CN104164414B - 酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法。先将氧化石墨烯均匀分散于磷酸缓冲液中，然后加入酶混匀得混合液，再将铜盐水溶液加入混合液中，在恒温摇床中反应后即得所述酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物；所述的铜盐为硫酸铜、醋酸铜或氯化铜。本发明酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物能提高酶活和酶的稳定性；同时制备方法柔和环保，实验过程中没有涉及任何高温和有机试剂等，且设备非常简单，作为一种新型的有机‑无机材料，其可望在酶固定、电化学、材料学、生物学等多领域有较大潜力。

Description

酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于新材料技术领域，具体涉及一种酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法。
背景技术
酶是一类具有生物催化功能的生物大分子，是一种生物催化剂，其反应速度快，选择特异性强，能完成复杂的反应过程，且反应条件温和，工艺简单，污染小。因此生物酶已经在医药、工业、食品、饲料、环保、能源等多领域得到广泛应用。然而，酶作为生物催化剂，它的生物活性常常在应用过程中丧失，导致不可恢复性的酶失活，其稳定性和重复利用率也很低。酶固定能克服一定的缺陷，但可能造成酶的构象变化，从而在一定程度上导致酶活降低，且重复利用性很弱。很多酶的生产过程不易，价格昂贵，因此，增强酶活、提高酶的稳定性和重复利用率就显得格外重要。
氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化后的产物，它的单原子层可以在横向尺寸上扩展，其结构超越了一般化学和材料科学的尺度。因此，GO被视为一种非传统型态材料，是一种性能极其优越的新型碳材料，其比表面积较高且表面具有丰富的官能团，比如羰基、羟基、羧基和酚羟基。GO因其在热学、光学、机械力学等方面优越的表现及其突出的纳米结构，21世纪以来吸引了众多研究人员参与研究。其中，氧化石墨烯复合材料备受关注，包括聚合物类复合材料和无机物类复合材料等。改性的GO及其复合材料在能量储存、传感器、有机电化学、材料科学等众多领域均具有深远意义。
无机材料的纳米花已经在催化和分析科学中得到广泛应用，但是有机-无机材料的杂化纳米花是2012年Ge等首次发现的，这种酶-无机杂化材料可提高酶活，提高酶稳定性和重复利用性。
从目前的文献报道可以将酶-无机杂化纳米花的研究分为以下几类：
①机理的研究
有机-无机材料的杂化纳米花是2012年J. Ge（Protein-inorganic hybridnanoflowers, Nature nanotechnology, 2012, 7, 428-432）等首次发现的，研究表明大多数酶与磷酸铜晶体杂化后的复合物呈现出“花朵”状的纳米结构，其复合物中酶的活性也都有不同程度的提高，并进一步比较了不同酶与无机材料（磷酸铜晶体）杂化纳米花的结构及酶活的提高，解释了在杂化复合材料中各个成分所起到的作用。最初磷酸铜晶体形成，蛋白质骨架上的氨基和铜离子结合形成主要的成核位点，之后大量的蛋白质分子和晶体在成核位点形成，最后，非均质的生长形成花一样的结构。此外，分析比较了不同酶形成的纳米花。
②实验条件的研究
L. B. Wang 等人 (A New Nanobiocatalytic System Based on AllostericEffect with Dramatically Enhanced Performance, Journal of the AmericanChemical Society, 2013, 135, 1272-1275) 在J.Ge的基础上详细分析了各种条件对酶-无机材料纳米花的影响，主要包括缓冲液的浓度、pH、酶的浓度、金属离子的浓度。结果发现不同的实验条件下得到不同的纳米结构：纳米花、纳米片、平行六面体，同时还证明了纳米花中除了酶活增加以外，其稳定性和重复利用率也大大提高。K. Ghosh (Temperature-dependent morphology of hybrid nanoflowers from elastin-like polypeptides,APL Materials, 2014, 2, 021101)研究了温度对纳米花的影响，发现不同的温度对纳米花的结构有很大影响。
③ 多酶的研究
J. Sun 等人(Multi-enzyme co-embedded organic-inorganic hybridnanoflowers: synthesis and application as a colorimetric sensor, Nanoscale,2014, 6, 255-262) 研究了多酶-无机材料杂化纳米花，其实验中复合物由两种不同的酶和无机成分复合得到。
综上所述，就酶-无机杂化纳米材料而言，目前研究还处于探索阶段，主要的研究是围绕单一的酶-无机杂化纳米花。氧化石墨烯作为新型的无机材料虽然具有很好的性能，在酶固定中也有研究，但将酶-无机杂化材料和氧化石墨烯结合起来的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物及其制备方法，所述复合物在不破坏酶和氧化石墨烯结构的情况下，酶活有所提高，稳定性增强。
本发明采用的技术方案如下：
酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，先将氧化石墨烯均匀分散于磷酸缓冲液中，然后加入酶混匀得混合液，再将铜盐水溶液加入混合液中，在恒温摇床中反应后即得所述酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物；所述的铜盐为硫酸铜、醋酸铜或氯化铜。
复合物中各物质的质量百分含量为：氧化石墨烯25-30%，酶35-45%，磷酸铜晶体25-35%。
其中，投料质量比为：氧化石墨烯：酶：铜盐为8-12:10-20:10-20。
优选的，所述铜盐为硫酸铜，氧化石墨烯：酶：铜盐为10:15:12.8。
铜盐溶液的浓度无严格要求。
所述磷酸缓冲液的浓度为0.1-0.5 mol/L， pH控制在5.5-7.5。
在恒温摇床中反应的条件为：温度20-40℃，摇床转速为100-160 rpm，反应2-3天；优选的，在恒温摇床中反应的条件为：温度25℃，摇床转速为140 rpm，反应2天。
反应后分离沉淀、洗涤并冷冻干燥。
优选的，在不高于-30℃的条件下干燥4-8个小时。
本发明中磷酸缓冲液的pH根据具体的酶而定，先将氧化石墨烯均匀分散于磷酸缓冲液中，超声分散均匀后加入酶，摇匀，再加入铜盐溶液，放入摇床中反应，之后静置12 h，离心分离，冷冻干燥。
冷冻干燥具体可在真空冷冻干燥仪中进行。
其中，所述复合物是在磷酸缓冲液中加入硫酸铜、氯化铜或醋酸铜溶液，生成磷酸铜晶体，进而和酶、氧化石墨烯发生进一步反应而得到。
本发明将酶、氧化石墨烯在二价铜离子存在的条件下生成一种新型有机-无机杂化纳米复合物，所述复合物结构规则，实现了酶活性的提高，酶稳定性的增强，同时还具有抗菌性能、吸附性能。其中的氧化石墨烯，一方面作为酶的结合物，另一方面为酶提供载体，可将氧化石墨烯的优良性质广泛应用于工业中。制备方法简单，条件温和。作为一种具有新型功能结构的有机-无机杂化纳米复合物，将生物研究和材料科学结合在一起，可望在有关酶工程应用的食品加工、发酵工程、医药科学、造纸业、污水处理、生物反应器等多方面得到广泛的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物能提高酶活和酶的稳定性；同时制备方法柔和环保，采用摇床反应的动态反应方法，相对于现有有机-无机材料的杂化纳米花制备多采用的静态反应法而言，可以得到规则的产品，有异于静态法得到的颗粒状产品。实验过程中没有涉及任何高温和有机试剂等，且设备非常简单，作为一种新型的有机-无机材料，其可望在酶固定、电化学、材料学、生物学等多领域有较大潜力。
附图说明
图1为实施例1获得的溶菌酶/氧化石墨烯复合物的扫描电镜图；
图2为实施例2获得的漆酶/氧化石墨烯复合物的扫描电镜图；
图3为实施例3获得的碳酸酐酶/氧化石墨烯复合物的扫描电镜图。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物，质量组成为：氧化石墨烯（GO）27%；溶菌酶41%；磷酸铜晶体 32%。溶菌酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的扫描电镜图如图1所示，由图可知，所述复合物具有非常规则的结构。
（1）复合物的制备：
将10mg氧化石墨烯通过超声充分溶解在pH 6.0的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)中，加入15 mg溶菌酶混匀，再加入0.667 mL 120 mM的硫酸铜溶液，在恒温摇床中反应，条件为：温度25℃，摇床转速为140 rpm，反应48 h。之后分离沉淀、洗涤并于真空冷冻干燥仪中进行冷冻干燥，冷冻温度设置在-30 ℃以下，干燥6小时。
（2）复合物抑菌性能研究
实验采用大肠杆菌ATCC25922作为试剂检验复合物的抑菌性能。
称取牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，加入1000 ml蒸馏水，充分溶解，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20 min，得到液体培养基。用移液枪取20 ml液体培养基于锥形瓶中，挑取1-2环活化的菌种于液体培养基中，将锥形瓶放入37℃、160 r/min的摇床中培养24 h，制备出106数量级的大肠杆菌菌液备用。配置一定浓度的药物贮存液，所有药物为粉剂，其有效力为750 μg/mg。用分析天平精确称取药物0.6826 mg。将0.6826 mg药物溶于1mL LB稀释液中，此稀释液的药物浓度为5120 μg/mL。取无菌试管5支排成一排并依次编号，第1管中加入1.8 mL LB，其余加入1 mL LB。取药物稀释液0.2 mL加入第1管，从第1管中吸取1 mL加入第2 管，依此操作至第5管，将第5管吸取1 mL弃去。此时各管的药物浓度依此是：512、256、128、64、32 μg/mL。再向各管中加入106数量级的大肠杆菌菌液1 mL。对照管设置两个：只含2 mL菌液；只含2 mL LB。将各管置于37 ℃、250 rpm的摇床中培养2 h。培养后取出试管摇匀，吸取0.5 mL菌液于4.5 mL的无菌水中稀释，该试管中菌浓度为培养后浓度的10-1，并按此稀释，得到为稀释浓度依次是10-2,10-3,10-4。取10-4浓度的稀释液0.1 mL于平板上，涂布均匀（此步骤做两个平行）。将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中，培养12 h后观察结果，采集图像并菌落计数，计算抑菌率（BR）。抑菌率达到90%的最小浓度即是药物的最小抑菌浓度。从上述实验中得知，溶菌酶的最小抑菌浓度为1250 μg/mL，氧化石墨烯的最小抑菌浓度为1024 μg/mL，磷酸铜晶体的最小抑菌浓度为256 μg/mL（此浓度下的抑菌率为95%），而复合物最小抑菌浓度为256 μg/mL（此浓度下的抑菌率为98%）。可见相同质量下同时含有氧化石墨烯、磷酸铜和溶菌酶的复合物其中溶菌酶的活性有所提高，总体复合物的抑菌性也增强。
