CN103109687A - 一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法 - Google Patents

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李廷春
周应兵
杨华应
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Abstract

本发明公开了一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法，其方法是烟草发芽试验过程中，待烟草完全发芽，子叶完全展开后，利用高浓度、高分子量的聚乙二醇渗透液模拟烟草幼苗发根和生长的干旱胁迫条件，研究在高渗溶液下烟草小苗的根生长量和植株萎焉比率，从而快速筛选抗旱的烟草，本发明的意义在于规避了烟草种质间在后期生长过程中，由种质生长特性而造成的差异，提供了一种操作简单，快速，准确性好的烟草高通量抗旱筛选方法，为烟草抗旱机理的研究及抗旱材料的利用奠定了基础，有助于烟草的抗旱分离群体筛选。

Description

一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及烟草种质筛选方法，具体是一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法。
背景技术
干旱是影响植物生长发育的主要环境因子之一。烟草在生长过程中，特别是从团棵期进入旺长期时常常遭遇干旱，干旱已经成为影响其营养生长的重要因素。因此，通过对烟草抗旱材料的筛选、利用，可望研究植物的抗旱机制，选育抗旱的烟草品种，以解决生产中的干旱问题。
目前，前人在抗旱研究中得出了一些行之有效的抗旱筛选方法，这些方法有田间直接鉴定、旱棚鉴定、盆栽鉴定、室内模拟干旱发芽期鉴定等等，由于田间直接鉴定、旱棚鉴定与盆栽鉴定受自然条件、作物自身发育特性影响较大，试验误差较大；相比而言，由于室内模拟干旱具有条件可控性强、试验周期短、方法简单、适用于大批量筛选、鉴定，所以，室内模拟干旱的方法是较为常用的方法，但由于处理方法、测试时间和评价标准不同，试验的结论也存在较大的误差。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足之处，提供一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法，该方法通过在种子发芽后的小苗期，采用高浓度、高分子量的聚乙二醇（PEG）渗透溶液模拟小苗生长的干旱胁迫条件，研究在高渗透溶液下烟草种子的根生长量和萎焉植株率，以减小误差，提高筛选方法的准确性。
本发明实现发明目的采用如下技术方案：
一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法，其特点在于按如下步骤进行：
（1）烟草种子的消毒处理
精选大小一致、无破损的种子，用体积浓度8-12%H2O2处理10min，再用蒸馏水洗3-4次后，晾干，待用；
（2）烟草种子发芽试验
培养皿中以双层滤纸为发芽床，然后放入步骤（1）消毒处理过的种子放入培养皿中，用蒸馏水进行发芽，盖好培养皿后，放入昼温度为28℃、10h，夜温度为25℃、14h的气候培养箱进行培养；
（3）定苗、控水
连续培养7-10天后，取出，进行定苗，剔除未发芽种子、弱苗，留长势较好的小苗，倾斜放置培养皿，控水至滤纸吸水至饱和，用移液器吸出多余水份；
（4）PEG-6000处理
加入等同滤纸吸收饱和所需蒸馏水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000终质量浓度为25%，然后盖好培养皿，用石蜡膜封口，放入昼温度为28℃、10h，夜温度为25℃、14h的气候培养箱进行培养；以蒸馏水处理为对照；
（5）烟草萎焉比率和根长变化量的测定
步骤(3)长势较好的小苗经步骤（4）的气候培养箱培连续培养5天后，取出，记录烟草小苗萎焉植株数，测定小苗的根长，计算小苗萎焉植株数和根长生长变化量。
计算公式①、②
① 萎焉率（%）=（萎焉小苗植株数/小苗总数）×100%
② 根长伸长比（%）=（PEG处理后小苗根长-PEG处理前小苗根长）/（PEG处理前小苗根长）×100%
其中，对不同的材料，萎焉率越小、根长变化比越大，表明材料的抗旱性越好。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明通过对种子发芽后的萎焉率和根长伸长比比较来筛选抗旱烟草材料，其操作简单，快速，误差小，准确性好，能有效、快速的进行烟草抗旱材料的大批量筛选。
附图说明
图1是本发明筛选方法中采用PEG-6000处理条件下的不同品种（系）小苗萎焉率比较。
图2是本发明筛选方法中采用PEG-6000处理条件下的不同烟草品种根长伸长比比较。
图3是传统筛选方法中采用 PEG-6000处理条件下的不同品种发芽率比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细的说明：
实施例1
本发明具体实施方式采用的材料及仪器：
仪器：人工气候培养箱、移液器、培养皿、直尺
材料：PEG-6000、蒸馏水、滤纸、石蜡膜
如下实施例材料：歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14；均由安徽省农业科学院烟草研究所提供。
实施例：
（1）烟草种子的消毒处理：
