CN103278663A - 一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置；包括显微成像装置、样品台、样品池和中央监控器，所述样品池包括载玻片和样品池本体，测力微针安装在样品台的测力凹槽内，通过样品池的上端方槽接入溶液腔，并密封；操纵微针安装在样品台的操纵凹槽内，通过样品池的第一方槽接入溶液腔，并密封；操纵微针安装在持针器上，持针器内部充满水通过硅胶管与注射器相连；所述持针器固定在微操纵仪上，所述微操纵仪可移动操纵微针，并通过显微成像装置成像。该装置能够测量pN量级的单分子力谱，可置换样品池内溶液环境，并可兼作为磁镊装置。本发明还同时提供了一种廉价、操作方便的基于玻璃微针的单分子力谱方法。

Description

一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置及方法

技术领域

本发明属于单分子操纵与检测领域，具体涉及一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置及方法。

背景技术

力能影响生物大分子的结构和功能。在外界力的作用下，生物大分子如DNA分子会有相应的力学反应和构象变化。在单个分子的水平上研究力对生物分子的结构和构象变化的作用是最直接准确的技术路径。单分子力谱方法就是在这种背景下产生的技术。其通过外界力的施加于生物分子方法，观察其力-末端距长度变化曲线得到生物分子本身的结构信息或者与其他因子如结合蛋白质的相互作用信息。

目前国际国内已有商业化成品装置测量如DNA分子，蛋白质的单分子力谱。如原子力显微镜（AFM）利用微悬臂作为测力探针。光镊利用光阱将连有DNA分子的聚苯乙烯小球束缚住达到操控DNA分子的目的。通过移动小球拉伸DNA分子，得到力谱曲线。但是，现有的单分子力谱技术所用的AFM，光镊装置商业化成品大多价格昂贵，价格高达几十万到一百多万人民币，超出了一般实验室的购买能力。而且这些力谱技术都各有一些不足。如AFM的微悬臂弹性系数相对较大，对于研究DNA分子的pN量级单分子力谱精度远远不够，一般只能用来研究蛋白质分子的单分子力谱。光镊装置要用到激光，由于激光波长一般处在非可见波段，调节光路的时候激光可能对人造成伤害。激光也可能会对研究的生物物质产生伤害。对于研究DNA分子的单分子力谱来说，往往要用到双光镊系统，系统的结构复杂，操作也相对比较繁琐不便。

以往的研究中还发展了另外一种单分子力谱技术，即基于玻璃微针的单分子力谱技术，详见文献《纯化组蛋白引起的DNA凝聚》（科学通报，2007，52（14），1615）。该技术的主要实现步骤如下：整个装置安装在一个倒置显微镜的样品台上。样品池容积约1mL，通过将3个弧形玻璃黏在玻璃衬底上形成，上面盖上一钻有小孔的玻璃片以防止空气流动的影响，蛋白从玻璃片的小孔中加入。一根玻璃微针安装在三维操纵仪上以吸取小球。另外一个弹性系数很小的玻璃微针充当测力探针安装在样品台上，它们的前端开口直径约2μm，是用微针拉制器拉制而成。两根玻璃微针都与一端连有注射器的塑料管相连，注射器盛有去离子水，并且塑料管和玻璃微针都充满了去离子水，这样通过调整注射器的高度，可以产生正的水压或者负的水压，从而吸取或放掉需要操纵的小球。加入小球-DNA-小球结构的样品后通过操纵小球移动可以达到操纵DNA分子的目的。这种基于微针的单分子力谱技术样品池所耗费的样品液体积较大，在1ml左右。其结构是开放型结构，部分溶液表面暴露于空气中，容易蒸发，实验进行一段时间后，样品池内溶液往往要蒸发掉一部分，容易产生扰动影响实验。玻璃微针的弹性系数的校准是通过拉伸DNA分子得到B-S相变平台的已知65pN的力校准得到，由于DNA在该相变中容易断裂，所以这种校准方法很不方便而且很难推广到其它单分子力谱方法。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置；该装置能够测量pN量级的单分子力谱，可控温，可置换样品池内溶液环境，并可兼作为磁镊装置。

