CN104004826A - 突变的基因prpf4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用 - Google Patents
突变的基因prpf4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用。筛选HRDs致病基因的方法包括（1）HRDs遗传资源库的建立，（2）设计并合成HRDs致病基因的基因芯片杂交探针，并将其整合到基因芯片上；（3）利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序；（4）对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因；（5）针对新发现的剪切基因突变位点进行功能预测。本发明建立了高效的HRDs靶基因捕获技术，以深度测序为手段，确认HRDs捕获芯片效率，建立高效、可信的生物信息分析模型。
Description
分案说明
本申请系2013年1月7日提交的申请号为2013100052529，名称为一种筛查HRDs致病突变的方法及涉及的基因芯片杂交探针设计方法的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用。
背景技术
遗传性视网膜疾病(Hereditary retinal diseases,HRDs)是一组由遗传缺陷引起的进行性视网膜退行性疾病，是临床上常见且危害严重的遗传性致盲疾病。作为世界范围内工作年龄人群的第一大致盲眼病，HRDs在欧美发病率约为1/3000，在我国更是高达1/1000。我国是HRDs遗传资源大国，但目前HRDs相关的遗传学信息多来自西方国家，因此对我国HRDs患者进行深入的遗传学研究显得尤为重要。
HRDs多为单基因遗传病，众多基因缺陷均可导致其发生，其常见的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X连锁隐性遗传。迄今，全世界已鉴定出191个HRDs相关致病基因和231个连锁位点(www.RetNet.org)，且随着研究深入，该数目正逐年递增。其致病基因数之多表明临床表现相同的患者，很有可能有不同的基因型，即显著的遗传异质性。目前仍有大于60%(西方国家统计结果，我国比率更高)HRDs患者的致病基因尚未找到，提示存在大量新致病基因有待挖掘。
由DNA转录得到的前体RNA(pre-mRNA)需经过剪接成为信使RNA(mRNA)才能进一步参与翻译过程合成蛋白质，而该剪接过程主要发生在剪接体。剪接体是由小分子核糖核蛋白(snRNPs)组成的超大分子复合体，构成剪接体的snRNP有五种：U1、U2、U4/U6和U5。研究指出，与前体RNA剪接体蛋白编码相关的基因(剪切基因)能够引起常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)。目前已被证实能够引起ADRP的剪切基因有PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9以及由申请人所发现并报道的SNRNP200，这些剪切基因都是通过影响U4/U6-U5复合体而引起ADRP的。值得关注的是，上述六个剪切基因所编码的蛋白在生物体各种细胞内广泛表达，但目前研究仅发现该六个基因相关的突变能够引起视网膜疾病，没有引起其他疾病的报道。因此，针对剪切基因与RP发病的相关研究显得尤为必要。
针对HRDs的研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究HRDs致病基因的一个重要目的是进行HRDs分子诊断，鉴于其显著的遗传异质性，如何检测众多致病基因突变是目前的难题之一。基于连锁分析的定位克隆策略是鉴定单基因遗传病致病基因的经典方法，但是同时也面临一些困难：①通常需要多代家系，难以分析小家系和散发病例。②有时多代家系也不能定位致病位点。③难以在连锁区域内筛选出正确的致病基因。因此，鉴于HRDs疾病本身的性质及传统分析技术的局限性，寻求一种全新的HRDs致病基因的研究方法显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是针对上述缺陷，提供突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种以深度测序为平台筛查或检测HRDs致病突变所涉及的基因芯片杂交探针的设计方法，包括：
(1)候选基因的选择:所述的基因捕获芯片涵盖了全部179个由RetNet公布的视网膜疾病相关基因，及高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因；
(2)转录本的选择：针对不同基因选择特定转录本，选择原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本；
(3)杂交探针的设计：根据(2)中挑选出的不同转录本设计杂交探针，设计标准为：(a)探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；(b)去除在人类基因组中出现的高度重复序列及出现2-5倍的较低频率的重复片段；(c)对临近外显子的探针进行整合，整合标准为：当相邻外显子的综合目标区域总和小于600bp时，即将其整合为一个探针，以求通过一对探针完成多对外显子区域的捕获；其中，所述的相邻外显子的综合目标区域指前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止；(d)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游100bp的内含子的基础上，各继续增加相同bp数的内含子，使探针大小达到250bp。
其中，所述的高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因优选PRPF4。
本发明方法是一种通用的以深度测序为平台筛查HRDs致病突变所涉及基因芯片的杂交探针设计方法，所述的高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因不局限于上述优选的基因，也可以是其他的高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因。
