CN104030991A - 一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用海洋细菌发酵制备巨杆菌素Bacimethrin的方法。巨杆菌素(Bacimethrin,4-Amino-2-methoxy-5-pyrimidylmethanol)分子量为155.16，分子式为C6H9N3O2。通过天然产物分离方法从海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5)发酵产物中分离得到。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子化合物制备方法，特别是一种来源于海洋微生物的巨杆菌素生产方法。
背景技术
在动植物养殖业，长期高剂量使用化学药物和抗生素的驱动下，产生了耐药性的病害菌，使得动植物病害的防治越来越难，同时对人类食物安全及人类健康形成了极大的威胁，人们不得不寻找新的防治方法。生物防治技术及新型绿色抗生素的开发应用成为了新宠。从陆生的微生物分离化合物在一个世纪前就开始了，想从中寻找新型物质的难度太大，而海洋微生物的发现及开发还刚刚开始。
本文就从海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物中首次分离获得巨杆菌素，并研究发现其具有较强的抑菌特性。目前关于巨杆菌素的生产分离和生物活性分析还未见相关专利及文献研究报道。
发明内容
本发明提供一种巨杆菌素分离纯化方法
A海洋微生物B5发酵产物预处理：海洋微生物B5发酵产物煮沸10分钟，静置过夜或离心分离，去除热凝固物及固体颗粒获得上清液。将上清液依次通过10000分子量、1000分子量超滤膜和300分子量的纳滤膜，获得小于300分子量的膜下过滤液。将此过滤液真空浓缩至原体积的1/5。
B将上述浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中，按体积比为1:1加入乙酸乙酯充分混匀萃取10分钟，静置10分钟分离，分离乙酸乙酯相。再在残余相中加入等体积新乙酸乙酯按上述方法萃取，共萃取3次。合并3次萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，获得乙酸乙酯萃取相浸膏。
C称取适量上述乙酸乙酯萃取相浸膏用少量甲醇溶解拌入ODS填料中，自然挥干或减压干燥后装入(20mm*100mm)制备液相柱的预装柱中。利用5个柱体积的5％甲醇水溶液按20ml/min流量润洗ODS制备柱(25mm*500mm)。连接上上述的预装柱，按下述表1洗脱梯度进行洗脱，按每管45ml接取洗脱液，278nm处检测洗脱峰，收集15.35min处的洗脱峰，并依次标号，真空旋转浓缩各管洗脱液。用少量纯甲醇溶解后利用高效液相色谱测定各接收管中巨杆菌素纯度。
所述梯度洗脱如下：
表1中压制备液相梯度洗脱表
所述高效液相色谱纯化的条件如下：
C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径4.6mm，柱长250mm，填充介质为C18；
检测波长：278nm
柱温箱温度：30℃
上样量为5ul，流动相的流速为1ml/min。
流动相由A液和B液组成；A液：甲醇；B液：纯水。用10％甲醇等度洗脱D合并上述巨杆菌素纯度大于85％以上的接收管，真空减压浓缩至原体积的1/5，加入少量巨杆菌素晶种，在15℃进行结晶。待晶型长大后，移去母液。利用少量纯甲醇洗巨杆菌素表面残液，再加入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶，于15℃下进行重结晶，待晶型长大后，移去母液，利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液，获得巨杆菌素纯晶体。
附图说明
图1为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的革兰氏染色。
图2为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的芽孢染色。
图3为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株的鞭毛染色。
图4为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株以16SrDNA基因序列为基础构建的系统发生树
图5为海洋解淀粉芽孢杆菌B5菌株以gyrB基因序列为基础构建的系统发生树
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1产巨杆菌素的海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法:
⑴样品的采集与富集在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水，海泥，海带，浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品。注明样品名称、采集日期以及采 集地点。
⑵样品进行如下处理：海水样品采集来的海水混匀取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海泥样品采集来的海泥混匀采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g浒苔破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d。浒苔，裙带菜，龙须菜，紫菜样品处理同海带样品处理。
