CN104330564B - 用于npc早期诊断的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于NPC早期诊断的试剂盒。本发明的检测试剂盒,操作简单,重复性好,具有灵敏度高,特异性好的优点,实验数据表明,gH/gL‑IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。为鼻咽癌的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标,有利于鼻咽癌的早期筛查和诊断。将本发明的检测试剂盒与现有的VCA‑IgA检测结果相结合,特别是与对VCA‑IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA‑IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种诊断试剂及离体诊断方法,特别涉及一种用于NPC早期诊断的试剂盒。
背景技术
鼻咽癌(NPC)为我国最常见的恶性肿瘤之一,多见于我国南方的广东、广西、湖南、福建、江西等省,男性发病率为女性的2~3倍,我国病例报道年龄分布在3~90岁,但30~50岁是高发年龄区。
鼻咽癌患者体内不仅存在高滴度抗EB病毒抗体,且其抗体水平随病情发展而变化,一些特异性的血清标志物已在鼻咽癌高发地区被广泛应用于人群筛查及早期诊断中。早在上世纪70年代,免疫荧光法(IFA)检测血清中EBV壳抗原(VCA)和早期抗原(EA)被用于筛查鼻咽癌,而大部分正常人血清中未能检出。这项技术所代表的第一代鼻咽癌血清学检查技术很快成为鼻咽癌筛查的金标准。然而传统免疫荧光法受主观影响大、耗时长、对检测者熟练程度要求高,结果随观察者不同而改变,难以进行质量质控。这些局限性被随之孕育而生的酶联免疫吸附测定(ELISA)所突破,作为第二代鼻咽癌血清学检查技术,ELISA具有更高的准确性,便于实现自动化,运用试剂盒快速进行诊断过程,更适于大规模人群筛查。EB病毒壳抗原VCA用于鼻咽癌高发地区人群筛查及早期诊断,其具有较高的特异性及敏感度,至今VCA-IgA IFA或VCA-IgA ELISA仍作为一线的辅助诊断指标。
鼻咽癌的三早防治是提高生存率的关键,然而在鼻咽癌中,VCA-IgA阳性率为70-95%,5-30%的鼻咽癌患者无法诊断。黄腾波等采用VCA-IgA联合EA-IgA对广东省内98180名30-59岁人群进行鼻咽癌筛查的前瞻性研究,敏感度为50.9%;Liu等采用VCA-IgA联合EBNA1-IgA对四会市5481名受试者进行筛查,敏感度为75%。VCA-IgA阴性的鼻咽癌患者容易漏诊。因此在临床上联合多指标进行诊断,特别是开发和研究对部分VCA-IgA阴性的患者有诊断价值的指标具有重要临床价值。
发明内容
本发明的一个目的在于提供定量EB病毒gH/gL复合体抗体的试剂作为NPC早期诊断试剂的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种NPC早期诊断方法。
发明人研究发现,gH/gL-IgA抗体水平在鼻咽癌患者和健康人群这两组人群中有显著性统计学差异,ROC曲线分析结果显示,gH/gL-IgA曲线下面积(AUC)为0.893,gH/gL-IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。运用间接免疫荧光法(IFA)检测样本血清中EBV壳抗原(VCA)抗体(VCA-IgA)。根据检测结果绘制ROC曲线,并确定临界值:以titer≥1:40为VCA-IgA IFA的Cut-off值,其诊断鼻咽癌的灵敏度为84.6%。在209例鼻咽癌患者中,VCA-IgA IFA诊断鼻咽癌假阴性者共32人,在这32人中,运用gH/gL-IgA ELISA进行诊断,构建ROC曲线,发现gH/gL-IgA ELISA曲线下面积(AUC)为0.879,32人中25人为gH/gL-IgA阳性,敏感度达78.1%。为鼻咽癌的诊断提供了新的高灵敏度与特异性的检测指标,尤其对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。
本发明所采取的技术方案是:
一种鼻咽癌早期诊断或筛查的方法,包括如下步骤:
1)获取待测样品;
2)直接或间接定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量;
3)根据检测得到的定量结果,确定待测样品是否为鼻咽癌高风险样品。
作为本发明的进一步改进,上述方法中使用的待测样品为血清样本、唾液。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,使用ELISA法定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,通过绘制ROC曲线确定鼻咽癌高风险的判定标准。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为ROC曲线的Yuden指数。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为:以OD值计,EB病毒gH/gL复合体抗体-IgA的OD值高于0.63;其中,OD值的测定方法如下:
1)血清样本用样本稀释液以1:100稀释,以100μl/孔加样,37℃中孵育1小时;
2)PBST洗板5次,最后一次控干,加入稀释好的HRP标记的羊抗人IgA,100μl/孔,37℃中孵育30min;
