CN103940775B - 清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法。具体操作步骤为：（一）采集校正集并采集原始光谱数据；（二）清开灵注射液中间体指标成分含量的测定；（三）校正模型的建立与检验；（四）在线测定清开灵注射液生产过程的中间体新样品；本发明测定时间大为缩短，通常每个样品在1min之内完成，其检测精度也逼近于标准方法；本发明有望可以解决清开灵注射液生产过程混配阶段传统离线测定耗时长、效率低、检测滞后等问题，同时为清开灵注射液等品种的质量提升提供有力的技术保障。

Description

清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法

技术领域

本发明属于中药液体制剂的质量检测技术领域，特别涉及一种用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法。

背景技术

中药注射液按照《中华人民共和国药典》(2010年版)的定义是“系指药材经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。”清开灵注射液主要是有栀子、板蓝根、金银花、黄芩苷、胆酸、猪去氧胆酸、珍珠母和水牛角等组方药材经现代生产工艺制备而成。清开灵注射液通过血管给药方式大大提高了中药对人身的药物有效供给和生物利用率，并进而提高了功效。清开灵注射液目前在清热解毒、镇静安神等方面有明显优势。

在清开灵注射液的实际生产过程中，由于清开灵注射液混配过程受到诸多方面的约束，其检测多是采用离线操作、事后分析，因此该检测过程存在很多缺陷。例如生产工艺复杂，无法及时反馈待测样品的含量参数等质量问题，存在着分析结果滞后，费时费力，操作繁琐等情况，这些不利于清开灵注射液的在线质量快速分析，提高生产效率，不适合中药现代化生产发展的需要。因此，迫切需要研究一种快速、高效、准确、便利的分析检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中无法在线操作，同时准确测量清开灵注射液中间体各成分的缺点与不足，提供一种用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，该方法可以有效地解决清开灵注射液生产过程中的中间体指标成分的含量快速测定，提高生产效率。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

一种用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，包括如下步骤：S1：采集校正集并采集原始光谱数据

从清开灵注射液中间体的样品中采集样品作为校正集，并利用近红外光谱仪采集校正集的原始光谱数据；

其中，所述清开灵注射液中间体的样品是指清开灵注射液混配阶段所得滤液，所述清开灵注射液中间体的样品包括银黄混合液和六混液；

所述银黄混合液的制备方法为将黄芩苷用注射用水溶解，调pH至7.5，加入金银花提取液，混匀即为银黄混合液，所述银黄混合液成分中包括黄芩苷和绿原酸；

所述六混液的制备方法为将栀子液、板蓝根液和水牛角、珍珠母水解液混合液合并然后加到胆酸、猪去氧胆酸的75％乙醇溶液中，并添加乙醇使乙醇总含量达75％，调节混合液pH值至7.0，冷藏，滤过，滤液回收乙醇，加水，冷藏，即为六混液，所述六混液成分中包括胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷；

采集的清开灵注射液中间体的样品应根据样品的批次、组方药材的来源等因素合理挑选校正集，在挑选建立校正模型时应尽可能的增大这些因子的变异范围，以得到代表性尽可能好的校正集。

优选的，所述校正集的数量至少为15个；进一步优选的，所述校正集的数量为22个。

S2：清开灵注射液中间体指标成分含量的测定

将步骤S1中已经采集完近红外光谱的清开灵注射液中间体的样品进行含量测定，具体操作步骤如下：

当测定银黄混合液时，

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下黄芩苷含量测定方法测定样品中的黄芩苷含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中金银花项下绿原酸含量测定方法测定样品中的绿原酸含量；

当测定六混液时，

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下胆酸测定方法测定样品中的胆酸含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下猪去氧胆酸测定方法测定样品中的猪去氧胆酸含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中栀子药材含量测定方法测定样品中的栀子苷含量；

