CN103120710B - 炒北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了北葶苈子提取物抗肿瘤有效组分提取物，它是北葶苈子（炒）通过水提取，用乙酸乙酯萃取，再经硅胶（200-300目）柱分离，以不同比例的二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，其二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱部位为北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。该部位具有明显的抑制U251（胶质瘤细胞）的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。本发明公开了其制法。

Description

炒北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物及其药物组合物。 

背景技术

目前由于环境污染的加剧，生活节奏的加快，生活压力的增大，癌症的发生率处于上升的趋势，据世界卫生组织最新数据显示，到2020年前，全球癌症发病率将增加50%,而近几年我国癌症发病率则以每年2.5%的速度增加，所以加快抗癌药物的研究显得更为紧迫。 

目前临床上抗肿瘤的药物主要为化学合成药物，虽对肿瘤疾病的治疗大有改善，但这些抗肿瘤治疗化学药物普遍存在毒副作用大，易产生耐药性等缺点。与之相比，中药在临床上所表现的不良反应相对较小，治疗费用相对较低，并且能保持用药的连续性，在预防和治疗肿瘤方面有较明显的优势。自20世纪50年代，逐渐出现中医药防治肿瘤的文献报道，规范的药物实验研究，中医药开始广泛应用于恶性肿瘤的防治。近年来，国内外对来源于天然的抗肿瘤药物的研究高度重视，对现有的中药资源进行了体内外抗肿瘤筛选试验研究，实验结果显示，很多中药具有不同程度的抗肿瘤作用。 

葶苈子（Semen Descurainiae.Semen Lepidii）为十字花科（Cruciferae）两种 

基源植物，即独行菜（Lepidium apetalum Wild）和播娘蒿(Descurainia Sophia L.Webb ex Prantl)的干燥成熟种子。前者习称为北葶苈子，主要分布在我国的东北、河北、山东、山西、四川、内蒙古等地；后者习称为南葶苈子或华东葶苈子，主要分布在我国的东北、河南、山东、浙江、甘肃、内蒙古等地。临床上主要用于治疗痰涎壅肺、喘咳痰多、胸胁胀满、不得平卧、胸腹水肿、小便不利、肺源性心脏病心力衰竭等（中华人民共和国卫生部药典委员会.《中国药典》.北京：化学工业出版社，2010.）。

现代药理研究表明，葶苈子具有止咳平喘、强心、利尿、抗菌、抗癌（国家医药管理中草药情报中心站.植物药有效成分手册：119，411，556-557，962-963，998.）、调血脂（刘忠良.药学实践杂志，2000，18（1）：15-17.）等作用。其中白芥子为止咳有效成分，苄基芥子油具有广谱抗菌作用，而其强心、利尿作用主要与其含有的强心苷类：毒毛旋花子配基(strophanthidine)、伊夫双苷(evobioside)、伊夫单苷(evomonoside)、葶苈苷（helveticoside）及糖芥苷(erysimoside) 有关（陈毓群，李荣芷，王云雯. 药学学报，1981，16（1）：62-64. C.A.：1974：81，166395.）。葶苈子对人鼻咽癌细胞和千田子宫颈癌细胞株有极强的抑制作用，对艾氏腹水癌小鼠的癌细胞有明显的抑制作用，且几乎无毒副反应（常敏毅.抗癌中药：482-483；湖南科学技术出版社.）。孙凯研究发现毒毛旋花子配基对人体鼻咽癌（9KB）细胞具有明显的抑制作用， ED₅₀﹤1μg/ml（孙凯.南葶苈子的化学成分研究[D] .沈阳药科大学，2005）。中国专利200810226062.9《葶苈子提取物在制备抗肿瘤药物中的应用》涉及了葶苈子提取物的提取溶剂及功效，但未涉及葶苈子抗肿瘤作用具体有效部位及详细品名。 

发明内容                                                              

本发明的目的之一是，提供北葶苈子抗肿瘤有效部位提取物及其制备方法。

本发明的目的之二是，提供所说有效部位在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。 

本发明的技术方案如下： 

北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物，它是由炒制的北葶苈子粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯萃取，回收有机溶剂得乙酸乙酯浸膏，过硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，收集二氯甲烷与甲醇比为20:1的洗脱液，蒸去溶剂，即得北葶苈子抗肿瘤有效部位提取物。

