CN104313181B - 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104313181B
CN104313181B CN201410529309.XA CN201410529309A CN104313181B CN 104313181 B CN104313181 B CN 104313181B CN 201410529309 A CN201410529309 A CN 201410529309A CN 104313181 B CN104313181 B CN 104313181B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hypotype
bird flu
detection
quantitative pcr
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410529309.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104313181A (zh
Inventor
徐贵峰
张晓玮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou weibaxin Biotechnology Co., Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201410529309.XA priority Critical patent/CN104313181B/zh
Publication of CN104313181A publication Critical patent/CN104313181A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104313181B publication Critical patent/CN104313181B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851Quantitative amplification

Abstract

本发明公开了一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法,能够实现同时检测出待测标本中是否含禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型两种病原体,并能够实时精确检测并对病毒进行定量,应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针,使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强,从而避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题,基于上述优点,该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用,具有广泛的应用前景。

Description

一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法
技术领域
[〇〇〇1]本发明属于分子生物技术领域,具体涉及一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。背景技术
[0002] 禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型病毒(AIV)引起的一种禽类感染或疾病综合征。禽流感的发病情况取决于病毒的致病性及一级宿主的易感性,也受环境因素、饲养管理条件及并发疾病等因素的影响,可表现为无症状感染、轻度上呼吸道症状、产蛋量下降及急性的致病性死亡。
[0003] 2008年我国南方活禽市场监测到一株鸭源H4亚型禽流感病毒(H4N2),而从2009年起在中国南方禽流感疫情监测中分离到多株H4亚型禽流感病毒(AIV),目前发现的禽流感 H4亚型尚未形成对哺乳动物的全身性感染,但病毒来源复杂,抗原和基因型差异大,若H4亚型禽流感与高致病禽流感发生重组有可能构成巨大的危害。
[0004] H6亚型禽流感,在家禽中广泛存在,致病性和传播力都比较低。2013年6月,台湾出现全球首例H6N1患者,虽然只是个案,但表明H6亚型禽流感有潜在的传染人的能力。
[0005] 由于H4、H6禽流感不具备高致病性,且未出现规模性的哺乳动物感染,目前常规的 H4和H6检测方法,还是血清学诊断方法,其中最常用的为血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验,市场上鲜有相应的PCR试剂盒检测产品。血清学诊断方法建立在已发生病毒感染并产生抗体的基础上,而且由于禽流感病毒具备高度变异性和重组性,很容易出现假阳性和假阴性。使用病毒分离培养的方法进行检测,操作繁琐,耗时长,难以大规模推广。用普通PCR的方法, 相比前面所说的方法灵敏度和可操作性都有提升,然而后续的琼脂糖凝胶电泳仍然不够简便,且容易出现非特异扩增和产物污染。
[0006] 实时RT-PCR(real time RT-PCR,RRT-PCR)又称TaqMan PCLRRT-PCR检测禽流感快速、敏感、特异,由于其不仅采用了特异性引物,而且采用了特异性探针,使该方法的特异性高于传统PCR,大大减少了非特异性扩增造成的假阳性结果。全封闭反应的荧光RT-PCR技术是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号,实现了对PCR扩增过程实时监测, 无需电泳检测,彻底杜绝了 PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染。应用一步法RT-PCR和荧光水解探针,用于检测A型禽流感,其敏感度很高,可达10 fg(约100个)的靶RNA分子。发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是:
[0009] 一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒,所述试剂盒包含:
[0010] 用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针,其序列如下:
[0011] H4-F:5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’(SEQ ID N0.1),
[0012] H4-R:5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’(SEQ ID N0.2),
[0013] H4-P:5’_ TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’(SEQ ID N0.3);[〇〇14]和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针,其序列如下:
[0015] H6-F:5’_ TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA _3’(SEQ ID N0.4),
[0016] H6-R:5’_ CACTGCATTGAACCATTTGAACA _3’(SEQ ID N0.5),
[0017] H6-P:5’_ TGATCATGGCAATAGG -MGB-3’(SEQ ID N0.6);[〇〇18]其中,荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。
[0019] 优选的,所述试剂盒还包含10X双色荧光定量PCR buffer,其含有以下成分: 500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2、250mM KC1 以及 15v/v%的DMS0。