本发明的技术方案如下：

一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置，包括显微成像装置、样品台、样品池和中央监控器，显微成像装置与样品池可做相对平移；显微成像装置将获取的图像信息传输给中央监控器进行数据处理；

所述样品台上设置有一用于容置样品池的样品池凹槽，所述样品池放置在样品池凹槽内；所述样品台上样品池凹槽的一侧设置有用于容纳测力微针的测力凹槽，另一侧设置有用于容纳操纵微针的操纵凹槽和用于容纳硅胶管的硅胶管凹槽；

所述样品池包括载玻片和样品池本体，所述样品池本体为由有机玻璃片制成的一体式部件，所述样品池本体呈长方体状，顶面上设置有一凹进样品池本体内部的溶液腔；样品池本体的一侧端面上开设有一下端圆孔和一上端方槽，下端圆孔和上端方槽均与溶液腔连通；所述上端方槽靠近样品池侧壁；

样品池本体的另一侧端面上开设有第一方槽和第二方槽，第一方槽和第二方槽均与溶液腔连通；第一方槽的尺寸大于第二方槽的尺寸；样品池本体扣设在载玻片上，与载玻片粘结；

所述样品池本体上的下端圆孔和第二方槽各接有一根供溶液进出的硅胶管；一测力微针安装在样品台的测力凹槽内，通过样品池的上端方槽接入溶液腔，并密封；一操纵微针安装在样品台的操纵凹槽内，通过样品池的第一方槽接入溶液腔，并密封；所述操纵微针安装在持针器上，持针器内部充满水通过硅胶管与注射器相连；所述持针器固定在微操纵仪上，所述微操纵仪可移动操纵微针，并通过显微成像装置成像。

本发明的进一步设置在于，还包括温控装置，所述温控装置包括控制器、半导体制冷片和散热单元，半导体制冷片安装在样品台上，散热单元安装在半导体制冷片上；所述控制器与温度传感器的输出端以及半导体制冷片的控制端均相连，控制器、半导体制冷片和温度传感器构成一闭环控制系统。

本发明的进一步设置在于，所述散热单元为一中空循环水冷容器，所述中空循环水冷容器接出两根水管，一根水管与置于外部水溶液中的潜水泵连接，另一根置于外部水溶液中用于水循环。

本发明还同时提供了一种廉价、操作方便的基于玻璃微针的单分子力谱方法；该方法能够校准得到准确的玻璃微针弹性系数，然后测量如DNA分子之类的生物大分子的单分子力谱，精度达到pN量级，能够方便地交换样品池内部溶液并进行控温。

技术方案如下：

一种基于玻璃微针的单分子力谱方法，包括以下步骤：

（1）将单分子力谱与磁镊兼用装置中的测力微针、操纵微针和注射器都注满水，并将缓冲液从样品池本体上的第一方槽中加入样品池；

（2）将小球-DNA-小球结构样品液用加样枪从第一方槽中加入缓冲液，等待小球-DNA-小球结构样品液沉到样品池的底部；

（3）用凡士林将第一方槽封住，通过微操纵仪移动操纵微针，并在显微成像装置下成像；

（4）将样品台移到显微成像装置的视野中，使测力微针和操纵微针同时成像；

（5）通过微操纵仪将操纵微针沉到样品池底部，吸住小球-DNA-小球结构样品液中的一对小球对，然后移动到测力微针处，其中一个磁球吸在测力微针上，另一个磁球吸在操纵微针上；

