CN103424350B - 一种低数量级诱变细胞的高通量分析系统与计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低数量级诱变细胞的高通量分析系统与计数方法。系统包括PC机/笔记本电脑、用于维持细胞生长环境的细胞培养箱、高通量的96x微电极板、正常细胞、诱变细胞和诱变剂。首先利用PC机/笔记本电脑中的实时细胞监控软件记录诱变细胞的生长曲线，并分析该诱变细胞响应曲线的动态特征，计算得到诱变细胞响应曲线的基准值和阈值，在此基础上，建立诱变细胞数目与生长时间之间的关系方程（亦即：估计模型），再利用非线性回归算法，辨识得到该估计模型的参数，利用辨识的估计模型实现对低数量级、待测诱变细胞数目的计数。本发明最大的优势在于，采用非侵入式的检测手段，无需生物标记，且可以实现高通量的检测。

Description

一种低数量级诱变细胞的高通量分析系统与计数方法

技术领域

本发明涉及一种细胞统计技术与分析系统，特别是涉及一种低数量级的、诱变细胞的高通量统计方法与分析系统，属于细胞基因毒性分析领域。

背景技术

基因毒性(Genotoxicity)是指一些物质具有的特性，该特性能损害细胞内基因信息，破坏细胞内遗传物质的完整性。在大多数情况下，基因毒性可以使不同细胞和其它身体系统产生异变，从而引发生物体的各种疾病（如癌症，即：身体内的失去控制细胞生长）。

在自然环境中，往往存在着大量的药物或污染物，这些物质具有一定基因毒性，可使正常细胞发生诱变，产生诱变细胞，导致生物体发生癌变。因此，通过统计诱变细胞数目，可以鉴定药物或污染物的危害等级，从而预测环境污染物对人体健康产生有害影响的可能性，即：实现人类健康风险评估。但是，自然环境中的诱变剂浓度都非常低，低浓度的诱变剂产生诱变细胞数目也非常少，受检测灵敏度的限制，传统的细胞计数方法很难统计出低数量级的诱变细胞数目，例如：若培养皿中的诱变细胞数目不足100时，MTT比色法无法实现检测。

专利“一种高精度细胞统计技术与分析装置”[申请号：201210062508.5，公开号：CN102851208A]提出一种基于图像分析技术的细胞统计方法，通过调节显微成像装置，获取清晰的细胞显微图片，并对图片进行一系列的图像操作，获取识别结果，并对结果进行统计分析，得到所检测细胞的个数，尺寸与形态等。此方法需要一套高精度的显微成像系统，常用于正常细胞计数，并且无法实现高通量检测。

专利“用于对细胞和生物分子进行计数的系统和方法”[申请号：200980121707.5，公开号：CN102089418A]将细胞的样本与荧光标记试剂接触，并利用荧光光束，由检测设备成像技术，配以计算机软件，实现对待测细胞的计数。此方法是一种侵入式的检测方法，需要荧光标记试剂，细胞的活性受到荧光标记试剂的影响，实验员受感染的机会较大，且其测试步骤单一枯燥，实验员容易疲劳、出错，无法实现高通量检测。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提出一种结合实时细胞分析仪（Real Time Cell Analyzer，RTCA）的诱变细胞的分析系统与计数方法，能实现低数量级诱变细胞的高通量检测。

依据本发明之目的，提出一种低数量级诱变细胞的高通量分析系统，该系统包括用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机/笔记本电脑、用于维持细胞生长环境的细胞培养箱（incubator），一高通量的96x微电极板（E-Plate）、正常细胞、诱变细胞和诱变剂；其中，PC机/笔记本电脑安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件平台，该平台能控制细胞培养箱的环境参数，如：温度、湿度，以及二氧化碳浓度，从而保持细胞生长环境条件的均匀性；并能实时检测微电极板E-Plate的阻抗变化信号，并将该信号转化成细胞指数（Cell Index，CI）显示在屏幕上，同时也存储在PC机/笔记本电脑硬盘中；96x微电极板置于细胞培养箱中，细胞培养箱的环境参数（温湿度，二氧化碳浓度）由实时细胞监控软件控制，从而保持在整个诱变过程的环境条件不变；正常细胞接种在96x微电极板中，诱变细胞和诱变剂加在96x微电极板的微孔中。

其中，正常细胞接种在96x微电极板（E-Plate）中，细胞会贴壁生长，其数量变化会导致E-Plate底部的金箔传感器的阻抗发生变化，微电极上的贴壁细胞越多,阻抗值变化就越大，实时细胞监控软件将这种变化转化成细胞指数（CI），显示在系统中。

