CN103305525A - 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103305525A
CN103305525A CN2012100655841A CN201210065584A CN103305525A CN 103305525 A CN103305525 A CN 103305525A CN 2012100655841 A CN2012100655841 A CN 2012100655841A CN 201210065584 A CN201210065584 A CN 201210065584A CN 103305525 A CN103305525 A CN 103305525A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lectin
gene
tobacco
chinese scholartree
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012100655841A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103305525B (zh
Inventor
林忠平
徐志超
杜鹃
胡鸢雷
Original Assignee
林忠平
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 林忠平 filed Critical 林忠平
Priority to CN201210065584.1A priority Critical patent/CN103305525B/zh
Publication of CN103305525A publication Critical patent/CN103305525A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103305525B publication Critical patent/CN103305525B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种槐树凝集素基因，及其编码的蛋白，槐树凝集素基因Lectin的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。构建Lectin植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转Lectin基因烟草；结果表明：Lectin基因在烟草中表达，转Lectin基因的烟草有明显的抗虫效果。

Description

一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用。
背景技术
植物凝集素是一类有高度特异性糖结合活性的蛋白，有与单糖特异可逆结合的结构域。第一个被发现的植物凝集素基因来自蓖麻子。植物凝集素广泛分布在自然界中而且在植物中地位十分重要，凝集素基因在进化过程中为了适应自然产生了多种特有的功能：贮存物质，固氮功能，防卫功能，抗虫功能，促进有丝分裂等。目前凝集素抗虫机理尚未弄清楚，其原理可能是凝集素蛋白与昆虫肠腔部位的糖蛋白特异结合，降低肠道膜的通透性，从而导致肠道功能蛋白失去活性，影响营养物质吸收引发病变。目前国内外对凝集素基因抗虫功能的研究较为广泛，其对植物的抗虫防御等作用，在农业、医学等领域研究有广阔的应用前景。
现在，在生活中，我们都希望食用干净的无污染的蔬菜、水果，可是在蔬菜、水果成熟的过程中，又不可避免的会用农药。植物凝集素基因导入作物中会从根本上减少害虫的侵蚀也可以减少化学污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种槐树凝集素基因，其碱基序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明的第二个目的在于一种槐树凝集素基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第三个目的在于提供一种含有槐树凝集素基因的表达载体。
所述表达载体为植物表达载体。
本发明的第四个目的在于提供槐树凝集素基因在抗虫植物中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种提高植物抗虫性的方法，将槐树凝集素基因导入植物组织或细胞，得到具有抗虫性的植物，所述槐树凝集素基因是下述核苷酸序列之一：
1)SEQ ID NO：1所示DNA序列；
2)编码SEQ ID NO：2所示氨基酸残基序列的DNA序列。
所述槐树凝集素基因通过含有所述槐树凝集素基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
所述植物表达载体为p3300-35S-Lectin。
本发明的技术路线为：
1)利用分子生物学方法从槐树中克隆凝集素基因，命名为Lectin；
2)构建Lectin植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转Lectin基因烟草；
3)结果表明：Lectin基因在烟草中表达，转Lectin基因的烟草有明显的抗虫效果。
本发明克隆了一种槐树凝集素基因Lectin，构建Lectin植物表达载体，用农杆菌转化烟草，获得转Lectin基因烟草；结果表明：Lectin基因在烟草中表达，转Lectin基因的烟草有明显的抗虫效果。
附图说明
图1Lectin植物表达载体构建流程图；
图2Lectin转基因烟草RNA琼脂糖凝胶电泳检测图；
图3Lectin转基因烟草RT-PCR检测电泳图；
图4非转基因烟草叶片小菜蛾饲喂检测图；
图5Lectin转基因烟草叶片小菜蛾饲喂检测图；
图6Lectin转基因烟草叶片经抗小菜蛾检测实验结果图，A代表叶片正面，B代表叶片背面。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
本发明用到的材料及试剂：
槐树叶片，采自北大校园。
小菜蛾，取自中国农科院植保所。
农杆菌Agr0。大肠杆菌DH5α。
DNA聚合酶，RNA反转录酶，购自北京全式金生物技术有限公司。引物合成及测序在上海生工生物工程有限公司。
实施例1Lectin基因克隆
