CN103320414A - 中性α-半乳糖苷酶M-GALC及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中性α-半乳糖苷酶M-GALC及其编码基因与应用。蛋白M-GALC具有α-半乳糖苷酶活性，来源于毛壳霉（chaetomium globosom），是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列表序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶的比活力为1.91U/mg；最适pH为7.0；最适温度为42℃；在37-50℃的温度范围内和pH值为6.0-9.0范围内具有高的酶活性。本发明为α-半乳糖苷酶的制备提供了一个新途径，具有重要的应用价值。

Description

中性α-半乳糖苷酶M-GALC及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种中性α-半乳糖苷酶M-GALC及其编码基因与应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase，EC3.2.1.22)，又称为蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能专一性催化水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-1，6半乳糖苷键，其不仅能水解棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖，还能水解含α-半乳糖苷的杂多糖。α-半乳糖苷酶作为一种新型酶制剂，在饲料工业中得到了广泛的应用。

近年来的研究表明，α-半乳糖苷酶作为一种特异性外源酶，添加于含大豆粕的饲料中，可有效促进饼粕类饲料原料中α-半乳糖苷物质的分解，提高饲料营养素的利用率，消除由α-半乳糖苷类物质引起的抗营养作用，为机体提供更多的能量，促进肠道有益微生物的增殖。

目前，不断提高菌种产酶水平，研究α-半乳糖苷酶合成的调控机制、酶基因的克隆和异源高效表达，进行产业化推广应用是今后发展的主要方向。α-半乳糖苷酶主要是利用微生物发酵法生产的，菌种主要来源于曲霉和犁头霉。毛壳霉（chaetomiumglobosom）属于子囊菌门，盘菌亚门，类壳目，毛壳菌科，马杜拉分支菌属，目前国内外未见毛壳霉来源的α-半乳糖苷酶基因报道。克隆毛壳霉的α-半乳糖苷酶基因及异源表达，具有α-半乳糖苷酶分类学理论指导的意义，新基因的获得也将对该基因在其他表达系统的高效表达建立研究基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种中性α-半乳糖苷酶M-GALC及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白M-GALC，来自毛壳霉（chaetomium globosom），具有α-半乳糖苷酶活性，为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）或（b）中的蛋白M-GALC便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签

残基数

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tagII	8	WSHPQFEK
C一myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白M-GALC可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白M-GALC的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点（具体可为EcoR I和Not I位点间）得到的重组质粒。

本发明保护扩增以上任一所述基因全长或其任意片段的引物对。

本发明保护所述蛋白在降解糖链末端具α-1，6半乳糖苷键的物质或制备α-半乳糖苷酶中的应用。所述糖链末端具α-1，6半乳糖苷键的物质可为α-半乳糖苷类的寡糖或含α-半乳糖苷键的多聚糖。

所述糖链末端具α-1，6半乳糖苷键的物质可为对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖。

所述降解的pH值为5.0—10.0，或6.0—9.0，或6.0—7.0，或7.0—8.0，或8.0—9.0，如5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0。

所述降解的温度为30—60℃，或30—55℃，或37—50℃，或37—42℃，或42—45℃，如30、37、42、45、50、55或60℃。

实验证明，本发明所提供的蛋白M-GALC，具有α-半乳糖苷酶活性，其比活力为1.91U/mg；最适pH为7.0；最适温度为42℃。该蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶在37—50℃的温度范围内和pH值为6.0—9.0范围内具有较高的酶活性。本发明为α-半乳糖苷酶的制备提供了一个新途径，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增蛋白M-GALC编码基因的电泳图。其中，左泳道为分子量标准，右泳道为PCR扩增产物。

图2为SDS-PAGE电泳图。

图3为蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶在不同温度下的相对酶活。

图4为蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶经37℃和50℃处理不同时间后的相对酶活。

图5为蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶在不同pH下的相对酶活。

图6为蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶经不同pH处理后的相对酶活。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中α-半乳糖苷酶酶活的测定方法如下：

以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(pNPG)为底物，经酶解后测定释放的对硝基酚(pNP)的含量，获得α-半乳糖苷酶酶活；1个α-半乳糖苷酶酶活定义为：1分钟内分解pNPG产生1μmol pNP的酶量作为1个酶活单位（1U）。