利用上述分析系统的计数方法，包括如下步骤：正常细胞接种在96x微电极板中12小时后，在不同的微孔（well）中加入不同数量的诱变细胞与诱变剂，诱变剂将正常细胞全部杀死，让诱变细胞生长，利用实时细胞监控软件平台记录整个诱变细胞的生长曲线，并分析该诱变细胞响应曲线的动态特征，计算得到诱变细胞响应曲线的基准值和阈值；在此基础上，建立诱变细胞数目与生长时间之间的关系方程，即估计模型，再利用非线性回归算法，辨识得到该估计模型的参数，利用辨识的估计模型实现对低数量级、待测诱变细胞数目的计数。

本发明的细胞计数方法包括如下步骤：

（1）将正常细胞接种在96x的微电极板的微孔（well）中；

（2）等待正常细胞稳定12小时后，在微电极板的不同的微孔中加入不同数量的诱变细胞与诱变剂；

（3）诱变剂杀死正常细胞后，剩下的诱变细胞继续生长，实时细胞监控软件平台控制并记录整个诱变过程（200小时），记录并存储不同诱变细胞的生长曲线；

（4）对所记录的诱变细胞生长曲线进行平滑处理，去除传感器的噪声信号；

（5）分析诱变细胞响应曲线的动态特征，计算不同数量级诱变细胞生长曲线的基准值与阈值；

（6）取所有生长曲线基准值的最大值为最终基准值，取所有生长曲线阈值的最小值为最终阈值；用最终基准值与最终阈值分别画一条水平直线，直线与每一条诱变细胞的生长曲线有两个交点，取交点之间的时间差值为诱变细胞的生长时间；

（7）建立诱变细胞数目与生长时间之间的幂函数方程（即：估计模型），并用非线性回归算法得到该幂函数方程的参数；

（8）利用幂函数方程（估计模型）估算待测诱变细胞样品的细胞数目。

本发明与现有技术比较的有益效果是：

（1）采用非侵入式、无标记的检测方法，且细胞指数的读数是非损伤的；

（2）采用96x微电极板进行细胞接种，可实现高通量诱变细胞评估；

（3）采用实时细胞监控软件可以连续、实时的显示数据，记录整个诱变细胞的生长过程，可获得完整的细胞效益图谱，而不是假定细胞处于某种合适的处理阶段（终点法），进行细胞分析；

（4）本计数方法可以实现低数量级细胞的估计。

附图说明

图1为诱变细胞分析系统的结构原理图；其中，1-正常细胞，2-微电极板，3-诱变剂，4-诱变细胞，5-细胞培养箱，6-PC机；

图2为低数量级诱变细胞计数的流程示意图；

图3为低数量级诱变细胞生长曲线，及其计算的基准值与阈值图；

图4为诱变细胞估计模型曲线图。

图5为低数量级诱变细胞估计结果图。

具体实施方式

请参阅第1图，其为本发明用于低数量级诱变细胞高通量计数的分析系统结构原理图，如图所示，本发明包括一用于监测细胞生长和控制其生长环境参数的PC机6，一用于维持细胞生长环境的细胞培养箱5（incubator），一高通量的96x微电极板2（E-Plate），正常细胞1，诱变细胞4，诱变剂3。

其中，PC机6中安装有ACEA公司开发的实时细胞监控软件平台，该平台能控制细胞培养箱的环境参数，如：温度、湿度，以及二氧化碳浓度，从而保持细胞生长环境条件的均匀性；并能实时检测微电极板2的阻抗变化信号，并将该信号转化成细胞指数（Cell Index，CI）显示在屏幕上，同时也存储在PC机硬盘中。

其中，96x微电极板2置于细胞培养箱5中，细胞培养箱5的环境参数（温湿度，二氧化碳浓度）由实时细胞监控软件控制，从而保持在整个诱变过程的环境条件不变。

其中，正常细胞1接种在96x微电极板2（E-Plate）中，细胞会贴壁生长，其数量变化会导致E-Plate底部的金箔传感器的阻抗发生变化，微电极上的贴壁细胞越多,阻抗值变化就越大，实时细胞监控软件将这种变化转化成细胞指数（CI），显示在系统中。