所述的外显子和内含子拼接处是指外显子上下游至少各100个bp。
本发明基于深度测序为平台筛选HRDs致病基因的基因芯片杂交探针设计方法中，设计的用于筛选HRDs致病基因PRPF4的杂交探针序列共15条，序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示。
一种以深度测序为平台筛查HRDs致病突变的方法，包括以下步骤：
(1)建立HRDs遗传资源库，收集HRDs类病人的临床资料及血液标本，提取基因组DNA；
(2)按照上述杂交探针设计方法设计并合成HRDs致病基因芯片的杂交探针，并将其整合到基因芯片上；
(3)利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序；
(4)对测序结果进行优化的生物信息学分析，筛选出高度可疑的致病基因及致病突变；
(5)针对新发现的剪切基因突变位点进行致病能力预测和功能研究。
步骤(2)所述的基因芯片优选Roche Nimblegen公司生产的基因芯片。
步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选利用美国Illumina公司的Hi-seq2000仪器完成。
步骤(3)所述的利用制备的基因芯片捕获目标区域并进行深度测序优选流程为：将基因组DNA片段化，在DNA末端标记“A”并与Illumina PE接头-寡核苷酸混合物相连接；连接产物经PCR富集，获得DNA文库，并将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列；创建配对末端，在IlluminaHiSeqTM2000平台上对目标序列进行测序。
步骤(4)所述的对测序数据进行生物信息学分析优选包括：
(1)采用Mosaik软件处理Illumina原始测序数据，产生.bam类型文件，将.bam文件输入GATK，利用GATK检测单核苷酸变异体和小的插入或缺失，同时进行质量评估，便于下游的生物信息学分析，最后产生.vcf类型文件；
(2)将患者的测序结果在包括dbSNP132
(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.)，HapMap计划(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000Genome Project(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)以及Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在内的五个单核苷酸多态性(SNP)数据库中筛查，滤过所有已知的SNP位点；
(3)将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析插入/缺失突变、无义突变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。
通过本发明所述的方法获得的HRDs致病基因为与视网膜疾病相关的剪切基因为PRPF4。
有益效果
1.HRDs是常见的、严重的遗传性致盲疾病，在我国发病率高达1/1000，是世界范围内工作年龄人群中的第一大致盲眼病。挖掘HRDs的新致病突变和新致病基因有利于进一步探索HRDs的分子遗传学病因，是充分利用我国的眼科遗传病资源，造福遗传性视网膜疾病患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本专利旨在探索HRDs的遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治疗。
2.大量研究证实，剪切基因的功能异常能够引起ADRP。因此，针对剪切基因与ADRP的相关研究显得尤为必要。本专利的候选基因涵盖了6个已知致病的剪切基因及4个高度可疑的剪切基因，所有基因均是由申请人在多年从事遗传学研究的基础上查阅大量文献所筛选出的，通过本发明方法的到进一步明确了这些基因与HRDs的关系。
3.一个基因可以对应多个不同的转录本，且不同转录本所编码的RNA及蛋白有所不同。本专利中申请人根据长期从事遗传学研究的经验，筛选出最优转录本，并根据不同的转录本设计相应的探针，从而使筛查效益达到最高。
4.基因的外显子区域发生改变，可直接引起氨基酸序列发生改变，从而导致蛋白的结构和功能发生改变。然而研究表明，外显子和内含子交界区碱基的改变可直接影响基因的剪切。本专利所设计的杂交探针覆盖所有已知致病基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处(外显子上下游至少各100个bp)，使致病位点筛查面达到最广。
5.在探针设计过程中，本专利对临近的外显子进行整合，旨在用一个探针检测600bp以内的相邻外显子的综合目标区域(即前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止)，以求通过一对探针完成两对甚至多对外显子区域的捕获，使探针的筛查效率达到最高。与此同时，我们剔除了目标区域中所含有的高度重复序列以及在人类基因组中出现2-5倍的较低频率的重复片段，避免捕获其他同源基因，使筛查的假阳性率降到最低。
6.HRDs具有显著的遗传异质性，目前已知致病基因191个，已连锁位点231个，且仍存在大量未知的致病基因。应用传统技术研究显然具有很大的局限性。深度测序技术是一种比较成熟的高通量测序技术，可一次性对海量基因(全基因组)进行平行测序，有传统技术无法比拟的优势。研究证实深度测序技术在孟德尔遗传疾病的基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，将深度测序技术应用于我国遗传性视网膜疾病研究是非常必要的、可行的。我们所申请的专利旨在建立高效的HRDs靶基因捕获技术，以深度测序为手段，确认HRDs捕获芯片效率，建立高效、可信的生物信息分析模型。
附图说明
图11980-2012年已鉴定的视网膜疾病相关基因及位点数目
图2挖掘新致病基因的技术路线
图3深度测序流程
图4家系图(红框标注为已采血患者)
图5先证者眼底照
图6测序图
图7蛋白结构预测
具体实施方式
实施例1
实验方法：
1.HRDs遗传资源库的建立。
1.1收集以下三类病人的临床资料及血液标本：