一种制备上述葶苈子抗肿瘤有效部位提取物的方法，它包括如下步骤： 

步骤1.将炒制的北葶苈子粉碎，用水回流提取，冷却，离心，浓缩提取液，用95%乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液；

步骤2.将步骤1的提取液用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩得乙酸乙酯浸膏，浸膏用硅胶柱层析，洗脱剂依次为不同比例（100∶0~0∶100）的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷与甲醇比为20∶1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

本发明进一步提供了北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制U251增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒实验中，本发明的北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物可以明显抑制U251的增殖，具有细胞毒作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。 

有益效果                                                                                 

1、本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取等常规方法，从北葶苈子中提取得到了具有抗肿瘤作用的有效组分提取物，该有效组分提取物经实验证明具有体外抑制U251生长的活性。

2、本发明拓展了抗肿瘤药物的原料来源，扩大了北葶苈子的用途，使北葶苈子发展成为抗肿瘤药物的新原料，可显著提高北葶苈子的附加值。 

具体实施方式

以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

实施例1.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的制备

将中药材北葶苈子（炒）粉碎，用10倍质量的水回流提取3h，离心后的残渣重复提取1次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的80%的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%~70%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取至有机相接近无色，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。取适量乙酸乙酯提取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇（100:0，50:1，20:1，10:1，5:1，1:1及0∶100）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集20:1的洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析。具体条件为：色谱柱为岛津shimpack C18柱（4.6×150mm），流速为1.0ml/min。梯度洗脱：A相：0.01%甲酸-水；B相：甲醇，洗脱程序为0.0min～45.00min：B：2%～50%。北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在此色谱条件下，主要出现3个保留峰，保留时间分别为：t₁=2.3min，t₂=13. 3min，t₃=42.7min。 

实施例2.北葶苈子抗肿瘤有效部位提取物的制备

将中药材北葶苈子（炒）粉碎，用10倍质量的水回流提取2h，离心后的残渣重复提取2次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。取适量乙酸乙酯提取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇（30:1，20:1，10:1，5:1）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集20:1的洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析，色谱条件同实施例1。结果表明，北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在高效液相色谱上的保留情况与实施例1的一致。 

实施例3. 北葶苈子抗肿瘤有效部位提取物的制备

将中药材北葶苈子（炒）粉碎，用8倍质量的水回流提取3h，离心后的残渣重复提取2次，离心，合并所有水提取液，浓缩提取液至原药材质量数（克）的体积（ml），加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，加等体积的乙酸乙酯萃取至有机相接近无色，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。取适量乙酸乙酯提取物过硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷-甲醇（50:1，30:1，20:1，10:1，5:1）进行梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液体积为4倍柱体积，收集20:1的洗脱液，浓缩，真空干燥，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

取北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物进行高效液相色谱分析，色谱条件同实施例1。结果表明，北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在高效液相色谱上的保留情况与实施例1的一致。 

实施例4.抗肿瘤活性实验

以实施例1得到的北葶苈子有效组分提取物为受试药物，体外培养U251，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500r﹒min^-1离心5min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至2×10⁴个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO₂）中培养24h，之后加入受试药物20μl，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。在加药48h后，每孔加入5mg﹒ml^-1MTT试剂20μl，继续置于37℃培养4h。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1—实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。

表1  北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物活性实验（U251） 

以实施例2-3得到的北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物重复本实施例得到相同结果。

Claims (3)

1.北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物，其特征是：它是由炒制的北葶苈子粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯萃取，回收有机溶剂得乙酸乙酯浸膏，过硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，收集二氯甲烷与甲醇比为20:1的洗脱液，蒸去溶剂，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

2. 一种制备权利要求1所述北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是它包括如下步骤：

步骤1.将炒制的北葶苈子粉碎，用水回流提取，冷却，离心，浓缩提取液，用95%乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液；

步骤2.将步骤1的提取液用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩得乙酸乙酯浸膏，浸膏用硅胶柱层析，洗脱剂依次为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集二氯甲烷与甲醇比为20∶1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物。

3.根据权利要求1所述的北葶苈子抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物是指抗肿瘤细胞U251的药物。