用Trizol法提取槐树叶片RNA，用反转录酶进行反转录。以反转录的DNA产物做为扩增目标基因的模板，进行PCR扩增，得到长度为867bp的cDNA片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，命名为：Lectin。Lectin基因其编码槐树凝集素，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示
引物序列为：
上游引物LectinXbaI：
5’GCTCTAGAATGGCTTCCTACAAGTT3’
下游引物LectinSmaI：
5’GGCCCGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGTGGATCCTCAAG3’
引物上加限制性内切酶XbaI和SmaI的识别位点以利于下一步扩增产物连接到载体上。
PCR反应体系(50μL)为：模板2μL；
Taq DNA聚合酶(10000U/mL)1μL；
dNTPs(2.5mmol/L)4μL；
10×bufffer5μL；
引物各2μL；
ddH2O 34μL。
反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，30个循环，然后72℃10min。
PCR扩增目的条带进行回收然后连接PMD18-T载体进行测序，验证其准确性。
实施例2Lectin植物表达载体构建
Lectin植物表达载体p3300-35S-Lectin构建过程参见图1。
用限制性内切酶XbaI和SmaI分别双酶切载体P3300-35s-tnos和目的基因Lectin的PCR扩增产物，酶切产物用T4DNA连接酶进行粘性末端的连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5α进行PCR检测，得到Lectin植物表达载体，命名为p3300-35S-Lectin。
实施例3Lectin植物表达载体农杆菌介导转化烟草
1、农杆菌的培养
将含有Lectin的质粒p3300-35S-Lectin用液氮冻融法转化到农杆菌Agr0感受态中，条件：液氮冻3min，37℃5min。筛选阳性单菌落，用含Rif(50mg/L)，Sm(100mg/L)和Kan(100mg/L)的液体LB中28℃振荡培养2d至对数生长期。
2、农杆菌侵染及再生苗培养
将W38烟草无菌苗叶片切成0.5cm2的小块(伤口)，用经过MS0液体培养基稀释的农杆菌菌液侵染15min，侵染后的叶片用无菌纸吸干，除去多余的农杆菌菌液，将侵染后的叶片放入MS0培养基中共培养(暗培养)2d。
将共培养后的叶盘转移到含MS0+6-BA(2mg/mL)+Car(500mg/mL)+NAA(1mg/mL)+PPT(10mg/mL)的分化培养基上。待分化出的芽1cm左右大小时，转到含MS0+PPT(10mg/L)+Car(500mg/L)的生根培养基上，3周左右形成不定根。将生根后的烟草苗移栽至温室中。
3、转基因烟草的鉴定
提取转基因烟草叶片的总DNA和RNA，进行PCR和RT-PCR检测。
PCR反应体系(20μL)为：10×buffer 2μL；
dNTPs(2.5mmol/L)2μL；
引物各1μL；
模板1μL；
Taq DNA聚合酶(10000U/mL)0.5μL。
反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，30个循环；然后72℃10min。
Lectin转基因烟草RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，所提RNA结构完整，符合接下来的RT-PCR检测要求。
Lectin转基因烟草RT-PCR检测结果如图3所示，根据RT-PCR结果来看，筛选出的转基因烟草RNA水平都有Lectin基因的表达。
实施例4转基因烟草的抗虫实验
用小菜蛾做抗虫实验。将一定数量(10-15只)的小菜蛾幼虫分别放在未转基因烟草和转基因烟草的叶片上，饲养3天，观察，计数。
用非转基因烟草饲喂小菜蛾，3天后烟草叶片基本被吃光，小菜蛾的幼虫孵化成蛾子，并飞走，如图4所示，非转基因烟草对小蔡蛾没有抗性。
用Lectin转基因烟草饲喂小菜蛾，3天后烟草叶片受损程度很低，且小菜蛾幼虫死亡，如图5和图6所示，实验结果表明：用Lectin转基因烟草饲喂小菜蛾3天的抑制率为74％以上，Lectin转基因烟草能有效的抑制小菜蛾的繁殖，具有明显的抗虫作用。
Figure ISA00000683643000021
Figure ISA00000683643000031

Claims (8)

1.一种槐树凝集素基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的槐树凝集素基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.含有权利要求1所述槐树凝集素基因的表达载体。
4.权利要求3所述表达载体为植物表达载体。
5.权利要求1所述槐树凝集素基因在抗虫植物中的应用。
6.一种提高植物抗虫性的方法，将槐树凝集素基因导入植物组织或细胞，得到具有抗虫性的植物，所述槐树凝集素基因是下述核苷酸序列之一：
1)SEQ ID NO：1所示DNA序列；
2)编码SEQ ID NO：2所示氨基酸残基序列的DNA序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述槐树凝集素基因通过含有所述槐树凝集素基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为p3300-35S-Lectin。
CN201210065584.1A 2012-03-14 2012-03-14 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用 Expired - Fee Related CN103305525B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210065584.1A CN103305525B (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210065584.1A CN103305525B (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103305525A true CN103305525A (zh) 2013-09-18
CN103305525B CN103305525B (zh) 2015-02-18