⑶海洋细菌的分离及纯化分别取1mL上述样品富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中进行梯度稀释取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次观察并挑取形态、颜色不同的菌落采用三区划线方法进行纯化得到若干海洋细菌纯菌株。
⑷鳗弧菌拮抗菌分离、筛选，将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液。取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀点种⑶中获得的一株海洋细菌，在28℃条件下进行共培养36小时，观察并测量抑菌圈大小，筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌。经菌体形态学、生理生化及基因学鉴定确定获得一株海洋解淀粉芽孢杆菌B5。
⑸筛选到的海洋细菌B5纯培养物，转入固体斜面试管在28℃条件培养24小时，放在4℃冰箱中保存。
实施例2产巨杆菌素的海洋解淀粉芽孢杆菌B5的鉴定和表型等方面的研究:
上述的海洋细菌B5的生物学形态描述为：在海水TSB培养基上，菌落形态：圆形突起，边缘不整齐，白色，干涩无光泽，该菌株菌体形态：杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，芽孢中生，椭圆形，周生鞭毛。菌体形态：杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性，芽孢中生，椭圆形，周生鞭毛，大小为(0.5～0.8)×(1.5.～4.5)μm。如图1，图2，图3所示。
上述的海洋细菌B5的生理生化指标：生理生化试验结果表明，菌株B5的生理生化试验结果与文献的有关海洋解淀粉芽孢杆菌特征一致，能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇，不利用果糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇，氧化酶反应、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化，v-p实验和2％氯化钠生长试验为阳性，吲哚反应、MR试验和脱羧酶试验为阴性。如表2。
表2 海洋解淀粉芽孢杆菌B5的生理生化指标
注“-”表示阴性，“+”表示阳性
根据形态学观察结果和生理生化特性，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版等相关文献，初步认为海洋细菌B5属于芽孢杆菌属。
上述的海洋细菌B5的基因学鉴定为：
⑴海洋细菌B5的16S rDNA测序
应用细菌16SrDNA基因通用引物,正向引物为(ALF165312)：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，反向引物：(ALF165313)：5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1381bp的基因片段，其序列已在GenBank中登记，登记号为JN051504.1，序列如序列表SEQ ID NO.1。经与GenBank数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列比对，序列同源性非常高的100个序列中，菌株chenj-5的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis，Bacillus vallismortis的16S rDNA序列相似度在99％以上，无法准确区分。见图4。
⑵海洋细菌B5的gyrB基因PCR扩增与测序
应用gyrB基因引物(-gyrB primers：)
UP-1S(5-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3)，
UP-2Sr(5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3)，扩增海洋细菌B5的16SrDNA序列，经扩增产物测序得到海洋细菌B5大小为1165bp的基因片段，其序列已 在GenBank中登记，登记号为JN859130.1。
用Blast在线程序进行同源比较,结果表明,所测得序列与数据库中Bacillusamyloliquefaciens来源的DNA gyrase subunit B基因序列的一致性很高最高达99％。见序列表SEQ ID NO.2，图5。
根据菌株的形态特征和基因学特征的分析以及系统发育分析，鉴定海洋细菌B5为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。
本发明所述的的海洋解淀粉芽孢杆海洋解淀粉芽孢杆菌B5(Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5)已于2014年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(其简称CCTCC)，保藏号：CCTCCNO:M2014229该菌株基因序列已于2012年1月8号登记在NCBI中，登记号：JN859130.1。
实施例3海洋解淀粉芽孢杆菌B5产巨杆菌素的发酵方法：
菌种活化：取海洋解淀粉芽孢杆菌B5，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物。