（6）测力微针的弹性系数校准；

（7）利用注射泵通过样品池本体上的供溶液进出的硅胶管，将外界溶液置换入样品池内；

（8）通过微操纵仪控制操纵微针，通过显微成像装置获取的图像分析测力微针的形变信号，得到DNA的力－长度曲线，即力谱信号。

其中，步骤（6）具体包括以下子步骤：

（6.1）将一安装在微操纵仪上的磁铁置于样品池侧面；

（6.2）通过升高注射器水位产生正水压释放掉操纵微针上的磁球，将操纵微针移动远离该磁球，磁球由于热涨落会产生布朗运动；利用磁球的布朗运动测得此时的外力大小；

（6.3）通过显微成像装置获取的测力微针图像，分析得到测力微针的偏移量；

（6.4）利用步骤（6.2）中的外力大小除以步骤（6.3）中得到的偏移量，即可得到校准后的测力微针弹性系数。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用玻璃微针作为测力探针，具有成本低廉，操作直观简便的优点。本发明发明将测力探针置于靠近样品池侧壁，这种设计可通过靠近侧壁的磁铁施加磁力于DNA分子，而达到作为磁镊装置的目的，而且可通过磁镊技术中的测力方法校准探针的弹性系数。

2、本发明所述样品池的容积可控制在200μL左右，除节省样品耗费外，还使小球-DNA-小球样品尽量集中于可为操纵微针捕捉的位置，方便操作。密封样品池设计可避免样品池内溶液暴露于空气中，减少外界干扰，并使置换内部溶液成为可能。样品液进出样品池设计可方便置换样品池内溶液引入研究体系，方便研究。

3、本发明采用了利用磁球布朗运动校准测力探针弹性系数的方法，该方法将磁镊测力技术与力谱技术结合，步骤简洁明了，十分方便。

附图说明

图1为样品台和样品池组合的结构图；

图2为样品台的结构图；

图3为样品池的结构图；

图4为样品池本体的结构图；

图5为操纵微针的形貌图；

图6为经过切断后的操纵微针图；

图7为测力微针的测力原理图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

如图1-4所示，本发明提供了一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置，包括显微成像装置、样品台1、样品池2和中央监控器，显微成像装置与样品池2可做相对平移；显微成像装置将获取的图像信息传输给中央监控器进行数据处理。

所述样品台1上设置有一用于容置样品池2的样品池凹槽11，所述样品池2放置在样品池凹槽11内；所述样品台1上样品池凹槽11的一侧设置有用于容纳测力微针3的测力凹槽12，另一侧设置有用于容纳操纵微针4的操纵凹槽13和用于容纳硅胶管5的硅胶管凹槽14；

所述样品池2包括载玻片6和样品池本体7，所述样品池本体7为由有机玻璃片制成的一体式部件，所述样品池本体7呈长方体状，顶面上设置有一凹进样品池本体7内部的溶液腔21；样品池本体7的一侧端面上开设有一下端圆孔22（直径为1mm）和一上端方槽23（1mm*1mm），下端圆孔22和上端方槽23均与溶液腔21连通。

样品池本体7的另一侧端面上开设有第一方槽24（3mm*3mm）和第二方槽25（1mm*1mm），第一方槽24和第二方槽25均与溶液腔21连通；第一方槽24的尺寸大于第二方槽25的尺寸；样品池本体7扣设在载玻片6上，与载玻片6粘结。

所述样品池本体7上的下端圆孔22和第二方槽25各接有一根供溶液进出的硅胶管5；一测力微针3安装在样品台1的测力凹槽12内，通过样品池2的上端方槽23接入溶液腔21，并密封；一操纵微针4安装在样品台1的操纵凹槽13内，通过样品池2的第一方槽24接入溶液腔21，并密封；所述操纵微针4安装在持针器上，持针器内部充满水通过硅胶管与注射器相连；所述持针器固定在微操纵仪上，所述微操纵仪可移动操纵微针，并通过显微成像装置成像。

为了便于对样品池进行温控，本发明还增加了温控装置，所述温控装置包括控制器、半导体制冷片8和散热单元9，半导体制冷片8安装在样品台5上，散热单元9安装在半导体制冷片8上；所述控制器与温度传感器的输出端以及半导体制冷片8的控制端均相连，控制器、半导体制冷片8和温度传感器构成一闭环控制系统。温度传感器实时检测样品池中溶液的温度，并将所述温度值输出至控制器，控制器判断当前温度是否达到预期温度，之后控制半导体制冷片8进行加热或冷却，如此循环，实现样品池内的恒温。