Family

ID=49131246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210065584.1A Expired - Fee Related CN103305525B (zh) 2012-03-14 2012-03-14 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103305525B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088035A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 南京农业大学 大豆凝集素基因lec-s 的应用
CN106432453A (zh) * 2016-08-23 2017-02-22 广东省农业科学院作物研究所 一种烟草凝集素蛋白及其编码基因和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1313386A (zh) * 2001-03-12 2001-09-19 云南省农业科学院生物技术研究所 苦参凝集素和其抗虫、抗病编码基因及其应用
CN1357553A (zh) * 2001-12-11 2002-07-10 中国科学院遗传研究所 菊芋凝集素、其编码基因及其在抗虫植物基因工程中的应用
CN1560250A (zh) * 2004-03-04 2005-01-05 上海交通大学 红豆杉凝集素蛋白编码序列
CN103088035A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 南京农业大学 大豆凝集素基因lec-s 的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1313386A (zh) * 2001-03-12 2001-09-19 云南省农业科学院生物技术研究所 苦参凝集素和其抗虫、抗病编码基因及其应用
CN1357553A (zh) * 2001-12-11 2002-07-10 中国科学院遗传研究所 菊芋凝集素、其编码基因及其在抗虫植物基因工程中的应用
CN1560250A (zh) * 2004-03-04 2005-01-05 上海交通大学 红豆杉凝集素蛋白编码序列
CN103088035A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 南京农业大学 大豆凝集素基因lec-s 的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周晓宇等: "植物凝集素及其在抗虫基因工程中的应用", 《山地农业生物学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088035A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 南京农业大学 大豆凝集素基因lec-s 的应用
CN103088035B (zh) * 2013-01-10 2014-04-16 南京农业大学 大豆凝集素基因lec-s 的应用
CN106432453A (zh) * 2016-08-23 2017-02-22 广东省农业科学院作物研究所 一种烟草凝集素蛋白及其编码基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103305525B (zh) 2015-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102010466B (zh) 植物抗性相关蛋白myb及其编码基因与应用
CN103571844B (zh) dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用
CN107653258A (zh) 棉花GhLecRK1基因在植物抗黄萎病中的应用
CN110468137B (zh) 一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用
CN106591332B (zh) 茄子亚精胺合成酶基因SmSPDS及其在提高抗青枯病能力方面的应用
CN104131015B (zh) 一种岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用
van Bel et al. Sieve element biology provides leads for research on phytoplasma lifestyle in plant hosts
CN110551730B (zh) 茄二十八星瓢虫rps18基因及其在防虫害中的应用
CN103305525B (zh) 一种槐树凝集素基因及其编码的蛋白与应用
CN103627716B (zh) 一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用
Wei et al. Resistance of antimicrobial peptide gene transgenic rice to bacterial blight
CN101092634B (zh) 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法
CN113430200B (zh) 美国白蛾vATPase A基因dsRNA及其细菌表达液及应用
CN114907465B (zh) 水稻孕穗期耐冷性相关的OsLEA9蛋白及其相关生物材料与应用
CN110079549A (zh) 一种通过过表达马铃薯StSN2基因诱导马铃薯快速结薯的方法
CN114231537B (zh) 可提高植物抗镉胁迫能力的杨树乳胶蛋白mlp基因及其表达的蛋白和用途
CN115976050A (zh) 猕猴桃感病基因及其适用的vigs沉默体系构建
CN103088035B (zh) 大豆凝集素基因lec-s 的应用
CN101497885B (zh) 抗蚜虫基因ppa及其制备以及利用其编码的蛋白
CN103665131A (zh) 棉铃虫和烟夜蛾的npf神经肽及其编码基因和应用
CN104263731B (zh) 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
CN104131014B (zh) 岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP1的应用
CN102140446A (zh) 油菜iMyAP基因过表达在油菜抗菌核病中的应用
CN102174547A (zh) 一种火把梨β-1,3-葡聚糖酶基因PpGlu及应用
CN104059931A (zh) 桔小实蝇细胞色素p450基因的rna干扰载体及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150218

Termination date: 20170314