其中，在正常细胞1接种在微电极板2上12小时后，在不同的微孔（well）中加入不同数量的诱变细胞4与诱变剂3，该诱变剂3会将正常细胞全部杀死，让诱变细胞4生长，实时细胞监控软件记录整个诱变细胞4的生长过程。

本发明的计数方法：首先利用实时细胞监控软件记录诱变细胞的生长曲线，并分析该诱变细胞响应曲线的动态特征，计算得到诱变细胞响应曲线的基准值（Baseline）和阈值（Threshold），在此基础上，建立诱变细胞数目与生长时间之间的关系方程（亦即：估计模型），再利用非线性回归算法，辨识得到该估计模型的参数，利用辨识的估计模型实现对低数量级、待测诱变细胞数目的计数。

如图2所示，本发明的计数方法具体包含如下步骤：

第1步：将正常细胞1接种在96x的微电极板2中；

第2步：等待正常细胞1稳定12小时后，在微电极板2的不同的微孔中加入不同数量的诱变细胞4M_j（M_j∈{512,256,128,64,32,16,8,4,2,1}，j=1,2,…,10）与诱变剂3；

第3步：诱变剂3杀死正常细胞后，剩下的诱变细胞4继续生长，实时细胞监控软件控制并记录整个诱变过程（200小时），记录并存储不同诱变细胞M_j在不同时刻的细胞指数CI_j[i]（i=1,2,…,200，亦即：实时细胞监控软件每1小时采样一个点），其结果如图3所示，其中各曲线代表的含义如下:a-无诱变细胞；b-1个诱变细胞；c-2个诱变细胞；d-4个诱变细胞；e-8个诱变细胞；f-16个诱变细胞；g-32个诱变细胞；h-64个诱变细胞；i-128个诱变细胞；j-256个诱变细胞；k-512个诱变细胞；l-基准值CI^b；m-阈值CI^t。

第4步：对所记录的不同数量级诱变细胞生长曲线进行平滑处理：

$\left\{\begin{array}{c}{y}_j\left[k\right]=\frac{\left(\underset{i=k-\mathrm{Num}}{\overset{k}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{CI}}_j\right[i]-\max \left({\left\{{\mathrm{CI}}_j\right[i\left]\right\}}_{i=k-\mathrm{Num}}^k\right)-\min \left({\left\{{\mathrm{CI}}_j\right[i\left]\right\}}_{i=k-\mathrm{Num}}^k\right))}{\mathrm{Num}-2};k\&GreaterEqual;\mathrm{Num}\\ y_j\left[k\right]\frac{\underset{i=1}{\overset{k}{\mathrm{\&Sigma;}}}{\mathrm{CI}}_j\left[i\right]}{k};k<\mathrm{Num}\end{array}\right.---\left(1\right)$

其中，Num为移动平滑窗体的长度，这里取Num=6；k为采样时刻k=1,2,…,200；y_j[k]为第M_j诱变细胞平滑处理后的细胞指数值。

第5步：计算不同数量级诱变细胞M_j生长曲线的基准值与阈值。为得到合理的基准值和阈值，首先要计算细胞指数的变化率B_j[k]：

$B_j\left[k\right]=\frac{y_j[k+1]-y_j[j-1]}{2}---\left(2\right)$

细胞指数的变化率B_j[k]直接反映诱变细胞在采样时刻k的生长速率，若为负值，则表示细胞死亡，反之则表示细胞生长；绝对值越高表示细胞指数变化越大，细胞越有活力。

在此基础上，计算不同数量级诱变细胞的细胞指数变化率B_j[k]第一次大于0时的值，并获取此时刻的细胞指数CI为该数量级诱变细胞的基准值

${\mathrm{CI}}_j^b={\mathrm{CI}}_j\left[k_j^b\right];j=\mathrm{1,2},...,10$

$\left\{\begin{array}{c}{k}_j^b=\underset{k=\mathrm{1,2},...,200}{\min }\left(k\right)\\ s.t.B_j\left[k\right]>\mathrm{\&delta;}\end{array}\right.---\left(3\right)$

其中，δ为很小的数值，这里为避免系统噪声的影响，取δ=10^-4（接近于0）。

此外，计算不同数量级诱变细胞的细胞指数变化率B_j[k]最大值时的值，并获取此时刻的细胞指数CI为该数量级诱变细胞的阈值

${\mathrm{CI}}_j^t={\mathrm{CI}}_j\left[k_j^t\right];j=\mathrm{1,2},...,10$                                          （4）

$s.t.k_j^t=\underset{k=\mathrm{1,2},...,200}{\arg \max }\left(B_j\right[k\left]\right)$