（3）贮藏稳定性研究
将0.03mg/mL的溶菌酶溶液和复合物溶液分别放置一周后，测其抑菌性，复合物抑菌性保留81%，游离溶菌酶抑菌性则仅保留43%。可见，溶菌酶/氧化石墨烯杂化纳米复合物中酶的稳定性显著增强。
实施例2
酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物，质量组成为：GO 27 %；漆酶 41 %；磷酸铜晶体 32 %。漆酶/氧化石墨烯复合物扫描电镜图如图2所示。
（1）复合物的制备
将10mg氧化石墨烯通过超声充分溶解在pH 5.7的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)中，加入15 mg漆酶混匀，再加入0.667 mL 120 mM的硫酸铜溶液，在恒温摇床中反应，条件为：温度25℃，摇床转速为140 rpm，反应48 h。之后分离沉淀、洗涤并于真空冷冻干燥仪中进行冷冻干燥，冷冻温度设置在-30 ℃以下，干燥4小时。
（2）复合物对染料的去除
配置一定浓度的染料溶液，将一定量的复合物加入染料溶液中反应一段时间，离心取上清液测吸光度，计算出复合物对染料的去除率。
0.0732 mg/mL的复合物在100 min后对200 mg/L的亚甲基蓝的去除率为65.17%，0.03 mg/mL游离漆酶在100 min后对亚甲基蓝的去除率几乎为0。0.0732 mg/mL的复合物在10 min后对200 mg/L的茜素红的去除率为88.62%，0.03 mg/mL游离漆酶在10 min后对茜素红的去除率为14.36%。
（3）贮藏稳定性研究
将0.03mg/mL的漆酶溶液和复合物溶液分别放置一周后，测其活性。相对于游离的漆酶，复合物则保持了较高的酶活，可达60%，而游离漆酶仅为保留37%的酶活。
实施例3
酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物，质量组成为：GO 27 %；碳酸酐酶 41%；磷酸铜晶体 32 %。碳酸酐酶/氧化石墨烯复合物扫描电镜图如图3所示。
（1）复合物的制备：
将氧化石墨烯通过超声充分溶解在pH 7.0的磷酸缓冲液(0.2 mol/L)中，加入15mg碳酸酐酶混匀，再加入0.667 mL 120 mM的硫酸铜溶液，在恒温摇床中反应，条件为：温度25℃，摇床转速为140 rpm，反应48 h。之后分离沉淀、洗涤并于真空冷冻干燥仪中进行冷冻干燥，冷冻温度设置在-30 ℃以下，干燥6小时。
（2）复合物对二氧化碳的固定
将复合物（3 mg）溶解在30 mL 1 M氯化钙溶液中，在冰水浴条件下，持续通入二氧化碳气体30 min。离心冷冻干燥后，在复合物的表面可看到生成的碳酸钙颗粒。
实施例4
将硫酸铜替换为氯化铜，加入的质量为13.6mg，其他同实施例1。
实施例5
将硫酸铜替换为醋酸铜，加入的质量为16mg，其他同实施例1。

Claims (8)

1.酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，先将氧化石墨烯均匀分散于磷酸缓冲液中，然后加入酶混匀得混合液，再将铜盐水溶液加入混合液中，在恒温摇床中反应后即得所述酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物；所述的铜盐为硫酸铜、醋酸铜或氯化铜；投料质量比为：氧化石墨烯：酶：铜盐为8-12:10-20:10-20；在恒温摇床中反应的条件为：温度20-40℃，摇床转速为100-160 rpm，反应2-3天。
2.如权利要求1所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，在恒温摇床中反应的条件为：温度25℃，摇床转速为140 rpm，反应2天。
3.如权利要求1所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1-0.5 mol/L， pH控制在5.5-7.5。
4.如权利要求1所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述铜盐为硫酸铜，氧化石墨烯：酶：铜盐为10:15:12.8。
5.如权利要求1所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，反应后分离沉淀、洗涤并冷冻干燥。
6.如权利要求5所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物的制备方法，其特征在于，在不高于-30℃的条件下干燥4-8个小时。
7.权利要求1-6任一所述制备方法获得的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物。
8.如权利要求7所述的酶/氧化石墨烯功能型杂化纳米复合物，其特征在于，复合物中各物质的质量百分含量为：氧化石墨烯25-30%，酶35-45%，磷酸铜晶体 25-35%。
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