CN103789279B - 含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以磷酸盐缓冲液为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和磷酸盐缓冲液混合，研磨，离心分离，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，本发明的抗氧化性能高，本发明还提供其制备方法，步骤是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入磷酸盐缓冲液，研磨，离心，得上清液；再加入磷酸盐缓冲液至玻璃匀浆器中，研磨，离心，得上清液；在上清液中加入磷酸盐缓冲液定容，本发明工艺简单。

Description

含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液和制备方法
技术领域
本发明涉及抗氧化组合物技术领域，具体是涉及到一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液和制备方法。
背景技术
活性氧是微生物生长代谢过程不可避免的产物，细胞内最常见的活性氧包括超氧自由基（O2 · -）、过氧化氢（H2O2）以及羟自由基（·OH）。在正常情况下，低水平的活性氧（ROS）是细胞行使生物学功能所必需的，因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。但在某些特殊的情况下，比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚。由于自由基高度的活泼性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分子，这种过量的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA，细胞内自由基的积累还会引起膜脂过氧化，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致细胞损伤。
在正常的生理情况下，体内自由基不断产生，同时细胞自身有自由基清除系统，可及时清除代谢产生的自由基而免受伤害，使之维持在一个正常的生理水平上。但在逆境下，比如重金属胁迫条件下，一方面自由基产生过多，另一方面自由基清除系统会发生紊乱，从而使细胞受到伤害。大量研究已经证实，细胞内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效抗氧化的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液和制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以磷酸盐缓冲液为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和磷酸盐缓冲液混合，研磨，离心分离，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，每10 ml含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性为15～33U，所述谷胱甘肽过氧化物酶的活性为31～61 U，所述过氧化氢酶的活性为20～81 U。
黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述黄孢原毛平革菌菌体的制备方法为，将黄孢原毛平革菌在30～35℃下培养3～5天，超纯水清洗。
所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液为1ml时，使用的所述黄孢原毛平革菌菌体的质量为10～100 mg。黄孢原毛平革菌体质量和含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的体积配比表示为黄孢原毛平革菌菌体浓度。
所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，浓度为50mM，pH值为7。
本发明还提供一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的制备方法，步骤是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入磷酸盐缓冲液，充分研磨，离心，得上清液；再加入磷酸盐缓冲液至玻璃匀浆器中，充分研磨，离心，得上清液；合并上述上清液，在合并后的上清液中加入磷酸盐缓冲液定容。
本发明的有益效果是，
1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD) 是重要的活性氧防护酶，广泛存在于各类生物体中，能催化生物体内超氧自由基(O2 · -)发生歧化反应，是机体内O2 · -的天然消除剂，维持机体中自由基产生和清除的动态平衡，对机体细胞起保护作用，SOD将O2 · -歧化成 H2O2，再由CAT和过氧化物酶（POD）将H2O2分解成 H2O和O2。SOD的活性和含量也在一定程度上反映了机体清除氧自由基的能力，对其进行准确测定，具有重要意义。
2、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GSH-Px催化还原型谷胱甘肽氧化与H2O2还原反应，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），阻断由脂氢过氧化物(LOOH) 引发自由基的二级反应，减少LOOH对生物体的损害，从而保护细胞膜的结构及功能不受活性氧的干扰及损害。
3、过氧化氢酶(CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气，能够高效催化H2O2分解，避免了H2O2在体内的积累，从而维持体内正常的活性氧水平，具有清除生物体内自由基，保护细胞免受损害等作用。
本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液具有稳定的抗氧化能力和自由基清除能力，能有效维持细胞内的氧化还原平衡，并能缓解由细胞失去氧化还原平衡而引起的氧化损伤，用于保护细胞，抵抗自由基的毒性。
本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液对活性氧有着独特的亲附性，具有较好的溶解性，分子量小，能渗透到细胞中，在细胞的某一氧化损伤位点定点作用，并且能够被细胞再生，从而起到保护作用。
本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的制备方法，工艺简单，操作方便。
本发明的黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的抗氧化酶活性。
图2为本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的总抗氧化能力效果图。
图3为本发明的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液对H2O2和·OH的清除效果图。
具体实施方式
实施例 1
一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0）为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和磷酸盐缓冲液混合，研磨，离心分离，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，每10 ml含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性为33U，所述谷胱甘肽过氧化物酶的活性为61 U，所述过氧化氢酶的活性为81 U。