第6步：取所有数量级诱变细胞的基准值的最大值为最终基准值CI^b：

${\mathrm{CI}}^b=\max \left({\left\{{\mathrm{CI}}_j^b\right\}}_{j=1}^{10}\right)---\left(5\right)$

取所有数量级诱变细胞的阈值的最小值为最终阈值CI^t：

${\mathrm{CI}}^t=\min \left({\left\{{\mathrm{CI}}_j^t\right\}}_{j=1}^{10}\right)---\left(6\right)$

第7步：用最终基准值CI^b画一条水平基准线，如图3所示，该基准线与每一条诱变细胞的生长曲线有一个交点k_j，取该交点的横坐标最小值为评估时间起点t(k^s)，即：

$k^s=\min \left({\left\{k_j\right\}}_{j=1}^{10}\right)$                              （7）

$s.t.k_j=\underset{k=\mathrm{1,2},...,200}{\arg \min }(k{|\mathrm{CI}}_j\left(k\right)={\mathrm{CI}}^b)$

用最终阈值CIt画一条水平阈值线，如图3所示，该阈值线与每一条诱变细胞的生长曲线有个交点k_j，取该交点的时间值t(k_j)与评估时间起点t(k^s)的差值为该数量级诱变细胞M_j的生长时间t_j：

$t_j=t\left(k_j\right)-t\left(k^s\right);j=\mathrm{1,2},...,10$               （8）

$s.t.k_j=\underset{k=\mathrm{1,2},...,200}{\arg \min }\left(k\right|{\mathrm{CI}}_j\left(k\right)={\mathrm{CI}}^t)$

第8步：建立诱变细胞数目M_j与生长时间t_j之间的幂函数方程（即：估计模型）：

$t_j=a_1{\left(M_j\right)}^{a_2}+a_3---\left(9\right)$

其中a₁,a₂,a₃为估计模型参数，

采用非线性回归算法得到该幂函数方程的参数，如图4所示，在此实施例中：a₁=255.1，a₂=-0.99，a₃=104.8。

第9步：用步骤1到步骤7的处理方法处理待测诱变细胞样品的生长曲线，得到待测诱变细胞的生长时间t，利用估计模型（9）即可估算出待测诱变细胞样品的细胞数目

$\hat{M}={\left(\frac{t-a_3}{a_1}\right)}^{\frac{1}{a_2}}---\left(10\right)$

为说明本发明的实施效果，将0.2uL的诱变剂3加入待测试诱变细胞样品中，并将该待测样品接种到96x微电极板2中，总共需占据96x微电极板2的16个微孔，这16个微孔的生长曲线如图5所示。由公式（10）即可算出，待测诱变细胞样品中诱变细胞数目为25。此结果与显微镜下人工计数的结果基本一致，说明本发明能够实现低数量级诱变细胞的计数，且具有较高的精度。

Claims (2)

1.一种低数量级诱变细胞的高通量分析系统的计数方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将正常细胞接种在96x的微电极板的微孔中；

(2)等待正常细胞稳定12小时后，在微电极板的不同的微孔中加入不同数量的诱变细胞与诱变剂；

(3)诱变剂杀死正常细胞后，剩下的诱变细胞继续生长，实时细胞监控软件平台控制并记录整个诱变过程，记录并存储不同诱变细胞的生长曲线；

(4)对所记录的诱变细胞生长曲线进行平滑处理，去除传感器的噪声信号；

(5)分析诱变细胞响应曲线的动态特征，计算不同数量级诱变细胞生长曲线的基准值与阈值；

(6)取所有生长曲线基准值的最大值为最终基准值，取所有生长曲线阈值的最小值为最终阈值；最终基准值与最终阈值分别所在的水平直线与每一条诱变细胞的生长曲线有两个交点，取交点之间的时间差值为诱变细胞的生长时间；

(7)建立诱变细胞数目与生长时间之间的幂函数方程，即估计模型，并用非线性回归算法得到该估计模型的参数；所述估计模型为：其中a₁,a₂,a₃为估计模型参数，M_j为诱变细胞数目，t_j为诱变细胞的生长时间；j代表不同数量诱变细胞的序号，其取值范围为j＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10；

(8)利用估计模型估算待测诱变细胞样品的细胞数目。

2.根据权利要求1所述的计数方法，其特征在于，所述步骤(3)的整个诱变过程为200小时，实时细胞监控软件平台每1小时采样一个点。