实施例1、目的蛋白M-GALC及其编码基因的获得

从豆制品加工厂采集的土壤样品中筛选获得一株毛壳霉（chaetomium globosom）菌株MK，以该菌株的基因组DNA为模板，用自行设计的一对简并引物进行PCR扩增，获得长0.8bp的DNA片段，再以该片段为模板，用自行设计的巢式引物和简并引物进行Tail-PCR，获得3800bp的基因片段，其核苷酸序列如序列表序列3所示。该序列经分析发现2244bp的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表序列2所示。

提取上述毛壳霉（chaetomium globosom）菌株MK的总RNA，反转录获得cDNA；以cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

QF:5’-ATGAGTTTCGCTTCAATGTC-3’；

QR:5’-CTACTGCCTCTCGAGCAGGA-3’；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得的2.2Kb片段（如图1所示）。将PCR产物回收，并进行测序，结果如序列表序列2所示。序列表序列2编码序列表序列1所示的由748个氨基酸组成的蛋白质M-GALC，将编码该蛋白的基因命名为基因m-galc。该蛋白质M-GALC的预测分子量为82.5Kda，理论等电点为4.91。

实施例2、目的蛋白M-GALC的制备

一、重组表达载体构建

提取上述毛壳霉（chaetomium globosom）菌株MK的总RNA，反转录获得cDNA；以该cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：

ZYF：5’-GAATTCATGAGTTTCGCTTCAATGTC-3’（下划线处为ECOR I识别序列）；

ZYR：5’-GCGGCCGCCTACTGCCTCTCGAGCAGGA-3’(下划线处为Not I识别序列)；

回收PCR产物，进行测序，获得在序列表序列2的5’末端连接ECOR I酶切识别序列、3’末端连接Not I酶切识别序列的DNA片段。将该DNA片段用EcoR I和Not I双酶切后，与经EcoR I和Not I双酶切的原核表达载体pET-30a(+)（购自Novegon）的载体骨架片段相连，获得重组表达载体pET-m-galc，经测序证实，该载体为在载体pET-30a(+)的EcoR I和Not I位点间连入序列表序列2所示DNA片段的重组载体。

二、重组菌的构建

将重组表达载体pET-m-galc转化大肠杆菌Rosetta（购自北京全式金生物技术有限公司），获得含有重组表达载体pET-m-galc的重组菌X；

将空载体pET-30a(+)转化大肠杆菌Rosetta，获得含有空载体pET-30a(+)的重组菌CK。

三、目的蛋白的制备和分离纯化

1、将重组菌X或重组菌CK接种于10ml LB液体培养基（含卡那霉素100mg/L），37℃摇床培养过夜。按1%体积转接于100ml LB液体培养基（含卡那霉素100mg/L），摇床培养至OD₆₀₀为0.6～0.8。加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于28℃、200rpm条件下诱导培养4小时，得到100ml发酵液。

2、取步骤1获得的发酵液离心，收集菌体，按菌液：Tris-HCl缓冲液（20Mm,pH8.0）=10：1的比例重悬菌体，用超声波破碎细胞，离心，分别收集上清液和沉淀。

3、步骤2的上清液用Ni柱亲合层析纯化，获得含有目的蛋白M-GALC的溶液，具体纯化步骤如下：

1）取亲和层析树脂（Ni-NTA Agarose）1.5-2ml，加入已放好垫片的塑料管中，待树脂全部沉积到一起时，放入上层垫片，压紧，这样就灌好一个亲和层析柱，备用。

2）将柱子垂直摆放在4℃冰箱中，加入水15-20ml。

3）待步骤2）加入的水流尽后，加入2～3ml0.1mol/L硫酸镍。

4）待步骤3）加入的硫酸镍流尽后，加入15～20ml NTA-0缓冲液平衡柱子。

5）待步骤4）加入的缓冲液流尽后，加入步骤2的上清液；

6）待步骤5）加入的清液全部流尽后，用NTA-0缓冲液20ml洗脱柱子。

7）再用10ml NTA-100缓冲液洗脱柱子，回收该洗脱液，得到10ml洗脱液。

所述NTA-0缓冲液由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为10％（体积百分含量）的甘油和终浓度为0.5mol/L的氯化钠组成；NTA-0缓冲液的pH值为8.0；所述终浓度为各物质在NTA-0缓冲液中的浓度。