取上述烟草材料（歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14）种子每份0.08g（约1000粒）装入网袋中，先用蒸馏水水洗3次，然后用体积浓度10%H2O2处理10min，再用蒸馏水洗3-4次后，晾干，待用。
（2）50%高浓度PEG-6000渗透液的配置
以1000ml为例，精确称取PEG-6000 500g，加入蒸馏水充分溶解，而后定容至1000ml。
（3）烟草种子发芽试验
以9cm双层滤纸为发芽床，以110mm培养皿为载体，放入步骤（1）消毒处理过的种子，每个培养皿均匀放入130粒，分6个重复，用蒸馏水进行发芽，盖好培养皿后，放入昼温度为28℃(10h)，夜温度为25℃(14h)的气候培养箱进行培养。
（4）定苗、控水
连续培养10天后，取出，进行定苗，剔除未发芽种子、弱苗，每皿留长势较好的小苗100株，倾斜放置培养皿，控水至滤纸吸水至饱和，用移液器吸出多余水份。
（5）PEG-6000处理
以9cm双层滤纸吸水至饱和时，总含水量为3ml，加入3ml50%PEG-6000，至皿中PEG-6000终质量浓度为25%，而后盖好培养皿，用石蜡膜封口，放入昼温度为28℃(10h)，夜温度为25℃(14h)的气候培养箱进行培养。以蒸馏水处理为对照，处理与对照各设分3个重复。
（6）烟草萎焉比率和根长变化量的测定
步骤5培养5天后，取出，记录烟草小苗萎焉植株数，测定小苗的根长，计算小苗萎焉植株数和根长生长变化量。
计算公式①、②
① 萎焉率（%）=（萎焉小苗植株数/小苗总数）×100%
② 根长伸长比（%）=（PEG处理后小苗根长-PEG处理前小苗根长）/（PEG处理前小苗根长）×100%
实验室快速鉴定结果与分析
1、PEG-6000对不同烟草品种小苗萎焉率的影响
利用PEG-6000处理歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14共14个烤烟品种（系）进行品种抗旱性的萎焉率指标研究。结果表明：三组重复中，萎焉率大小差异均表现为6517<中烟14<吉烟9号<长脖黄<云烟97<安选一号<中烟100<NC89<春雷三号<K326<Coker411<NC82<云烟87<歪把子，部分品种（系）间差异显著，重复性好，图1为其中一组重复中不同烤烟品种的萎焉率比较。
2、PEG-6000对不同烟草品种根长伸长比的影响
利用PEG-6000处理歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14共14个烤烟品种（系）进行品种抗旱性的根生长伸长比的指标研究。结果表明：三组重复中，根长伸长比差异均表现为为6517>中烟14>吉烟9号>云烟97>长脖黄>安选一号>中烟100>NC89>春雷三号>K326>Coker411> NC82>云烟87>歪把子，部分品种（系）间差异显著，重复性好，且与小苗萎焉率表现基本一致，如图2所示，为其中一组重复中不同烤烟品种的根长伸长比比较。
实施例2 用常规PEG-6000浸种方法筛选抗旱材料
本发明具体实施方式采用的材料及仪器：
仪器：人工气候培养箱、移液器、培养皿
材料：PEG-6000、蒸馏水、滤纸、石蜡膜
如下实施例材料：歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14均由安徽省农业科学院烟草研究所提供。
实施例：
（1）烟草种子的消毒处理：
取上述烟草材料（歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14）种子每份0.08g（约1000粒）装入网袋中，先用蒸馏水水洗3次，然后用体积浓度10%H2O2处理10min，再用蒸馏水洗3-4次后，晾干，待用。
（2）25%高浓度PEG-6000渗透液的配置
以1000ml为例，精确称取PEG-6000 250g，加入蒸馏水充分溶解，而后定容至1000ml。
（3）烟草种子发芽试验
以9cm双层滤纸为发芽床，以110mm培养皿为载体，放入步骤（1）消毒处理过的种子，每个培养皿均匀放入100粒，而后加入25%的PEG-6000渗透液进行发芽试验，以蒸馏水作为对照，分3个重复，盖好培养皿后，用石蜡膜封口，放入昼温度为28℃(10h)，夜温度为25℃(14h)的气候培养箱进行培养。
（4）发芽率计数
连续培养10天后，拿出培养皿，清点发芽的种子数与不发芽种子数，计算发芽率。
计算公式：
发芽率（%）=（发芽种子数/小苗总数）×100%
实验室快速鉴定结果与分析
利用PEG-6000处理歪把子、云烟87、安选一号、云烟97、K326、长脖黄、NC89、中烟100、吉烟9号、6517、NC82、Coker411、春雷三号、中烟14共14个烤烟品种（系）种子进行品种抗寒性的发芽率比较，结果表明，PEG-6000处理后，三组重复中，按种子发芽率由大到小排列分别为中烟14>6517>云烟97>吉烟9号>长脖黄> NC89>Coker411>安选一号>中烟100>K326>春雷三号>歪把子>云烟87>NC82；6517>云烟97>中烟14>吉烟9号>长脖黄> NC89>Coker411>NC82>安选一号>中烟100>K326>春雷三号>歪把子>云烟87；云烟97>6517>中烟14>吉烟9号>长脖黄> Coker411>NC89>安选一号>中烟100>K326>春雷三号>歪把子>云烟87>NC82（如图3所示）；各重复结果存在一定的差异，这主要由于种子自身品质特性存在差异造成的，试验中发现，虽是同年收获的同一品种种子，但正常条件下，种子自身发芽率也存在差异，因此，利用传统的PEG-6000浸种方法依据发芽率进行抗旱材料筛选，误差相对较大。