采用凯氏定氮仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中附录IXL第二法测定样品中的含氮量。

在近红外光谱的采集过程中，不可避免的由于仪器状态、环境干扰以及测定条件的细微差异导致光谱的变化，通过对光谱信号进行预处理以消除此类影响，改善模型的性能，本发明主要采用了多种预处理方法如无预处理、卷积平滑、卷积求导、多元散色校正、标准正态变量变换和归一化中的一种或几种对光谱进行优化，以寻求最佳的光谱预处理方法。

在近红外光谱区域，不同波段的光谱吸收信息对于最后建立的模型的贡献价值不同，在特定的波段范围处，针对特定组分的吸收强度可能小于杂质的吸收或者干扰因素影响，且难以抽取对特征信息进行有效提取；采用化学计量学方法尤其是偏最小二乘法可以对全谱数据信息进行处理，但是为了改善模型的性能，提高计算速度，应该在建模过程中对光谱的波段范围进行优选，波段范围选择的方法一般包括全波段、相关系数法和迭代优化等方法中的一种或者几种，一般选取的波段范围为12000～4000cm^-1中的部分或全部范围。

S3：校正模型的建立与检验

S31：将步骤S1获得的校正集的原始光谱数据进行预处理和波段范围选择，得到清开灵注射液中间体指标成分含量特征光谱信息；

S32：以偏最小二乘法对得到的清开灵注射液中间体指标成分含量特征光谱信息分别和步骤S2所测得的指标成分含量的真实值进行关联建立校正模型，并采用参数检验校正模型；

其中，黄芩苷的波段选择方法为迭代优化2(M＝1，2，3)，选择波段范围5804.685～6402.509cm^-1，光谱预处理方法为归一化，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为4；

绿原酸的波段选择方法为迭代优化2(M＝2)，选择波段范围5793.114～6387.082cm^-1和7586.588～8180.556cm^-1，光谱预处理方法为卷积平滑，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为4；

胆酸的波段选择方法为迭代优化3，选择波段范围7563.446～8153.557和8751.382～9341.492cm^-1，光谱预处理方法为二阶卷积求导，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为2；

猪去氧胆酸和含氮量的波段选择方法为相关系数法，阈值≥0.4，光谱预处理方法为二阶卷积求导，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为3；

栀子苷的波段选择方法为迭代优化1，选择波段范围7609.729～8809.235cm^-1，光谱预处理方法为无谱图预处理，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为5；

S33：在化学计量学分析系统中导入步骤S32中所得的各校正模型；

为保证所建立模型的准确性，通常要对所建立的校正模型进行预测，利用近红外光谱仪采集清开灵注射液生产过程中的中间体新样品的原始光谱数据，将所采集清开灵注射液生产过程中的中间体新样品的原始光谱数据输入到已导入校正模型的化学计量学分析系统中，经软件系统计算得到未知清开灵注射液生产过程中的中间体指标成分含量，即预测值；并采用S2中的相应的标准方法测得清开灵注射液生产过程中的中间体新样品的实际含量，即真实值，将预测值与真实值进行对比，以检验所建立的校正模型的预测能力。

S4：在线测定清开灵注射液生产过程的中间体新样品

利用近红外光谱仪采集清开灵注射液生产过程的中间体新样品的原始光谱数据，将所得原始光谱数据输入到已导入校正模型的化学计量学分析系统中，经软件系统计算得到新样品中各成分的含量。

化学计量学分析系统是一种可进行数据运算处理的软件，其可以对所获得的光谱数据进行光谱预处理、回归校正、预测分析的功能，在本发明中，所选用的化学计量学分析系统优选的采用OPUS、Unscrambler、Matlab、TQ或广州白云山明兴制药有限公司质量监控系统。

进一步优选的，所述化学计量学分析系统为TQ或广州白云山明兴制药有限公司质量监控系统。

在本发明中，利用近红外光谱仪采集在线测定清开灵注射液生产过程的中间体新样品的操作条件与采集校正集原始光谱数据的操作条件相同；

具体操作条件如下：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，产地为美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)进行数据采集。

在本发明中用到的评价校正模型的参数，其具体意义是：

(1)决定系数：R²(Thecoefficientofdetermination)

