗-EGFR抗体，如通过使用本文提供的或本领域已知的测定进行。
治疗性施用的抗-EGFR抗体的有效量依赖于例如治疗目标、施用途径和患者的状况。此外，主治医生可考虑已知改变药物作用的个作用因素，包括疾病的严重度和类型、患者的健康状况、体重、性别、饮食、施用时间和途径、其它药物及其它相关临床因素。此外，治疗专家可考虑副作用如本文所述或本领域已知的副作用的发生和严重度。因此，治疗专家可滴定抗体或其抗原结合片段的剂量并根据需要改变施用途径，以获得最佳治疗作用及最小化不希望的副作用。临床医生可施用所述抗体直至达到实现希望的作用的剂量。这种治疗的行进可以通过本文所述或本领域已知的常规测定监测。所述修饰的抗-EGFR抗体的剂量可以改变以鉴定实现活性同时降低或消除副作用的最佳或最小剂量。
通常地，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体的施用剂量范围是足够大范围以产生希望的治疗作用，其中应答用抗-EGFR抗体治疗的病症症状减轻。通常地，所述剂量可以随着患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，可以由本领域技术人员确定。在一些实例中，所述剂量不是大到导致不良副作用。所述剂量可以由各个医生在不良副作用出现时调整。示例性的剂量包括但不限于0.1mg/kg或大约0.1mg/kg-100mg/kg或大约100mg/kg，例如至少大约或大约0.1mg/kg，大约或为0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg.kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg或更高。在一些实例中，示例性的剂量包括但不限于0.01mg/m2或大约0.01mg/m2-800mg/m2或大约800mg/m2，例如至少大约或大约或为0.01mg/m2，大约或为0.1mg/m2、0.5mg/m2、1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2、35mg/m2、40mg/m2、45mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2及700mg/m2。应理解本领域技术人员可识别并在单位mg/kg与mg/m2之间转变剂量(见例如Michael J.Derelanko，TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK，CRC Press，p.16(2000))。
为了治疗疾病或病症，所述抗-EGFR抗体的剂量可以根据疾病的类型和严重度变化。所述抗-EGFR抗体可以在单次施用、多次单独施用或者持续注入形式施用。对于在几天或更长时间的重复施用，根据具体状况，可以重复治疗直至发生希望的疾病症状抑制或者实现患者病症希望的改善。重复施用可包括根据治疗进展而增加或降低量的抗-EGFR抗体。例如，初始剂量可以大于维持剂量。在一些实例中，初始剂量为400mg/m2，维持剂量为250mg/m2。
本发明也涵盖其它剂量方案。例如，剂量方案可以变化。与降低的副作用相关的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以较高剂量应用。此外，在疾病组织中具有增加的活性的抗-EGFR抗体可以较低剂量使用。确定本文所述抗-EGFR抗体包括修饰的抗-EGFR抗体的活性的方法为本领域技术人员已知，示例性的方法在本文描述。此外，剂量方案可以根据经验确定。本发明的抗-EGFR抗体的最佳量和每次施用的间隔时间根据治疗的病症的性质和程度、施用形式、途径和部位及治疗的特定患者的年龄和状况而定，医生可以确定使用的合适剂量。这个剂量可以适当重复。如果发生副作用，根据正常的临床实践可以改变或降低所述剂量的量和/或施用频率。这种研究在本领域技术人员水平内。
在一些实例中，所述抗-EGFR抗体每天或几天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体相继施用两或多次，其中每次施用间隔选择的时间。在一些实例中，选择的时间是至少或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。
在施用一或多次抗-EGFR抗体之后，也可以测定特定剂量或剂量方案的副作用，例如通过本文所述或本领域已知的任何方法进行。剂量和/或施用频率可以根据副作用的类型和严重度而修改。
正如本领域技术人员所理解，最佳治疗方案是变化的，且评估在治疗下的疾病状态及在施用一或多次治疗之前和之后患者的一般状况，以确定最佳治疗方案和施用频率在治疗方法的范围内。应进一步理解对于任何特定的对象，可以根据个体需要及施用或监管药物配制物施用的人员的专业判断随时调节具体的剂量方案，本文所述的剂量只是举例而无限制其范围之意。治疗如本文所述疾病或病症而施用的抗-EGFR抗体的量可以通过本文所述或本领域已知的标准临床技术确定。此外，可应用体外测定和动物模型以帮助鉴定最佳剂量范围。这种测定可提供据推断可给对象施用如人的剂量范围。基于动物模型鉴定最佳剂量范围的方法为本领域技术人员熟知，并在本文例证。
4.施用途径
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以通过本领域已知的施用多肽的任何方法给对象施用，包括例如全身性或局部施用。所述抗-EGFR抗体可以通过如胃肠外(例如皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下或腔内)、外敷、硬脑膜外或粘膜(例如鼻内、口腔、阴道、外阴、食管、口腔食管、支气管或肺)等途径施用。所述抗-EGFR抗体可以在外部给对象施用，在疾病部位通过局部或经皮吸收起作用。含有抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过注入或推注、通过上皮或粘膜皮肤内层吸收(例如口腔粘膜、阴道、直肠和肠粘膜)施用。含有抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的组合物可以与其它生物学活性剂一起施用。在特别的实例中，所述抗-EGFR抗体可以通过注入如通过注入泵或注射泵施用，及可以与另一治疗剂组合施用或者作为单一治疗施用。
所述施用方法和/或途径可以改变以减轻与施用本文提供的抗-EGFR抗体相关的副作用。例如，如果患者经历轻度或中度(即1或2级)注入反应，则可以降低注入速度(例如降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。如果患者经历严重(即3或4级)注入反应，则可以暂时或永久停止所述注入。
在一些实例中，如果对象经历不良副作用如严重皮肤毒性，例如重度痤疮样皮疹，可以调整治疗。例如，在不良副作用发生后，可以延迟施用，如延迟1或2周或者直至不良的副作用得以改善。在一些实例中，在再次发生不良副作用后，可以降低剂量。例如，如果剂量是250mg/m2，在第二次发生不良副作用之后，可以延迟1-2周施用所述抗-EGFR抗体。如果副作用改善，可继续施用所述抗-EGFR抗体，剂量降低至250mg/m2。在第三次发生副作用之后，可以延迟1-2周施用所述抗-EGFR抗体。如果副作用改善，可以继续施用抗-EGFR抗体，剂量降低至150mg/m2。在发生几次不良副作用之后，可以停止施用所述抗-EGFR抗体。在具有轻度或中度皮肤毒性的患者中，技术人员可以继续施用所述抗体而不用剂量改变。这种决定在本领域技术人员能力范围内。
本领域技术人员基于所述抗-EGFR抗体或者包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物的剂量性质，可以选择合适的输送方法。这种性质包括但不限于溶解性、吸湿性、结晶性质、熔点、密度、粘性、流动性、稳定性和降解性质。
5.组合治疗
在本文提供的方法中，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以在施用一或多种其它治疗方案或治疗剂之前、之后或同时施用。专业医生可以根据经验或者通过考虑所述治疗剂的药动学和作用模式、每个治疗方案或治疗剂的合适剂量以及合适的施用时间和施用方法而确定。另外的治疗方案或治疗剂可改善所述抗-EGFR抗体的效力或安全性。在一些实例中，所述另外的治疗方案或治疗剂可治疗相同疾病或共病而不改变所述抗-EGFR抗体的作用。在一些实例中，所述另外的治疗方案或药剂可减轻、降低或消除本领域已知或本文所述的与施用抗-EGFR抗体相关的一或多种副作用。
例如，本文所述的抗-EGFR抗体可以与化疗、放疗或者这二者一起施用。所述修饰的抗-EGFR抗体可以组合一或多种其它预防剂或治疗剂施用，包括但不限于抗体、细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素制剂、激酶抑制剂、抗血管发生制剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞增殖制剂、血管发生抑制剂、蛋白酶酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、另外的抗-EGFR抗体、FcγRIIb或其它Fc受体抑制剂，或者其它治疗剂。
所述一或多种另外的药剂可以与抗-EGFR抗体同时、相继或间歇施用。所述药剂可以与抗-EGFR抗体共施用，例如作为同一药物组合物或相同输送方法的一部分。在一些实例中，所述药剂可以与抗-EGFR抗体在与修饰的抗-EGFR抗体同时共施用，但是以不同的输送方式施用。所述药剂也可以在与施用抗-EGFR抗体不同的时间施用，但是与施用抗-EGFR抗体的时间足够接近以具有组合的预防或治疗效力。在一些实例中，一或多种另外的药剂在施用抗-EGFR抗体随后或之前施用，间隔选择的时间点。在一些实例中，所述间隔时间为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月。在一些实例中，所述一或多种药剂是多次施用的，和/或本文提供的抗-EGFR抗体是多次施用的。
在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种抗体或抗体片段一起施用。所述抗-EGFR抗体可以与在治疗同一疾病或另外的共病中有效的一或多种抗体一起施用。例如，与所述抗-EGFR抗体一起施用的一或多种抗体可以选自抗癌抗体、治疗自身免疫或炎症性疾病的抗体、治疗移植排斥的抗体、治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)的抗体及治疗感染性疾病的抗体。在一些实例中，两或多种本文提供的抗-EGFR抗体组合施用。
可以与本文提供的抗-EGFR抗体共施用的抗癌抗体例如包括但不限于17-IA细胞表面抗原抗体，如(依决洛单抗)；抗-4-1BB抗体；抗-4Dc抗体；抗-A33抗体如A33和CDP-833；抗-α1整联蛋白抗体如那他珠单抗；抗-α4β7整联蛋白抗体如LDP-02；抗-αVβ1整联蛋白抗体如F-200、M-200和SJ-749；抗-αVβ3整联蛋白抗体如阿普单抗、CNTO-95、Mab-17E6和抗-补体因子5(C5)抗体如5G1.1；抗-CA125抗体如(奥戈伏单抗)；抗-CD3抗体如(visilizumab)和Rexomab；抗-CD4抗体如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗-CD6抗体如Oncolysin B和Oncolysin CD6；抗-CD7抗体如HB2；抗-CD19抗体如B43、MT-103和Oncolysin B；抗-CD20抗体如2H7、2H7.v16、2H7.v114、2H7.v115、(托西莫单抗)、(利妥昔单抗)及(替伊莫单抗)；抗-CD22抗体如(依帕珠单抗)；抗-CD23抗体如IDEC-152；抗-CD25抗体如巴利昔单抗和(达利珠单抗)；抗-CD30抗体如AC10、MDX-060和SGN-30；抗-CD33抗体如(吉妥单抗)、Oncolysin M和Smart M1 95；抗-CD38抗体；抗-CD40抗体如SGN-40和toralizumab；抗-CD40L抗体如5c8、及IDEC-131；抗-CD44抗体如bivatuzumab；抗-CD46抗体；抗-CD52抗体如(阿伦单抗)；抗-CD55抗体如SC-1；抗-CD56抗体如huN901-DM1；抗-CD64抗体如MDX-33；抗-CD66e抗体如XR-303；抗-CD74抗体如IMMU-1 10；抗-CD80抗体如galiximab和IDEC-1 14；抗-CD89抗体如MDX-214；抗-CD123抗体；抗-CD138抗体如B-B4-DM1；抗-CD146抗体如AA-98；抗-CD148抗体；抗-CEA抗体如cT84.66、labetuzumab和抗-CTLA-4抗体如MDX-101；抗-CXCR4抗体；抗-EGFR抗体如ABX-EGF、(西妥昔单抗)、IMC-C225和Merck Mab 425；抗-EpCAM抗体如Crucell's抗-EpCAM、ING-1和IS-IL-2；抗-麻黄碱B2/EphB4抗体；抗-Her2抗体如)、MDX-210；抗-FAP(成纤维细胞活化蛋白)抗体如sibrotuzumab；抗-铁蛋白抗体如NXT-211；抗-FGF-1抗体；抗-FGF-3抗体；抗-FGF-8抗体；抗-FGFR抗体，抗-纤维蛋白抗体；抗-G250抗体如WX-G250和抗-GD2神经节苷脂抗体如EMD-273063和TriGem；抗-GD3神经节苷脂抗体如BEC2、KW-2871和mitumomab；抗-gpIIb/IIIa抗体如ReoPro；抗-肝素酶抗体；抗-Her2/ErbB2抗体如(曲妥单抗)、MDX-210和帕妥珠单抗；抗-HLA抗体如Smart 1D10；抗-HM1.24抗体；抗-ICAM抗体如ICM3；抗-IgA受体抗体；抗-IGF-1抗体如CP-751871和EM-164；抗-IGF-1R抗体如IMC-A12；抗-IL-6抗体如CNTO-328和elsilimomab；抗-IL-15抗体如抗-KDR抗体；抗-层黏蛋白5抗体；抗-Lewis Y抗原抗体如Hu3S193和IGN-311；抗-MCAM抗体；抗-Muc1抗体如BravaRex和TriAb；抗-NCAM抗体如ERIC-1和ICRT；抗-PEM抗原抗体如Theragyn和Therex；抗-PSA抗体；抗-PSCA抗体如IG8；抗-Ptk抗体；抗-PTN抗体；抗-RANKL抗体如AMG-162；抗-RLIP76抗体；抗-SK-1抗原抗体如Monopharm C；抗-STEAP抗体；抗-TAG72抗体如CC49-SCA和MDX-220；抗-TGF-β抗体如CAT-152；抗-TNF-o抗体如CDP571、CDP870、D2E7、(阿达木单抗)及(英利昔单抗)；抗-TRAIL-R1和TRAIL-R2抗体；抗-VE-钙黏蛋白-2抗体；及抗-VLA-4抗体如此外，可以使用抗独特型抗体，包括但不限于GD3表位抗体BEC2和gp72表位抗体105AD7。此外，可以使用双特异性抗体，包括但不限于抗-CD3/CD20抗体Bi20。