制备方法包括如下步骤：
（1）无菌条件下，在100 ml Kirk培养基中接种2ml黄孢原毛平革菌孢子悬浮液，30℃下培养5天。
Kirk培养基的具体成分为，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.71 g，VB1（维生素B1） 0.01 g，酒石酸铵 0.2 g，葡萄糖10 g；微量元素液70 ml；缓冲溶液 850 ml，缓冲溶液为20 mmol/L的酒石酸钠缓冲液：3.0018 g酒石酸/1000 ml，用3%（m/v）的NaOH溶液调节pH值至4.5；用水定容至1L。
其中，微量元素的成分为：NaCl 1.0 g，CoCl2·6H2O 0.18 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.01 g,，MnSO4·H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，AlK(SO4)2·12H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，H3BO3 0.01g，甘氨酸1.5 g，用水定容至1L。
（2）收集黄孢原毛平革菌菌体，无菌超纯水清洗3遍，滤去水分，并用滤纸吸干黄孢原毛平革菌菌体表面的水分，分别称取0.1 g黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，分别加入4 ml磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0），充分研磨，在10000 rpm下高速旋转离心10 min，取上清液。
（3）将上清液转移至离心管中，再加入4 ml磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0）至玻璃匀浆器中，在10000 rpm下高速旋转离心10 min，取上清液；将两次上清液充分混合，加入适量磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0）定容至10 ml，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液。
实施例 2
一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.0）为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和磷酸盐缓冲液混合，研磨，离心分离，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，每10 mL含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性为15U，所述谷胱甘肽过氧化物酶的活性为32 U，所述过氧化氢酶的活性为20 U。
制备方法包括如下步骤：
（1）无菌条件下，在100 ml Kirk培养基中接种5 ml黄孢原毛平革菌孢子悬浮液，35℃下培养5天。
（2）收集黄孢原毛平革菌菌体，无菌超纯水清洗5遍，滤去水分，并用滤纸吸干黄孢原毛平革菌菌体表面的水分，分别称取1.0 g黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，分别加入4 ml磷酸缓冲液（50 mM，pH 7.0），充分研磨，在15000 rpm下高速旋转离心5 min，取上清液。
（3）将上清液转移至离心管中，再加入4 ml磷酸缓冲液（50 mM，pH 7.0）至玻璃匀浆器中，在15000 rpm下高速旋转离心5 min，取上清液；将两次上清液充分混合，加入适量磷酸缓冲液（50 mM，pH 7.0）定容至10 ml，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液。
实施例 3
超氧化物歧化酶测定
①邻苯三酚自氧化速率的测定：在25 ℃下加入2.5 ml缓冲液(0.1 M Tris-HCl，pH 8.0)，超纯水0.1 ml，加入25℃预热过的邻苯三酚0.15 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，在320 nm波长下每隔30 s测吸光度值（A值）一次，以缓冲液(0.1 M Tris-HCl，pH 8.0)作为对照样，测定邻苯三酚自氧化速率。
②SOD酶活性测定：
以每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个SOD活性单位，以U表示。
测定方法为，在25℃下加入2.5ml缓冲液（0.1M Tris-HCl，pH为8.0），含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液0.1ml，加入25℃预热过的邻苯三酚0.15ml，总体积为2.75ml，迅速摇匀，倒入光径为1cm的比色杯内，在320nm波长下每隔30s测吸光度值（A值）一次，以Tris-HCl缓冲液为对照样，测定含抗氧化酶的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液存在下，邻苯三酚的氧化速率。
SOD酶活性计算：
SOD酶活性（U）=[(邻苯三酚自氧化速率-邻苯三酚的氧化速率)/邻苯三酚自氧化速率]*总体积（ml）/(含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液体积（ml）*50%)。
超氧化物歧化酶测定实验结果如图1所示，含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中的超氧化物歧化酶活性较高，其中，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，超氧化物歧化酶（SOD）活性为15.65 U；黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，SOD活性为21.56 U；黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，SOD活性为32.01 U。
谷胱甘肽过氧化物酶测定
取含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液0.4 ml加入离心管中，加入1 mM GSH 0.4 ml。离心管置于37 ℃预温5 min，然后加入已预温至37 ℃的1.5 mM H2O2溶液0.2 ml，混匀并立即记录反应开始时间，继续保温5 min，反应完毕后，立即依次加入质量浓度为1.67%的偏磷酸沉淀液4.0 ml，使蛋白酶失活。以3000 rpm/min离心10 min，取出上清液2 ml，加入0.32 M Na2HPO4沉淀液2.5 ml，与 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）试剂0.5 ml（1 mM）混匀，反应5 min，以超纯水代替含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液作为空白样调零，用UV-2550岛津紫外分光光度计测定412 nm光波处测定光密度值，即OD412，计算GSH-Px活性。
GSH-Px活性(U)= OD412*A*6.25/(5 (min)* 含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液体积（ml）)