$R^2=1-\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_{i,act}-y_{i,pre})}^2}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_{i,act}-{\stackrel{\‾}{y}}_{i,act})}^2}$

y_i，act为第i样品按照步骤S2中所述方法的测定值，为校正集所有样品按照步骤S2中所述方法的测定值的平均值，y_i，pre为校正集预测过程中的第i样品的预测值，n为校正集的样品数。

在固定的浓度范围内，其值越接近于1，表示校正模型的预测值与真实值越接近。

(2)交叉检验的校正标准偏差(standarderrorofcrossvalidation，SECV)：

$SECV=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_{i,act}-y_{i,pre})}^2}{n-1}}$

y_i，act为第i样品按照步骤S2中所述方法的测定值，y_i，pre为校正集交互验证预测过程中的第i样品的预测值，n为校正集的样品数。

(3)校正标准偏差(standarderrorofcalibration，SEC)：

$SEC=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_{i,act}-y_{i,pre})}^2}{n-1}}$

y_i，act为第i样品按照步骤S2中所述方法的测定值，y_i，pre为所建模型对校正集中的第i样品的预测值，n为校正集的样品数。

优选的，步骤S2中所述参数是指交叉检验的校正标准偏差(SECV)、校正标准偏差(SEC)和决定系数(R²)中的一种或几种。

进一步优选的，步骤S2中所述参数是指交叉检验的校正标准偏差(SECV)、校正标准偏差(SEC)和决定系数(R²)。

校正模型要不断的更新修正及维护：当样品的测定条件(时间或者空间)发生改变时，必须采用新的样本加入校正集对模型进行校正，如果发现模型的预测能力降低，就需要在校正集中增加这一检验样品，并重新按照上述步骤修改校正集。一个预测效果良好且稳定的模型需要不断的进行完善，才能在实际应用中发挥最大作用。

本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：

本发明通过将样品的红外光谱数据与指标成分含量连系起来建模，并通过对所采集的红外光谱数据进行预处理和优化，使得通过本发明所建模型得到的预测值接近真实值，检测精度也逼近于标准方法，显著提高了指标成分含量的检测精度；同时本发明结合计算机及其配套软件实现，方法先进、科学、测定速度快，检测费用低，与现有方法相比，测定时间大为缩短，通常每个样品在1min之内完成，作为一种应用前景极好的快速质量控制方法，本发明有望可以解决清开灵注射液生产过程混配阶段传统离线测定耗时长、效率低、检测滞后等问题，同时为清开灵注射液等品种的质量提升提供有力的技术保障。

附图说明

图1是银黄混合液的近红外光谱图(A：原始光谱，B：无预处理，C：卷积平滑；D：一阶卷积求导；E：二阶卷积求导；F：标准正态变量变换；G：多元散色校正；H：归一化；I：一阶卷积求导+多元散色校正)；

图2是银黄配混合液的预测值(A：黄芩苷，B：绿原酸)；

图3是六混液的预测值(A：胆酸，B：猪去氧胆酸，C：栀子苷，D：含氮量)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1清开灵注射液银黄混配阶段

(1)校正集的采集及其原始光谱数据的采集

从清开灵注射液中间体银黄混合液的样品，组成样本集，利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据；

银黄混合液的样品，采集5个批次共计30个样品，其中22个作为校正集，剩余8个作为预测集；

利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)进行数据采集，得到银黄混合液的原始近红外光谱数据；

(2)银黄混合液指标成分的含量测定

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下黄芩苷含量测定方法测定样品中的黄芩苷含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中金银花项下绿原酸含量测定方法测定样品中的绿原酸含量；

(3)校正模型的建立与检验

将步骤S1获得的校正集的原始光谱数据进行预处理和波段范围选择，得到银黄混合液中黄芩苷、绿原酸含量特征光谱信息；以回归算法对得到的银黄混合液中黄芩苷、绿原酸含量特征光谱信息和银黄混合液中黄芩苷、绿原酸的真实值进行关联建立多个校正模型，并采用参数检验校正模型，获得最优校正模型；在化学计量学分析系统中导入最优校正模型；本实施例以黄芩苷为例做说明，绿原酸采用相同的处理方法；