可以与本文提供修饰的抗-EGFR抗体共施用的可以治疗自身免疫或炎症性疾病、移植物排斥、GVHD的抗体例如包括但不限于抗-α4β7整联蛋白抗体如LDP-02、抗-β2整联蛋白抗体如LDP-01、抗-补体(C5)抗体如5G1.1、抗-CD2抗体如BTI-322、MEDI-507、抗-CD3抗体如OKT3、SMART抗-CD3、抗-CD4抗体如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A、抗-CD11a抗体、抗-CD14抗体如IC14、抗-CD18抗体、抗-CD23抗体如IDEC 152、抗-CD25抗体如赛尼哌、抗-CD40L抗体如5c8、Antova、IDEC-131、抗-CD64抗体如MDX-33、抗-CD80抗体如IDEC-114、抗-CD147抗体如ABX-CBL、抗-E-选择素抗体如CDP850、抗-gpIIb/IIIa抗体如/Abcixima、抗-ICAM-3抗体如ICM3、抗-ICE抗体如VX-740、抗-FcγR1抗体如MDX-33、抗-IgE抗体如rhuMab-E25、抗-IL-4抗体如SB-240683、抗-IL-5抗体如SB-240563、SCH55700、抗-IL-8抗体如ABX-IL8、抗-干扰素γ抗体、及抗-TNFa抗体如CDP571、CDP870、D2E7、英利昔单抗、MAK-195F、抗-VLA-4抗体如Antegren。可以共施用以治疗自身免疫或炎症性疾病、移植物排斥和GVHD的其它含有Fc分子例如包括但不限于p75TNF受体/Fc融合蛋白(依那西普)和Regeneron's IL-1 trap。
可以共施用的治疗感染性疾病的抗体例如包括但不限于抗-炭疽抗体如ABthrax、抗-CMV抗体如CytoGam和斯韦单抗、抗-隐孢子虫抗体如CryptoGAM、Sporidin-G、抗-螺杆菌抗体如Pyloran、抗-乙型肝炎抗体如HepeX-B、Nabi-HB、抗-HIV抗体如HRG-214、抗-RSV抗体如felvizumab、HNK-20、帕丽珠单抗、RespiGam及抗-葡萄球菌抗体如Aurexis、Aurograb、BSYX-A110和SE-Mab。
在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与竞争结合一或多种Fc受体的一或多种分子一起施用。例如，共施用抑制性受体FcγRIIb的抑制剂可导致效应子功能增加。相似地，共施用激活受体的抑制剂如FcγRIIIa可使不希望的效应子功能最小化。Fc受体抑制剂包括但不限于被工程化为作为结合FcγRIIb、FcγRIIIa或者其它Fc受体，以及其它免疫球蛋白和称作IVIg(静脉内注射的免疫球蛋白)的特别处理的竞争性抑制剂的Fc分子。在一个实施方案中，施用所述抑制剂，使其在施用抗-EGFR抗体之前起作用。另一种实现相继给药作用的方式是提供立即释放剂型的Fc受体抑制剂，及然后持续释放配制的抗-EGFR抗体。立即释放和控制释放配制物可以单独施用或者组合仅一个单位剂量形式中。
在一些实例中，本文所述的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种化疗剂一起施用。示例性的化疗剂包括但不限于烷化剂如噻替派和环磷酰胺烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；抗-雄激素如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮脯利特和戈舍瑞林；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡里奇霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、培洛霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗雌激素包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抗-代谢物如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；氮杂环丙烷如苄替哌、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；叶酸补充物如亚叶酸；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(氮芥)、盐酸甲氧氮芥、苯丙酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲如亚硝基脲氮芥、氯脲霉素、福莫司汀、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷莫司汀；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；蛋白质如精氨酸脱亚胺酶和天冬酰胺酶；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫醚嘌呤、硫鸟氨酸；嘧啶类似物如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧鸟苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；紫杉烷例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology、Princeton、N.J.)和多西他奇Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、胸苷酸合成酶抑制剂(如雷替曲塞)、另外的化疗剂包括醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、安吖啶、bestrabucil、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、地美可辛、亚丝醌、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、依氟鸟氨酸、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、蘑菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝基可润、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、足叶草酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、雷佐生、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三乙撑亚胺苯醌、2，2’，2″-三氯三乙胺、氨基甲酸乙酯、长春花碱酰胺、氮烯唑胺、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷(″Ara-C”)、环磷酰胺、噻替派、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氨甲喋呤、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、长春瑞滨、米托蒽醌、替尼泊苷、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达、伊班膦酸钠、CPT-11、维甲酸、esperamycin、卡培他滨、及拓扑异构酶抑制剂如伊立替康。也可以使用上述任何药物的药物可接受的盐、酸或其衍生物。在一些实例中，本文提供的修饰的抗-EGFR抗体与伊立替康一起施用(见例如Pfeiffer et al.(2007)Acta.Oncol.46(5)：697-701)。
化疗剂可以作为前药施用。可以与本文所述抗-EGFR抗体一起施用的前药例如包括但不限于含有磷酸盐的前药，含有硫代磷酸酯的前药，含有硫酸盐的前药，含有肽的前药，D-氨基酸修饰的前药，糖基化前药，含有β-内酰胺的前药，含有任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或者含有任选取代的苯基乙酰胺的前药，5-氟胞嘧啶及其它5-氟尿嘧啶前药，其可转变为更活性的无细胞毒性药物。
在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种抗血管发生剂一起施用。例如，所述抗血管发生因子可以是小分子或蛋白质(例如抗体，Fc融合体或细胞因子)，其结合参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体。示例性的抗血管发生剂包括但不限于结合血管内皮生长因子(VEGF)或者结合VEGF-R的抗体、降低VEGF或VEGF-R表达水平的基于RNA的治疗剂、VEGF-毒素融合体、Regeneron's VEGF-trap、血管生成抑制素(血纤维蛋白溶酶原片段)、抗凝血酶III、核酶、ABT-627、Bay 12-9566、BeneFin、贝伐单抗、二膦酸盐、BMS-275291、软骨产生的抑制剂(CDI)、CAI、CD59补体片段、CEP-7055、Col 3、康普瑞汀、内皮抑素(胶原蛋白XVIII片段)、法尼基转移酶抑制剂、纤连蛋白片段、gro-beta、常山酮、肝素酶、肝素六糖片段、HMV833、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、IM-862、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素可诱导的蛋白质10(IP-10)、白细胞介素-12、kringle 5(血纤维蛋白溶酶原片段)、马马司他、金属蛋白酶抑制剂(例如TIMPs)、2-甲氧基雌二醇、MMI 270(CGS 27023A)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)、血小板因子-4(PF4)、普马司他、催乳素16kDa片段、增殖蛋白相关蛋白(PRP)、PTK 787/ZK 222594、类视黄醇、solimastat、角鲨胺、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、四氢皮质醇-S、四硫钼酸盐、酞胺哌啶酮、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、TNP470、转化生长因子β(TGF-β)、血管抑制素、血管形成抑制素(钙网蛋白片段)、ZS6126和ZD6474.
在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与以或多种酪氨酸激酶抑制剂一起施用。示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于喹唑啉类如PD 153035、4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶如CGP 59326、CGP 60261和CGP62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯(2，3-d)嘧啶；姜黄色素(二阿魏酰甲烷、4，5-二(4-氟苯胺基)笨邻二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制剂；PD-0183805(Warner-Lambert)；反义分子(例如结合编码ErbB-核酸的那些分子)；喹喔啉(美国专利No.5,804,396)；酪氨酸磷酸化抑制剂(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering A G)；pan-ErbB抑制剂如C1-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼(STI571，Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；C1-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering A G)；INC-1 C11(Imclone)；或者在如下专利公开中所述：U.S.Pat.No.5,804,396；PCT WO99/09016(American Cyanimid)；PCTWO 98/43960(American Cyanamid)；PCT WO 97/38983(Warner-Lambert)；PCT WO 99/06378(Warner-Lambert)；PCT WO 99/06396(Warner-Lambert)；PCT WO 96/30347(Pfizer，Inc)；PCT WO 96/33978(AstraZeneca)；PCT WO 96/33979(AstraZeneca)；PCT WO96/33980(AstraZeneca)，gefitinib(ZD 1839，AstraZeneca)及OSI-774(OSIPharmaceuticals/Genentech)。
在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种免疫调节剂一起施用。这种药剂可增加或降低一或多种细胞因子的产生，正调节或负调节自身抗原呈递，掩饰MHC抗原，或者促进一或多种类型免疫细胞的增殖、分化、迁移或激活状态。示例性的免疫调节剂包括但不限于非类固醇抗炎药物(NSAID)如阿司匹林、异丁苯丙酸、塞来昔布、双氯灭痛、依托度酸、苯氧苯丙酸，消炎痛、酮咯酸、奥沙普秦、萘丁美酮，舒林酸、托美汀、罗非考昔、萘普生、酮洛芬及萘丁美酮；类固醇类(例如糖皮质激素、地塞米松、可的松、羟基可的松、甲基强的松龙、泼尼松、氢化波尼松、氟氢强的松龙，柳氮磺胺吡啶类二十烷酸如前列腺素、血栓烷和白三烯；以及局部类固醇如地蒽酚、钙泊三醇、氯倍他索和他扎罗汀)；细胞因子如TGFb、IFNa、IFNb、IFNg、IL-2、IL4、IL-10；细胞因子、趋化因子或受体拮抗剂，包括抗体、可溶受体和针对BAFF、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD52、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152的受体-Fc融合体，补体因子(C5，D)CTLA4、嗜酸细胞活化趋化因子、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23，整联蛋白、LFA-1、LFA-3、MHC、选择素、TGFβ、TNFα、TNFβ、TNF-R1，T细胞受体，包括(依那西普)、(阿达木单抗)和(英利昔单抗)；异源抗-淋巴细胞球蛋白；其它免疫调节分子如如2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶、MHC结合肽和MHC片段的抗独特型抗体、咪唑硫嘌呤、布喹那、溴麦角隐亭、环磷酰胺、环孢霉素A、D-青霉胺、脱氧精胍菌素、FK506、戊二醛、金、羟化氯喹、来福米特、malononitriloamide(例如来福米特)、氨甲喋呤、二甲胺四环素、咪唑立宾、霉酚酸酯、雷帕霉素和柳氮磺胺吡啶。