3)PBST洗板5次。加入显色底物TMB,100μl/孔,37℃中孵育30min;
4)加入100μl 2M H2SO4终止反应;
5)终止反应后10min内酶标仪上(450nm)测定OD值。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,待测样品来自鼻咽癌VCA-IgA阴性的患者。
本发明的有益效果是:
本发明的检测试剂盒,操作简单,重复性好,具有灵敏度高,特异性好的优点,实验数据表明,gH/gL-IgA以OD值0.63为临界值,其灵敏度和特异性分别为83.7%、82.3%。为鼻咽癌的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标,有利于鼻咽癌的早期筛查和诊断。
将本发明的检测试剂盒与现有的VCA-IgA检测结果相结合,特别是对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。
附图说明
图1是表达产物gH/gL复合体的SDS-PAGE(左)和anti-flag作为一抗的Western-blot(右)检测结果,gH分子量大小为85KDa,gL分子量大小为26Kda;
图2是表达产物gH/gL-IgA OD值在鼻咽癌患者(NPC)与健康对照组(Control)分布的散点分布图;
图3是鼻咽癌患者(NPC)与健康对照组(Control)检测gH/gL-IgA结果进行ROC分析的结果;
图4是gH/gL-IgA ELISA诊断VCA-IgA IFA阴性患者的ROC曲线。
具体实施方式
EB病毒糖蛋白gH (gp85) 和gL以异质二聚体的形式存在,含量在糖蛋白中仅次于gp350,作为膜抗原主要成分之一,表达于EB病毒裂解期,与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合密切相关。其他类型疱疹病毒的糖蛋白gH此前已被多次报道可诱发免疫反应。例如,水痘带状疱疹病毒糖蛋白复合体gH/gL包含可以与人类免疫球蛋白IgG的γ链反应的区域结构;杆状病毒系统表达重组纤维乳头状瘤相关疱疹病毒糖蛋白gH采用ELISA成功应用于诊断海龟的纤维乳头状瘤中。但是由于NPC的致病机理并不十分明确,未有任何实验数据显示EB病毒糖蛋白复合体gH/gL与NPC的进展具有相关性。
一种鼻咽癌早期诊断或筛查的方法,包括如下步骤:
1)获取待测样品;
2)直接或间接定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量;
3)根据检测得到的定量结果,确定待测样品是否为鼻咽癌高风险样品。
血清样本易于制备,处理难度低,作为本发明的进一步改进,上述方法中使用的待测样品为血清样本。当然,也可以使用其他临床样本,如唾液等其他人体样本。
直接定量EB病毒gH/gL复合体抗体的量,可以通过添加EB病毒gH/gL复合体,之后使用ELISA法定量。间接定量EB病毒gH/gL复合体抗体的量,可以通过与定量EB病毒gH/gL复合体抗体表达量相关产物的量来确定,如其mRNA表达量,或其产物。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,使用ELISA法定量样品中EB病毒gH/gL复合体抗体的量。显然的,也可以使用其他公知的方法来定量中EB病毒gH/gL复合体抗体的量。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,通过绘制ROC曲线确定鼻咽癌高风险的判定标准。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为ROC曲线的Yuden指数。当本方法用于VCA-IgA阴性患者时,可同样通过绘制ROC曲线,以ROC曲线的Yuden指数作为其高风险判定标准。
作为本发明的进一步改进,上述方法中,鼻咽癌高风险的判定标准为:以OD值计,EB病毒gH/gL复合体抗体-IgA的OD值高于0.63;其中,OD值的测定方法如下:
1)血清样本用样本稀释液以1:100稀释,以100μl/孔加样,37℃中孵育1小时;
2)PBST洗板5次,最后一次控干,加入稀释好的HRP标记的羊抗人IgA,100μl/孔,37℃中孵育30min;
3)PBST洗板5次。加入显色底物TMB,100μl/孔,37℃中孵育30min;
4)加入100μl 2M H2SO4终止反应;
5)终止反应后10min内酶标仪上(450nm)测定OD值。
下面以ELISA法为例,结合具体的实验操作,进一步说明本发明的技术方案。
EB病毒糖蛋白复合体gH/gL的制备
1)将EBV 的gH编码序列(GenBank编号NC009334,aa 18-679)、gL编码序列(GenBank编号YP001129472,aa 24-137)分别导入含杆状病毒信号肽gp64载体,分别构建得到EBV-gH和EBV-gL重组杆粒DNA,分别记为Bacmid-gH和Bacmid-gL;
2)将重组杆粒Bacmid-gH和Bacmid-gL分别转染Sf9细胞(Invitrogen),得到表达EBV-gH(aa 18-679)和EBV-gL(aa 24-137)的重组杆状病毒;将2株重组杆状病毒同时感染High five细胞(Invitrogen),收获表达得到的EB病毒糖蛋白复合体gH/gL蛋白。
制备得到的EB病毒糖蛋白复合体gH/gL的SDS-PAGE(左)和Western-blot(右)如图1所示,检测结果,gH分子量大小为85KDa,gL分子量大小为26Kda,证明得到的是EB病毒糖蛋白复合体gH/gL。