[0020] 优选的,所述试剂盒还包含病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B;病毒提取液A每 1000ml中含有:异硫氰酸胍480g,0.1M Tris-HCl(pH 6.4)500ml,0.2M EDTA(pH8.0)120ml; 病毒提取液B为异丙醇。[〇〇21] 一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR方法,包括以下步骤:[〇〇22] 1)提取待测样品中的总RNA;[〇〇23] 2)以得到的总RNA为模板,使用用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针
[0024] H4-F:5’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3’(SEQ ID N0.1),
[0025] H4-R:5’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3’(SEQ ID N0.2),
[0026] H4-P:5’- TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA -3’(SEQ ID N0.3),[〇〇27]和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针
[0028] H6-F:5’_ TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA _3’(SEQ ID N0.4),
[0029] H6-R:5’_ CACTGCATTGAACCATTTGAACA _3’(SEQ ID N0.5),
[0030] H6-P:5’- TGATCATGGCAATAGG -MGB -3’(SEQ ID N0.6);[〇〇31] 进行双色荧光定量PCR检测,其中,荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同;[〇〇32] 3)结果分析:反应结束后,根据荧光Ct值判断待测样品是否为禽流感病毒H4亚型、禽流感病毒H6亚型阳性。[〇〇33]优选的,双色荧光定量PCR反应体系总体积为25yl,其组成如下:双色荧光定量PCR Mix 20yl,反转录酶、Taq酶混合液ly 1,以及提取的待测样品中的总RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4yl;其中,双色荧光定量PCR Mix中含有H4-F、H4-R、H4-P、H6-F、H6-R、H6-P& 及10X双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。[〇〇34] 优选的,所述10X双色荧光定量PCR buffe含有以下成分:500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2、250mM KC1 以及 15v/v%的DMSO。[〇〇35] 双色荧光定量PCR Mix的组成为:
[0036] 10X双色荧光定量PCR buffer 2.5yl
[0037] H4-F(10yM) lyl
[0038] H4-R(10yM) lyl
[0039] H6-F(10yM) lyl
[0040] H6-R(10yM) lyl
[0041] H4-P(10yM) 0.5yl
[0042] H6-P(10yM) 0.5yl
[0043] dNTPS (lOmM) lyl
[0044] ddH2〇(Rnase free) 11.5y1
[0045] 总体积 20.0yl。[〇〇46] 优选的,双色荧光定量PCR反应条件为:93°C 2分钟,93°C 5〜30秒,55〜58°C 45 秒,40个循环。[〇〇47]优选的,步骤3)结果分析的条件设定如下:
[0048] 1)设置基线:对ABI 7000、7500、7700仪器设为6〜15个循环,对PE5700设为3〜15 个循环,对MJ Research 0pt1n2仪器设为6〜12个循环;
[0049] 2)设置阈值:以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为原则。
[0050] 优选的,步骤3)结果分析判断方法如下:[〇〇51] 1)阳性:Ct值小于等于35.0,且曲线有指数增长期;[〇〇52] 2)可疑:Ct值大于35.0且小于40.0,重复一次实验,如果Ct值仍小于40.0,且曲线有指数增长期,为阳性,否则为阴性;[〇〇53] 3 )阴性:检测不到样品Ct值或Ct值为40。[〇〇54]本发明的有益效果是:[〇〇55]本发明提供了一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒及检测方法,能够实现同时检测出待测标本中是否含禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型两种病原体,并能够实时精确检测并对病毒进行定量,应用极为方便。由于引入了特异性扩增引物和荧光探针,使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强,从而避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题,基于上述优点,该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用, 具有广泛的应用前景。附图说明[〇〇56]图1为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对禽流感病毒H4亚型(AIV-H4)检测的敏感性实验,从左到右依次为1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102拷贝AU的标准品的扩增结果。[〇〇57]图2为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)检测的敏感性实验,从左到右依次为1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102拷贝/yl的标准品的扩增结果。[〇〇58]图3为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对AIV-H4检测的特异性实验结果。[〇〇59]图4为应用本发明联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒对AIV-H6检测的特异性实验结果。具体实施方式
[0060] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明内容。
[0061] 特异性引物及探针的设计:
[0062] 根据从Genbank上检索到的禽流感病毒(Avian influenza virus)Hl〜H16的核酸序列,设计用于检测禽流感病毒H4亚型和禽流感病毒H6亚型的引物和探针,其序列如下: [〇〇63] 禽流感病毒H4亚型(AIV-H4)的
[0064] 上游引物:H4-F: 5,-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3,( SEQ ID N0 • 1),
[0065] 下游引物:財-1?:5’-〇^1'1'〇^^〇八八6〇〇^〇八八-3’(5£0 10从).2),
[0066] 荧光探针:財-?:5’-了6(:11^了厶60厶(^6(:1'1'打66〇:1'11^-3’(5£0 10勵.3),扩增片段长度为75bp;
[0067] 和[〇〇68] 禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)的
[0069] 上游引物:H6-F:5’_ TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA _3’(SEQ ID N0.4),
[0070] 下游引物:H6-R:5’_ CACTGCATTGAACCATTTGAACA -3’(SEQ ID N0.5),