在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种细胞因子一起施用。示例性的细胞因子包括但不限于淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素、N-甲二磺酰人生长激素及牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；prorelaxin；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和黄体化激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；及粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15，肿瘤坏死因子如TNF-α、TNF-β；及其它多肽因子包括LIF和试剂盒配体(KL)。
在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种细胞因子或刺激免疫系统细胞并增强效应子功能的其它药剂一起施用。例如，可以与本文所述抗-EGFR抗体一起施用的刺激NK细胞的药剂包括但不限于IL-2。在另一实施方案中，可以与本文所述抗-EGFR抗体一起施用的刺激巨噬细胞的药剂包括但不限于C5a，甲酸基肽如N-甲酸基-甲硫酰-亮氨酰-苯丙氨酸(Beigier-Bompadre et.al.(2003)Scand.J.Immunol.57：221-8)。可以与本文所述抗-EGFR抗体一起施用的刺激中性粒细胞的药剂包括但不限于G-CSF和GM-CSF。进一步地，促进这种免疫刺激性细胞因子迁移的药剂可以与本文所述抗-EGFR抗体一起施用。包括但不限于干扰素γ、IL-3和IL-7的其它药剂可促进一或多种效应子功能。在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体与一或多种细胞因子或者抑制效应细胞功能的其它药剂一起施用。
在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体与一或多种抗生素一起施用，包括但不限于：氨基苷类抗生素(例如阿泊拉霉素、阿贝卡星、班贝霉素、丁酰苷菌素、地贝卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、核糖霉素、西索米星、壮观霉素)，氨基环醇(例如壮观霉素)，酰胺醇类抗生素(例如叠氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素)，袢霉素抗生素(例如利福米特和利福平)，碳青霉烯类(例如亚胺培南，美罗培南，帕尼培南)；头孢菌素类(例如头孢克洛，头孢羟氨苄，头孢羟唑，头孢三嗪，头孢西酮，头孢唑兰，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢丙烯，头孢呋辛，头孢克肟，头孢氨苄，头孢拉定)，头霉素类(头孢拉宗，头孢西丁，头孢米诺，头孢美唑和头孢替坦)；林可霉素类(例如氯林可霉素，林可霉素)；大环内酯类(例如阿奇霉素，布雷非德菌素A，克拉霉素，红霉素，罗红霉素，妥布霉素)，单内酰环类(例如氨曲南，卡芦莫南和替吉莫南)；莫匹罗星；氧头孢烯类(例如氟氧头孢，拉氧头孢(latamoxef和moxalactam))；青霉素类(例如甲亚胺青霉素、美西林匹伏、阿莫西林、巴氨西林、苄基青霉素酸、青霉素G钠、依匹西林、芬贝西林、氟氯青霉素、培那西林、盐酸喷沙西林、o-苯明青霉素、青霉素O、青霉素V、苯甲酸青霉素V、青霉素V hydrabamine、青霉素V甲哌四环素、和苯氧乙基青霉素钾)；多肽(例如杆菌肽、多粘菌素E、多粘菌素B、替考拉宁、万古霉素)；喹诺酮类(氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、恩氟沙星、氟罗沙星、氟甲喹、加替沙星、吉米沙星、格雷沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、吡哌酸、罗索沙星、芦氟沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星和曲伐沙星)；利福平；链阳性菌素(例如喹奴普丁、达福普汀)；磺胺类(磺胺、磺胺甲恶唑)；四环素(氯四环素、盐酸地美环素、去甲氯四环素、多西环素、Duramycin、二甲胺四环素、新霉素、土霉素、链霉素、四环素和万古霉素)。
在一些实例中，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体与一或多种抗真菌剂一起施用，包括但不限于两性霉素B、环吡酮胺、克霉唑、益康唑、氟康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、制霉菌素、特比萘芬、特康唑和噻康唑。在一些实例中，本文所述抗-EGFR抗体与一或多种抗病毒剂一起施用，包括但不限于蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂，以及包括I型干扰素、病毒融合体抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、无环鸟苷、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、克拉夫定、恩夫韦地、恩替卡韦、膦甲酸、更昔洛韦、碘苷、印地那韦、洛匹那韦、普来可那立、利巴韦林、金刚烷胺、利托那韦、沙奎那韦、三氟胸苷、阿糖腺苷和叠氮胸苷。
本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以与其它治疗方案组合。例如，在一个实施方案中，用本文提供的修饰的抗-EGFR抗体治疗的患者可接受放射治疗。放射治疗可以根据本领域常用的及本领域技术人员已知的方案施用。这种治疗包括但不限于铯、铱、碘或钴放射治疗。所述放射治疗可以是整体照射，或者可以局部定向于机体的特定部位或组织，如肺、膀胱或前列腺。典型地，放射治疗或大约1-2周时间脉冲施用。然而，放射治疗可以施用较长时间。例如，放射治疗可以施用头颈癌患者大约6-7周。任选地，放射治疗可以单次施用、多次施用、相继施用。专业医生可根据经验确定本发明可用放射治疗的合适剂量。在一些实例中，所述抗-EGFR抗体及任选一或多种其它抗癌治疗剂用于离体治疗癌细胞。这种离体治疗可用于骨髓移植，特别是自体骨髓移植。例如，用本文所述抗-EGFR抗体及一或多种抗癌治疗剂治疗含有癌细胞的细胞或组织，这可以用于使癌细胞衰竭或基本上衰竭，之后再移植进受体患者中。
放疗也可以包含用同位素标记的分子如抗体治疗。示例性的放射免疫治疗剂包括但不限于(Y-90标记的抗-CD20)、(Y-90标记的抗-CD22)和(I-131标记的抗-CD20)。
此外，本文提供的抗-EGFR抗体如修饰的抗-EGFR抗体可以与其它的治疗技术如手术或光疗法组合施用患者或对象。
H.实施例
如下实施例仅是例证本发明而无限制本发明范围之意。
实施例1：抗-EGFR抗体突变体的产生及根据pH-依赖性活性筛选
1.初级筛选
a.文库产生
产生参考西妥昔单抗抗-EGFR抗体，其含有轻链(SEQ ID NO：1110及编码SEQ IDNO：9)和重链(SEQ ID NO：1111及编码SEQ ID NO：8所示的完全重链序列)，从而FLAG标签(SEQ ID NO：13)连接在恒定结构域的C-末端并克隆进表达载体中以编码IgG抗体(SEQ IDNO：1109所示的全长DNA序列)。通过定点诱变构建和产生西妥昔单抗抗-EGFR抗体的单一点突变体文库。所述文库含有西妥昔单抗抗-EGFR抗体的变体，从而每个成员与参考抗体相比在西妥昔单抗的重链(SEQ ID NO：8，具有SEQ ID NO：3所示的可变重链)或轻链(SEQ IDNO：19，具有SEQ ID NO：10所示的可变轻链)的可变区内的100个氨基酸位置之一含有一个单一氨基酸突变。变化的位置在西妥昔单抗抗-EGFR抗体的轻链和重链的可变区内，大部分位置在轻链或重链CDR中(见图1)。在每个位置产生至少15个氨基酸突变，从而在每个位置的15个突变中包括氨基酸组氨酸。产生的文库的单一变体成员的总数为1501。对每个文库成员进行测序。制备所述文库的甘油贮存物并在-80℃贮存。
b.筛选文库成员
为了筛选，将编码文库成员的表达载体作为IgG抗体在CHO细胞中单独表达并收集上清。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Cat.No.11668-027)根据厂商方案将质粒DNA转染进单层CHO-S细胞(invitrogen，Cat.No.11619-012)中。简而言之，将CHO-S在转染前一夜接种并于具有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中生长。第二天，在细胞达到80％铺满后，将CHO-S细胞的培养基更换为Opti-MEM(Invitrogen)。将质粒DNA与Lipofectamine的混合物(0.2μgDNA与0.5μL Lipofetamine)加入CHO-S细胞中并温育过夜。第二天，为细胞补加CD-CHO无血清培养基(Invitrogen，Cat.No.10743-029)。在转染后(通常在转染72小时后)收集转染细胞的上清。
如下文所述，使用平行的高通量pH敏感的ELISA在两种条件下测定上清结合EGF受体(EGFR sECD)的可溶的胞外结构域情况。使EGFR sECD与His标签缀合(sEGFR-H6)且是商购的(Sino Biologics，Cat#10001-H08H)。
简而言之，将sEGFR-H6固定在96孔Hi-结合平板(Costar#2592)上，所述固定通过在缓冲液A(Krebs-Ringer Buffer(KRB，Sigma Aldrich，#K4002)，pH 7.4，无人血清)中以100μL sEGFR-H612nM(1.32μg/mL)的抗原包被平板而进行，所述包被在4℃过夜或者在室温(RT)2小时。然后将该平板用250μL/孔缓冲液A洗涤3次。接着，将平板分为两组，第一组(pH7.4组)随后在室温用250μL的pH 7.4缓冲液B(1mM乳酸/25％人血清)封闭1小时，第二组(pH 6.0组)随后用250μL的pH 6.0缓冲液C(16.6mM乳酸/25％人血清)在室温封闭1小时，在此期间是覆盖的。
将上述西妥昔单抗抗-EGFR抗体文库的每个变体成员的100微升(100μL)FLAG-标签的抗-EGFR抗体变体上清以两个稀释度(稀释度1和稀释度2)加入含有结合的sEGFR-H6抗原的两个96孔平板(一组一个，pH 6.0组和pH 7.4组)的分别的孔中。对于稀释，将上述澄清的上清样品在pH 7.4的缓冲液B(KRB，pH 7.4，1mM乳酸/25％人血清；组1)或pH 6.0的缓冲液C(KRB，pH 6.0，16.6mM乳酸/25％人血清；组2)中以1∶20(稀释度1)或1∶100(稀释度2)在相同缓冲液中稀释。与FLAG标签缀合的参考西妥昔单抗抗-EGFR抗体(抗-EGFR-FLAG抗体)用作标准，在pH 7.4缓冲液B(KRB，pH 7.4，1mM乳酸/25％人血清)或者pH 6.0缓冲液C(KRB，pH 6.0，16.6mM乳酸/25％人血清)中制备系列稀释液(3×，起始浓度为30ng/mL，随后1∶3稀释)，每个孔中加入100μL。在稀释后，西妥昔单抗抗-EGFR-FLAG抗体浓度为200pM(30ng/mL)、66.67pM(10ng/mL)、22.22pM(3.33ng/mL)、7.41pM(1.11ng/mL)、2.47pM(0.37ng/mL)、0.82pM(0.123ng/mL)和0。
将含有西妥昔单抗抗-EGFR-FLAG抗体标准和变体抗-EGFR-FLAG样品的平板盖上并在室温温育1小时。然后将平板用250μL/孔的pH 7.4缓冲液B或者pH 6.0缓冲液C洗涤3次。。将在pH 7.4缓冲液B或pH 6.0缓冲液C中的500ng/mL的山羊抗-FLAG-HRP检测抗体(Abcam，#ab 1238)以100μL/孔加入每个孔中，并将该平板覆盖及在室温温育1小时。然后将平板用250μL/孔的pH 7.4缓冲液B或者pH 6.0缓冲液C洗涤3次。最后，将100μL SureblueTMB Microwell Peroxidase Substrate 1-component(KPL，#52-00-03)溶液加入每个孔中，使该平板在室温显影15-20分钟(避光)。通过在每个孔中加入100μL TMB终止溶液(KPL，#50-85-06)终止反应，使用微孔板分光光度计(Molecular Devices，Spectra MaxM2)在30分钟内在OD450读取平板。
c.抗体结合结果
一式两份进行ELISA，计算重复反应的平均OD值。基于所述OD值，鉴定在pH 6.0(及16.6mM乳酸)与在pH7.4(及1mM乳酸)相比呈现更高的sEGFR-H6结合活性的变体抗-EGFR抗体，并示于表15中。该表示出在稀释度1和稀释度2的变体抗体在pH 6.0的平均OD(OD6.0)，在pH 7.4的平均OD(OD7.4)，及在pH 6.0和7.4的平均OD值比率(OD6.0/OD7.4)。表15还示出变体抗-EGFR抗体的重链(HC)和轻链(LC)的可变区的SEQ ID NO。
aHC＝重链；LC＝轻链
bV＝可变
d.确定抗体浓度
抗体浓度通过抗-EGFR抗体定量ELISA确定。简而言之，将平板用100μL在PBS中的12nM(1.32ug/mL)的sEGFR-H6(Sino Biologicals Inc，Cat#10001-H08H)抗原包被，用250μl/孔PBS洗涤3次，在室温用250μl具有5mg/mL BSA的PBS封闭1小时。在具有5mg/mL BSA的PBS中制备系列稀释的抗-EGFR-FLAG抗体标准(蛋白质A柱纯化的)。起始抗体浓度为100ng/mL，随后如所说明的1∶3稀释。制备测试样品稀释液(1∶3稀释)，并将100μl/孔标准与测试样品加入孔中，在室温温育1小时。将平板用250μl/孔具有5mg/mL BSA的PBS洗涤3次。加入100μL/孔在PBS/5mg/mL BSA中1∶5000稀释(终浓度为0.2μL/mL)的兔抗-人IgG-Fc-HRP。将平板在室温温育1小时，用250μl/孔的PBS/5mg/mL BSA洗涤3次。加入TMB底物并如上所述读取平板。