(一)、不同的光谱预处理方法对校正模型的影响

在近红外光谱的采集过程中，不可避免的由于仪器状态、环境干扰以及测定条件的细微差异导致光谱的变化，通过对光谱信号进行预处理以消除此类影响，改善模型的性能。本发明主要采用了多种预处理方法如无预处理、卷积平滑、卷积求导、多元散色校正、标准正态变量变换和归一化中的一种或几种对光谱进行优化。原始光谱与部分优化后的光谱如图1所示。

(二)、不同波段范围对校正模型的影响

波段范围的选择：在近红外光谱区域，不同波段的光谱吸收信息对于最后建立的模型的贡献价值不同，在特定的波段范围处，针对特定组分的吸收强度可能小于杂质的吸收或者干扰因素影响，且难以抽取对特征信息进行有效提取。采用化学计量学方法尤其偏最小二乘法可以对全谱数据信息进行处理，但是为了改善模型的性能，提高计算速度，应该在建模过程中对光谱的波段范围进行优选。本发明中主要采用了不同波段选择方法如全波段、相关系数法、迭代优化等方法中的一种或者几种对光谱进行优化。

(三)、偏最小二乘法(PLS)模型主因子数的选择

在校正集样品数量一定的情况下，近红外光谱图在特定的波段范围内，采用不同的主因子数，可以得到不同的SECV值，通过TQ优化得到最优的SECV值，以避免“过拟合”和“欠拟合”现象的发生。对于(二)中的各种算法相结合的最后结果，其主因子数如表1中所示。

(四)、最优化模型的筛选

以黄芩苷为例，通过比较表1中各种算法下的SECV值和SEC值，综合主因子数等考虑，最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为迭代优化2(M＝1，2，3)，选择波段范围5804.685～6402.509cm^-1，光谱预处理方法为归一化，主因子数为4，采用PLS进行回归得到最后模型，其SECV为0.9950，SEC为0.6945，R²为0.9985。

表1不同方法所建立的黄芩苷的校正模型参数

注：迭代优化1是指对N个波长区间段进行全排列组合，使用每一种组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，本部分选择的N＝5；

迭代优化2是指从N个波长区间段中选择M段组合成一段光谱，进行建模，即N选M，对所有的可能组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，本部分选择的N＝10，M＝1，2，3；

迭代优化3是指对N个波长区间段，第一次只用1个区间段光谱进行建模；每次增加一个波长区间，进行建模；依次增加一个波长区间，进行建模；最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，其中使用全波段光谱建模并取最小的SECV初始化整个该方法的SECV，本部分选择的N＝10；

迭代优化4是指对N个波长区间段，第一次只用1个区间段光谱进行建模；每次增加一个波长区间，进行建模；依次增加一个波长区间，进行建模；最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，其中使用N段光谱的第一段光谱建模并取最小的SECV初始化整个该方法的SECV，本部分选择的N＝10。

绿原酸按照同样的处理方式。

表2不同方法所建立的绿原酸的校正模型参数

绿原酸最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为迭代优化2(M＝2)，选择波段范围5793.114～6387.082cm^-1和7586.588～8180.556cm^-1，光谱预处理方法为卷积平滑，主因子数为4，采用PLS进行回归得到最后模型，其SECV为0.0019，SEC为0.0014，R²为0.9997。

(4)校正模型的预测

选取清开灵注射液中间体银黄混合液的样品8个，组成校正模型的预测集；

利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)；采集银黄混合液的近红外光谱图，得到预测集的原始近红外光谱数据；所采集预测集原始光谱数据输入到已导入最优校正模型的的TQ中，经系统计算得到预测集的预测值；预测集的预测值与真实值对照，对校正模型进行检验；其中黄芩苷、绿原酸的真实值均按照步骤(2)中的方法进行测定。将预测值与真实值进行对比，预测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，如表3所示，说明建立的校正模型具有良好的预测能力。