[0071] 荧光探针:H6-P:5’_ TGATCATGGCAATAGG -MGB _3’(SEQ ID N0.6),扩增片段长度为136bp。[〇〇72] 进行双色荧光定量PCR检测,其中,禽流感病毒H4亚型报告基团为Fam,禽流感病毒H6亚型的荧光探针报告基团为Vic〇 [〇〇73]标本采集和预处理:
[0074] 本方法及试剂盒适用标本类型包括禽类的组织、血清、咽拭子、分泌排泄物等。[〇〇75] 组织标本:无菌条件下取组织约100〜200mg,置入1.5ml洁净EP管中,保存待检。[〇〇76]血清:用一次性无菌注射器抽取受检鸟静脉血3_5ml,留取血清,保存待检。[〇〇77] 咽及泄殖腔等拭子:用棉拭子取咽或泄殖腔分泌物,将拭子放入盛有1.0ml PBS的离心管中,立即送检。
[0078]分泌排泄物:无菌条件下采集,保存待检。采集的标本应该尽快送检,或者保存于-20。。。[〇〇79]阳性质控品的制备:[〇〇8〇] 分别以禽流感病毒H4亚型(AIV-H4)和禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)RNA标准品为模板,进行PCR扩增,步骤如下:[0081 ]反转录体系:
[0082] Oligo dT Primer (50處)lyl、dNTP Mixture (10mM ) lyl以及总RNA 2yg,65°C 5min,激冷,然后加入5XPrimeScript Buffer 4yl(TAKARA公司)、RNase Inhibitor (40U/ yl) 0.5iil、P;rimeSc;ript RTase (200 U/yl) lyl和RNase free H2O 4.5iil〇 [〇〇83]反转录条件:
[0084] 3(TC 10min,然后 42°C,30min,进行逆转录和成 cDNA。
[0085] PCR 体系:
[0086] 10XPCR Buffer 5yl、TaKaRa Taq(5U/yl) lyl、dNTP Mixture(各2.5mM) 4yl、 上述H4和H6上下游引物(10虚)各0.5yl、上述cDNA 0.5yl和RNase free H2O 39.25yl。
[0087] PCR 条件:
[0088] 按照94°C 3分钟预变性,94°C 30秒,60°C 30秒,72°C 45秒,共35个循环,72°C延伸10分钟。[〇〇89]反应后取5yl PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测,将切胶纯化的PCR产物与PMD-18T载体连接,重组质粒pMD-18T-H4或pMD-18T-H6涂布于培养皿上,转化感受态DH5a细胞,挑取阳性菌落抽提质粒,取品5yl稀释测其A260nm和A280nm吸光度值,计算其浓度并换算成绝对拷贝数,稀释成1.〇 X 107拷贝AU,作为双色荧光定量PCR的阳性质控品。
[0090] RNA 的提取:[〇〇91] 1)固体组织:取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎,加入1.5ml生理盐水继续研磨,待勾衆后转至1.5ml的EP管中,lOOOOrpm离心2min,取上清100yl于1.5ml的EP管中,加入200yl RNA提取液A充分震荡,静置3min;[〇〇92] 2)血清或病毒液:取100yl血清加入200yl RNA提取液A充分震荡,静置3min,然后加入200yl RNA提取液B,用力震荡15s,4°C 13,000rpm离心5min;[OO93] 3)弃上清,加入lml 75%乙醇,充分混勾,13,OOOrpm离心5min,小心吸去大部分残留液体;[〇〇94] 4)将提取管敞口在室温空气中干燥10min,使液体挥发干净,用20yl DEPC处理水溶解沉淀即为待检测的病毒RNA。[〇〇95] 双色荧光定量PCR扩增:[〇〇96] 每个测试反应体系配制如下,双色PCR Mix 20yl、反转录酶系0.5yl、Taq酶系0.5y 1,瞬时离心,然后加入待检测的RNA 4yl;同样按照上述体系设置阳性和阴性对照,加入阳性质控品或阴性质控品4iU进行扩增。
[0097]将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内,设置各检测的名称和荧光基团种类(检测AIV-H4的报告基团选择FAM,检测AIV-H6的报告基团选择VIC,淬灭基团选择TAMRA),设定循环条件:ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器循环条件为93°C 2分钟,93°C 30秒,55°C 45秒,40个循环;LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93°C 2分钟,93°C 5秒,58°C 45秒,共40个循环。[0〇98]结果分析和判定:[〇〇99] 1、结果分析条件设定
[0100] 1)设置基线(baseline):对ABI 7000、7500、7700等仪器设为6-15cycle,对PE5700 设为3_15cycle,对MJ Research 0pt1n2设为6_12cycle。特殊情况可对基线适当调整。
[0101] 2)设置阈值(threshold):以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线) 的最尚点。[〇1〇2] 2、结果判断[〇1〇3] (1)阳性:检测样本Ct值小于等于35.0,且曲线有明显的指数增长期;[〇1〇4] (2)可疑:检测样本Ct值大于35.0且小于40.0,重复一次实验,如果Ct值仍小于40.0,且曲线有明显的指数增长期,为阳性,否则为阴性;
[0105] (3)阴性:检测不到样本Ct值或Ct值为40。
[0106] 灵敏度实验:
[0107] 上述阳性质控品(107拷贝AU),依次稀释为1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X 103、1.0 X 102、1.0 X 101、1.0 X 10Q拷贝/yl,进行灵敏度实验。
[0108] 双色荧光定量PCR体系中AIV-H4检测的敏感性实验见图1,双色荧光定量PCR体系中AIV-H6检测的敏感性实见图2。图1为双色荧光PCR体系中AIV-H4检测的敏感性实验,从左到右依次为1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102 拷贝/yl的标准品的扩增结果。图2为双色荧光PCR体系中AIV-H6检测的敏感性实验,从左到右依次为1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102 拷贝/yl的标准品的扩增结果。
[0109]结果证实本试剂盒检测灵敏度为:1.0 x loir1,该双色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍,精确性优于普通PCR方法。[〇11〇] 特异性实验:
[0111] 根据上述的双色荧光定量PCR检测方法,用禽流感病毒H4亚型、禽流感病毒H6亚型、二者双阳性以及其它病毒如猪流感HlNl(SIV-HlNl)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒 H5N1亚型(AIV-H5N1)、禽流感病毒H7N9亚型(AIV-H7N9)、禽流感病毒H9N2(AIV-H9N2)、阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证,结果证实,本发明方法及试剂盒特异性好,未出现假阳性,吻合度为1 〇〇%,实验结果见图3和图4。
[0112] 图3为双色方法PCR体系中禽流感病毒H4亚型(AIV-H4)的特异性实验结果,AIV-H4 为阳性、SIV-H1N1、AIV-H6N1、AIV-H5N1、AIV-H7N9、AIV-H9N2、NDV 及阴性质控品均为阴性。
[0113] 图4为双色方法PCR体系中禽流感病毒H6亚型(AIV-H6)的特异性实验结果,AIV-H6 为阳性、SIV-H1N1、AIV-H4N2、AIV-H5N1、AIV-H7N9、AIV-H9N2、NDV 及阴性质控品均为阴性。