e.计算特异性活性
特异性活性(SA)通过将平均OD值除以抗体浓度而计算。然后通过将变体抗-EGFR抗体的特异性活性除以参考FLAG-标签的抗-EGFR亲代抗体的特异性活性，将所述特异性活性标准化以给出每个变体的标准化的特异性活性(NSA)。表16示出上述每个鉴定的变体在稀释度1和稀释度2的标准化的特异性活性。鉴定所述变体抗-EGFR抗体在pH 6.0的NSA＞0.4，在pH 7.4的NSA＜0.4，并选择这样的变体进行进一步分析。这些鉴定的抗体的突变是含有轻链(LC)突变的抗体及含有重链(HC)突变的抗体，所述轻链突变是L004C、L004V、S056H或N091V；所述重链突变是：V024I、V024L、S025C、S025G、S025I、S025Q、S025T、S025L、N031I、N031T、N031V、Y032T、V050L、G054R、G054C、G054P、D058M、Y059E、F063R、F063C、F063G、F063M、F063V、T064N、T064V、S068F、S068Q、D072K、D072L、D072M、D072W、N073Q、S074H、S074R、S074D、S074G、S074Y、K075H、K075W、Q077R、Q077E、T100I、T100P、Y101W、Y104D、Y104F、Y104S或A107N。
aHC＝重链，LC＝轻链
2.确认筛选
如第1部分所述进行确认筛选，不同之处是在这两个pH值条件下均使用5％血清。表17示出每个示例性的所测试的修饰的抗体在稀释度1和稀释度2在每个稀释度在pH 6.0的OD(OD6.0)，在每个稀释度在pH 7.4的OD(OD7.4)，及在pH 6.0和7.4的平均OD值的比率(OD6.0/OD7.4)。
aHC＝重链，LC＝轻链。
实施例2：组合文库的产生和筛选
产生抗-EGFR变体成员的组合文库，其含有具有突变LC-I29S、重链中的V24E、S25C、F27R、R97H、Y104D和/或HC-Q111P的所有组合的抗体成员。通过定点诱变在实施例1中所述的西妥昔单抗抗-EGFR参考抗体中产生多个点突变。所述文库含有西妥昔单抗抗-EGFR抗体的变体，从而每个成员与参考抗体相比在重链(SEQ ID NO：8，具有SEQ ID NO：3所示的可变重链)或轻链(SEQ ID NO：9，具有SEQ ID NO：10所示的可变轻链)的可变区中含有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸突变。产生的组合文库的变体成员总数为128。对文库的每个成员进行测序。制备文库成员的甘油贮存物并在-80℃贮存。为了筛选，将编码文库成员的表达载体作为IgG抗体分别在CHO细胞中表达并收集上清。
如实施例1所述筛选文库，加入25％人血清及抗体稀释为浓度4ng/mL、2ng/mL和1ng/mL。在pH 6.0与在pH 7.4相比呈现出更高活性的示例性的抗体在表18中示出，表中示出了修饰的抗体与西妥昔单抗在浓度4ng/mL在pH 6.0的OD(OD6.0)，在pH 7.4的OD(OD7.4)，及在pH 6.0和7.4的平均OD值的比率(OD6.0/OD7.4)。具有最高OD pH6.0/OD pH7.4结合比率的抗体是含有重链突变HC-Y104D/Q111P(SEQ ID NO：1062)、HC-V24E/F27R/R97H/Q111P(SEQ ID NO：1093)、HC-S25C/Y104D(SEQ ID NO：1112)和HC-S25C/Q111P(SEQ ID NO：1113)的那些抗体。
实施例3：加入人血清对ELISA的影响
通过定量ELISA确定人血清对未修饰的(西妥昔单抗参考抗体)和变体抗-EGFR抗体(HC-Y104D和HC-Y104D/HC-Q111P)的结合的影响。
1.表达和纯化
将CHO-S细胞在摇瓶中培养，使用补加GlutaMAX(8mM)的CD-CHO培养基。在转染当天，根据厂商方案将密度大约1.0×106个细胞/mL的300mL的CHO-S细胞用375μg质粒DNA及375μL的FreeStyleTM MAX Reagent(Invitrogen)进行转染。在转染后96小时通过离心(4000g×20’)收获培养基。在条件培养基中表达的抗体通过亲和性层析进一步纯化，使用从蛋白质A树脂(BioRad：Cat#156-0218)制备的蛋白质A柱(2mL)进行。结合柱的IgG使用0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.5在一个步骤中洗脱。将洗脱的IgG中和并透析，之后使用BCA蛋白质测定(Pierce Biotechn)确定蛋白质。
为建立表达所述HC-Y104D突变体的稳定细胞系，根据厂商方案将密度大约为1.0×106个细胞/mL的30mL的CHO-S细胞用37.5μg质粒DNA及37.5μL的FreeStyleTM MAXReagent(Invitrogen)进行转染。转染后72小时，细胞在补加GlutaMAX(8mM)和1mg/mL G418的CD-CHO培养基中繁殖(clone)，所述繁殖使用在96孔圆底平板(Nunc)的15个孔中的一维系列稀释策略进行。四周后，通过western印迹分析(WB)筛选表达Y104D突变体的克隆，所述WB使用过氧化物酶缀合的抗人IgG Fc(Jackson Immonolab)作为检测抗体。阳性克隆步进式地扩展到12孔随后6孔平板中，随后T-25和T-75培养瓶及最后到摇瓶中。将表达5mg/L的Y104D的两个克隆13E3和15D6进一步扩展至波动袋生物反应器生产，以支持Y104D突变体的所有体外、离体和体内表征。
为了建立表达HC-Y104D/Q111P双突变体的稳定细胞系，将密度大约为1.0×106个细胞/mL的25×5mL的CHO-S细胞使用25μg质粒DNA通过电穿孔转染，所述电穿孔使用MaxCyte STX仪器根据厂商指导方案进行。转染后72小时，将4×5mL细胞在补加GlutaMAX(8mM)和1mg/mL G418的CD-CHO培养基中繁殖，所述繁殖使用在96孔圆底平板(Nunc)的25个孔中的一维系列稀释策略进行。四周后，通过western印迹分析(WB)筛选表达Y104D/Q111P突变体的克隆，所述WB使用过氧化物酶缀合的抗人IgG Fc(Jackson Immonolab)作为检测抗体。然后将阳性克隆如上述逐步扩展至摇瓶。将在2-5mg/L的表达Y104D/Q111P的两个克隆9-1-5B和9-4-6A进一步扩展至波动袋生物反应器生产，以支持Y104D/Q111P突变体的所有体外、离体、体内表征。
2.加入人血清对ELISA的影响
如实施例1所述做一些修改进行ELISA。从起始浓度100ng/mL制备3倍系列稀释的西妥昔单抗抗-EGFR-FLAG参考抗体和FLAG-标签的抗-EGFR HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P突变抗体稀释液。在无血清、含有5％人血清或25％人血清的pH 7.4缓冲液(KRB，pH 7.4，1mM乳酸)中制备标准和突变抗体。也在无血清、含有5％人血清或25％人血清的pH 6.0缓冲液(KRB，，16.6mM乳酸)中制备标准和突变体抗体。对于每种条件，抗-EGFR-FLAG抗体标准及HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P突变抗体的最终浓度为666.67pM(100ng/mL)、222.22pM(33.33ng/mL)、74.07pM(11.11ng/mL)、24.69pM(3.70ng/mL)、8.23pM(1.23ng/mL)、2.74pM(0.41ng/mL)、0.91pM(0.137ng/mL)和0。将100微升(100μL)每种浓度的每种抗体加入96孔平板的孔中。每个平板包括抗-EGFR-FLAG抗体标准、阳性对照(亲代抗体)和阴性对照(无原始抗体)。一式三份进行ELISA。
结果示出人血清增加变体抗-EGFR与sECD EGFR的结合。与在不存在人血清条件下与sECD EGFR结合相比，加入5％人血清导致HC-Y104D和HC-Y104D/HC-Q111P抗-EGFR变体在pH 6.0或pH 7.4的OD增加大约3倍。加入25％人血清导致HC-Y104D和HC-Y104D/HC-Q111P抗-EGFR变体在pH 6.0或pH 7.4的OD增加大约4-5倍。对于西妥昔单抗，加入5％或25％人血清在pH 6.0或pH 7.4导致OD与不存在人血清条件下的OD相比增加低于2倍。
实施例4：乳酸浓度对ELISA的影响
通过pH-敏感性ELISA确定乳酸对未修饰的(西妥昔单抗参考抗体)及变体抗-EGFR抗体(HC-Y104D和HC-Y104D/HC-Q111P)的结合的影响，如实施例3所述，不同之处是修改测定缓冲液。
在含有16.7mM乳酸或不含乳酸的pH 6.0缓冲液(KRB，pH 6.0，无血清)中制备西妥昔单抗抗-EGFR-FLAG参考抗体标准及待测试的FLAG-标签的抗-EGFR抗体变体(HC-Y104D或HC-Y104D/HC-Q111P)。也在含有16.7mM乳酸或不含有乳酸的pH 7.4缓冲液(KRB，无血清)中制备标准和突变体抗体。将每个抗体稀释到终浓度为666.67pM(100ng/mL)、222.22pM(33.33ng/mL)、74.07pM(11.11ng/mL)、24.69pM(3.70ng/mL)、8.23pM(1.23ng/mL)、2.74pM(0.41ng/mL)、0.91pM(0.137ng/mL)和0。将100μL标准和抗体变体加入合适孔中。每个平板包括抗-EGFR-FLAG抗体标准、阳性对照(亲代抗体)和阴性对照(无原始抗体)。一式三份进行ELISA。结果示出存在增加浓度的乳酸在pH6.0或pH 7.4对西妥昔单抗或者抗-EGFR变体结合sECD EGFR无显著影响。
实施例5：所鉴定的采样(hit)的结合亲和性
进行生物薄层干涉测量以测量变体抗-EGFR抗体与EGFR在pH 6.5和pH 7.4的结合。通过生物薄层干涉测定以96孔形式，使用Octet Qke仪器(ForteBio，Menlo Park，CA)测量西妥昔单抗和变体抗-EGFR抗体对sEGFR的解离常数(KD)。数据采集软件用于所有操作步骤，包括生物素化的sECD EGFR配体加样和抗体结合与解离步骤。配体加样和抗体结合与解离步骤以在不同pH值的两组(pH 6.5组和pH 7.4组)进行。
通过将15μL的NHS-PEG4-生物素溶液(于20mM超纯水中)(PIERCE，Cat#21329)加入含有1mg sEGFR的溶液中，将该反应混合物在室温温育30分钟，制备生物素化的sECD EGFR。通过透析除去未反应的NHS-PEG4-生物素，根据厂商指导通过BCA蛋白质测定(PIERCE，Cat#23225)测量生物素化的sEGFR的蛋白质浓度。
1.抗-EGFR变体在pH 6.5和pH 7.4的结合亲和性
为了评估在不同pH下结合的差别，对于配体加样步骤，生物素化的sECD EGFR与PBS中链霉亲和素生物层结合(pH 6.5或pH 7.4)。将链霉亲和素传感器在含有PBS(pH 6.5或pH 7.4)的孔中浸入1分钟，然后将该传感器浸入含有在PBS(pH 6.5或pH 7.4)中生物素化的sEGFR(50μg/mL)的孔中2分钟。将传感器在含有PBS(pH 6.5或pH 7.4)的孔中漂洗。在所有步骤期间，将平板在1000rpm搅动。
亲和性测量的抗体结合和解离步骤：
为了测量结合速率，将固定化的sECD-EGFR传感器浸入具有在pH 6.5或7.4的PBS中的22nM或66.7nM的抗体(西妥昔单抗或变体抗-EGFR抗体)的孔中2分钟。为了测量解离速率，将抗体结合的传感器浸入pH 6.5或7.4的PBS孔中4分钟。通过测量从光层和生物层中反射的光中产生的干涉图中的变化定量sEGFR与抗体(西妥昔单抗或变体抗-EGFR抗体)的结合和解离。
结合速率、解离速率和KD值用Software Data Analysis(v.6.4)计算，所述计算使用整体曲线拟合进行。西妥昔单抗和变体抗-EGFR抗体在pH 6.5和pH 7.4的KD值在表19中示出。
2.缓冲液成分和pH对抗-EGFR变体的结合亲和性的影响
在进一步的实验中，使用与上述相似的生物层干涉测定法测量变体抗-EGFR抗体与sECD EGFR在pH 6.0、6.5和pH 7.4，在PBS、Krebs-Ringer Bicarbonate缓冲液(KRB)或具有25％人血清的KRB中的结合。结果在下表20中示出。
对于每种缓冲液条件，Y104D和Y104D/Q111P突变体在pH 7.4比在pH 6.0或pH 6.5呈现出对sEGFR较低的亲和性(较高KD值)，及在pH 6.0和6.5相似的结合亲和性。西妥昔单抗对于sEGFR的结合亲和性在每种缓冲液类型在不同的pH值是相似的。在pH 6.0和pH 6.5条件下，西妥昔单抗在PBS中与在KRB中相比呈现对sEGFR略低的亲和性，及在pH 7.4在PBS与KRB中相似的亲和性。Y104D和Y104D/Q111P突变体在PBS和KRB中在所有三种pH条件下呈现出相似结合。所有三种抗体的结合亲和性在存在25％人血清条件下均最高。在存在25％人血清条件下，Y104D和Y104D/Q111P突变体与西妥昔单抗呈现出相似的结合速率(kon)，但是Y104D和Y104D/Q111P突变体呈现出较高的解离速率(koff)，导致所述突变体的结合亲和性(KD)降低。西妥昔单抗与突变体之间的解离速率(koff)中的差别在pH 7.4条件下最大。
实施例6：EGFR磷酸化
通过ELISA(RnD systems reagents，#DYC3570-2)测量来自用参考西妥昔单抗抗体或抗-EGFR抗体变体处理的人新生儿角化细胞和A431细胞的磷酸化EGFR的浓度。
1.样品制备