表3银黄混合液校正模型对预测集预测结果(mg/mL)

(5)测定银黄混合液的新样品

利用近红外光谱仪采集清开灵注射液中间体银黄混合液的新样品的原始光谱数据；所采集清开灵注射液银黄混合液的新样品的原始光谱数据输入到已导入校正模型的TQ中，经软件系统计算得到银黄混合液的新样品主要成分的含量；

具体操作条件为：在室温(15～30℃)下，利用近红外光谱仪在实际的生产线上采集银黄混合液的原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(美国赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)进行数据采集，得到银黄混合液的原始近红外光谱数据；采集到的光谱原始数据自动被在线分析系统读取，经系统计算得到银黄混合液样品中黄芩苷、绿原酸的含量，如图2所示。

图2中，两条虚线之间为各组分含量在实际生产过程中允许的的误差范围，由图2可知，黄芩苷、绿原酸的含量均在误差范围之内，检测结果准确，表明本发明所建立的校正模型具有良好的预测能力。

实施例2清开灵注射液六混过滤液阶段

(1)校正集的采集及其原始光谱数据的采集

从清开灵注射液生产过程的中间体六混液取实际样品，组成样本集，利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据；

六混液的样品，采集5个批次共计30个样品，其中22个作为校正集，剩余8个作为预测集；

利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)进行数据采集，得到六混过滤液的原始近红外光谱数据；

(2)六混液指标成分的含量测定

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下胆酸测定方法测定样品中的胆酸含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版第一增补本)中清开灵注射液项下猪去氧胆酸测定方法测定样品中的猪去氧胆酸含量；

采用高效液相色谱仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中栀子药材含量测定方法测定样品中的栀子苷含量；

采用凯氏定氮仪，按照《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中附录IXL第二法测定样品中的含氮量；

(3)校正模型的建立与检验

将步骤(1)获得的校正集的原始光谱数据进行预处理和波段范围选择，得到六混液中胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量含量的特征光谱信息；以回归算法对得到的六混液中胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量含量特征光谱信息和六混液中胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量的真实值进行关联建立多个校正模型，并采用参数检验校正模型，获得最优校正模型；在化学计量学分析系统中导入最优校正模型；

(一)、不同的光谱预处理方法对校正模型的影响

在近红外光谱的采集过程中，不可避免的由于仪器状态、环境干扰以及测定条件的细微差异导致光谱的变化，通过对光谱信号进行预处理以消除此类影响，改善模型的性能。本发明主要采用了多种预处理方法如无预处理、卷积平滑、卷积求导、多元散色校正、标准正态变量变换和归一化中的一种或几种对光谱进行优化。

(二)、不同波段范围对校正模型的影响

波段范围的选择：在近红外光谱区域，不同波段的光谱吸收信息对于最后建立的模型的贡献价值不同，在特定的波段范围处，针对特定组分的吸收强度可能小于杂质的吸收或者干扰因素影响，且难以抽取对特征信息进行有效提取。采用化学计量学方法尤其偏最小二乘法可以对全谱数据信息进行处理，但是为了改善模型的性能，提高计算速度，应该在建模过程中对光谱的波段范围进行优选。本发明中主要采用了不同波段选择方法如全波段、相关系数法、迭代优化等方法中的一种或者几种对光谱进行优化。

(三)、PLS模型主因子数的选择

在校正集样品数量一定的情况下，近红外光谱图在特定的波段范围内，采用不同的主因子数，可以得到不同的SECV值，通过广州白云山明兴制药有限公司质量监控系统优化得到最优的SECV值，以避免“过拟合”和“欠拟合”现象的发生。对于(二)中的各种算法相结合的最后结果，其主因子数如表4中所示。