Claims (3)

1.一种联合检测禽流感H4和H6亚型的双色荧光定量PCR试剂盒,所述试剂盒包含: 用于检测禽流感病毒H4亚型的引物和探针,其序列如下:H4-F:5 ’-GATTTCGTTCTCCATATCATGCTTT-3 ’(SEQ ID N0.1),H4-R:5 ’-CCATTCTGACAAGCCCACAA-3 ’(SEQ ID N0.2),H4-P:5’_ TGCTTGTAGCACTGCTTTTGGCCTTCA _3’(SEQ ID N0.3);和用于检测禽流感病毒H6亚型的引物和探针,其序列如下:H6-F:5,- TCGAGCAGTCTAGTTTTGGTAGGA -3'(SEQ ID N0.4),H6-R:5’_ CACTGCATTGAACCATTTGAACA _3’(SEQ ID N0.5),H6-P:5’_ TGATCATGGCAATAGG -MGB-3’(SEQ ID N0.6);其中,荧光探针H4-P和H6-P的报告基团不相同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包含10 X双色荧光定量 PCR缓冲液,其含有以下成分:500mM pH值为8.0的Tris-HCl、50mM MgCl2、250mM KC1以及 15v/v%的DMS0。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包含病毒核酸提取液 A、病毒核酸提取液B;病毒提取液A每1000ml中含有:异硫氰酸胍480g,500ml pH值为6.4的 0.1M Tris-HCl,120ml pH值为8.0的0.2M EDTA;病毒提取液B为异丙醇。
CN201410529309.XA 2014-10-09 2014-10-09 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法 Active CN104313181B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410529309.XA CN104313181B (zh) 2014-10-09 2014-10-09 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410529309.XA CN104313181B (zh) 2014-10-09 2014-10-09 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104313181A CN104313181A (zh) 2015-01-28
CN104313181B true CN104313181B (zh) 2016-11-02