所述NTA-100缓冲液由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为10％（体积百分含量）的甘油、终浓度为0.5mol/L的氯化钠和终浓度100mmol/L的咪唑组成；NTA-100缓冲液的pH值为8.0；所述终浓度为各物质在NTA-100缓冲液中的浓度。

4、SDS-PAGE检测

分别收集重组菌X和重组菌CK在步骤1所述诱导前和诱导后的菌体，用相应等体积的Tris-HCl缓冲液重悬，得到菌体悬浮液，用于SDS-PAGE检测；分别收集步骤2中的重组菌X菌体破碎后上清和沉淀，用于SDS-PAGE检测；收集重组菌X菌体破碎后上清经步骤3纯化得到的洗脱液，用于SDS-PAGE检测。结果如图2所示。

图2中，泳道1表示重组菌CK在诱导前的菌体悬浮液，泳道2表示重组菌CK在诱导后的菌体悬浮液，泳道3表示重组菌X在诱导后的菌体悬浮液，泳道4表示重组菌X菌液离心收集菌体后经缓冲液重悬破碎后的菌体，泳道5表示重组菌X菌液离心收集菌体后经缓冲液重悬破碎后的上清，泳道6表示重组菌X菌体破碎后上清经NTA100纯化的洗脱液，泳道M表示Marker。

结果表明，重组菌X经诱导后产生目的蛋白经纯化后为单一条带，其分子量与预测的分子量一致。重组菌CK无目的蛋白M-GALC的产生。

5、蛋白定量分析

使用试剂盒Easy Protein Quantitative Kit（北京全式金生物技术有限公司，产品目录编号DQ101-01）对步骤3获得的重组菌X和重组菌CK的洗脱液分别进行蛋白质定量分析。结果表明，重组菌X的洗脱液中目的蛋白M-GALC的浓度为183.06μg/mL，换算得到步骤1获得的重组菌X发酵液中含目的蛋白M-GALC的浓度为18.306μg/mL；重组菌CK的洗脱液中目的蛋白M-GALC的浓度为0。

6、目的蛋白M-GALC的α-半乳糖苷酶酶活测定及比活力

1）将pNPG溶于0.1M、pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中,获得20mM的pNPG溶液。将步骤3得到的10ml洗脱液用0.1M、pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释100倍，获得待测溶液。取1mL待测溶液和1mL20mM的pNPG溶液混合摇匀，在温度为42℃、pH值为7.0的条件下温育15min后，加入2mL1M的Na₂CO₃溶液终止反应。测定被终止的反应液的OD_405nm值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。调零对照：以0.1M、pH为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液代替所述待测溶液进行测定。

0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH7.0）：A1液41.175mL，B1液8.825mL，调节pH值，加水50mL稀释定容；A1液:0.2M磷酸氢二钠缓冲液；B1液:0.1M柠檬酸缓冲液。

2）制作标准曲线：将pNP标准品溶于0.1M、pH值为7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，得到不同浓度的标准品溶液，检测不同浓度的标准品溶液在OD₄₀₅nm处测吸光值，制作标准曲线。

3）酶活计算公式

每毫升洗脱液中酶活的计算公式如下：

α-半乳糖苷酶酶活(U/ml洗脱液)=(196.74X+0.5174)×N/(15×1000)

X：405nm处光吸收值；15：反应15min；N：将洗脱液稀释成待测溶液的稀释倍数（即100）

结果：重组菌X在步骤3中得到的10ml洗脱液中的α-半乳糖苷酶酶活为0.35U/mL，即重组菌X在步骤1中的发酵液中的α-半乳糖苷酶酶活为0.035U/mL。重组菌CK在步骤3中得到的10ml洗脱液中的α-半乳糖苷酶酶活为0U/mL，即重组菌CK在步骤1中的发酵液中的α-半乳糖苷酶酶活为0U/mL。

本发明所提供的目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶的比活力为0.35U/mL÷183.06μg/mL=1.91U/mg。