(四)、最优化模型的筛选

以胆酸为例，通过比较表4中各种算法下的SECV值和SEC值，综合主因子数等考虑，最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为迭代优化3，选择波段范围7563.446～8153.557和8751.382～9341.492cm^-1，光谱预处理方法为二阶卷积求导，主因子数为2，采用PLS进行回归得到最后模型，其SECV为0.0421，SEC为0.0277，R²为0.9733。

表4不同方法所建立的胆酸的校正模型参数

猪去氧胆酸与含氮量按照同样的处理方式。

表5不同方法所建立的猪去氧胆酸的校正模型参数

猪去氧胆酸最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为相关系数法，阈值≥0.4，光谱预处理方法为二阶卷积求导，主因子数为3，采用PLS进行回归得到最后模型；猪去氧胆酸的SECV为0.0884，SEC为0.0307，R²为0.9789；

表6不同方法所建立的含氮量的校正模型参数

含氮量最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为相关系数法，阈值≥0.4，光谱预处理方法为二阶卷积求导，主因子数为3，采用PLS进行回归得到最后模型；含氮量的SECV为0.0982，SEC为0.0437，R²为0.9777。

栀子苷按照同样的处理方式。

表7不同方法所建立的栀子苷的校正模型参数

栀子苷最终选择的最优模型的建立参数为：波段选择方法为迭代优化1，选择波段范围7609.729～8809.235cm^-1，光谱预处理方法为无谱图预处理，主因子数为5，采用PLS进行回归得到最后模型，其SECV为0.0111，SEC为0.0045，R²为0.9901。

(4)校正模型的预测

选取清开灵注射液六混液的样品8个，组成校正模型的预测集；

利用近红外光谱仪采集校正集原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)；采集六混液的近红外光谱图，得到预测集的原始近红外光谱数据；所采集预测集原始光谱数据输入到已导入最优校正模型的广州白云山明兴制药有限公司质量监控系统中，经系统计算得到预测集的预测值；预测集的预测值与真实值对照，对校正模型进行检验；其中胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量的真实值均按照步骤(2)中的方法进行测定。将预测值与真实值进行对比，预测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，如表8和表9所示，说明建立的校正模型具有良好的预测能力。

表8六混液校正模型对预测集预测结果(mg/mL)

表9六混液校正模型对预测集预测结果(mg/mL)

(5)测定六混液的新样品

利用近红外光谱仪采集清开灵注射液中间体中六混液新样品的原始光谱数据；将所采集清开灵注射液中间体中六混液新样品的原始光谱数据输入到已导入校正模型的广州白云山明兴制药有限公司质量监控系统中，经软件系统计算得到新的清开灵注射液中间体中六混液的胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量的含量；

具体操作条件为：在室温(15～30℃)下，利用近红外光谱仪在实际的生产线上采集六混液的原始光谱数据：在室温(15～30℃)下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪(美国赛默飞世尔科技公司，美国，光源：卤钨灯，检测器：InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm)进行数据采集，得到六混液的原始近红外光谱数据；采集到的光谱原始数据自动被在线分析系统读取，经系统计算得到六混液样品中胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量的含量，如图3所示。

图3中，两条虚线之间为各组分含量在实际生产过程中允许的的误差范围，由图3可知，胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷、含氮量的含量均在误差范围之内，检测结果准确，表明本发明所建立的校正模型具有良好的预测能力。

本发明采用上述技术方案建立了清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，结果表明，所建立的近红外光谱快速分析方法适合于清开灵注射液清开灵注射液中间体指标成分含量的快速测定：快速简单、准确可靠、重现性好。该技术是清开灵注射液成分含量测定上的一大创新，具有巨大的经济和社会效益。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采集校正集并采集其原始光谱数据