1.1.13代或3代以上的常染色体显性遗传家系、常染色体隐性遗传家系、X连锁隐性遗传家系，包括RP、Leber先天性黒矇、先天性静止性夜盲、卵黄样黄斑营养不良、Stargardt病。
1.1.2收集各种HRDs的遗传性小家系。
1.1.3收集无家族史的各种HRDs的散发病例。
1.2提取基因组DNA：
采用TIANamp血液DNA抽提试剂盒(Tiangen Biotech Co.Ltd,Beijing,China)，按照厂家提供的protocol从采集到的病人外周血中提取病人的基因组DNA。
2.挖掘HRDs新致病基因/已知致病基因的新突变(见图2)。
2.1设计并定制HRDs相关基因捕获芯片：
2.1.1候选基因的选择：
该基因捕获芯片涵盖了全部179个由RetNet公布的视网膜疾病相关基因(其中包括6个已知致病剪切基因)，及4个高度怀疑可能与视网膜疾病相关的剪切基因。其中，6个已知致病剪切基因分别为：PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、RP9及SNRNP200(该基因由申请人率先发现并报道与HRDs疾病相关)；4个高度可疑的剪切基因分别是：SNRNP40、SNRNP27、PRPF4及EFTUD2，其在Ensemble数据库中的基因编号如下表所示。以上基因均是由申请人在多年从事遗传学研究的基础上查阅大量文献所筛选出的。
| 基因 | 基因编号 | 基因 | 基因编号 |
| PRPF3 | ENSG00000117360 | SNRNP200 | ENSG00000144028 |
| PRPF6 | ENSG00000101161 | SNRNP40 | ENSG00000060688 |
| PRPF8 | ENSG00000174231 | SNRNP27 | ENSG00000124380 |
| PRPF31 | ENSG00000105618 | PRPF4 | ENSG00000136875 |
| RP9 | ENSG00000164610 | EFTUD2 | ENSG00000108883 |
注：以上信息均来自Ensemble数据库(www.ensembl.org)，可输入基因编码检索基因详细信息及基因序列。
2.1.2转录本的选择：
针对不同基因选择特定的转录本，每个基因均含有多个转录本，在选择转录本时，我们的原则是：首先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本。据以上原则，我们所筛选出的10个剪切基因相关转录本分别是：
| 基因 | 转录本编号 | 基因 | 转录本编号 |
| PRPF3 | ENST00000324862 | SNRNP200 | ENST00000323853 |
| PRPF6 | ENST00000266079 | SNRNP40 | ENST00000263694 |
| PRPF8 | ENST00000572621 | SNRNP27 | ENST00000244227 |
| PRPF31 | ENST00000321030 | PRPF4 | ENST00000374198 |
| RP9 | ENST00000297157 | EFTUD2 | ENST00000426333 |
注：以上信息均来自Ensemble数据库(www.ensembl.org)，可输入转录本编码检索转录本详细信息。
2.1.3杂交探针的设计：
申请人根据挑选出的不同转录本设计杂交探针，并由Roche-NimbleGen公司定制。杂交探针的设计标准为：(1)探针覆盖所有候选基因的目标区域，即外显子区域以及外显子和内含子拼接处(外显子上下游各100个bp)；(2)去除重复序列：对于在基因组出现的高度重复序列以及在人类基因组中出现2-5倍的较低频率的重复片段，我们予以去除，避免捕获其他同源基因，增加假阳性，从而降低检测效率。申请人将所有候选基因的目标区域与人类基因组DNA序列进行比对，共移除了2.5%的重复序列；(3)在探针设计过程中，我们对临近的外显子进行了特定的整合，其相邻探针整合标准为：当相邻外显子的综合目标区域(即前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止)总和小于600bp，即将其整合为一个探针，以求通过一对探针完成多对外显子区域的捕获；(4)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游100bp的内含子的基础上，各继续增加相同bp数的内含子，使探针大小达到250bp。根据以上设计原则，我们针对16个剪切基因所设计的探针序列如下：
用于筛选HRDs致病基因PRPF4的杂交探针序列共15条，序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15所示；
2.2目标区域捕获及深度测序(见图3)：
首先将基因组DNA片段化，并在DNA末端标记“A”，与Illumina PE接头-寡核苷酸混合物相连接，连接产物经PCR富集，获得DNA文库。然后将DNA文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列。最后创建配对末端，在Illumina HiSeqTM2000平台上对目标序列进行测序。
2.3对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因：
2.3.1采用Mosaik软件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/Mosaik)处理Illumina原始测序数据(配对末端数据)，产生.bam类型文件。将.bam文件输入GATK，利用GATK检测单核苷酸变异体(single nucleotide variant)和小的插入或缺失(insertion/deletions)，同时进行质量评估，便于下游的生物信息学分析，最后产生.vcf类型文件。
2.3.2将患者的测序结果在包括dbSNP132