其中，A：标准GSH(uM)/标准GSH(OD412)。
谷胱甘肽过氧化物酶测定实验结果如图1所示，含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，谷胱甘肽过氧化物酶活性较高，其中，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性为31.56 U，黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，GSH-Px活性为42.75 U，黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，GSH-Px活性为60.28 U。
过氧化氢酶测定
取2.5 ml 0.1 mol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，加入0.1 ml含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，以PBS代替含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液为对照调零，以0.5 ml 0.1 M的过氧化氢启动反应，测定OD240（测定40s）。以单位时间内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。
CAT活性(U)=[ΔA240×Vt]/（Vs×0.1×t）
ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；t为反应时间(min)；Vt为含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液总体积（ml）；Vs为测定时取用的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液体积（ml）。
过氧化氢酶测定实验结果如图1所示，含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，过氧化氢酶活性较高，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，过氧化氢酶（CAT）活性为20.76 U；黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，CAT活性为45.43 U；黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，CAT活性为89.95 U。
实施例 4
总抗氧化能力测定
ABTS· +自由基的生成：
0.549 g 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）溶解在100 ml 配制的过氧化氢溶液中（10 mmol/L)，室温下（25~30℃）避光静置1小时，有特征的蓝绿色的ABTS· +产生，保存至4℃冰箱中备用。
总抗氧化能力测定步骤：
取10 mmol/L的ABTS· +，用醋酸钠盐缓冲液（pH 3.6）稀释至734 nm下吸光度为0.70±0.02。取上述制备的不同浓度的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液50 ul，加入3 ml ABTS· +溶液，得反应液，准确震荡30 s，在30℃下测定反应液在734 nm处3 min内吸光度值的变化，以超纯水代替含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液作为空白对照样，计算含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的总抗氧化能力（ΔA）。
总抗氧化能力实验结果如图2所示，显示含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液具有一定的抗氧化能力，且随着黄孢原毛平革菌菌体浓度的增加，抗氧化能力得到有效增强。
对 O2 · - 的清除能力测定
取2.5 ml Tris-HCl缓冲液(0.1 M，pH 8.0)，加入含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液0.1 ml，加入25℃预热过的邻苯三酚0.15 ml，迅速摇匀，倒入比色杯内，以超纯水代替邻苯三酚作为对照样，在320 nm波长下测定3 min内的吸光度变化值（ΔA0）。
O2 · -清除能力实验结果如图3所示，显示含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液对O2 · -具有一定的清除能力，清除率可达52%。
对 H2O2 的清除能力测定
取1 ml含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，加入到初始浓度C0为20 mg/L的H2O2溶液中，黑暗条件下振荡降解1 h，测定剩余的H2O2浓度Ct，计算其清除能力。
H2O2清除能力=（C0-Ct）/ C0*100%
其中，C0为H2O2初始浓度，Ct为降解1 h后的H2O2浓度。
H2O2清除能力实验结果如图3所示，显示含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液对H2O2具有很强的清除能力，清除率接近95%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，其特征是，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以磷酸盐缓冲液为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和磷酸盐缓冲液混合，研磨，离心分离，得到含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶，每10 ml含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性为15～33 U，所述谷胱甘肽过氧化物酶的活性为31～61 U，所述过氧化氢酶的活性为20～81 U；所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，浓度为50mM，pH值为7；所述含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液为1ml时，使用的所述黄孢原毛平革菌菌体的质量为10～100 mg。
2.如权利要求1所述的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，其特征是，黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心。
3.如权利要求1或2所述的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液，其特征是，所述黄孢原毛平革菌菌体的制备方法为，将黄孢原毛平革菌在30～35℃下培养3～5天，超纯水清洗。
4.一种如权利要求1-3任一种所述的含抗氧化酶的黄孢原毛平革菌提取液的制备方法，其特征是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入磷酸盐缓冲液，充分研磨，离心，得上清液；再加入磷酸盐缓冲液至玻璃匀浆器中，充分研磨，离心，得上清液；合并上述上清液，在合并后的上清液中加入磷酸盐缓冲液定容。
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