实施例3、目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶的性质鉴定

本实施例均以重组菌X在实施例2的步骤3中得到的洗脱液为检测对象。

一、最适温度及温度稳定性

1、最适温度

按照实施例2步骤6中的方法进行，不同之处在于：在温度为30、37、42、45、50、55、60或65℃的条件下测定的α-半乳糖苷酶酶活。

将温度为42℃条件下，测得的酶活为0.35U/ml记作100%，计算各不同温度条件下测得的酶活相对于0.35U/ml的百分比，即相对酶活（%）。实验设3次重复，结果取平均值，如图3所示。

图3中，在反应温度分别为30、37、42、45、50、55、60℃时，相对酶活（%）分别为：35.63%、72.5%、100%、87.5%、63.58%、29%、14.13%。

结果表明，本发明所提供的目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶的最适温度为42℃，且在37—50℃的温度范围内都具有高的酶活性。

2、温度稳定性

按照实施例2步骤6中的方法进行，不同之处在于：检测前，将重组菌X在实施例2的步骤3中得到的洗脱液先在37℃或50℃下分别保持0.5、1、2、4、8、10、20、30、40、55或60min。

将未经保温的洗脱液测得的酶活为0.35U/ml记作100%，计算经其余保温处理后测得的酶活相对于0.35U/ml的百分比，即相对酶活（%）。实验设3次重复，结果取平均值，如图4所示。

图4中，经37℃保温0.5、1、2、4、8、10、20、30、40、55和60min后的相对酶活（%）分别为：98.54%、98.20%、96.82%、96.48%、95.88%、95.02%、94.85%、86.09%、75.87%、74.58%、65.40%；经50℃保温0.5、1、2、4、8、10、20、30、40、55和60min后的相对酶活（%）分别为：80.99%、80.79%、78.15%、41.40%、28.04%、19.37%、5.94%、2.42%、1.94%、0.18%、0.18%。

结果表明，本发明所提供的目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶在37℃保温1小时，酶活仍保持在65.40%，在50℃保温2min，酶活保持在78.15%。

二、最适pH值及pH值稳定性

1、最适pH值

按照实施例2步骤6中的方法进行，不同之处在于：将使用的缓冲液分别替换为如下不同pH值得缓冲液：

pH3.0、6.0、7.0、8.0的0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；

pH4.0、5.0的0.1M乙酸钠-乙酸缓冲液；

pH9.0、10.0的0.05M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

以pH值为7.0条件下的酶活0.35U/ml为100%，计算各不同pH条件下酶活相对于0.35U/ml的百分比，即相对酶活（%）。实验设3次重复，结果取平均值，如图5所示。

图5中，pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0条件下的相对酶活分别为：0.16%、0.35%、2.47%、23.66%、100%、45.77%、9.41%、3.68%。

结果表明，本发明所提供的目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶的最适pH值为7.0。

2、pH值稳定性

按照实施例2步骤6中的方法进行，不同之处在于：检测前，分别用步骤1的pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0缓冲液将重组菌X在实施例2的步骤3中得到的洗脱液稀释5倍，于37℃温育1小时,作为待测溶液。

以使用pH7.0的缓冲液处理0min的酶活0.35U/ml为100%，计算各不同pH处理相对于0.35U/ml的百分比，即相对酶活（%）。实验设3次重复，结果取平均值，如图6所示。

图6中，经pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0缓冲液37℃温育1小时后的相对酶活分别为：1.98%、2.25%、13.03%、78.16%、79.72%、63.2%、60.63%、13.05%。

结果表明，本发明所提供的目的蛋白M-GALC作为α-半乳糖苷酶在pH值6.0-9.0之间具有较好的稳定性。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列表序列1衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述基因，其特征在于：所述基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白在降解糖链末端具α-1，6半乳糖苷键的物质或制备α-半乳糖苷酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述糖链末端具α-1，6半乳糖苷键的物质为对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为5.0—10.0，或6.0—9.0，或6.0—7.0，或7.0—8.0，或8.0—9.0。

10.根据权利要求7—9中任一所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为30—60℃，或30—55℃，或37—50℃，或37—42℃，或42—45℃。

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