(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.)，HapMap计划(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000Genome Project(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)，炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)以及Exome Variant Server(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)在内的五个单核苷酸多态性(SNP)数据库中筛查，滤过所有已知的SNP位点；
2.3.3将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析插入/缺失突变、无义突变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。
2.4经Sanger测序验证，鉴定致病基因：
PCR法分别针对筛选出的突变位点及邻近DNA序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用PCR的反应体系(20μL体系)为：5*buffer4μL，25mMMgCl22μL，DNA1μL，F(上游引物)1μL，R(下游引物)1μL，10mM dNTP0.4μL，Taq酶0.1μL，ddH2O10.5μL。PCR反应程序：98℃5min，35个循环(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。3%琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物送深圳华大基因公司测序。并对测序结果进行进一步分析，使用NCBI在线对比工具BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假阳性结果，并筛选出在家族中共分离的突变位点。
实验结果：
申请人对已收集的来自45个不同遗传类型的HRDs家系的60位已确诊的患者及家族内的正常人(为其编号为HD01-HD40，HD51-HD70)通过上述目标区域测序的方法检测其致病基因，得到以下初始实验结果：
| 基因 | 变异位点 | 变异类型 | 变异携带者 |
| PRPF4 | 9:116045356 | A>T;Het. | HD07 |
| PRPF4 | 9:116045694 | C>G;Het. | HD31 |
| PRPF4 | 9:116050463 | C>T;Het. | HD14 |
| PRPF4 | 9:116054614 | G>T;Het. | HD06 |
注：以上突变位点为突变碱基在Ensemble数据库中对应的物理位置；突变类型中，Het代表杂合突变，Hom代表纯合突变。
以上述表格中PRPF4在HD14患者家系中的突变验证为例，详细阐述突变验证相关实验结果：
1.临床资料
1.1家系图(见图4)
1.2家族中先证者临床资料：
裸眼视力：右眼指数50cm、左眼指数30cm，双眼矫正视力无提高；眼底照相：见图5；双眼ERG：双眼a、b波均消失，呈熄灭波。
家系验证结果
我们从先证者及相关家庭成员的血液中提取基因组DNA，通过对家族中所有的病人进行目标区域测序，我们发现了我们PRPF4p.P315L（9号染色体，物理位置为116050463的碱基由C突变为T；RNA水平：PRPF4基因编码RNA第944位碱基由C突变为T；蛋白水平：PRPF4基因编码蛋白第315位氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸），该基因相关的突变从未在HRDs患者中发现。经Sanger测序验证证实该突变位点在该家族中表现为共分离，且我们在200个正常人(400个等位基因)中筛选未发现相应突变。测序结果见图6。
根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，我们成功证实该突变位点PRPF4p.P315L为新的RP致病位点。
实施例2：
针对实施例1中所检测出的致病基因进行功能学研究，此处以上述PRPF4基因新突变p.P315L为例。
实验方法：
1.保守性分析：
采用NCBI HomoloGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)对所筛选得到突变在多个物种中进行保守性预测。
2.根据SIFT和PolyPhen值预测突变的致病能力：
采用两款主流在线预测软件：PolyPhen-2(Polymorphism Phenotyping,version2；http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)以及SIFT Human Protein DB(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)，预测错义突变及无义突变对蛋白水平的影响，从而预测突变的致病能力。
3.蛋白晶体结构改变研究：
由于PRPF4基因参与构成U4/U6复合体，且该突变位点位于WD40结构域中，故采用SWISSMODEL(http://swissmodel.expasy.org/)预测软件对PRPF4p.P315L突变靶点进行结构预测。
实验结果：
1.保守性分析：
PRPF4p.P315该位点在酵母、线虫、鱼、鸡、鼠、狼、牛、猩猩及人类等多个物种中均高度保守，即该位点在进化过程中高度保守，从而进一步证明该位点的突变可能会引起较为严重的病理现象。
2.SIFT和PolyPhen值预测：
PRPF4p.P315L其SIFT值为0.07，PolyPhen值为0.999。高度提示其拥有较大的致病可能性。
3.蛋白晶体结构改变研究：
研究证明该突变可以引起明显的蛋白结构改变，从而对蛋白功能产生影响(图7)。
Claims (3)
1.突变的基因PRPF4在制备遗传性视网膜疾病诊断试剂中的应用，其特征在于突变的基因PRPF4编码蛋白第315位氨基酸由野生型的脯氨酸突变为亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的遗传性视网膜疾病诊断试剂为基因捕获芯片。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的基因捕获芯片上用于捕获PRPF4基因的杂交探针序列如SEQ ID NO.10所示。
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