将大约10,000个人新生儿角化细胞(Invitrogen C-001-5C)或者A431细胞(ATCCCRL 1555)铺板于96孔平板(BD Falcon#35-3072)的孔中。在37℃在5％CO2湿化空气温育仪中温育过夜后，洗涤细胞，重悬浮于无血清Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)中，在相同条件下温育过夜。将细胞用冷却的磷酸盐缓冲盐水(PBS；137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH 7.2-7.4)洗涤。然后，将平板分为两组。在第一组中，在调节为pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入10μg/mL纯化的西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体或者缓冲液对照。在第二组中，在调节为pH6.5的磷酸盐缓冲液中加入纯化的西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体或者缓冲液对照。对于A431细胞，也进行剂量应答，从而将西妥昔单抗或者HC-Y104D抗-EGFR抗体以30μg/mL、10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mL和0.001μg/mL浓度加入样品。将细胞在37℃温育15-30分钟。
在最初的与抗体温育后，将在与抗体相同缓冲液中的EGF(RnD Systems，catalogno.236-E)(100μg/mL)分别加入细胞中。也测试对照细胞，其中无抗体加入(仅EGF)或者其中无抗体或EGF加入(无处方)。将细胞在37℃温育15-30分钟。在与抗原温育后，将细胞用冷却的PBS洗涤，加入冷却的裂解缓冲液(1％NP-40Alternative，20mM Tris(pH 8.0)、137mMNaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM激活的原钒酸钠、10μg/mL Aprotinin、10μg/mL亮抑酶肽)。收集裂解物并立即测定或者在≤-70℃贮存。
2.ELISA
将96孔微板(Costar#2592)用大鼠抗人抗-磷酸EGFR捕获抗体(8.0μg/mL于PBS中，100μL/孔)(R&D Systems#842428)在室温包被过夜。抽吸每个孔，用洗涤缓冲液(0.05％20于PBS中，pH 7.2-7.4)(R&D Systems#WA126)洗涤共5次。将平板在室温用300μL封闭缓冲液(1％BSA、0.05％NaN3于PBS中，pH 7.2-7.4)封闭1-2小时。抽吸所述孔，并用洗涤缓冲液洗涤共5次。将细胞裂解物(西妥昔单抗、Y104D抗-EGFR抗体、仅EGF或者无处方)在IC稀释液(1％NP-40Alternative、20mM Tris(pH8.0)、137mM NaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM激活的原钒酸钠)中稀释，并加入100μL。重复抽吸和洗涤步骤，加入100μL与HRP(20mMTris(pH 8.0)、137mM NaCl、0.05％20、0.1％BSA)缀合的小鼠抗-人磷酸-EGFR(Y1068)抗体。将平板密封并在室温温育2小时。重复抽吸和洗涤步骤。在每个孔中加入底物(H2O2和四甲基联苯胺的1∶1混合物(R&D Systems，Catalog#DY999))(100μL)，将平板在室温温育20分钟。加入终止溶液(2N H2SO4(R&D Systems，Catalog#DY994)(50μL)，立即在微板读取器中读取所述孔的在450nm的光密度(OD)，所述读取以540nm或570nm的波长校正进行。
3.结果
a)A431细胞
结果示出EGF抗原诱导EGFR磷酸化(见图3A)。在来自用抗体在pH 6.5和7.4预处理的A431细胞的样品中，结果示出抗-EGFR西妥昔单抗抗体的存在抑制EGF诱导的EGFR磷酸化，由此磷酸化的EGFR(EGFR-P)水平与未用EGF刺激的对照细胞相当。将细胞与变体HC-Y104D变体预温育也抑制EGF诱导的磷酸化，但是程度低于参考西妥昔单抗。在pH 6.5，变体HC-Y104D对抑制EGF诱导的EGFR磷酸化的作用较高。
所述抗体的抑制作用是剂量依赖性的(图3B)。将磷酸化的EGFR的浓度根据抗体(西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体)的浓度绘图。对于参考西妥昔单抗抗体(WT)，抑制作用在抗体浓度高于1μg/mL时开始观测到，及在浓度高于10μg/mL时稳定。参考西妥昔单抗抗体的抑制作用在pH 6.5和7.4是相似的。对于用HC-Y104D预温育的细胞，在浓度为1μg/mL时也观测到EGF诱导的磷酸化的抑制，但是低于参考WT抗体的抑制作用。在30μg/mL，抑制作用仍未稳定。然而，结果示出与HC-Y104D在pH 6.5预温育导致比在pH 7.4观测到的抑制作用更高。
b)新生儿角化细胞
在来自新生儿角化细胞的样品中观测到相似结果(见图3C)。在pH 6.5和pH 7.4，参考西妥昔单抗抗体导致EGF诱导的磷酸化的相似的抑制作用。在pH 7.4，细胞与HC-Y104D抗体预温育不导致EGF诱导的磷酸化的任何抑制。然而，在pH 6.5，EGF诱导的EGFR磷酸化与无抗体的样品相比降低大约1/4，表明所述变体抗体在pH 6.5比在pH 7.4呈现出更高的活性。
实施例7：人和新生儿角化细胞在存在西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体条件下的生长
测量在与西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体温育后，人新生儿角化细胞(Invitrogen C-001-5C)和成人角化细胞(Invitrogen C-005-5C)的生长情况。将西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体加入正常生长培养基(10％FBS，DMEM(pH 7.4))中，至浓度为10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mL、0.0411μg/mL、0.0137μg/mL和0.00457μg/mL。
将人新生儿角化细胞和成人角化细胞(1000个细胞/孔)加入96孔平板(BD Falcon35-3072)中，平板中存在含有西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体的正常生长培养基。每个条件在5个孔中测定。将细胞在37℃在5％CO2湿化空气温育仪中温育5天。通过 Luminescent Cell Viability Assay(Promega Cat#G-7571)测量细胞生长，以存活细胞与无抗体生长的对照细胞的百分比表示。
结果示于表21和图4。在成人角化细胞(图4A)和新生儿角化细胞(图4B)中，西妥昔单抗以剂量依赖性方式抑制细胞生长，存活细胞百分比随着抗体浓度升高而降低。在最高浓度西妥昔单抗(10μg/mL)，观测到成人角化细胞和新生儿角化细胞的23％存活细胞。在成人角化细胞和新生儿角化细胞中，细胞生长不随着HC-Y104D抗-EGFR抗体浓度增加而降低。在成人角化细胞和新生儿角化细胞中，在抗体浓度为0.0411μg/mL、0.0137μg/mL和0.00457μg/mL，在用HC-Y104D的测定中的存活细胞百分比与西妥昔单抗存活细胞百分比相似。在抗体浓度10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL和0.123μg/mL，在成人角化细胞和新生儿角化细胞中HC-Y104D抗-EGFR抗体的存活细胞百分比显著高于西妥昔单抗存活细胞百分比。这表明参考的抗-EGFR西妥昔单抗抗体抑制新生儿角化细胞生长，但是抗-EGFR抗体变体HC-Y104D则否。
实施例8：西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体对异种移植模型中肿瘤生长的影响
使用A431鳞状细胞癌细胞、FaDu喉咽癌细胞、及衍生自A431细胞的工程化的细胞系A431LDHA和A431CA9，产生异种移植肿瘤模型，用于评估西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体的抗肿瘤活性。
1.皮下注射A431肿瘤
A431鳞状细胞癌异种移植模型用于评估和对比西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体的抗肿瘤活性。
a.西妥昔单抗剂量应答
为雄性无胸腺的NCr-nu/nu小鼠在其右侧腹部皮下(SC)注射接种0.1mL悬浮于RPMI-1640培养基中的3.3×106A431鳞状细胞癌细胞(ATCC CRL1555)。当肿瘤达到大约100mm3大小时，将动物随机分为6个研究组(n＝5/组，共30只动物)，接受运载工具(西妥昔单抗缓冲液)及1.2、4、12、40或80mg/kg体重的西妥昔单抗，在研究的第0、5、7、11和14天经腹膜内(IP)注射，每周施用两次。肿瘤生长以肿瘤体积(mm3)测定，使用数字测径器每周确定两次，肿瘤体积根据公式(1/2*L*W2)计算，其中L(长度)是肿瘤的最长直径，W(宽度)是与测量的“长度”垂直的最长直径。特别地，肿瘤体积在第0、5、7、11和14天测量。
肿瘤体积在仅运载工具对照动物中随着研究的进程线性增加。在施用西妥昔单抗的小鼠中肿瘤的体积呈现出在第5天和第7天比运载工具对照组减慢。在7天后，西妥昔单抗处理的肿瘤的生长在剩余的研究期间停滞在第7天测量的大小。观测到肿瘤生长的降低是剂量依赖性的，在施用80mg/kg体重的西妥昔单抗的小鼠中，降低50％至几乎无肿瘤生长。
b.西妥昔单抗vs.HC-Y104D
如上述产生A431异种移植模型。当肿瘤大小达到大约100mm3时，将动物随机分为5个研究组(n＝4/组)：(1)组1，运载工具(西妥昔单抗缓冲液)；(2)组2，0.1mg/小鼠(4mg/kg体重)西妥昔单抗；(3)组3，1.0mg/小鼠(40mg/kg体重)西妥昔单抗；(4)组4，0.1mg/小鼠(4mg/kg体重)HC-Y104D抗-EGFR抗体；(5)组5，1.0mg/小鼠(40mg/kg体重)HC-Y104D抗-EGFR抗体。给小鼠经腹膜内(IP)注射施用0.1mg或1.0mg的参考西妥昔单抗或者HC-Y104D抗-EGFR抗体变体或者运载工具对照，在第0、4、7、11和14天每周施用两次。肿瘤生长如上述在第0、4、7、11、14和18天测量，不同之处是用运载工具处理的动物最后的肿瘤测量是在第14天，因为动物被牺牲。西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR抗体处理组的肿瘤生长抑制(TGI)使用公式％TGI＝[1-(TB-TA)/(CB-CA)]×100计算，其中TB是在开始处理后14天处理组中平均肿瘤体积(mm3)，TA是在处理当天处理组中平均肿瘤体积(mm3)，CB是在开始处理后14天对照组中平均肿瘤体积，CA是在处理当天对照组中平均肿瘤体积(见例如Teicher BA andAndrews PA：Anticancer Drug Development，Guide：Preclinical Screening，ClinicalTrials and Approval，2nd edition.Humana Press，Totowa，New Jersey，pp.134，2004andT.Friess et al.，(2006)Anticancer Research 26：3505-3512)。
结果示出在不存在抗体时，肿瘤体积在仅存在运载工具条件下随着时间稳定增加(图5)。在用参考西妥昔单抗或HC-Y104D抗-EGFR变体抗体处理的动物中与仅用运载体对照动物相比在两个检测条件下肿瘤体积均明显降低，最小的肿瘤生长在用1.0mg抗体处理的动物中出现。在第14天，用0.1mg HC-Y104D抗-EGFR抗体和0.1mg西妥昔单抗处理的动物分别呈现出59％和68％的肿瘤生长抑制。在第14天，用1.0mg HC-Y104D抗-EGFR抗体和1.0mg西妥昔单抗处理的动物分别呈现出88％和96％的肿瘤生长抑制。因此，结果示出HC-Y104D抗-EGFR变体的体内效力与参考西妥昔单抗抗体相似。
2.皮下注射FaDu肿瘤
FaDu喉咽癌异种移植模型用于评估和对比西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体的抗肿瘤活性。
a.西妥昔单抗剂量应答
对雄性无胸腺NCr-nu/nu小鼠在其右侧腹部经皮下(SC)注射接种悬浮于RPMI-1640培养基中的0.1mL的5.0×106FaDu喉咽癌细胞(ATCC)。当肿瘤大小达到大约～100mm3时，将动物随机分为6个研究组(n＝7/组)，接受运载体(西妥昔单抗缓冲液)及1.2、4、12、40或80mg/kg体重的西妥昔单抗，在研究的第0、3、7、10和14天经腹膜内(IP)注射，每周施用两次。在第-1、3、7、10和14天如上述测量肿瘤生长情况。
仅接受运载工具的动物模型呈现出随着研究的进程的稳定肿瘤生长。在施用1.2mg/kg西妥昔单抗的动物中肿瘤生长迅速低于运载工具处理的对照动物的大约50％。施用4、12、40或80mg/kg西妥昔单抗在所有测量时间点完全阻止肿瘤生长。这些结果表明FaDu异种移植模型与A431异种移植模型相比对西妥昔单抗更敏感。
b.西妥昔单抗vs.HC-Y104D
如上述产生FaDu异种移植模型。当肿瘤大小达到大约100mm3时，将动物随机分为5个研究组(n＝4/组)：(1)组1，运载工具(西妥昔单抗缓冲液)；(2)组2，4mg/kg西妥昔单抗；(3)组3，40mg/kg西妥昔单抗；(4)组4，4mg/kg HC-Y104D抗-EGFR抗体；(5)组5，40mg/kg HC-Y104D抗-EGFR抗体。所述抗体或仅运载体在第0、3、7和10天经腹膜内(IP)注射每周施用两次。使用检测器如上述在施用抗体的第-1、3、7、10和14天测量肿瘤生长情况。
仅施用运载工具的动物在研究期间呈现肿瘤稳定生长。用4mg/kg或40mg/kg的变体抗-EGFR处理随着时间稳定降低肿瘤生长，在第14天肿瘤生长分别降低大约40％和70％。用4mg/kg或40mg/kg西妥昔单抗处理在研究期间完全阻止肿瘤生长。
实施例9：抗-EGFR抗体Y104D与A431皮下肿瘤或皮肤移植物的离体结合
1.与皮下肿瘤的离体结合研究
a.EGFR在皮下肿瘤中的表达
使用免疫组织化学(IHC)评估如实施例8.1所述作为异种移植物在裸鼠中生长的A431人肿瘤中EGFR表达水平。收获A431皮下肿瘤及在10％中性缓冲的福尔马林(NBF)中固定，在石蜡中包埋。将5μm切片堆积在玻片上并干燥。在染色之前，将玻片去石蜡并再水合。将切片用EGFR IHC试剂盒(Dako，Carpinteria，CA)免疫标记。根据厂商指导使用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)观测染色。核用苏木精复染。使用Nikon Eclipse TE2000U显微镜连接Insight FireWire数码相机(Diagnostic Instruments，Michigan)捕捉显微照片。在肿瘤细胞中对EGFR的强细胞膜阳性证实衍生自A431的异种移植肿瘤保留高水平EGFR表达。