其中海水TSB固体斜面培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，5g琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用NaOH调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB固体斜面培养基。
种子液制备过程：将海洋解淀粉芽孢杆菌B5固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5种子液。
发酵培养过程：在通气搅拌式发酵罐内加入巨杆菌素发酵培养基，在121℃下维持15min灭菌后，接入种子液搅拌发酵，获得发酵产物。种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为：36小时。获得具有抑制鳗弧菌活性的海洋解淀粉芽孢杆菌B5发酵产物。
其中巨杆菌素发酵培养基的配置方法为：按照质量体积百分比加入葡萄糖0.25％，NaCl2％，豆饼粉1.7％，K2HPO30.25％，利用水加热搅拌溶解后，利用碱水调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌20min后获得液体发酵培养基。
实施例4海洋解淀粉芽孢杆菌B5所产的巨杆菌素的分离纯化方法
A海洋微生物B5发酵产物预处理：海洋微生物B5发酵产物煮沸10分钟，静置过夜或离心分离，去除热凝固物及固体颗粒获得上清液。将上清液依次通过10000分子量、1000分子量超滤膜和300分子量的纳滤膜，获得小于300分子量的膜下过滤液。将此过滤液真空浓缩至原体积的1/5。
B将上述浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中，按体积比为1:1加入乙酸乙酯充分混匀萃取10分钟，静置10分钟分离，分离乙酸乙酯相。再在残余相中加入等体积新乙酸乙酯按上述方法萃取，共萃取3次。合并3次萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，获得乙酸乙酯萃取相浸膏。
C称取适量上述乙酸乙酯萃取相浸膏用少量甲醇溶解拌入ODS填料中，自然挥干或减压干燥后装入(20mm*100mm)制备液相柱的预装柱中。利用5个柱体积的5％甲醇水溶液按20ml/min流量润洗ODS制备柱(25mm*500mm)。连接 上上述的预装柱，按下述表3洗脱梯度进行洗脱，按每管45ml接取洗脱液，278nm处检测洗脱峰，收集15.35min处的洗脱峰，并依次标号，真空旋转浓缩各管洗脱液。用少量纯甲醇溶解后利用高效液相色谱测定各接收管中巨杆菌素纯度。
所述梯度洗脱如下：
表3中压制备液相梯度洗脱表
所述高效液相色谱纯化的条件如下：
C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径4.6mm，柱长250mm，填充介质为C18；
检测波长：278nm
柱温箱温度：30℃
上样量为5ul，流动相的流速为1ml/min。
流动相由A液和B液组成；A液：甲醇；B液：纯水。用10％甲醇等度洗脱D合并上述巨杆菌素纯度大于85％以上的接收管，真空减压浓缩至原体积的1/5，加入少量巨杆菌素晶种，在15℃进行结晶。待晶型长大后，移去母液。利用少量纯甲醇洗巨杆菌素表面残液，再加入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶，于15℃下进行重结晶，待晶型长大后，移去母液，利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液，获得巨杆菌素纯晶体。
Claims (5)
1.一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法，其特征在于步骤如下：
A海洋解淀粉芽孢杆菌B5的发酵产物的预处理：海洋解淀粉芽孢杆菌B5的发酵产物煮沸10分钟，静置过夜或离心分离，去除固体获得上清液；将上清液依次通过截留分子量为10000Da、1000Da和300Da的纳滤膜，获得小于300Da分子量的膜下过滤液；将此过滤液真空浓缩至原体积的1/5得到浓缩液；
其中所述的海洋解淀粉芽孢杆菌B5在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年5月27日，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2014229。
B将浓缩液移至分液漏斗或萃取罐中，按体积比为1:1加入乙酸乙酯充分混匀萃取10分钟，静置10分钟水相和有机相分离，收集乙酸乙酯相；再在残余水相中加入等体积的乙酸乙酯按上述方法萃取，合计萃取3次；合并3次的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，获得乙酸乙酯萃取相的浸膏。
C称取乙酸乙酯萃取相的浸膏，用甲醇溶解浸膏并拌入ODS填料中，自然挥干或减压干燥后装入20mm*100mm的制备液相柱的预装柱中；利用3个柱体积的5％质量浓度的甲醇水溶液，按16ml/min的流速润洗25mm*500mm的ODS制备柱；连接上上述的预装柱，梯度洗脱，按每管45ml接取洗脱液，278nm处检测洗脱峰，收集15.35min处附近的洗脱峰，并依次标号；利用高效液相色谱测定各接收管浓缩物中巨杆菌素的纯度；
所述梯度洗脱如下：
表1中压制备液相梯度洗脱表
所述高效液相色谱检测条件如下：
C18柱型号为Shim-pack VP-ODS，内径4.6mm，柱长250mm，填充介质为C18；检测波长：278nm；柱温箱温度：30℃；上样量为5ul，流动相的流速为1ml/min；