Claims (1)

1.一种烟草抗旱种质的快速、高通量筛选方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）烟草种子的消毒处理
精选大小一致、无破损的种子，用体积浓度8-12%H2O2处理10min，再用蒸馏水洗3-4次后，晾干，待用；
（2）烟草种子发芽试验
培养皿中以双层滤纸为发芽床，然后放入步骤（1）消毒处理过的种子放入培养皿中，用蒸馏水进行发芽，盖好培养皿后，放入昼温度为28℃、10h，夜温度为25℃、14h的气候培养箱进行培养；
（3）定苗、控水
连续培养7-10天后，取出，进行定苗，剔除未发芽种子、弱苗，留长势较好的小苗，倾斜放置培养皿，控水至滤纸吸水至饱和，用移液器吸出多余水份；
（4）PEG-6000处理
加入等同滤纸吸收饱和所需蒸馏水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000终浓度为25%，然后盖好培养皿，用石蜡膜封口，放入昼温度为28℃、10h，夜温度为25℃、14h的气候培养箱进行培养；以蒸馏水处理为对照；
（5）烟草萎焉比率和根长变化量的测定
步骤(3)长势较好的小苗经步骤（4）的气候培养箱培连续培养5天后，取出，记录烟草小苗萎焉植株数，测定小苗的根长，计算小苗萎焉植株数和根长生长变化量。
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