b.抗-EGFR抗体与皮下肿瘤的结合
使用免疫荧光测定(IF)评估西妥昔单抗和HC-Y104D结合并因此标记人EGFR的能力。将Erbitux和HC-Y104D在PBS中以10、5、1、0.3、0.1μg/mL的浓度缀合于DyLight594，所述缀合使用DyLight 594抗体标记试剂盒(Thermo Scientific；Rockford，IL)根据厂商指导进行。在切片后，将冷冻的A431肿瘤切片在冷却的丙酮中固定10分钟，与5μg/mL或1μg/mL的DyLight594-缀合的西妥昔单抗或HC-Y104D抗体温育1小时。在PBS中洗涤后，将切片用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸化物)(Molecular Probes，Eugene)复染。使用NikonEclipse TE2000U显微镜连接Insight FireWire数码相机(Diagnostic Instruments，Michigan)用20×和40×物镜捕捉显微照片，每个照片使用相同设置以允许在实验条件之间对比。
西妥昔单抗和HC-Y104D抗体均表明A431实体瘤的强免疫标记。在每个浓度(5μg/mL和1μg/mL)下用HC-Y104D抗体的标记强度低于西妥昔单抗，但是在5μg/mL HC-Y104D获得的强度与使用1μg/mL西妥昔单抗观测的强度相似。
2.对灵长类动物皮肤的离体结合研究
a.在灵长类动物皮肤中的EGFR表达
使用免疫组织化学(IHC)评估人和非人灵长类动物皮肤样品中EGFR的表达水平。人皮肤样品得自当地手术中心，食蟹猴、狨猴和松鼠猴的皮肤得自Worldwide PrimatesInc.(Miami，FL)。将福尔马林固定的人、食蟹猴、狨猴和松鼠猴的皮肤样品切片，并用EGFRIHC试剂盒(DAKO)如上述进行IHC处理。核用苏木精复染。如上述用20×和40×物镜捕捉显微照片。
正如所期望地，基底角化细胞的膜呈现出EGFR强染色。食蟹猴和松鼠猴皮肤组织的基底角化细胞也呈现出染色，食蟹猴皮肤染色略低于观测到的人和松鼠猴组织的染色。甚至当使用40×物镜观测时，狨猴皮肤不呈现任何可检测的染色。这些结果表明食蟹猴和松鼠猴EGFR而不是狨猴EGFR与由抗人EGFR单克隆抗体识别的人EGFR足够相似。
b.抗-EGFR抗体与冷冻的皮肤样品的结合
使用免疫荧光测定(IF)评估西妥昔单抗和HC-Y104D结合并因此标记皮肤样品中人EGFR的能力。对人、食蟹猴、狨猴和松鼠猴的冷冻切片(人皮肤自当地手术中心获得；食蟹猴、狨猴和松鼠猴皮肤自Worldwide Primate，Florida获得)如上述在中性pH直接进行免疫标记，所述标记使用与Alexafluor 594(Thermo Scientific DyLight 594AntibodyLabeling Kit；Rockford，IL)缀合的1.0μg/mL西妥昔单抗或者HC-Y104D。核用DAPI复染。如上述捕捉纤维照片，使用20×和40×物镜。
西妥昔单抗表明在人组织中前角化细胞和基底细胞的强免疫标记，在食蟹猴皮肤样品中略低。HC-Y104D抗体表明与西妥昔单抗标记的切片相比在人皮肤和食蟹猴皮肤的真皮中前角化细胞和基底细胞的免疫标记强度更低。西妥昔单抗和HC-Y104D在松鼠猴和狨猴皮肤中均不呈现可检测的标记。
实施例10：荧光标记的抗-EGFR抗体Y104D在体内与肿瘤及皮肤的选择性结合
将西妥昔单抗、Y104D抗-EGFR抗体和对照人IgG在室温用DyLight755Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific，Rockford，IL)，一种近红外萤石，标记60分钟。评估DL755标记的IgG、西妥昔单抗和HC-Y104D与异种移植肿瘤或者人或猴皮肤移植物的结合，所述评估使用IVIS Caliper荧光成像系统，激发波长为745nm，发射波长为800nm。在施用抗体之前及在施用抗体之后1分钟、2分钟、10分钟、60分钟、120分钟、240分钟、360分钟、1天后及每天捕捉图像。在人皮肤移植模型中，在施用抗体后10天也捕捉图像。
1.西妥昔单抗和HC-Y104D与皮下A431肿瘤的结合
如实施例8所述通过将A431细胞注射进裸鼠的右侧腹部而产生A431异种移植肿瘤。移植21天后，给小鼠施用10μg/小鼠(0.5mg/kg)人IgGDL755、HC-Y104DDL755或者西妥昔单抗DL755(n＝4/组)。在4只动物/组检测DL755标记，使用IVIS Caliper荧光成像系统，激发波长745nm，发射波长800nm。在施用抗体之前及施用抗体之后4小时捕捉图像，然后每天捕捉图像共7天。
阴性对照抗体IgGDL755与肿瘤的结合在施用后4小时最小，但是在研究的7天内略增加(大约3倍)。在研究的前4天，西妥昔单抗DL755结合高于Y104DDL755结合，在第4天达到高于基线信号(在施用4小时后的IgGDL755信号)的大约13倍峰强度。在4天后，西妥昔单抗信号略降低为基线信号的大约11-11.5倍。结合肿瘤的Y104DDL755信号在研究期间稳定增加，在第6和7天增加至基线信号的大约11-11.5倍。抗-EGFR抗体(西妥昔单抗DL755和Y104DDL755)的信号覆盖肿瘤的整个表面，在每个时间点均比肿瘤结合IgGDL755检测的信号强得多。
通过Fc检测，对人注射IgGDL755、HC-Y 104DDL755和CeuximabDL755的小鼠免疫组织化学染色，可用于更详细评估抗体结合的位置。如上述，给裸鼠在右侧腹部注射A431细胞以产生A431肿瘤。在移植A431细胞后21天，给小鼠施用一次静脉内注射剂量的1mg/小鼠的IgGDL755、Y104DDL755或西妥昔单抗DL755(n＝2/组)。在抗体给药48小时后，如上述使用IVISCaliper荧光成像系统观测肿瘤。在肿瘤成像后，灌注小鼠，收获肿瘤，将肿瘤冷冻切片与HRP缀合的山羊抗人IgG二抗温育以使用上述标准方法检测注射的抗体的Fc区。DAB用作HRP底物以能进行观测。染色的组织使用装备20×物镜的Nikon Eclipse TE2000U显微镜连接Insight FireWire数码相机(Diagnostic Instruments，Michigan)进行检测。
来自用IgGDL755注射的动物的肿瘤呈现出弥散的非特异性IgG染色。相反，用Y104DDL755或西妥昔单抗DL755注射的肿瘤呈现出明显的膜特异性结合。这些结果与Y104DDL755和西妥昔单抗DL755抗体在A431肿瘤中结合细胞膜表面上EGFR靶的结果一致。
2.西妥昔单抗和HC-Y104D与皮下PC-3肿瘤的结合
衍生自PC-3细胞的异种移植肿瘤通过将在100μl无血清中的2×106PC-3细胞(Caliper Life Sciences)注射进雄性裸鼠右侧腹部肌肉中而产生。在植入35天后，给携带PC-3肿瘤的小鼠施用10μg/小鼠(0.5mg/kg)的人IgGDL755、HC-Y 104DDL755或CeuximabDL755(n＝2/组)，及使用IVIS Caliper荧光检测系统如上述检测DL755标记。在施用抗体之前捕捉图像，然后每天捕捉图像共5天。对PC-3异种移植肿瘤在静脉内施用1mg/小鼠的人IgG(对照)、HC-Y104D或西妥昔单抗之后48小时也通过Fc检测进行平行的免疫组织化学研究。
施用人IgGDL755的小鼠呈现出定位于肿瘤部位的一些低DL755信号。施用HC-Y104DDL755或西妥昔单抗DL755的小鼠呈现出比在施用人IgGDL755的动物中观测到的更能定位于肿瘤的DL755信号，但是该信号与在实施例9.2.a中观测到的对应的信号相比降低。Fc检测免疫组织化学研究表明所有三个抗体的非特异性染色。观测到无膜特异性染色，表明人IgG、HC-Y104D和可一般性地积聚在EGFR不足的PC3肿瘤内，而不是特异性结合肿瘤表面。
作为评估皮肤毒性的模型，在体内评估荧光标记的西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体与在小鼠中植入的人和猴皮肤移植物的结合。将西妥昔单抗、Y104D抗-EGFR抗体和对照人IgG在室温用DyLight755Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific，Rockford，IL)，一种近红外萤石标记60分钟。
3.西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体与人皮肤移植物的结合
将人中厚皮片(split thickness skin graft，STSG)(人皮肤得自当地手术中心)和人包皮移植物(购自NDRI(1628JFK Blvd，8Penn Center，Philadelphia，PA)经手术移植在Ncr nu/nu小鼠左背侧。通过抗-EGFR IHC试剂盒(Dako)在植入后第70天和32天证实人皮肤移植物中的EGFR表达。在植入后第32天和36天，通过静脉内注射给具有人皮肤移植物的小鼠施用标记的抗体，剂量为300μg/小鼠。
在人STSG小鼠模型中，在施用后1小时在所有小鼠中均观测到循环系统信号，与循环标记的抗体一致。这种循环信号持续大约7或8天。在施用DL755标记的西妥昔单抗的小鼠中，仅在施用后第1天，在皮肤移植物部位检测到高于全身信号的较高强度信号。这个信号在施用后1-10天每天拍摄的图片中可见。在施用HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体或对照人IgG抗体的小鼠中，在所有检测时间点，在皮肤移植部位观测到极小地高于全身信号的信号。在每个测量的时间点，在施用西妥昔单抗抗体的小鼠中在肿瘤移植部位的信号均显著高于在施用HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体的小鼠中的对应的信号。
在后续的研究中证实这些结果，其中在植入后21天，分析接受人包皮移植物的小鼠的抗体结合情况，所述分析使用相同方法进行(n＝3/组)，在静脉内施用10μg/小鼠(0.5mg/kg)的人IgGDL755、Y104DDL755或西妥昔单抗DL755之前和之后4小时及然后每天进行，共6天。在施用后第1天，在施用Y104DDL755或西妥昔单抗DL755的小鼠中皮肤移植部位检测到高于全身信号强度的信号。通过信号强度显示的皮肤移植物结合能力，在施用西妥昔单抗DL755的小鼠中增加直至地3天，然后在研究期间的剩余3天保持相同水平。在施用Y104DDL755的小鼠中的皮肤移植物结合能力在研究期间剩余时间保持在大约第1天观测到的水平。在研究期间观测到人IgGDL755与皮肤移植物最小的结合力。这些结果表明西妥昔单抗DL755呈现出比Y104DDL755更高的结合人皮肤中表位的能力。IgGDL755、Y104DDL755或西妥昔单抗DL755与人包皮移植物的结合结果通过免疫组织化学核实。在植入后第28天，给接受人包皮移植物的小鼠施用一次静脉内剂量的1mg/小鼠的IgG、Y104D或西妥昔单抗。在抗体给药48小时后，灌注小鼠并将冷冻切片与HRP-缀合的山羊抗人IgG二抗一起温育。DAB用作HRP底物。染色的组织使用装备40×物镜的Nikon Eclipse TE2000U显微镜连接Insight FireWire数码相机(Diagnostic Instruments，Michigan)进行检验。与体内研究结果一致，来自施用西妥昔单抗的小鼠的组织呈现出与人皮肤移植物多数的结合，来自施用Y104D的小鼠的组织呈现出与西妥昔单抗处理的切片相比降低得多的染色，在施用人IgG的小鼠组织中染色不可检测出。
4.西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体与猴皮肤移植物的结合
将猴STSG(得自BioTox的食蟹猴皮肤)经手术移植在7只Ncr nu/nu小鼠左侧背部。分别在植入后第70和32天通过抗-EGFR IHC试剂盒(Dako)确认猴皮肤移植物中EGFR表达。在植入后第32和36天，通过静脉内施用具有猴皮肤移植物的小鼠模型30μg/小鼠剂量的所述标记的抗体。
在含有猴STSG皮肤移植物的小鼠中，在施用后1小时在所有小鼠中均观测到循环全身信号，与循环标记的抗体一致。这个循环信号持续大约5-7天。在施用DL755标记的西妥昔单抗的小鼠中，在施用后1-9天每天在皮肤移植物中检测到高于全身信号的信号。在施用HC-Y104D修饰的抗-EGFR抗体的小鼠中，在施用后1-9天每天检测到高于全身信号的信号，但是在所有天测量的强度均明显低于在施用西妥昔单抗的小鼠中观测到的信号。在施用对照人IgG的小鼠中，在施用后1-9天每天在皮肤移植物部位观测到仅微弱的信号。
5.A431肿瘤vs.皮肤结合能力
使用定量荧光信号强度，通过将在实施例10.1中确定的肿瘤结合DL755信号强度除以在实施例10.2中确定的相同抗体的结合人皮肤移植物的对应的DL755信号强度(n＝2/组)，确定西妥昔单抗和HC-Y104D抗体的抗体肿瘤：皮肤结合比率。然后将该比率根据对照的施用IgG的动物计算的肿瘤：皮肤结合比率标准化。
结果示于图6。在所有时间点西妥昔单抗与肿瘤结合大约等于与皮肤的结合，在每个时间点得到的肿瘤：皮肤结合比率大约为1。相反，HC-Y104D的肿瘤结合更高于Y104D皮肤结合。在每个时间点的肿瘤：皮肤结合比率为大约4-5.5。这些结果表明HC-Y104D与结合皮肤移植物相比优先和选择性结合肿瘤。
实施例11：西妥昔单抗在皮肤移植模型中对皮肤毒性的影响
收获来自患者睑裂的供体皮肤，并将中厚皮片移植至4只Ncr nu/nu小鼠中。在皮肤移植后15天开始，给两只小鼠静脉内施用2mg西妥昔单抗(100mg/kg，HED 60mg/kg)，每周两次共4周。在施用西妥昔单抗后第35天，在最终西妥昔单抗给药后7天，目测皮肤移植物的状况。收集供体皮肤和含有人供体皮肤移植物和宿主小鼠皮肤的移植皮肤样品，通过免疫组织化学使用抗-EGFR IHC试剂盒(Dako)进行分析。
在开始西妥昔单抗处理后第35天，未接受西妥昔单抗的小鼠皮肤移植物整合进皮肤中。相反，接受西妥昔单抗的小鼠的皮肤移植物在开始处理后第35天收缩至小于原始皮肤移植物的一半大小，皮肤移植物与宿主皮肤之间的界面发红及疼痛，表明西妥昔单抗刺激的针对人组织的应答。
对供体皮肤进行IHC分析呈现强HuEGFR染色。含有人移植物和小鼠皮肤的区域的移植部位的IHC分析呈现在人移植物前角化细胞和基底细胞中的强HuEGFR染色，及在相邻小鼠皮肤的小鼠前角化细胞或及低细胞中无染色。
实施例12：抗-EGFR抗体与化疗剂组合治疗
评估西妥昔单抗和HC-Y104D抗-EGFR抗体组合化疗剂顺铂在抑制A431异种移植肿瘤生长的效力。
1.西妥昔单抗与顺铂