Family

ID=52368489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410529309.XA Active CN104313181B (zh) 2014-10-09 2014-10-09 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104313181B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106337090A (zh) * 2015-07-10 2017-01-18 北京众拓联科技发展有限公司 H4禽流感病毒rRT-PCR检测引物与探针检测试剂盒及检测方法
CN107287346B (zh) * 2016-03-30 2020-11-06 广东省疾病预防控制中心 用于禽流感病毒n亚型基因分型的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN109666767A (zh) * 2019-02-01 2019-04-23 扬州大学 检测并区分h7亚型禽流感病毒强弱毒的一步法实时荧光定量pcr引物、探针及试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100378230C (zh) * 2005-12-01 2008-04-02 上海交通大学 H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法
CN101724713A (zh) * 2009-12-21 2010-06-09 中国检验检疫科学研究院 一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒
CN102212623B (zh) * 2011-06-02 2013-01-16 广东省农业科学院兽医研究所 一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104313181A (zh) 2015-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102260749B (zh) H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒
CN104313181B (zh) 一种联合检测禽流感h4和h6亚型的双色荧光定量pcr试剂盒及检测方法
CN103275862A (zh) 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN104498626A (zh) 一种禽流感h5n6亚型的双色荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN102337351A (zh) 一种流感病毒分型检测试剂盒
CN105349707A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN103045761B (zh) 用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法
CN104745689A (zh) 一种用于检测百日咳杆菌的引物、探针和试剂盒
CN104195266A (zh) 检测小儿肺炎三种病原体的四重荧光定量pcr试剂盒
CN101812539A (zh) 猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法
CN101886139A (zh) 一种新型甲型流感病毒h1n1亚型双色荧光pcr检测方法及其试剂盒
CN104593486A (zh) 一种用于检测血吸虫的引物、探针和试剂盒
CN105063218B (zh) 快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量pcr试剂盒
CN103614494A (zh) 一种犬瘟热和犬细小病毒双色荧光定量pcr检测试剂盒
CN110241184A (zh) 一种快速检测鸭疫里默氏杆菌的rpa试剂盒及其用途
CN102329888A (zh) 一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量PCR检测方法及其试剂盒
CN102304591B (zh) 鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用
CN106435030B (zh) 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN107460249A (zh) 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒
CN101230405B (zh) H5型和h9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测试剂盒及方法
CN104946753A (zh) 用于牛支原体检测的特异性引物对、检测试剂盒及其使用方法和应用
CN104862311A (zh) 一种基于Taqman探针检测扬子鳄的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法
CN109355435A (zh) H7n9病毒检测用的核酸组合物和h7n9病毒实时荧光定量检测试剂盒及其应用
CN108486282A (zh) 一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法
CN103320528A (zh) 一种用于以荧光rt-pcr检测样品中禽流感病毒的引物对、探针和包含其的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 510663 NO.201, building G11, No.31 Kefeng Road, Science City, Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangdong Province

Patentee after: Guangzhou weibaxin Biotechnology Co., Ltd

Address before: 510663 Yimin Science Park No.1 401, No.232 Kezhu Road, Guangzhou Science City, Guangzhou, Guangdong Province

Patentee before: GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Bicolor fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) kit and detection method for jointly detecting H4 and H6 subtypes of avian influenza

Effective date of registration: 20200521

Granted publication date: 20161102

Pledgee: China Co truction Bank Corp Guangzhou economic and Technological Development Zone sub branch

Pledgor: Guangzhou weibaxin Biotechnology Co., Ltd

Registration number: Y2020440000120

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20220119

Granted publication date: 20161102

Pledgee: China Co. truction Bank Corp Guangzhou economic and Technological Development Zone sub branch

Pledgor: Guangzhou weibaxin Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2020440000120