从清开灵注射液中间体的样品中采集样品作为校正集，并利用近红外光谱仪采集校正集的原始光谱数据；

其中，所述清开灵注射液中间体的样品是指清开灵注射液混配阶段所得滤液，所述清开灵注射液中间体的样品包括银黄混合液和六混液；

S2：清开灵注射液中间体指标成分含量的测定

将步骤S1中已经采集完近红外光谱的清开灵注射液中间体的样品进行含量测定，具体操作步骤如下：

当测定银黄混合液时，按照《中华人民共和国药典》2010年版第一增补本中的方法测定样品中的黄芩苷的含量；

当测定银黄混合液时，按照《中华人民共和国药典》2010年版一部中的方法测定样品中的绿原酸的含量；

当测定六混液时，按照《中华人民共和国药典》2010年版第一增补本中的方法测定样品中的胆酸、猪去氧胆酸的含量，并测定样品中的含氮量；

当测定六混液时，按照《中华人民共和国药典》2010年版一部中的方法测定样品中的栀子苷的含量，并测定样品中的含氮量；

S3：校正模型的建立与检验

S31：将步骤S1获得的校正集的原始光谱数据进行预处理和波段范围选择，得到清开灵注射液中间体指标成分含量的特征光谱信息；

S32：以偏最小二乘法对得到的清开灵注射液中间体指标成分含量的特征光谱信息分别和步骤S2所测得的指标成分含量的真实值进行关联建立校正模型，并采用参数检验校正模型；

其中，黄芩苷的波段选择方法为迭代优化2，其中，M＝1或2或3，选择波段范围5804.685～6402.509cm^-1，光谱预处理方法为归一化，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为4；绿原酸的波段选择方法为迭代优化2，其中M＝2，选择波段范围5793.114～6387.082cm^-1和7586.588～8180.556cm^-1，光谱预处理方法为卷积平滑，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为4；

所述迭代优化2是指从N个波长区间段中选择M段组合成一段光谱，进行建模，即N选M，对所有的可能组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，黄芩苷选择的N＝10，M＝1或2或3，绿原酸选择的N＝10，M＝2；

胆酸的波段选择方法为迭代优化3，选择波段范围7563.446～8153.557cm^-1和8751.382～9341.492cm^-1，光谱预处理方法为二阶卷积求导，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为2；

所述迭代优化3是指对N个波长区间段，第一次只用1个区间段光谱进行建模；每次增加一个波长区间，进行建模；依次增加一个波长区间，进行建模；最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，其中使用全波段光谱建模并取最小的SECV初始化整个该方法的SECV；猪去氧胆酸和含氮量的波段选择方法为相关系数法，阈值≥0.4，光谱预处理方法为二阶卷积求导，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为3；

栀子苷的波段选择方法为迭代优化1，选择波段范围7609.729～8809.235cm^-1，光谱预处理方法为无谱图预处理，采用偏最小二乘法建立校正模型时，主因子数为5；

所述迭代优化1是指对N个波长区间段进行全排列组合，使用每一种组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型；

S33：在化学计量学分析系统中导入步骤S32中建立的各校正模型；

S4：在线测定清开灵注射液生产过程的中间体新样品

利用近红外光谱仪采集清开灵注射液生产过程的中间体新样品的原始光谱数据，将所得原始光谱数据输入到已导入校正模型的化学计量学分析系统中，经软件系统计算得到新样品中各成分的含量；

其中，采集清开灵注射液生产过程的中间体新样品的操作条件与采集校正集原始光谱数据的操作条件相同。

2.根据权利要求1所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，所述化学计量学分析系统为OPUS、Unscrambler、Matlab、TQ。

3.根据权利要求1所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，所述校正集的数量至少为15个。

4.根据权利要求3所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，所述校正集的数量为22个。

5.根据权利要求1所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，采集清开灵注射液生产过程的中间体新样品的具体操作条件如下：

在室温15～30℃下，利用AntarisMX傅立叶近红外过程分析仪进行数据采集；具体操作条件为：光源为卤钨灯，检测器为InGaAs检测器，其中，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次，扫描光谱范围为10000～4000cm^-1，光程为2mm。

6.根据权利要求1所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，步骤S32中所述参数是指交叉检验的校正标准偏差、校正标准偏差和决定系数中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的用于清开灵注射液中间体指标成分含量快速测定的方法，其特征在于，步骤S32中所述参数是指交叉检验的校正标准偏差、校正标准偏差和决定系数。