如实施例8所述建立皮下A431异种移植肿瘤。当肿瘤大小达到大约100-200mm3时，将动物随机分成9个研究组(n＝5/组)，如表22所示，通过腹膜内注射施用西妥昔单抗，每周两次，和/或通过静脉内注射施用顺铂，每周两次。特别地，在第0、4、7、11和14天施用测试用品。
*＝p＜0.05vs.仅运载工具
肿瘤生长以肿瘤体积(mm3)度量，在第-1、4、7、11和14天如实施例8所述用数字测径器测量肿瘤体积并计算。处理组的肿瘤生长抑制(TGI)使用公式％TGI＝[1-(TB-TA)/(CB-CA)]×100计算，其中TB是在第14天处理组中平均肿瘤体积(mm3)，TA是在第一次处理前一天(第-1天)处理组中平均肿瘤体积(mm3)，CB是在第14天仅运载工具对照组中平均肿瘤体积，CA是在第一次处理前一天(第-1天)仅运载工具对照组中平均肿瘤体积(见例如Teicher BAand Andrews PA：Anticancer Drug Development，Guide：Preclinical Screening，Clinical Trials and Approval，2nd edition.Humana Press，Totowa，New Jersey，pp.134，2004and T.Friess et al.，(2006)Anticancer Research26：3505-3512)。结果在上表22中示出。
虽然1.5mg/kg顺铂自身不显著抑制肿瘤生长，但是当与4mg/kg(单独西妥昔单抗的TGI为41.8％vs.组合的TGI为53.2％)及12mg/kg(单独西妥昔单抗的TGI为65.9％vs.组合的TGI为74.1％)的西妥昔单抗组合时其有助于额外的肿瘤生长抑制。用单独5mg/kg顺铂处理导致34.2％的TGI，当与4mg/kg(单独西妥昔单抗的TGI为41.8％vs.组合的TGI为50.2％)及12mg/kg(单独西妥昔单抗的TGI为65.9％vs.组合的TGI为85.2％)的西妥昔单抗组合时进一步有助于TGI。用12mg/kg西妥昔单抗+5mg/kg顺铂观测到最大肿瘤生长抑制。
2.西妥昔单抗vs.HC-Y104D与顺铂
如上述在雄性裸鼠中建立皮下A431异种移植肿瘤。当肿瘤大小达到大约100mm3时，将动物随机分成8个研究组(n＝5/组)，如表23所示，通过IP施用西妥昔单抗或HC-Y104D，和/或通过IV施用顺铂，每周两次。特别地，在第0、4、7和11天施用测试用品。如先前所述在第-1、4、7、11和14天确定肿瘤体积(mm3)。
运载工具处理的平均肿瘤体积在研究期间进展性生长，直至在第14天达到大约2200mm3。施用5mg/kg顺铂在第14天使肿瘤生长降低大约45％。接受12mg/kg西妥昔单抗剂量的小鼠肿瘤呈现出肿瘤生长降低大约80％。在这个实验中，观测到12mg/kg西妥昔单抗与5mg/kg顺铂的组合处理无额外作用。接受12mg/kg HC-Y104D的小鼠肿瘤大小与运载工具对照组相比降低大约55％。另外的5mg/kg顺铂处理与单用12mg/kg HC-Y104D处理不引起肿瘤生长的任何进一步降低。增加HC-Y104D剂量至40mg/kg产生的肿瘤生长抑制与用12mg/kg西妥昔单抗观测到的结果相似。当40mg/kg HC-Y104D组合5mg/kg顺铂施用时观测到对额外的肿瘤抑制。
实施例13：抗-EGFR抗体-药物缀合物(ADCs)对肿瘤细胞生长和角化细胞生长抑制的影响
抗-EGFR抗体-药物缀合物(ADCs)通过将免疫毒素皂草素与西妥昔单抗、HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P抗-EGFR抗体融合而产生，通过混合生物素化的抗体与链霉亲和素-皂草素(Advanced Targeting Systems Bio，Cat#IT-27)或者使用可裂解的蛋白质交联剂(由Advanced Targeting Systems Bio提供)，以允许药物在靶细胞内部释放。
为了形成基于生物素-链霉亲和素的ADC，使在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.2中浓度为1-2mg/ml的抗体氧化，使抗体糖链的相邻羟基基团转变为醛基基团，使用终浓度5mg/ml的高碘酸钠(NaIO4)在4℃进行30分钟。将氧化的抗体用0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.2透析。然后将透析的抗体与在DMSO中以9∶1体积比制备的50mM酰肼-生物素混合，使反应中的酰肼-生物素为15mM，在室温温育2小时以在抗体的醛基与酰肼基团之间形成腙键。将生物素化的抗体用1×PBS透析，以等摩尔比率与链霉亲和素-皂草素混合以形成抗体-皂草素复合物。然后检测所述ADC抑制人肿瘤细胞系A431和MDA-MB-468和人角化细胞系HEK-N的细胞生长能力。
1.SaporinADC抑制A431细胞生长
将A431细胞在补加10％胎牛血清(FBS，Mediatech)的RPMI 1640培养基中培养。在ADC处理前一天，将A431细胞以1,000个细胞/孔的密度种植在200μL体积的透明底白色96孔平板中。将细胞不予处理或者用皂草素缀合的西妥昔单抗(Wt-Sap)、皂草素缀合的Y104D(Y104D-Sap)、皂草素缀合的Y104D/Q111P(YDQP-Sap)或者皂草素缀合的人IgG在从1μg/mL浓度开始增加浓度下处理。将细胞进行ADC处理5天。在第5天使用Cell Titer-gloLuminescent试剂盒(Promega)根据厂商指导测量活细胞。计算相对于未处理细胞的存活细胞百分比，及使用GraphPad Prism计算EC50值。结果示于下表24中。结果示出WT-Sap示出与Y104D-Sap和TDQP-Sap相似的对A431癌细胞的细胞生长抑制(CGI)活性。
2.皂草素ADC抑制新生儿角化细胞(HEK-N)
将新生儿角化细胞(HEK-N)在补加生长因子的Epilife培养基(Gibco)中培养。在皂草素ADC处理前一天，将HEK-N细胞以1,000个细胞/孔的密度种植在200μL体积透明的白底96孔平板中。将细胞不予处理或者用皂草素缀合的西妥昔单抗(Wt-Sap)、皂草素缀合的Y104D(Y104D-Sap)、皂草素缀合的Y104DQ111P(YDQP-Sap)或者皂草素-缀合的人IgG处理，从1μg/mL浓度开始增加浓度处理。对细胞进行ADC处理5天。在第5天，使用Cell Titer-gloLuminescent试剂盒(Promega)根据厂商指导测量活细胞。计算相对于未处理细胞的存活细胞百分比，使用GraphPad Prism计算EC50值。结果在表24中示出。结果示出WT-Sap示出比Y104D-Sap和TDQP-Sap对角化细胞更高的(CGI)活性。
实施例14：产生和筛选第二组合文库
产生组合抗-EGFR抗体突变体的第二代文库，以提供另外的抗-EGFR抗体候选物。检测所述候选物在降低的pH条件下的选择性结合。
1.第二文库构建
第二组合文库是使用如实施例2所述方法通过定点诱变HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P产生全长抗-EGFR抗体突变体HC-S053G/Y104D和HC-S053G/Y104D/Q111P而产生的。然后将新产生的突变体和先前产生的HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P用作亲代克隆，向其中单独加入突变S025V、F027G、T030F和D072L以产生如表25示出的20个构建体的文库。对所有构建体进行测序。
2.筛选第二组合文库
将第二组合文库的构建体和西妥昔单抗转染进CHO细胞中，使用如实施例1所述标准转染程序，抗体的表达如前所述通过测量上清中的浓度而确定(实施例1)。结果示于表25。结果示出小-CPS文库的许多克隆呈现出低表达。
表25.第二组合文库的构建体
克隆# SEQ ID 转染1 转染2
NO (ng/mL) (ng/mL)
2-1 HC-Y104D 320.7 246.2
2-2 HC-Y104D/Q111P 196.8 94.5
2-3 HC-S053G/Y104D 341.8 223.7
2-4 HC-S053G/Y104D/Q111P 298.5 157.5
2-5 HC-S025V/Y 104D 36.2 12.1
2-6 HC-S025V/Y104D/Q111P 40.1 15.5
2-7 HC-S025V/S053G/Y104D 87.5 36.0
2-8 HC-S025V/S053G/Y104D/Q111P 70.3 38.8
2-9 HC-F027G/Y104D 0.7 3.5
2-10 HC-F027G/Y104D/Q111P 0.5 2.4
2-11 HC-F027G/S053G/Y104D 15.1 14.8
2-12 HC-F027G/S053G/Y104D/Q111P 13.3 0.5
2-13 HC-T030F/Y104D 68.3 56.5
2-14 HC-T030F/Y104D/Q111P 49.6 32.3
2-15 HC-T030F/S053G/Y104D 67.3 69.2
2-16 HC-T030F/S053G/Y104D/Q111P 100.2 74.9
2-17 HC-D072L/Y104D 31.0 28.1
2-18 HC-D072L/Y104D/Q111P 10.3 0.5
2-19 HC-S053G/D072L/Y104D 61.6 46.5
2-20 HC-S053G/D072L/Y104D/Q111P 55.9 18.9
然后将上清浓度调节为4ng/mL、2ng/mL和1ng/mL，以使用实施例1所述pH敏感性ELISA测试在pH 6.0和pH 7.4的EGFR结合。每个构建体在每个浓度进行两次转染和pH敏感性ELISA。筛选结果在表26中示出。克隆2-9和2-10的浓度非常低，是在未稀释及1∶2和1∶4稀释下检测的。
西妥昔单抗结合EGFR在pH 6.0和pH 7.4是相似的。所有突变体克隆与克隆HC-Y104D和HC-Y104D/Q111P相比在pH 6.0均呈现出较低的结合，但是一些克隆证实在pH 7.4的结合降低至背景水平，导致较高的pH 6.0/pH7.4比率。
实施例15：Y104D/Q111P和T030F/Y104D/Q111P突变体的人源化和筛选
使用编码HC-Y104D/Q111P(克隆2-2，也称作DP)和HC-T030F/Y104D/Q111P(克隆2-14，也称作FDP)的全长轻链和重链CDR序列的双链DNA片段产生人源化克隆的文库，然后根据pH依赖性EGFR结合和蛋白质表达水平筛选该文库。
1.筛选人源化文库
将CHO-S细胞铺板于96孔平板中，用人源化克隆转染。每个平板还含有阳性对照(HC-Y104D/Q111P或HC-T030F/Y104D/Q111P)和阴性对照(仅载体)。在转染48小时后收集上清。如实施例1所述确定IgG浓度。将上清调节为2ng/mL并使用实施例1所述pH敏感性ELISA测试在pH 6.0和pH 7.4的pH依赖性EGFR结合。在pH 6.0和pH 7.4的结合活性与相同平板上阳性对照(HC-Y104D/Q111P或HC-T030F/Y104D/Q111P)的结合活性对比。
选择初级采样，不包括具有低表达水平的克隆，并进行次级构建和确认筛选。对于筛选，将转染的上清调节为浓度为4ng/mL、2ng/mL和1ng/mL，使用实施例1所述pH敏感性ELISA测试在pH 6.0和pH 7.4的pH依赖性EGFR结合。结果示于表27。确定所鉴定的采样的序列。在初始筛选中，一些所鉴定的采样是含有两个序列的混合物，因此以“/”命名(例如FDP-h9/FDP-h13)。分离混合物中的各个序列以进行随后的确认筛选。所有采样均含有亲代突变Y104D和0111P和/或T30F。序列分析示出有11个独特的重链和16个独特的轻链，每个采样均具有独特的人源化轻链和重链的组合。全长抗体的可变重链和轻链的SEQ ID NO在表中示出。
重复所鉴定的采样的筛选，使用浓度调节为30ng/mL、10ng/mL、3.3ng/mL、1.1ng/mL的转染的上清，测试在pH 6.0、pH 6.5和pH 7.4的其pH依赖性EGFR结合，所述测试使用与实施例1所述使用pH敏感性ELISA所述基本相同的程序进行，不同的是加入pH 6.5条件。所选择的突变体的结果在表28和29中示出。表28中示出了全长抗体的可变重链和轻链的SEQID NO。
概括而言，结果示出大多数所选择的采样与亲代阳性对照(HC-Y104D/Q111P或HC-T030F/Y104D/Q111P)相比呈现出在pH 6.0的结合活性对在pH 7.4的结合活性的相似或更好的结合活性比率。在一些情况中，与亲代阳性对照相比在pH 6.0结合活性降低，但是所选择的采样在pH 6.0的结合活性与亲代阳性对照相比基本上相同或者增加。对于一些采样，与亲代阳性对照相比在pH 7.4的结合活性也降低了。
2.所选择的人源化抗体在CHO-S细胞中的表达
还筛选了上述人源化抗体采样的表达的表达水平。将CHO-S细胞铺板于96孔平板中，并用表28和29示出的所选择的人源化克隆转染，使用实施例1所述方法进行。如实施例1所述确定IgG浓度。结果在表30中示出。结果示出人源化克隆的产量与亲代克隆相比显著增加。
由于修饰对本领域技术人员是明显的，意指本发明仅受所附权利要求书的范围限制。

Claims (35)

1.修饰的抗-EGFR抗体，或者其抗原结合片段，其包含在未修饰的抗体的可变重链中在对应于位置104的位置用天冬氨酸的置换(Y104D)，其中：
所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)或其部分，所述其部分足以与EGFR抗原结合，从而单独所述VH或VH和VL这两者是修饰的；
所述其部分足以形成抗原结合位点及含有所述Y104D氨基酸置换；
通过将抗体的VH链与SEQ ID NO:3所示的VH链比对来鉴定对应的氨基酸位置；
所述修饰的抗-EGFR抗体，或者其抗原结合片段，特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)或其可溶性片段，并且含有未修饰的抗体或其抗原结合片段中的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸置换，包括Y104D；
所述未修饰的抗-EGFR抗体选自：
i)西妥昔单抗，其包含(a)SEQ ID NO:3所示的可变重链及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链，或(b)SEQ ID NO:1所示的重链及SEQ ID NO:2所示的轻链，或其抗原结合片段；
ii)抗体，其包含SEQ ID NO:8所示的重链及SEQ ID NO:9所示的轻链，或其抗原结合片段；和
iii)Fab片段，其包含SEQ ID NO:5所示的重链及SEQ ID NO:2所示的轻链，或其抗原结合片段；和
