CN104151418A - 一种体外重组表达人tarc/ccl17可溶性蛋白的方法 - Google Patents

一种体外重组表达人tarc/ccl17可溶性蛋白的方法 Download PDF

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张伟
杨旸
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Abstract

本发明公开了一种体外重组表达人TARC/CCL17蛋白的方法。本发明方法是通过大肠杆菌融合表达人TARC/CCL17蛋白，再使用蛋白酶切，亲和层析，凝胶层析和离子交换层析的方法纯化得到纯净的人TARC/CCL17蛋白。使用本发明方法使得人TARC/CCL17蛋白可以在体外实现大量的可溶性表达，大大降低了TARC/CCL17蛋白的生产成本和生产难度。

Description

一种体外重组表达人TARC/CCL17可溶性蛋白的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及体外重组表达人TARC/CCL17蛋白的方法。
背景技术
TARC/CCL17 cDNA编码一个94氨基酸的蛋白前体，其中前23个氨基酸作为信号肽，经过剪切最终成为71个氨基酸的成熟蛋白。TARC/CCL17主要由树突状细胞、角质细胞、内皮细胞产生，其受体为CCR4。不同于其它临床标志物和趋化因子，血清TARC/CCL17存在于血小板中，并大量存在于特应性皮炎病人体内。已有研究发现,在特应性皮炎病人血清中TARC/CCL17蛋白的差异远大于其在病人血浆内的差异。因此， TARC/CCL17可以用作特应性皮炎检测临床标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外重组表达人TARC/CCL17蛋白的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
通过体外重组，借由大肠杆菌表达TARC/CCL17蛋白，而后使用亲和层析、凝胶层析和离子交换层析的方法分离纯化TARC/CCL17蛋白，进而得到纯TARC/CCL17蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将使得人TARC/CCL17蛋白可以通过大肠杆菌实现可溶性表达，大大降低了TARC/CCL17蛋白的生产成本和生产难度。
附图说明
图1为TARC/CCL17在大肠杆菌中融合表达后结果，泳道1为裂解物，泳道2为上清，泳道M为蛋白marker；
图2经纯化得到的TARC/CCL17蛋白，泳道1、2、3为收集到的蛋白峰，泳道M为蛋白marker。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
1. 将已知的TARC/CCL17对应的cDNA序列（SEQ ID NO:1）整合进大肠杆菌载体PETM3C中，将构建成的载体转化至大肠杆菌BL21。
2. 将菌体置于37℃，200rad/min的摇床中培养至OD600在0.6-0.8为止，加入IPTG，使菌液中IPTG的浓度达到0.2mmol/L ，并置于37℃，200rad/min的摇床中培养16h。
3. 离心4000g，20min收取菌体后，悬置于少量含50mM Tris-HCl，20mM NaCl的溶液中。
4. 超声破碎菌体后，离心18000g，20min，收取上清。
5. 使用亲和层析纯化蛋白，结合液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，5mM咪唑，清洗液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，20mM，洗脱液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，200mM。
6. 使用离子交换纯化蛋白，低盐溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl，高盐溶液为50mM Tris-HCl，1M NaCl。
7. 使用EK酶酶切蛋白，酶切溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl。
8. 使用凝胶层析纯化蛋白，溶液为50mM Tris-HCl，20mM NaCl。图中可见纯化后TARC/CCL17蛋白纯度极高，在95%以上。
申请人：深圳北京大学香港科技大学医学中心
发明名称：一种体外重组表达人TARC/CCL17蛋白的方法
 
SEQ ID NO:1
名称：TARC/CCL17
序列：gctcgagggaccaatgtgggccgggagtgctgcctggagtacttcaagggagccattccccttagaaagctgaagacgtggtaccagacatctgaggactgctccagggatgccatcgtttttgtaactgtgcagggcagggccatctgttcggaccccaacaacaagagagtgaagaatgcagttaaatacctgcaaagccttgagaggtcttga

Claims (1)

1.一种体外重组表达人TARC/CCL17蛋白的方法，其特征在于使用大肠杆菌克隆并表达TARC/CCL17蛋白，经超声破碎菌后采用凝胶层析和离子交换层析的方法纯化，并最终得到纯TARC/CCL17蛋白。
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CN108329389A (zh) * 2017-01-19 2018-07-27 深圳北京大学香港科技大学医学中心 一种趋化因子tarc/ccl17体外表达和分离纯化的方法

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PB01 Publication
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