其中，所述半导体制冷片8通过一导热固定片10固定在样品台5上。所述导热固定片10可为铝片、铜片等导热材质的固定片。半导体制冷片8和散热单元9之间，以及半导体制冷片8与导热固定片10之间均涂有导热硅脂。如此设置可以提高导热性能。所述散热单元9为一中空循环水冷容器，所述中空循环水冷容器接出两根水管，一根水管与置于外部水溶液中的潜水泵连接，另一根置于外部水溶液中用于水循环。

本发明通过控制器和半导体制冷片、样品台和散热单元实现加热或制冷，并最终达到样品池内的目标温度（即保持样品池的恒温）；温度传感器所测温度是样品池内部溶液温度而非样品池外表面温度，减小了温控误差。

采用上述单分子力谱与磁镊兼用装置进行单分子力谱测量的方法，包括以下步骤：

（1）将单分子力谱与磁镊兼用装置中的测力微针、操纵微针和注射器都注满水，并将缓冲液从样品池本体上的第一方槽中加入样品池；

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，配置方法为：所需溶质16ml0.2mM的NaH₂PO₄·2H₂O与84ml0.2mMNa₂HPO₄·12H₂O混合得到100ml的PBS溶液，再加入NaCl达到140mM；然后对其进行过滤以待用；该缓冲液的PH值为7.5。

测力微针和操纵微针都是利用微针拉制仪拉制的，其形貌如图5所示；切断前面的尖端，得到如图6所示的开口约2μm直径大小的玻璃微针。

（2）将小球-DNA-小球结构样品液用加样枪从第一方槽中加入缓冲液，等待小球-DNA-小球结构样品液沉到样品池的底部；

其中，我们采用lambdaDNA（NewEnglandBiolab）用于实验，其两端各有12bp的缺口，定制与缺口互补并且分别修饰有生物素和地高辛功能基的12个碱基的寡核酸片断，利用连接酶将两个片断补上得到两端修饰的DNA。在200mlPBS溶液中依次加入链亲和素修饰的2.8mm顺磁球2ml，1ml抗地高辛修饰的3mm聚苯乙烯球，0.2ml两端修饰功能基的DNA，因为生物素与链亲和素能够形成共价键，地高辛和抗地高辛能形成共价键，均匀混合一小时左右，即得到实验所需的中间连有DNA的小球对。

（3）用凡士林将第一方槽封住，通过微操纵仪移动操纵微针，并在显微成像装置下成像；

（4）将样品台移到显微成像装置的视野中，使测力微针和操纵微针同时成像；

（5）通过微操纵仪将操纵微针沉到样品池底部，吸住小球-DNA-小球结构样品液中的一对小球对，然后移动到测力微针处，其中3μm聚苯乙烯球吸在测力微针上，磁球吸在操纵微针上；

（6）测力微针弹性系数校准；具体包括：

（6.1）将一安装在微操纵仪上的磁铁置于样品池侧面；

（6.2）通过升高注射器水位产生正水压释放掉操纵微针上的磁球，将操纵微针移动远离该磁球，磁球由于热涨落会产生布朗运动；利用磁球的布朗运动测得此时的外力大小；

（6.3）通过显微成像装置获取的测力微针图像，分析得到测力微针的偏移量；

（6.4）利用步骤（6.2）中的外力大小除以步骤（6.3）中得到的偏移量，即可得到校准后的测力微针弹性系数。

（7）利用注射泵通过样品池本体上的供溶液进出的硅胶管，将外界溶液置换入样品池内；

（8）通过微操纵仪控制操纵微针，通过显微成像装置获取的图像分析测力微针的形变信号得到DNA的力－长度曲线；具体是指：如图7所示，通过分析测力微针3的图像偏移可得到测力微针3的偏移量δL，乘上步骤（6）中得到的弹性系数k，得到力，分析测力微针3与操纵微针4的距离变化可得到DNA的长度，这样得到了DNA分子的力－长度曲线即力谱信号。

Claims (5)

1.一种基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置，包括显微成像装置、样品台、样品池和中央监控器，显微成像装置与样品池可做相对平移；显微成像装置将获取的图像信息传输给中央监控器进行数据处理；