iv)i)、ii)或iii)的人源化形式；和
所述修饰的抗-EGFR抗体，或者其抗原结合片段，在肿瘤环境中具有条件活性，并且在肿瘤环境条件下和在非肿瘤环境条件下相比，呈现出与人表皮生长因子受体(EGFR)或者其可溶性片段的结合活性至少1.7的比率，其中：
肿瘤环境条件包括6.0-6.5的pH或者5mM-20mM的乳酸盐浓度两者或两者之一，及10mg/mL-50mg/mL的蛋白质浓度；和
非肿瘤环境条件包括7.0-7.8的pH或者0.5mM-5mM的乳酸盐浓度两者或两者之一，及10mg/mL-50mg/mL的蛋白质浓度。
2.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或者其抗原结合片段，其中所述结合活性的比率是至少2.0或至少3.0。
3.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在包括pH6.0-6.5的肿瘤环境条件下与在包括7.4的pH的非肿瘤环境下相比，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出所述结合活性比率。
4.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在包括6.0-6.5的pH及10mM-20mM的乳酸盐浓度的肿瘤环境条件下与在包括7.0-7.4的pH及0.5mM-2mM的乳酸盐浓度的非肿瘤环境下相比，所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出所述结合活性比率。
5.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中在肿瘤环境条件下与在非肿瘤环境条件下的蛋白质浓度是基本相同或者是相同的。
6.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，选自
i)抗体，其包含：
a)可变重链(VH)，其包含SEQ ID NO:495、1062、1112、1114-1117、1124-1126或1128-1130所示氨基酸序列；以及
b)可变轻链(VL)，其包含SEQ ID NO:4或10所示氨基酸序列；
ii)i)的抗体的抗原结合片段；和
iii)i)或ii)的人源化变体。
7.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其选自如下抗体，所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:495所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
b)SEQ ID NO:1062所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
c)SEQ ID NO:1112所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
d)SEQ ID NO:1114所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
e)SEQ ID NO:1115所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
f)SEQ ID NO:1116所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
g)SEQ ID NO:1117所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
h)SEQ ID NO:1124所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
i)SEQ ID NO:1125所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
j)SEQ ID NO:1126所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
k)SEQ ID NO:1128所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
l)SEQ ID NO:1129所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；
m)SEQ ID NO:1130所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链；和
n)SEQ ID NO:1118所示的可变重链，及SEQ ID NO:4或10所示的可变轻链。
8.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的可变重链或其部分含有氨基酸置换，所述氨基酸置换对应于选自如下参照SEQ ID NO:3所示的氨基酸位置的氨基酸置换：V24E、V24I、V24L、S25C、S25H、S25R、S25A、S25D、S25G、S25M、S25Q、S25V、S25L、S28C、L29H、N31H、G54D、G54S、F63R、F63C、F63M、F63P、F63S、T64V、L67G、D72L、D72P、D72W、N73Q、K75H、K75G、K75P、K75W、S76I、S76V、Q77E、T100P、Y104D、Y104S、Y104V、Q111I和Q111V，其中
对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VH链与SEQ ID NO:3所示的VH链而鉴定的，及
所述其部分足以形成抗原结合位点及含有所述氨基酸置换；和/或
b)所述修饰的抗-EGFR抗体的可变轻链或其部分含有氨基酸置换，所述氨基酸置换对应于选自参照SEQ ID NO:4所示的氨基酸位置的L4F、L4V、T5P和R24G的氨基酸置换，其中：
对应的氨基酸位置是通过比对所述抗体的VL链与SEQ ID NO:4所示的VL链而鉴定的，及
所述其部分足以形成抗原结合位点及含有所述氨基酸置换。
9.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体，或其抗原结合片段，其中：
所述修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的可变重链或其部分含有选自V24E、S25C、S25V、F27R、T30F、S53G、D72L、R97H和Q111P的进一步的氨基酸置换。
10.权利要求1的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰的抗-EGFR抗体是人源化的。
11.权利要求10的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述未修饰的抗-EGFR抗体包含SEQ ID NO:28所示的可变重链及SEQ ID NO:29所示的可变轻链。
12.权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其包含多达5个氨基酸置换，包括Y104D。
13.权利要求12的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸置换是HC-Y104D、HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25C/HC-Y104D、HC-Y104D/LC-I29S、HC-S53G/HC-Y104D、HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-Y104D、HC-S25V/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D、HC-S25V/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-Y104D、HC-T30F/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D、HC-T30F/HC-S53G/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-D72L/HC-Y104D、HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P、HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D或者HC-S53G/HC-D72L/HC-Y104D/HC-Q111P。
14.权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其中：
所述未修饰的抗-EGFR抗体是抗原结合片段；并且
所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段。
15.权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段，其是全长IgG抗体或选自Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双特异抗体、Fd和Fd’片段的抗原结合片段。
16.一种缀合物，其包含与靶向剂直接或间接连接的权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。
17.一种缀合物，其包含与靶向剂直接或间接连接的权利要求12的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求16的缀合物，其中所述靶向剂是治疗性部分。
19.权利要求17的缀合物，其中所述靶向剂是治疗性部分。
20.权利要求18的缀合物，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分、放射性同位素、化疗剂、裂解肽或者细胞因子。
21.权利要求19的缀合物，其中所述治疗性部分是细胞毒性部分、放射性同位素、化疗剂、裂解肽或者细胞因子。
22.权利要求18的缀合物，其中所述治疗性部分选自：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、美登素或其类似物或衍生物、阿里他汀或其功能性肽类似物或衍生物、尾海兔素10或15或其类似物、伊立替康或其类似物、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、卡里奇霉素或其类似物或衍生物、抗代谢物、烷化剂、铂衍生物、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、雷查霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物、抗生素、吡咯[2,l-c][l,4]-苯并二吖庚因(PDB)、毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素A、及美洲商陆抗病毒蛋白。
23.权利要求18的缀合物，其中所述治疗性部分是美登素衍生物，其是选自安丝菌素或mertansine(DM1)的美登醇；或者
所述治疗性部分是阿里他汀或其功能性肽类似物或其衍生物，其是一甲基阿里他汀E(MMAE)或F(MMAF)；或者
所述治疗性部分是抗代谢物，选自氨甲喋呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨和克拉屈滨；或者
所述治疗性部分是烷化剂，选自氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、氮烯唑胺(DTIC)、甲基苄肼和丝裂霉素C；或者
所述治疗性部分是铂衍生物，其是顺铂或卡铂；或者
所述治疗性部分是抗生素，选自更生霉素、博来霉素、道诺霉素、阿霉素、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素和氨茴霉素(AMC)；或者
所述治疗性部分是毒素，选自白喉毒素及其活性片段和杂交分子、蓖麻蛋白毒素、霍乱毒素、志贺样毒素、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属外毒素、alorin、皂草素、蒴莲素、gelanin、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素。
24.核酸分子，选自下列一或多项：
核酸分子，其包含编码权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的重链的核苷酸序列；
核酸分子，其包含编码权利要求1-5和8-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的轻链的核苷酸序列，所述轻链包含至少一个氨基酸置换，对应于选自L4F、L4V、T5P、R24G和I29S的氨基酸置换；和/或
核酸分子，其包含编码权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
25.载体，其包含权利要求24的核酸分子。
26.细胞，其包含一或多个权利要求25的载体。
27.产生修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的宿主细胞中从一或多个权利要求25的载体表达所编码的重链或轻链，并回收所述抗体。
28.药物组合物，其包含：
权利要求1-11任一项的修饰的抗-EGFR抗体或其抗原结合片段；以及
药物可接受的运载体或赋形剂。
29.权利要求28的药物组合物，其用于治疗肿瘤、癌症或转移。
30.权利要求1-11任一项的修饰的抗EGFR抗体或其抗原结合片段用于制备用于治疗肿瘤、癌症或转移的药物的用途。
31.药物组合物，其包含：
权利要求16的缀合物；以及
药物可接受的运载体或赋形剂。
32.权利要求31的药物组合物，其用于治疗肿瘤、癌症或转移。
33.权利要求16的缀合物用于制备用于治疗肿瘤、癌症或转移的药物的用途。
34.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其是修饰的人源化的西妥昔单抗，并且包含重链中的置换Y104D。
35.缀合物，其包含权利要求34的抗体或其抗原结合片段和细胞毒性剂。
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