流动相由A液和B液组成；A液：甲醇；B液：纯水；用10％甲醇等度洗脱。
D合并上述巨杆菌素纯度大于85％以上的接收管，真空减压浓缩至原体积的1/5，加入少量巨杆菌素晶种，在15℃进行结晶；待晶型长大后，移去母液；利用少量纯甲醇洗巨杆菌素表面残液，再加入少量纯甲醇溶解巨杆菌素结晶，于15℃下进行重结晶，待晶型长大后，移去母液，利用少量纯甲醇洗去巨杆菌素表面残液，获得巨杆菌素纯晶体。
2.根据权利要求1所述的一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法，其特征为所述海洋解淀粉芽孢杆菌B5的发酵产物通过如下方法制备获得：
A菌种的活化：取海洋解淀粉芽孢杆菌B5，采用划线法接种于海水TSB固体斜面培养基上，28℃培养18小时，得到对数生长期的斜面培养物；
其中海水TSB固体斜面培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，15g琼脂粉利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用NaOH调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水TSB固体斜面培养基。
B种子液的制备：将海洋解淀粉芽孢杆菌B5固体斜面培养物在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得海洋解淀粉芽孢杆菌B5种子液；
其中海水TSB液体培养基的配置方法为：称取胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，利用陈海水加热搅拌溶解后，加陈海水定容至1000ml，利用NaOH调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌15min后获得海水液体培养基。
C发酵培养：在通气搅拌式发酵罐内加入巨杆菌素发酵培养基，在121℃下维持15min灭菌后，接入种子液搅拌发酵，获得发酵产物。种子液预先利用无菌海水调整种子液的浓度至2.0*107cfu/ml，种子液的接种量按2％(v/v)接入；搅拌发酵环境参数为：通气量1.2vvm，温度为28℃，搅拌速度为每分钟150转；发酵时间为36小时。
其中巨杆菌素发酵培养基的配置方法为：按照质量体积百分比加入葡萄糖0.25％，NaCl2％，豆饼粉1.7％，K2HPO30.25％，利用水加热搅拌溶解后，利用碱水调整PH＝7.2—7.5，再在121℃条件下灭菌20min后获得液体发酵培养基。
3.根据权利要求2所述的一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法，其特征为所述海洋解淀粉芽孢杆菌B5的分离方法如下：
⑴样品的采集：在连云港海域用无菌采样袋及无菌采样工具采集海水、海泥、海带、浒苔、裙带菜、龙须菜、紫菜样品，注明样品名称、采集日期以及采集地点；
⑵样品的富集：
海水样品采集来的海水混匀，取10mL加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海水富集培养物；
海泥样品采集来的海泥采用五点法采样再混匀，取10g海泥放入事先灭好菌的装有100ml海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海泥富集培养物；
海带样品用无菌海水冲洗海带样品3次后，放入无菌组织捣碎机中破碎至糊状，取10g海带破碎物加入到装有100mL无菌海水TSB液体富集培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床富集培养2d得到海带富集培养物；
浒苔、裙带菜、龙须菜和紫菜样品处理同海带样品处理，分别得到浒苔、裙带菜、龙须菜和紫菜富集培养物；
⑶海洋细菌的分离及纯化：分别取1mL上述富集培养物的清液放入盛有9mL无菌海水的试管中，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.1mL涂布到直径9cm的海水TSB固体分离培养基平板上，28℃倒置培养2d，每个稀释梯度重复3次，观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；
⑷鳗弧菌拮抗菌的分离和筛选：将鳗弧菌在无菌条件下，挑取2-3环菌体接种到装有100mL无菌海水TSB液体培养基的500ml三角瓶中，28℃、180r/min的条件下摇床培养18小时，获得鳗弧菌种子液；取0.1ml上述鳗弧菌种子液涂布到海水TSB固体平板上，在上述每只平板上均匀点种一株步骤⑶中获得的海洋细菌，在28℃条件下进行共培养36小时，观察并测量抑菌圈大小，筛选出对鳗弧菌具有拮抗效果的海洋细菌即得到海洋解淀粉芽孢杆菌B5。
4.根据权利要求3所述的一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法，其特征为所述海洋解淀粉芽孢杆菌B5的gyrB基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，NCBI登记号为JN859130.1。
5.根据权利要求4所述的一种制备巨杆菌素Bacimethrin的方法，其特征为所述海洋解淀粉芽孢杆菌B5的16SrDNA基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
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