试剂盒组成:
ELISA板:预包被EB病毒糖蛋白复合体gH/gL的ELISA板,其制备方法如下:
1)包被缓冲液将EBV-gH/gL稀释成4.5ug/ml,在ELISA板的每孔加入100ul上述稀释的EBV-gH/gL,37℃中孵育2小时;
2)甩干包被液,PBST洗涤3次,最后一次控干;加入3%BSA封闭液,每孔100ul,4℃过夜;
3)PBST洗板4次,最后一次拍干,放于4℃保存备用。
包被液:35mM NaHCO3,15mMNa2CO3,pH 9.6;
封闭液:3%BSA,1×PBS,0.05%吐温-20;
稀释液:1×PBS,pH 7.2-7.4;
洗涤液:1×PBS,0.05%吐温-20,pH7.2-7.4;
抗体:HRP标记的羊抗人IgA,购买自武汉博士德;
底物显色剂:TMB,购买自Sigma;
终止液:2M H2SO4。
鼻咽癌患者
收集中山大学肿瘤防治中心2013年6月~2013年12月期间住院及门诊鼻咽癌患者208例。入组标准:病理诊断已确诊II/III型鼻咽癌(基于1978年世界卫生组织分类系统);有准确的临床分期(基于美国AJCC癌症分期手册第七版);样本均来自南方鼻咽癌高发地区的病人(广东、广西、江西、湖南、福建、四川);样本血清为治疗前抽取;患者具有完整人口统计学资料,病历资料,包括血清VCA-IgA免疫酶法及血浆EBV DNA定量检测结果。基于这些标准,选取I期患者10名,II期患者34名,III期患者110名,IV期患者54名;其中男性患者153名,女性患者55名;VCA-IgA阳性者176名,VCA-IgA阴性患者32名(VCA-IgA滴度≥1:40判断为阳性);EBV DNA阳性者149名,EBV DNA阴性患者59名(EBV DNA拷贝数≥100 copies/mL判断为阳性)。
健康人群
随机抽取中山大学职工体检血清样本198份,排除其他疾病,保留所有健康人群资料,包括VCA-IgA免疫酶法检测结果。其中男性138名,女性60名,平均年龄41.6岁,VCA-IgA阳性者13名,VCA-IgA阴性者185名。
检测方法:
1)血清样本用样本稀释液以1:100稀释,以100μl/孔加样,37℃中孵育1小时;
2)PBST洗板5次,最后一次控干,加入稀释好的HRP标记的羊抗人IgA,100μl/孔,37℃中孵育30min;
3)PBST洗板5次。加入显色底物TMB,100μl/孔,37℃中孵育30min;
4)加入100μl 2M H2SO4终止反应;
5)终止反应后10min内酶标仪上(450nm)测定OD值。
检测结果及分析:
选择鼻咽癌病人209例,健康对照198例进行血清样本检测(血清来源于中山大学肿瘤防治中心),酶标仪读数后,用SPSS(16.0)统计学软件进行分析。经统计,该数据为非正态分布,因此用Wilcoxon秩和检验。
Wilcoxon秩和检验结果显示gH/gL-IgA抗体水平在两组人群中有显著性统计学差异,鼻咽癌患者的血清OD450值明显高于正常人组(p值小于0.0001),其散点分布图见附图2。
gH/gL在鼻咽癌及正常组中的比较
分组 | 中位数(OD450) | 四分位间距 | P |
<0.001 | |||
鼻咽癌 | 0.84 | 0.37 | |
对照组 | 0.49 | 0.19 |
通过对鼻咽癌患者及正常人组的gH/gL-IgA OD450 值结果绘制ROC曲线(附图3)。根据约登指数(Yuden index)最大时设定Cut-off值,分析曲线表明选择OD450 值=0.63为Cut-off值,gH/gL-IgA抗体用于诊断鼻咽癌的敏感度83.7%,特异性为82.3%。
样本血清中VCA抗原的检测
为进一步确立本研究建立检测方法的诊断价值,使用临床上常用的EBV检测指标VCA-IgA抗体对本研究中样本进行检测。
运用间接免疫荧光法(IFA)检测样本血清中EBV壳抗原(VCA)抗体(VCA-IgA)。根据检测结果绘制ROC曲线,并确定临界值:以titer≥1:40为VCA-IgA IFA的Cut-off值,其诊断鼻咽癌的灵敏度为84.6%。在209例鼻咽癌患者中,VCA-IgA IFA诊断鼻咽癌假阴性者共32人,在这32人中,运用gH/gL-IgA ELISA进行诊断,构建ROC曲线(如附图4),我们发现gH/gL-IgA ELISA曲线下面积(AUC)为0.879,32人中25人为gH/gL-IgA阳性,敏感度达78.1%。
实验数据表明,EB病毒糖蛋白复合体gH/gL的定量分析为鼻咽癌的诊断提供新的高灵敏度与特异性的检测指标,尤其对VCA-IgA阴性患者有较好的诊断价值,可以与VCA-IgA形成互补,减少漏诊,为早期筛查和诊断鼻咽癌提供了一个新途径。
Claims (2)
1.定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂在制备鼻咽癌早期诊断或筛查试剂中的应用,定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂包括直接或间接定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:定量EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的试剂选自EB病毒gH/gL复合体IgA抗体的ELISA检测试剂。
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