其特征在于，所述样品台上设置有一用于容置样品池的样品池凹槽，所述样品池放置在样品池凹槽内；所述样品台上样品池凹槽的一侧设置有用于容纳测力微针的测力凹槽，另一侧设置有用于容纳操纵微针的操纵凹槽和用于容纳硅胶管的硅胶管凹槽；

所述样品池包括载玻片和样品池本体，所述样品池本体为由有机玻璃片制成的一体式部件，所述样品池本体呈长方体状，顶面上设置有一凹进样品池本体内部的溶液腔；样品池本体的一侧端面上开设有一下端圆孔和一上端方槽，下端圆孔和上端方槽均与溶液腔连通；所述上端方槽靠近样品池侧壁；

样品池本体的另一侧端面上开设有第一方槽和第二方槽，第一方槽和第二方槽均与溶液腔连通；第一方槽的尺寸大于第二方槽的尺寸；样品池本体扣设在载玻片上，与载玻片粘结；

所述样品池本体上的下端圆孔和第二方槽各接有一根供溶液进出的硅胶管；一测力微针安装在样品台的测力凹槽内，通过样品池的上端方槽接入溶液腔，并密封；一操纵微针安装在样品台的操纵凹槽内，通过样品池的第一方槽接入溶液腔，并密封；所述操纵微针安装在持针器上，持针器内部充满水通过硅胶管与注射器相连；所述持针器固定在微操纵仪上，所述微操纵仪可移动操纵微针，并通过显微成像装置成像。

2.根据权利要求1所述的基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置，其特征在于，还包括温控装置，所述温控装置包括控制器、半导体制冷片和散热单元，半导体制冷片安装在样品台上，散热单元安装在半导体制冷片上；所述控制器与温度传感器的输出端以及半导体制冷片的控制端均相连，控制器、半导体制冷片和温度传感器构成一闭环控制系统。

3.根据权利要求2所述的基于玻璃微针的单分子力谱与磁镊兼用装置，其特征在于，所述散热单元为一中空循环水冷容器，所述中空循环水冷容器接出两根水管，一根水管与置于外部水溶液中的潜水泵连接，另一根置于外部水溶液中用于水循环。

4.一种基于玻璃微针的单分子力谱方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将单分子力谱与磁镊兼用装置中的测力微针、操纵微针和注射器都注满水，并将缓冲液从样品池本体上的第一方槽中加入样品池；

（2）将小球-DNA-小球结构样品液用加样枪从第一方槽中加入缓冲液，等待小球-DNA-小球结构样品液沉到样品池的底部；

（3）用凡士林将第一方槽封住，通过微操纵仪移动操纵微针，并在显微成像装置下成像；

（4）将样品台移到显微成像装置的视野中，使测力微针和操纵微针同时成像；

（5）通过微操纵仪将操纵微针沉到样品池底部，吸住小球-DNA-小球结构样品液中的一对小球对，然后移动到测力微针处，其中一个磁球吸在测力微针上，另一个磁球吸在操纵微针上；

（6）测力微针的弹性系数校准；

（7）利用注射泵通过样品池本体上的供溶液进出的硅胶管，将外界溶液置换入样品池内；

（8）通过微操纵仪控制操纵微针，通过显微成像装置获取的图像分析测力微针的形变信号，得到DNA的力－长度曲线，即力谱信号。

5.根据权利要求4所述的基于玻璃微针的单分子力谱方法，其特征在于，步骤（6）具体包括以下子步骤：

（6.1）将一安装在微操纵仪上的磁铁置于样品池侧面；

（6.2）通过升高注射器水位产生正水压释放掉操纵微针上的磁球，将操纵微针移动远离该磁球，磁球由于热涨落会产生布朗运动；利用磁球的布朗运动测得此时的外力大小；

（6.3）通过显微成像装置获取的测力微针图像，分析得到测力微针的偏移量；

（6.4）利用步骤（6.2）中的外力大小除以步骤（6.3）中得到的偏移量，即可得到校准后的测力微针弹性系数。

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